JP3220451B2 - ブタクサからのアレルゲン蛋白質およびそれらの使用 - Google Patents
ブタクサからのアレルゲン蛋白質およびそれらの使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 説明 発明の背景 人口の約10％を構成しているところの、遺伝的に病気
にかかり易い個人は、彼らがさらされている種々の環境
源からの抗原に対して過敏性（アレルギー性）を示すよ
うになる。人に対して速効および／または遅延型の過敏
性を誘発し得る抗原はアレルゲンと呼ばれている。Kin
g,T.P.、Adv.Immun.、23:77−105（1976）。枯草熱、ぜ
ん息およびじんましんの徴候を含むところの、過敏症ま
たはアトピーは、速効的アレルギーの１種である。これ
は種々のアトピー性アレルゲン類、例えば草、木、雑
草、動物のふけ、昆虫、および食物の生産物、並びに医
薬品および化学品によって引き起こされ得る。
にかかり易い個人は、彼らがさらされている種々の環境
源からの抗原に対して過敏性（アレルギー性）を示すよ
うになる。人に対して速効および／または遅延型の過敏
性を誘発し得る抗原はアレルゲンと呼ばれている。Kin
g,T.P.、Adv.Immun.、23:77−105（1976）。枯草熱、ぜ
ん息およびじんましんの徴候を含むところの、過敏症ま
たはアトピーは、速効的アレルギーの１種である。これ
は種々のアトピー性アレルゲン類、例えば草、木、雑
草、動物のふけ、昆虫、および食物の生産物、並びに医
薬品および化学品によって引き起こされ得る。
アトピー性アレルギーに伴う抗体は、主に、IgE種の
免疫グロブリンに属している。IgEはマスト細胞および
好塩基性細胞と結合する。マスト細胞と結合したIgEと
特定のアレルゲンとを組み合わせると、このIgEはその
細胞表面上で架橋して、IgE−抗原相互作用の生理学的
効果をもたらす。脱顆粒は、他の物質の中で、ヒスタミ
ン、ヘパリン、好酸性白血球およびロイコトリエンのた
めの化学走性因子C4、D4およびE4（これらは気管支平滑
筋細胞の長引いた圧縮を引き起こす）の放出をもたら
す。Hood,L.E.他、Immunology、（第２版）、460−462
頁、The Benjamin/Cumming Publishing Co.,Inc.（198
4）。これらの放出された物質は、特定のアレルゲンとI
gEとの組み合わせによって引き起こされるアレルギー性
徴候の原因となる媒体である。それらを通してアレルゲ
ンの影響が明らかになる。このような影響は、体内に抗
原が入り込むルートそしてIgEおよびマスト細胞の堆積
様式に応じて、実用上全身的もしくは局所的であり得
る。局所的な発現は、一般に、体内にアレルゲンが入っ
た場所の上皮表面上に生じる。全体的な影響には、循環
（脈管内）抗原に対するIgE−好塩基性細胞応答の結果
である過敏症（過敏症ショック）が含まれる。
免疫グロブリンに属している。IgEはマスト細胞および
好塩基性細胞と結合する。マスト細胞と結合したIgEと
特定のアレルゲンとを組み合わせると、このIgEはその
細胞表面上で架橋して、IgE−抗原相互作用の生理学的
効果をもたらす。脱顆粒は、他の物質の中で、ヒスタミ
ン、ヘパリン、好酸性白血球およびロイコトリエンのた
めの化学走性因子C4、D4およびE4（これらは気管支平滑
筋細胞の長引いた圧縮を引き起こす）の放出をもたら
す。Hood,L.E.他、Immunology、（第２版）、460−462
頁、The Benjamin/Cumming Publishing Co.,Inc.（198
4）。これらの放出された物質は、特定のアレルゲンとI
gEとの組み合わせによって引き起こされるアレルギー性
徴候の原因となる媒体である。それらを通してアレルゲ
ンの影響が明らかになる。このような影響は、体内に抗
原が入り込むルートそしてIgEおよびマスト細胞の堆積
様式に応じて、実用上全身的もしくは局所的であり得
る。局所的な発現は、一般に、体内にアレルゲンが入っ
た場所の上皮表面上に生じる。全体的な影響には、循環
（脈管内）抗原に対するIgE−好塩基性細胞応答の結果
である過敏症（過敏症ショック）が含まれる。
数多くの人々に対して特に関心が持たれている１つの
アレルゲンは、抗原ＥまたはAmb a I、即ち短茎ブタク
サ（以下、「短いブタクサ」ともいう）（Ambrosia art
emisiifolia I.またはAmbrosia elatior）花粉の主要ア
レルゲン成分（類）でありそして北アメリカおよびカナ
ダにおける晩夏の枯草熱の主要原因であるところの、充
分な定義がなされていない構成要素（または構成要素の
群）である。Smith,J.J.他、Mol.Immun、25:355−364
（1988）;King,T.P.他、Biochem.、3:458−468（196
4）;King,T.P.、Adv.Immun.、23:77−105（1976）。平
均として、ブタクサに敏感な個人中の全血清IgEの13％
に及ぶ量が、Amb a Iに特異的であると予想されてい
た。Zeiss,C.R.他、J.Immun.、110:414−421（1973）。
Amb a Iは、酸性であり38,000の分子量を有しておりそ
して抽出およびクロマトグラフィー単離中に開裂して２
つの非共有結合的に会合した鎖（分子量が26,000のアル
ファ鎖および分子量が12,000のベータ鎖）を生じるとこ
ろの非グリコシル化蛋白質であると主張されてきた。Kn
ox,R.B.他、Nature、255:1066−1068（1970）;Knox,R.
B.およびHeslop−Harrison,J.、J.Cell Sci.、6:1−27
（1970）;King,T.P.、Adv.Immun.、23:77−105（197
6）;King,T.P.他、Archs Biochem.Biophys.,212:127−1
35（1981）。Amb a Iの二鎖および単鎖形態（これらは
両方共IgEに対して高い反応性を示す）は、アレルゲン
的および抗原的に関係している。King,T.P.他、Biochem
istry、3:458−468（1964）。しかしながら、Amb a Iを
物理的および化学的に変化させたいくつかのものは抗原
およびアレルゲン活性を著しく損失させることが示され
た。King,T.P.他、Archs Biochem.Biophys.、212:127−
135（1981）;King,T.P.他、Immunochemistry、11:83−9
2（1974）。
アレルゲンは、抗原ＥまたはAmb a I、即ち短茎ブタク
サ（以下、「短いブタクサ」ともいう）（Ambrosia art
emisiifolia I.またはAmbrosia elatior）花粉の主要ア
レルゲン成分（類）でありそして北アメリカおよびカナ
ダにおける晩夏の枯草熱の主要原因であるところの、充
分な定義がなされていない構成要素（または構成要素の
群）である。Smith,J.J.他、Mol.Immun、25:355−364
（1988）;King,T.P.他、Biochem.、3:458−468（196
4）;King,T.P.、Adv.Immun.、23:77−105（1976）。平
均として、ブタクサに敏感な個人中の全血清IgEの13％
に及ぶ量が、Amb a Iに特異的であると予想されてい
た。Zeiss,C.R.他、J.Immun.、110:414−421（1973）。
Amb a Iは、酸性であり38,000の分子量を有しておりそ
して抽出およびクロマトグラフィー単離中に開裂して２
つの非共有結合的に会合した鎖（分子量が26,000のアル
ファ鎖および分子量が12,000のベータ鎖）を生じるとこ
ろの非グリコシル化蛋白質であると主張されてきた。Kn
ox,R.B.他、Nature、255:1066−1068（1970）;Knox,R.
B.およびHeslop−Harrison,J.、J.Cell Sci.、6:1−27
（1970）;King,T.P.、Adv.Immun.、23:77−105（197
6）;King,T.P.他、Archs Biochem.Biophys.,212:127−1
35（1981）。Amb a Iの二鎖および単鎖形態（これらは
両方共IgEに対して高い反応性を示す）は、アレルゲン
的および抗原的に関係している。King,T.P.他、Biochem
istry、3:458−468（1964）。しかしながら、Amb a Iを
物理的および化学的に変化させたいくつかのものは抗原
およびアレルゲン活性を著しく損失させることが示され
た。King,T.P.他、Archs Biochem.Biophys.、212:127−
135（1981）;King,T.P.他、Immunochemistry、11:83−9
2（1974）。
ブタクサの花粉は米国東部およびカナダにおける晩夏
枯草熱の原因となる主要作用物であるため、異なる研究
室において、いかなる他の花粉アレルゲンよりも多く試
験対象となってきた。King,T.P.他、Immun.、23:77−10
5（1979）。熱心な研究にも拘らず、Amb a Iの免疫化学
的定義はまだ完全とは程遠いものである。Smithおよび
共同研究者達は、精製した天然のAmb a Iに対して誘発
される一連のネズミモノクローナル抗体（以下、「単ク
ローン抗体」ともいう）を用いて、Amb a Iのエピトー
プ構造の特徴付けを開始した。３つの、非重複であり非
反復の抗原部位が明らかにされ（部位Ａ、Ｂおよび
Ｃ）、そして部位ＡおよびＢ両方に向かう単クローン抗
体は、Amb a Iに結合するヒトIgEの80％の抑制をもたら
す。使用するこの単クローン抗体の反応性は、Amb a I
が物理的もしくは化学的に修飾されると、大きく減少し
た。Olsenの博士号論文、University of North Carolin
a、Chapel Hill（1986）;Olson,J.R.およびKlapper,D.
G.、J.Immun.、136:2109−2115（1986）。彼らは、これ
らの２つの部位（ＡおよびＢ）は形態的に依存している
エピトープであることを示した。即ち、それらは、修飾
中にそれらの形態を損失した単一構造物であるか、或は
天然のアレルゲンに近いがしかしこのアレルゲンが一度
修飾されると分離するところの、２個以上の不連続ペプ
チド類から成る複合構造物である。Smith,J.J.他、Mol.
Immun.、25:355−365（1988）。
枯草熱の原因となる主要作用物であるため、異なる研究
室において、いかなる他の花粉アレルゲンよりも多く試
験対象となってきた。King,T.P.他、Immun.、23:77−10
5（1979）。熱心な研究にも拘らず、Amb a Iの免疫化学
的定義はまだ完全とは程遠いものである。Smithおよび
共同研究者達は、精製した天然のAmb a Iに対して誘発
される一連のネズミモノクローナル抗体（以下、「単ク
ローン抗体」ともいう）を用いて、Amb a Iのエピトー
プ構造の特徴付けを開始した。３つの、非重複であり非
反復の抗原部位が明らかにされ（部位Ａ、Ｂおよび
Ｃ）、そして部位ＡおよびＢ両方に向かう単クローン抗
体は、Amb a Iに結合するヒトIgEの80％の抑制をもたら
す。使用するこの単クローン抗体の反応性は、Amb a I
が物理的もしくは化学的に修飾されると、大きく減少し
た。Olsenの博士号論文、University of North Carolin
a、Chapel Hill（1986）;Olson,J.R.およびKlapper,D.
G.、J.Immun.、136:2109−2115（1986）。彼らは、これ
らの２つの部位（ＡおよびＢ）は形態的に依存している
エピトープであることを示した。即ち、それらは、修飾
中にそれらの形態を損失した単一構造物であるか、或は
天然のアレルゲンに近いがしかしこのアレルゲンが一度
修飾されると分離するところの、２個以上の不連続ペプ
チド類から成る複合構造物である。Smith,J.J.他、Mol.
Immun.、25:355−365（1988）。
ブタクサのアレルゲンはかなりの注目を集めているに
も拘らず、ヒトに対する副作用の原因となるアレルゲン
の構造（類）または成分（類）の定義付けもしくは特徴
付けは、完全なものからは遠く離れたものであり、そし
て現在の脱感作治療では、複雑な、明確に定義されてい
ないブタクサ花粉抽出物を用いた治療が行われている。
も拘らず、ヒトに対する副作用の原因となるアレルゲン
の構造（類）または成分（類）の定義付けもしくは特徴
付けは、完全なものからは遠く離れたものであり、そし
て現在の脱感作治療では、複雑な、明確に定義されてい
ないブタクサ花粉抽出物を用いた治療が行われている。
発明の要約 本発明は、ブタクサからのアレルゲン蛋白質またはペ
プチド類、上記アレルゲン蛋白質またはペプチド類の全
ておよび一部をコード化するDNA、上記アレルゲン
（類）または該アレルゲン（類）の一部を含有する組成
物、並びにブタクサに敏感な個人が該アレルゲンにさら
された時に通常生じる副作用を減少させるか或は防止す
るため（即ち、該アレルゲンに対して個人を脱感作させ
るか、或は該アレルゲンの影響を防ぐため）の、該アレ
ルゲン（類）またはそれらの一部、或は該アレルゲン
（類）またはそれらの一部含有組成物の投与方法に関す
る。本発明は更に、ブタクサ花粉に対する敏感性の診断
方法に関する。
プチド類、上記アレルゲン蛋白質またはペプチド類の全
ておよび一部をコード化するDNA、上記アレルゲン
（類）または該アレルゲン（類）の一部を含有する組成
物、並びにブタクサに敏感な個人が該アレルゲンにさら
された時に通常生じる副作用を減少させるか或は防止す
るため（即ち、該アレルゲンに対して個人を脱感作させ
るか、或は該アレルゲンの影響を防ぐため）の、該アレ
ルゲン（類）またはそれらの一部、或は該アレルゲン
（類）またはそれらの一部含有組成物の投与方法に関す
る。本発明は更に、ブタクサ花粉に対する敏感性の診断
方法に関する。
抗原ＥまたはAmb a Iは、単一蛋白質ではなく、むし
ろブタクサに敏感な個人が反応する蛋白質の一族または
複数の属であることが今ここに示された。特に、本発明
は、ブタクサ花粉からのアレルゲン蛋白質中に存在して
いるアミノ酸配列もしくはペプチドをコード化するDNA
に関する。これは、単離されたブタクサアレルゲンAmb
a Iもしくは抗原Ｅ調剤の全てもしくは一部をコード化
するDNAに関する。上記ブタクサアレルゲン調剤は、実
際上不均一であり、そしてこれは、現在Amb a Iまたは
抗原Ｅと呼んでいるものに加えて、アレルゲン性を示す
（即ち、ブタクサ花粉にさらされた時ブタクサに対して
感受性を示す個人において観察される典型的な副作用を
生じさせる）他のブタクサ成分が含まれていてもよい。
これらには、例えば、文献中では抗原Ｋとして呼ばれて
おりそしてここではAmb a IIと呼ぶものが含まれ得る。
本発明はまた、短いブタクサ以外の種類のブタクサ、例
えばジャイアントブタクサおよびウエスターンブタクサ
中の同様なアミノ酸配列をコード化するDNA（即ち、ア
レルゲン類のアミノ酸破裂をコード化するDNA）に関す
る。
ろブタクサに敏感な個人が反応する蛋白質の一族または
複数の属であることが今ここに示された。特に、本発明
は、ブタクサ花粉からのアレルゲン蛋白質中に存在して
いるアミノ酸配列もしくはペプチドをコード化するDNA
に関する。これは、単離されたブタクサアレルゲンAmb
a Iもしくは抗原Ｅ調剤の全てもしくは一部をコード化
するDNAに関する。上記ブタクサアレルゲン調剤は、実
際上不均一であり、そしてこれは、現在Amb a Iまたは
抗原Ｅと呼んでいるものに加えて、アレルゲン性を示す
（即ち、ブタクサ花粉にさらされた時ブタクサに対して
感受性を示す個人において観察される典型的な副作用を
生じさせる）他のブタクサ成分が含まれていてもよい。
これらには、例えば、文献中では抗原Ｋとして呼ばれて
おりそしてここではAmb a IIと呼ぶものが含まれ得る。
本発明はまた、短いブタクサ以外の種類のブタクサ、例
えばジャイアントブタクサおよびウエスターンブタクサ
中の同様なアミノ酸配列をコード化するDNA（即ち、ア
レルゲン類のアミノ酸破裂をコード化するDNA）に関す
る。
図の簡単な説明 図１は、Amb a I中に存在している蛋白質もしくはペ
プチド類および上記蛋白質もしくはペプチド類をコード
化するDNAが同定単離されそして特徴付けられる評価の
いくつかのルートに関する図式的表示である。
プチド類および上記蛋白質もしくはペプチド類をコード
化するDNAが同定単離されそして特徴付けられる評価の
いくつかのルートに関する図式的表示である。
図1Aは、単クローン抗体およびオリゴプローブを用い
たAmb a Iもしくは抗原Ｅ調剤のスクリーニングに関す
る図式的表示である。
たAmb a Iもしくは抗原Ｅ調剤のスクリーニングに関す
る図式的表示である。
図1Bは、ブタクサ花頭λgt10ライブラリー（以下、
「収集」ともいう）のスクリーニングに関する図式的表
示である。これはまた、Amb a IおよびAmb a IIをコー
ド化する全長のcDNAクローン体を得るための、クロス雑
種形成およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法の使用
を説明するものである。
「収集」ともいう）のスクリーニングに関する図式的表
示である。これはまた、Amb a IおよびAmb a IIをコー
ド化する全長のcDNAクローン体を得るための、クロス雑
種形成およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法の使用
を説明するものである。
図２は、Amb a I調剤の成分に特異な単クローン抗体
を用いたスクリーニングによるλgt11収集から単離され
たところの、UNCクローン１のDNA挿入断片のヌクレオチ
ド配列である（Amb a I Aと呼ぶ）。
を用いたスクリーニングによるλgt11収集から単離され
たところの、UNCクローン１のDNA挿入断片のヌクレオチ
ド配列である（Amb a I Aと呼ぶ）。
図３は、Amb a I調剤の成分に特異な単クローン抗体
を用いたスクリーニングによるλgt11収集から単離され
たところの、UNCクローン６のDNA挿入断片のヌクレオチ
ド配列である（Amb a I Bと呼ぶ）。
を用いたスクリーニングによるλgt11収集から単離され
たところの、UNCクローン６のDNA挿入断片のヌクレオチ
ド配列である（Amb a I Bと呼ぶ）。
図４は、Amb a I調剤の成分に特異な単クローン抗体
を用いたスクリーニングによるλgt11収集から単離され
たところの、UNCクローン15のDNA挿入断片のヌクレオチ
ド配列である（Amb a I Cと呼ぶ）。
を用いたスクリーニングによるλgt11収集から単離され
たところの、UNCクローン15のDNA挿入断片のヌクレオチ
ド配列である（Amb a I Cと呼ぶ）。
図５は、ブタクサアレルゲン調剤Amb a I中に存在し
ていることが知られているアミノ酸配列から推論された
配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt
10 cDNA収集から単離されたところの、IPCクローン１の
cDNA挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌ
クレオチドプローブ配列の推論の基となる配列の位置に
アンダーラインを引く。
ていることが知られているアミノ酸配列から推論された
配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt
10 cDNA収集から単離されたところの、IPCクローン１の
cDNA挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌ
クレオチドプローブ配列の推論の基となる配列の位置に
アンダーラインを引く。
図６は、ブタクサアレルゲン調剤Amb a I中に存在し
ていることが知られているアミノ酸配列から推論された
配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt
10 cDNA収集から単離されたところの、IPCクローン５の
cDNA挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌ
クレオチドプローブ配列の推論の基となる配列の位置に
アンダーラインを引く。
ていることが知られているアミノ酸配列から推論された
配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt
10 cDNA収集から単離されたところの、IPCクローン５の
cDNA挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌ
クレオチドプローブ配列の推論の基となる配列の位置に
アンダーラインを引く。
図７は、ブタクサアレルゲン調剤Amb a I中に存在し
ていることが知られているアミノ酸配列から推論された
配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt
10 cDNA収集から単離されたところの、IPCクローン６の
cDNA挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌ
クレオチドプローブ配列の推論の基となる配列の位置に
アンダーラインを引く。
ていることが知られているアミノ酸配列から推論された
配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt
10 cDNA収集から単離されたところの、IPCクローン６の
cDNA挿入断片のヌクレオチド配列である。このオリゴヌ
クレオチドプローブ配列の推論の基となる配列の位置に
アンダーラインを引く。
図８は、IPCクローン１のDNA挿入断片の構成物分析オ
ープン読み取りに関する図式的表示である。
ープン読み取りに関する図式的表示である。
図９は、IPCクローン５のDNA挿入断片の構成物分析オ
ープン読み取りに関する図式的表示である。
ープン読み取りに関する図式的表示である。
図10は、IPCクローン６のDNA挿入断片の構成物分析オ
ープン読み取りに関する図式的表示である。
ープン読み取りに関する図式的表示である。
図11は、全長Amb a I Aクローン体のヌクレオチド配
列および推論されるアミノ酸配列である（UNCクローン
１に関する）。
列および推論されるアミノ酸配列である（UNCクローン
１に関する）。
図12は、全長Amb a I Bクローン体のヌクレオチド配
列および推論されるアミノ酸配列である（UNCクローン
６に関する）。
列および推論されるアミノ酸配列である（UNCクローン
６に関する）。
図13は、全長Amb a I Cクローン体のヌクレオチド配
列および推論されるアミノ酸配列である（UNCクローン1
5に関する）。
列および推論されるアミノ酸配列である（UNCクローン1
5に関する）。
図14は、全長Amb a I Dクローン体のヌクレオチド配
列および推論されるアミノ酸配列である。
列および推論されるアミノ酸配列である。
図15は、全長Amb a IIクローン体のヌクレオチド配列
および推論されるアミノ酸配列である。
および推論されるアミノ酸配列である。
図16は、類似した領域並びに不適合領域を示してい
る、Amb a IおよびAmb a IIの多重遺伝子族に関する複
合アミノ酸配列である。
る、Amb a IおよびAmb a IIの多重遺伝子族に関する複
合アミノ酸配列である。
図17は、ラビット抗Amb a Iポリクローナル抗体（以
下、「多クローン抗体」ともいう）、JB1E3−４抗Amb a
I単クローン抗体またはブタクサアレルギー患者の血清
で処理したところの、アフィニティー精製したAmb a I
ウエスタンブロットに関する写真である。
下、「多クローン抗体」ともいう）、JB1E3−４抗Amb a
I単クローン抗体またはブタクサアレルギー患者の血清
で処理したところの、アフィニティー精製したAmb a I
ウエスタンブロットに関する写真である。
図18は、大きさおよび電荷を基準にして分離しそして
T.P.Kingの抗体（これはAmb a Iを認識する）で染色し
たところの、短いブタクサ花粉の水抽出物の二次元ゲル
に関する写真である（ヤギの多クローン抗Amb a I）。
T.P.Kingの抗体（これはAmb a Iを認識する）で染色し
たところの、短いブタクサ花粉の水抽出物の二次元ゲル
に関する写真である（ヤギの多クローン抗Amb a I）。
図19は、ヤギの抗Amb a I抗体で処理したいくつかの
大腸菌発現組換Amb a I cDNAのウエスタンブロットに関
する写真である。
大腸菌発現組換Amb a I cDNAのウエスタンブロットに関
する写真である。
図20は、抗ヒトIgEを用いて染色したヒトのアレルギ
ー血清で処理したところの、いくつかの大腸菌発現組換
Amb a I cDNAのウエスタンブロットに関する写真であ
る。
ー血清で処理したところの、いくつかの大腸菌発現組換
Amb a I cDNAのウエスタンブロットに関する写真であ
る。
図21は、短いブタクサ花粉の水抽出物、アフィニティ
ー精製したAmb a I（B7）、クロマトグラフィー精製し
たAmb a I、および発現した組換Amb a I蛋白質含有大腸
菌溶解産物に対するブタクサアレルギー患者PBMCのＴ細
胞増殖応答に関する図式的表示である。
ー精製したAmb a I（B7）、クロマトグラフィー精製し
たAmb a I、および発現した組換Amb a I蛋白質含有大腸
菌溶解産物に対するブタクサアレルギー患者PBMCのＴ細
胞増殖応答に関する図式的表示である。
発明の詳細な説明 本発明は、ブタクサ花粉アレルゲン、詳細には、各々
以下に説明するところの、いくつかの相互関係を有する
方法を用いて、短いブタクサからのAmb a I（または抗
原Ｅ）として知られている調剤に関する研究を基とする
ものである。言葉Amb a Iおよび抗原Ｅは、互いに交換
可能な様式で用いる。ブタクサ花粉から得られる上記調
剤は、他のブタクサアレルゲン類、例えば抗原Ｋまたは
Amb a IIを含有している可能性がある。他の上記アレル
ゲンを上記調剤が含有している可能性は予測されてお
り、そして試験の結果はそのことを示している。
以下に説明するところの、いくつかの相互関係を有する
方法を用いて、短いブタクサからのAmb a I（または抗
原Ｅ）として知られている調剤に関する研究を基とする
ものである。言葉Amb a Iおよび抗原Ｅは、互いに交換
可能な様式で用いる。ブタクサ花粉から得られる上記調
剤は、他のブタクサアレルゲン類、例えば抗原Ｋまたは
Amb a IIを含有している可能性がある。他の上記アレル
ゲンを上記調剤が含有している可能性は予測されてお
り、そして試験の結果はそのことを示している。
本文中に記述する試験の結果は、Amb a Iは単一蛋白
質もしくはペプチドではなく、実際上不均一系であるこ
とを示している。即ち、抗原Ｅ（またはAmb a I）と現
在呼ばれているものは、明らかに、蛋白質の一族もしく
は族類であるか、或は現実に多型である。本文中に示す
研究により、ブタクサアレルゲン中に存在しているペプ
チド類もしくはアミノ酸配列をコード化するDNAの同定
および単離がもたらされた。説明した如く、Amb a I
A、Amb a I B、Amb a I CおよびAmb a I D、並びにAmb
a IIをコード化する全長cDNAが単離され配列決定され
た。これによりまた、ヒトのブタクサIgEと結合し、そ
して精製したAmb a I調剤を用いて製造したラビットのA
mb a I抗血清に結合することが示されたところの、蛋白
質のAmb a I調剤からの単離および精製がもたらされ
た。以下に示す項中に記述する方法により同定および単
離したところの、DNAと蛋白質もしくはペプチド類との
間の相互関係が示された。表示を容易にするため、用い
たいくつかの方法を図式的に図1Aおよび図1Bに示し、こ
れを参照にして以下の考察を行う。
質もしくはペプチドではなく、実際上不均一系であるこ
とを示している。即ち、抗原Ｅ（またはAmb a I）と現
在呼ばれているものは、明らかに、蛋白質の一族もしく
は族類であるか、或は現実に多型である。本文中に示す
研究により、ブタクサアレルゲン中に存在しているペプ
チド類もしくはアミノ酸配列をコード化するDNAの同定
および単離がもたらされた。説明した如く、Amb a I
A、Amb a I B、Amb a I CおよびAmb a I D、並びにAmb
a IIをコード化する全長cDNAが単離され配列決定され
た。これによりまた、ヒトのブタクサIgEと結合し、そ
して精製したAmb a I調剤を用いて製造したラビットのA
mb a I抗血清に結合することが示されたところの、蛋白
質のAmb a I調剤からの単離および精製がもたらされ
た。以下に示す項中に記述する方法により同定および単
離したところの、DNAと蛋白質もしくはペプチド類との
間の相互関係が示された。表示を容易にするため、用い
たいくつかの方法を図式的に図1Aおよび図1Bに示し、こ
れを参照にして以下の考察を行う。
本文中に記述する研究の結果として、ブタクサアレル
ゲン中に存在している蛋白質もしくはペプチド類をコー
ド化するDNAを同定および単離し、そしてコード化され
た生産物のアミノ酸配列を推論した。更に、Amb a Iま
たは抗原Ｅに特異な単クローン抗体の使用を通して、Am
b a I調剤から蛋白質を得た。この蛋白質（アフィニテ
ィー精製したAmb a Iと呼ぶ）は生物学的活性（ヒトのI
gEと結合する能力およびラビットのAmb a I抗血清と結
合する能力）を有することが示され、従ってこれは、ア
レルゲンである可能性が高い。２つの単離したDNA中に
存在しているヌクレオチド配列の領域によってコード化
されることも示された。
ゲン中に存在している蛋白質もしくはペプチド類をコー
ド化するDNAを同定および単離し、そしてコード化され
た生産物のアミノ酸配列を推論した。更に、Amb a Iま
たは抗原Ｅに特異な単クローン抗体の使用を通して、Am
b a I調剤から蛋白質を得た。この蛋白質（アフィニテ
ィー精製したAmb a Iと呼ぶ）は生物学的活性（ヒトのI
gEと結合する能力およびラビットのAmb a I抗血清と結
合する能力）を有することが示され、従ってこれは、ア
レルゲンである可能性が高い。２つの単離したDNA中に
存在しているヌクレオチド配列の領域によってコード化
されることも示された。
以下は、Amb a Iまたは抗原Ｅ調剤からの蛋白質もし
くはペプチド類をコード化するDNAを同定および単離す
るため、並びにAmb a I調剤からAmb a I活性を有するこ
とが知られている蛋白質を単離するために用いられてき
たいくつかの方法に関する説明である。図1A中に示すよ
うに、T.P.Kingおよび共同研究者の方法を基とする方法
により花粉抽出物から調製されたところの、Amb a Iも
しくは抗原Ｅ調剤を製造した。King,T.P.他、Arch.Bioc
h.and Biophys.、212:127−135（1981）。この調剤中の
蛋白質を同定するため、Klapperおよび共同研究者によ
って作られた単クローン抗体のパネルを用いた。Smith,
J.J.他、Mol.Immun.、25:355−365（1988）。抗原Ｅ調
剤からのいくつかのペプチド類の配列を通常の技術で測
定した。
くはペプチド類をコード化するDNAを同定および単離す
るため、並びにAmb a I調剤からAmb a I活性を有するこ
とが知られている蛋白質を単離するために用いられてき
たいくつかの方法に関する説明である。図1A中に示すよ
うに、T.P.Kingおよび共同研究者の方法を基とする方法
により花粉抽出物から調製されたところの、Amb a Iも
しくは抗原Ｅ調剤を製造した。King,T.P.他、Arch.Bioc
h.and Biophys.、212:127−135（1981）。この調剤中の
蛋白質を同定するため、Klapperおよび共同研究者によ
って作られた単クローン抗体のパネルを用いた。Smith,
J.J.他、Mol.Immun.、25:355−365（1988）。抗原Ｅ調
剤からのいくつかのペプチド類の配列を通常の技術で測
定した。
以下の項で下記を説明する:1）反応性を示す生成物を
コード化するDNA挿入断片含有クローン体同定のため、
これらの単クローン抗体のプール（即ち、Amb a Iに対
して反応性を示す単クローン抗体のプール）の使用、そ
して２）該アミノ酸配列をコード化するDNA挿入断片含
有クローン体同定のため、Amb a I調剤中に存在してい
るアミノ酸配列から構成されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブの使用。各々の方法は、Amb a Iもしくは抗原Ｅ調
剤中に存在しているアミノ酸配列をコード化するDNAを
含有しているところの、３つのクローン体の同定をもた
らした。以下に記述するようにして単離された２組のク
ローン体は互いに異なっていることが示された。
コード化するDNA挿入断片含有クローン体同定のため、
これらの単クローン抗体のプール（即ち、Amb a Iに対
して反応性を示す単クローン抗体のプール）の使用、そ
して２）該アミノ酸配列をコード化するDNA挿入断片含
有クローン体同定のため、Amb a I調剤中に存在してい
るアミノ酸配列から構成されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブの使用。各々の方法は、Amb a Iもしくは抗原Ｅ調
剤中に存在しているアミノ酸配列をコード化するDNAを
含有しているところの、３つのクローン体の同定をもた
らした。以下に記述するようにして単離された２組のク
ローン体は互いに異なっていることが示された。
ブタクサ蛋白質をコード化するDNA挿入断片含有クロー
ン体同定のための単クローン抗体の使用 公知の方法を用いてブタクサ花粉λgt11収集をスクリ
ーニングするため、Amb a I調剤の成分に対して特異的
な反応性を示す７個の単クローン抗体のプールを用い
た。Young,R.A.およびR.W.Davis、Proceedings of the
National Academy of Sciences、USA、80:1194−1198
（1983）。この結果、本文中それぞれAmb a I A、I Bお
よびI Cで表されているところの、３つのクローン体、
即ち最初に表示したUNCクローン１、６および15が同定
され、これらは、該パネル中の単クローン抗体の少なく
とも１つによって認識される生成物を表している。アレ
ルゲンAmb a IおよびAmb a IIをコード化するcDNAの学
名は、International Union of Immunological Societi
es Sub−Committee for Allergen Nomenclature（Marsh
他、Annals of Allergy、60:499−504（1988））の推奨
に従って命名した。
ン体同定のための単クローン抗体の使用 公知の方法を用いてブタクサ花粉λgt11収集をスクリ
ーニングするため、Amb a I調剤の成分に対して特異的
な反応性を示す７個の単クローン抗体のプールを用い
た。Young,R.A.およびR.W.Davis、Proceedings of the
National Academy of Sciences、USA、80:1194−1198
（1983）。この結果、本文中それぞれAmb a I A、I Bお
よびI Cで表されているところの、３つのクローン体、
即ち最初に表示したUNCクローン１、６および15が同定
され、これらは、該パネル中の単クローン抗体の少なく
とも１つによって認識される生成物を表している。アレ
ルゲンAmb a IおよびAmb a IIをコード化するcDNAの学
名は、International Union of Immunological Societi
es Sub−Committee for Allergen Nomenclature（Marsh
他、Annals of Allergy、60:499−504（1988））の推奨
に従って命名した。
Sanger,F.他の方法（Sanger,F.他、Proc.Natl.Acad.S
ci.、USA、74:5463（1977））を用いて、この３つの、
反応性を示すクローン体から単離したDNAを、配列決定
した。これらの３つのクローン体のヌクレオチド配列を
図２〜４に示す。
ci.、USA、74:5463（1977））を用いて、この３つの、
反応性を示すクローン体から単離したDNAを、配列決定
した。これらの３つのクローン体のヌクレオチド配列を
図２〜４に示す。
図２〜４中に示す部分的cDNA配列を使用し、Amb a I
A（図11）、Amb a I B（図12）、Amb a I C（図13）お
よびAmb a I D（図14）をコード化する全長cDNAを単離
するため、クロス雑種形成（実施例２に記述）およびPC
R方法（実施例３に記述）を用いた。
A（図11）、Amb a I B（図12）、Amb a I C（図13）お
よびAmb a I D（図14）をコード化する全長cDNAを単離
するため、クロス雑種形成（実施例２に記述）およびPC
R方法（実施例３に記述）を用いた。
別々に構成させたλgt10ブタクサ花頭収集からのcDNA
をクロス雑種形成するDNA配列決定の過程において、Amb
a IIペプチド配列を有する配列を共有している新規なc
DNAが誘導された（図15および図16）。この収集の構成
およびこの新規なcDNAの単離を実施例２に記述する。示
されている類似領域および不適合領域と共に、Amb a I
およびAmb a II多重遺伝子族の複合アミノ酸配列を図16
に示す。図16に、Amb a Iの配列を標準１文字コードで
示す。Amb a Iのそれに関係している他のAmb a I族の一
員に関する配列を、相違のみを示すことで表す。傍線は
２つの配列の間の同一性を示している。星印は、最大整
列を保持するために導入した配列中の破断部を示してい
る。アミノ酸の番号はAmb a I B配列を基としている。
与えられた族の一員中に配列多型性が認められた場合は
常に、主要配列を上つき文字で表しそして副次的配列を
下つき文字で表す。与えられた族の一員中の多型性は、
この多型性がブロックとして存在しているところのAmb
a I Dのアミノ酸183〜189を除いて、独立した出来事と
して生じる。
をクロス雑種形成するDNA配列決定の過程において、Amb
a IIペプチド配列を有する配列を共有している新規なc
DNAが誘導された（図15および図16）。この収集の構成
およびこの新規なcDNAの単離を実施例２に記述する。示
されている類似領域および不適合領域と共に、Amb a I
およびAmb a II多重遺伝子族の複合アミノ酸配列を図16
に示す。図16に、Amb a Iの配列を標準１文字コードで
示す。Amb a Iのそれに関係している他のAmb a I族の一
員に関する配列を、相違のみを示すことで表す。傍線は
２つの配列の間の同一性を示している。星印は、最大整
列を保持するために導入した配列中の破断部を示してい
る。アミノ酸の番号はAmb a I B配列を基としている。
与えられた族の一員中に配列多型性が認められた場合は
常に、主要配列を上つき文字で表しそして副次的配列を
下つき文字で表す。与えられた族の一員中の多型性は、
この多型性がブロックとして存在しているところのAmb
a I Dのアミノ酸183〜189を除いて、独立した出来事と
して生じる。
ブタクサ蛋白質をコード化するDNA挿入断片含有クロー
ン体同定のためのオリゴヌクレオチドプローブの使用 図1Aにも示すように、通常技術により同定しそして配
列決定したところの、Amb a I調剤中のアミノ酸配列（W
ENFK）を、アミノ酸配列をコード化するオリゴヌクレオ
チドプローブ（オリゴプローブ）の配列を推論するため
に用いた。このオリゴヌクレオチド配列を推論するため
に用いたアミノ酸配列は、VWVKPWENFKであった。AGE＃
１で表示するオリゴプローブの配列を推論するため、そ
のアミノ酸配列の一部（WENFK）を用いた。プールした
短いブタクサの花頭からの、polyA+の豊富なRNAを用い
てλgt10中に構成させたcDNA収集をスクリーニングする
ため、実施例１に記述したようにAGE＃１を用いた。こ
のオリゴプローブを用いたスクリーニングの結果、10個
の重複した信号が同定された。これらの重複信号（クロ
ーン体）に、同じAGE＃１オリゴヌクレオチドプローブ
を用いた第二スクリーニングを受けさせた。陽性を示し
たものの３種（第二陽性と呼ぶ）は明らかに重複して検
出された。この様式で同定したこれらのクローン体（IP
Cクローン１、IPCクローン５およびIPCクローン６で表
示）を、適当な条件下で増殖させた後、サザンブロット
分析により陽性を確認した。
ン体同定のためのオリゴヌクレオチドプローブの使用 図1Aにも示すように、通常技術により同定しそして配
列決定したところの、Amb a I調剤中のアミノ酸配列（W
ENFK）を、アミノ酸配列をコード化するオリゴヌクレオ
チドプローブ（オリゴプローブ）の配列を推論するため
に用いた。このオリゴヌクレオチド配列を推論するため
に用いたアミノ酸配列は、VWVKPWENFKであった。AGE＃
１で表示するオリゴプローブの配列を推論するため、そ
のアミノ酸配列の一部（WENFK）を用いた。プールした
短いブタクサの花頭からの、polyA+の豊富なRNAを用い
てλgt10中に構成させたcDNA収集をスクリーニングする
ため、実施例１に記述したようにAGE＃１を用いた。こ
のオリゴプローブを用いたスクリーニングの結果、10個
の重複した信号が同定された。これらの重複信号（クロ
ーン体）に、同じAGE＃１オリゴヌクレオチドプローブ
を用いた第二スクリーニングを受けさせた。陽性を示し
たものの３種（第二陽性と呼ぶ）は明らかに重複して検
出された。この様式で同定したこれらのクローン体（IP
Cクローン１、IPCクローン５およびIPCクローン６で表
示）を、適当な条件下で増殖させた後、サザンブロット
分析により陽性を確認した。
この３種のクローン体各々からのcDNA挿入断片を単離
し、M13mp18中にクローン化した後、配列決定した（図
５〜７）。アミノ酸配列もまた推論した（図８〜10）。
この配列決定したcDNA中のオープン読み取り構成物を検
査し（図８〜10）、そして配列を同定した（これによ
り、該オリゴヌクレオチドプローブの配列が推論され
た）。このcDNA挿入断片が、翻訳された蛋白質の一部を
コード化することは、該DNA配列（VWVKP）から推論され
た周辺のアミノ酸配列が該オリゴプローブの配列を推論
するために最初用いたアミノ酸配列と一致していること
により、支持された（図８〜10）。アレルギー患者から
のＴ細胞が合成ペプチドRAE4により刺激された（表
５）。このRAE4配列はIPCクローン５から推論された
（図８）。
し、M13mp18中にクローン化した後、配列決定した（図
５〜７）。アミノ酸配列もまた推論した（図８〜10）。
この配列決定したcDNA中のオープン読み取り構成物を検
査し（図８〜10）、そして配列を同定した（これによ
り、該オリゴヌクレオチドプローブの配列が推論され
た）。このcDNA挿入断片が、翻訳された蛋白質の一部を
コード化することは、該DNA配列（VWVKP）から推論され
た周辺のアミノ酸配列が該オリゴプローブの配列を推論
するために最初用いたアミノ酸配列と一致していること
により、支持された（図８〜10）。アレルギー患者から
のＴ細胞が合成ペプチドRAE4により刺激された（表
５）。このRAE4配列はIPCクローン５から推論された
（図８）。
二「組」のヌクレオチド配列（即ち、単クローン抗体
の使用を通して単離されたDNAであるところの組１、そ
して該オリゴプローブの使用を通して単離されたDNAで
あるところの組２）を比較することで明らかなように、
一組の範囲内（即ち、図２〜４の範囲内、および図５〜
７の範囲内）の配列の間には相同性が存在しているが、
組と組との間では配列に関してほとんど類似性がない。
の使用を通して単離されたDNAであるところの組１、そ
して該オリゴプローブの使用を通して単離されたDNAで
あるところの組２）を比較することで明らかなように、
一組の範囲内（即ち、図２〜４の範囲内、および図５〜
７の範囲内）の配列の間には相同性が存在しているが、
組と組との間では配列に関してほとんど類似性がない。
従って、Amb a Iまたは抗原Ｅ調剤は実際上不均一で
あり、そして蛋白質の一族（または族類）を示している
ことは明らかであるか、或はAmb a Iをコード化するDNA
中に相当の多型性が存在していることは明らかである。
このことは、Amb a Iまたは抗原Ｅに関する現在の文献
記述（これは、ブタクサに敏感な個人が反応するところ
の、ブタクサ花粉中に存在しているアレルゲン性蛋白質
の群もしくは群類としてよりはむしろ蛋白質として抗原
Ｅを表している）に反するものである。
あり、そして蛋白質の一族（または族類）を示している
ことは明らかであるか、或はAmb a Iをコード化するDNA
中に相当の多型性が存在していることは明らかである。
このことは、Amb a Iまたは抗原Ｅに関する現在の文献
記述（これは、ブタクサに敏感な個人が反応するところ
の、ブタクサ花粉中に存在しているアレルゲン性蛋白質
の群もしくは群類としてよりはむしろ蛋白質として抗原
Ｅを表している）に反するものである。
Amb a Iの抗原性ペプチド類およびDNAの単離に関する追
加的立証 追加的結果は更に、Amb a Iの抗原性ペプチド類およ
びそれらをコード化するDNAが同定されそして単離され
たことを明らかに示している。図1Aに示すように、変性
条件を受けさせていないAmb a I調剤を認識するところ
の、選択された単クローン抗体（4B5/B7で表示）を、花
粉抽出物から単一蛋白質（アフィニティー精製したAmb
a Iと呼ぶ）をアフィニティー精製するために用いた。
これは、所望の単クローン抗体を生産させ、腹水から多
量にそれを単離した後、セファローズ（Sepharose）（P
harmacia）上にそれを固定化することによる公知の技術
を用いて行った。花粉の水抽出物を単クローン抗体含有
カラムの上から流して、蛋白質種を溶離させた。この様
式で単離した抗原ＥがヒトのIgEと結合することを、ウ
エスタンブロット（図17）およびELISA技術の両方を用
いて示し、従ってAmb a I蛋白質もしくはペプチドの期
待される生物活性が立証された。
加的立証 追加的結果は更に、Amb a Iの抗原性ペプチド類およ
びそれらをコード化するDNAが同定されそして単離され
たことを明らかに示している。図1Aに示すように、変性
条件を受けさせていないAmb a I調剤を認識するところ
の、選択された単クローン抗体（4B5/B7で表示）を、花
粉抽出物から単一蛋白質（アフィニティー精製したAmb
a Iと呼ぶ）をアフィニティー精製するために用いた。
これは、所望の単クローン抗体を生産させ、腹水から多
量にそれを単離した後、セファローズ（Sepharose）（P
harmacia）上にそれを固定化することによる公知の技術
を用いて行った。花粉の水抽出物を単クローン抗体含有
カラムの上から流して、蛋白質種を溶離させた。この様
式で単離した抗原ＥがヒトのIgEと結合することを、ウ
エスタンブロット（図17）およびELISA技術の両方を用
いて示し、従ってAmb a I蛋白質もしくはペプチドの期
待される生物活性が立証された。
ペプチド配列決定分析を以下のようにして行った:2種
のペプチドを、それぞれ、アフィニティー精製したAmb
a Iの部分的トリプシン消化または臭化シアン（CNBr）
開裂から単離した後、ペプチド配列決定を行った。Amb
a IのＮ末端がブロックされているため、直接Ｎ末端蛋
白質配列決定分析からはいかなるアミノ酸配列も得るこ
とができない。このトリプシンのペプチドに関する配列
決定分析の結果は、そのアミノ酸配列の主要部分が、該
Amb a I AのcDNAによってコード化されたペプチド配列4
5〜77に一致していることを明らかに示していた（表
１）。表１は、蛋白質配列決定分析により測定されたAm
b a I蛋白質のアミノ酸配列と、Amb a IのcDNAから推論
されたアミノ酸配列との比較である。CNBr開裂ペプチド
配列決定は、そのCNBr開裂ペプチドが、Amb a I AのcDN
Aによりコード化されたペプチド配列171〜184に類似し
ていることを示していた（表１）。
のペプチドを、それぞれ、アフィニティー精製したAmb
a Iの部分的トリプシン消化または臭化シアン（CNBr）
開裂から単離した後、ペプチド配列決定を行った。Amb
a IのＮ末端がブロックされているため、直接Ｎ末端蛋
白質配列決定分析からはいかなるアミノ酸配列も得るこ
とができない。このトリプシンのペプチドに関する配列
決定分析の結果は、そのアミノ酸配列の主要部分が、該
Amb a I AのcDNAによってコード化されたペプチド配列4
5〜77に一致していることを明らかに示していた（表
１）。表１は、蛋白質配列決定分析により測定されたAm
b a I蛋白質のアミノ酸配列と、Amb a IのcDNAから推論
されたアミノ酸配列との比較である。CNBr開裂ペプチド
配列決定は、そのCNBr開裂ペプチドが、Amb a I AのcDN
Aによりコード化されたペプチド配列171〜184に類似し
ていることを示していた（表１）。
個々のペプチド類を単離することなしに蛋白質開裂混
合物を用いて、より一層のペプチド配列決定分析を行っ
た。この使用した技術には、Amb a IのcDNA配列から推
論された推定上のAsp−ProおよびMet−Pro結合を特異的
に加水分解（70％の蟻酸もしくはCNBrを用いて）するこ
とが含まれていた。このように、いかなる第一級アミノ
基も、通常の配列決定に先立つｏ−フタルアルデヒドと
の反応により、利用できるいかなるＮ末端プロリン残基
からもブロックされた。
合物を用いて、より一層のペプチド配列決定分析を行っ
た。この使用した技術には、Amb a IのcDNA配列から推
論された推定上のAsp−ProおよびMet−Pro結合を特異的
に加水分解（70％の蟻酸もしくはCNBrを用いて）するこ
とが含まれていた。このように、いかなる第一級アミノ
基も、通常の配列決定に先立つｏ−フタルアルデヒドと
の反応により、利用できるいかなるＮ末端プロリン残基
からもブロックされた。
これらの評価の結果（表１参照）は、アフィニティー
精製したAmb a I調剤から測定された２つのペプチド配
列が、Amb a I AのDNA配列の２つの部分（277〜321また
は361〜397）によりコード化されたものと一致している
ことを明らかに示していた。このペプチド配列決定分析
で検出された副次的配列もまた、Amb a IまたはAmb a I
IのcDNAによりコード化されたペプチド配列の一部に相
当していた。上記ペプチド配列決定分析は、Amb a Iも
しくは抗原Ｅコード化DNAが単離されたことに対する強
力な支持を与えていた。
精製したAmb a I調剤から測定された２つのペプチド配
列が、Amb a I AのDNA配列の２つの部分（277〜321また
は361〜397）によりコード化されたものと一致している
ことを明らかに示していた。このペプチド配列決定分析
で検出された副次的配列もまた、Amb a IまたはAmb a I
IのcDNAによりコード化されたペプチド配列の一部に相
当していた。上記ペプチド配列決定分析は、Amb a Iも
しくは抗原Ｅコード化DNAが単離されたことに対する強
力な支持を与えていた。
T.P.King博士の方法によって得た抗原Ｅの調剤もまた
ペプチド配列決定した。同様のペプチド配列決定技術を
用いた。４種のペプチド配列が同定され、これらは、Am
b a I AのDNAによりコード化されたペプチド配列の同様
な４種のセグメント（表１中の45〜92、171〜186、277
〜321および361〜397）と一致していた。このことは、A
mb a Iもしくは抗原Ｅコード化DNAが単離されたことに
対する追加的証拠を与えていた。
ペプチド配列決定した。同様のペプチド配列決定技術を
用いた。４種のペプチド配列が同定され、これらは、Am
b a I AのDNAによりコード化されたペプチド配列の同様
な４種のセグメント（表１中の45〜92、171〜186、277
〜321および361〜397）と一致していた。このことは、A
mb a Iもしくは抗原Ｅコード化DNAが単離されたことに
対する追加的証拠を与えていた。
T.P.King博士の方法により得られた精製抗原Ｋ（Amb
a II）に関して同様の技術を用いた。結果は、２つのペ
プチド配列が、Amb a IIのDNAによりコード化されたペ
プチド配列の２つの部分と一致していることを明らかに
示していた（表２、実施例２参照、図15）。表２は、蛋
白質配列決定分析により測定されたAmb a II蛋白質のア
ミノ酸配列と、Amb a IIのcDNAから推論されたアミノ酸
配列との比較である。この発見は、ブタクサ花粉のアレ
ルゲンのコード化するDNAが単離されたことに対する支
持を与えていた。
a II）に関して同様の技術を用いた。結果は、２つのペ
プチド配列が、Amb a IIのDNAによりコード化されたペ
プチド配列の２つの部分と一致していることを明らかに
示していた（表２、実施例２参照、図15）。表２は、蛋
白質配列決定分析により測定されたAmb a II蛋白質のア
ミノ酸配列と、Amb a IIのcDNAから推論されたアミノ酸
配列との比較である。この発見は、ブタクサ花粉のアレ
ルゲンのコード化するDNAが単離されたことに対する支
持を与えていた。
ラビットおよびヒトの抗血清を用いて、Amb a Iおよ
びAmb a IIはいくつかの抗原性決定因子を共有すること
が以前に報告された（King,T.P.、Adv.Immun.、23:77−
105（1976））。しかしながら、本発明以前には、この
２つの抗原間の正確な関係は不明確のままであった。Ki
ngおよび共同研究者達はまた、イオン交換クロマトグラ
フィーにより抗原ＥおよびＫの異なるイソ型（Amb a I
およびAmb a II）が単離できることを報告している（Ki
ng,T.P.他、Ach.Biochem.Biophys.、212:127−135（198
1））。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤで表示されるところの、記
述された異なるイソ型は、損傷を受けていないAmb a I
およびAmb a II種の制限蛋白質分解により生産されると
解釈された。Ａ、Ｂ、Ｃなどで表示されるところの、こ
れらのイソ型は、本発明中に概略を示す学名（即ち、Am
b a I A、Amb a I Bなど）とは直接的な関係を有するも
のでないことを特記する。
びAmb a IIはいくつかの抗原性決定因子を共有すること
が以前に報告された（King,T.P.、Adv.Immun.、23:77−
105（1976））。しかしながら、本発明以前には、この
２つの抗原間の正確な関係は不明確のままであった。Ki
ngおよび共同研究者達はまた、イオン交換クロマトグラ
フィーにより抗原ＥおよびＫの異なるイソ型（Amb a I
およびAmb a II）が単離できることを報告している（Ki
ng,T.P.他、Ach.Biochem.Biophys.、212:127−135（198
1））。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤで表示されるところの、記
述された異なるイソ型は、損傷を受けていないAmb a I
およびAmb a II種の制限蛋白質分解により生産されると
解釈された。Ａ、Ｂ、Ｃなどで表示されるところの、こ
れらのイソ型は、本発明中に概略を示す学名（即ち、Am
b a I A、Amb a I Bなど）とは直接的な関係を有するも
のでないことを特記する。
硫酸アンモニウムの45％飽和溶液中のAmb a IIを用い
て、ブタクサ花粉抽出物から35,000ダルトン種を共沈さ
せる。これらの蛋白質の大部分はゲル濾過クロマトグラ
フィーで凝集することが示される。これらの蛋白質の中
のいくつかの単量体形態を、イオン交換クロマトグラフ
ィーによりAmb a IIから分離した。推定上の結合したAs
p−Proの70％蟻酸加水分解そして第一級アミノ基のｏ−
フタルアルデヒドによるブロック化を含む配列決定技術
により、主要蛋白質はAmb a I CのDNA配列によりコード
化されたものに一致することが明らかに示された。この
ペプチド配列を表１の35kDと呼ぶ。この結果により、Am
b a I蛋白質は実際上不均一でありそして密接に関係し
たDNAによりコード化されることに対する追加的支持が
得られた。
て、ブタクサ花粉抽出物から35,000ダルトン種を共沈さ
せる。これらの蛋白質の大部分はゲル濾過クロマトグラ
フィーで凝集することが示される。これらの蛋白質の中
のいくつかの単量体形態を、イオン交換クロマトグラフ
ィーによりAmb a IIから分離した。推定上の結合したAs
p−Proの70％蟻酸加水分解そして第一級アミノ基のｏ−
フタルアルデヒドによるブロック化を含む配列決定技術
により、主要蛋白質はAmb a I CのDNA配列によりコード
化されたものに一致することが明らかに示された。この
ペプチド配列を表１の35kDと呼ぶ。この結果により、Am
b a I蛋白質は実際上不均一でありそして密接に関係し
たDNAによりコード化されることに対する追加的支持が
得られた。
図1A中にも示されているように、ラビットの多クロー
ン抗体がKingの抗原Ｅ調剤を用いて生産された。これら
の抗体は、花粉抽出物のウエスタンブロットで38kd蛋白
質種を同定することが示された（図17）。電荷を基とす
る一方向および大きさを基とするもう１つの方向で電気
泳動した後、ヤギの抗Amb抗体で処理したところの、ブ
タクサ花粉抽出物の二次ゲルを図18に示す。結果は、Am
b a I蛋白質と以前呼ばれていたものを差別的に帯電さ
せた形態に相当しているところの、相対分子量が35kDの
ブタクサ花粉抽出物中に存在しているいくつかの蛋白質
との結合を明らかに示している。同様の技術を用いて、
前述したアフィニティー精製Amb a Iとこれらの抗体と
が結合することも示された（図17）。
ン抗体がKingの抗原Ｅ調剤を用いて生産された。これら
の抗体は、花粉抽出物のウエスタンブロットで38kd蛋白
質種を同定することが示された（図17）。電荷を基とす
る一方向および大きさを基とするもう１つの方向で電気
泳動した後、ヤギの抗Amb抗体で処理したところの、ブ
タクサ花粉抽出物の二次ゲルを図18に示す。結果は、Am
b a I蛋白質と以前呼ばれていたものを差別的に帯電さ
せた形態に相当しているところの、相対分子量が35kDの
ブタクサ花粉抽出物中に存在しているいくつかの蛋白質
との結合を明らかに示している。同様の技術を用いて、
前述したアフィニティー精製Amb a Iとこれらの抗体と
が結合することも示された（図17）。
この抗体の反応性を考慮すると、この4B5/B7アフィニ
ティー精製したAmb a Iが、花粉のAmb a Iの認識パター
ン、そしてラビットの多クローン抗Amb a IおよびJB1E3
−４抗Amb a I単クローン抗体の両方を用いた皮膚試験
試薬の認識パターンと同様の認識パターンを有している
ことは明らかである（図17）。これはまた、ウエスタン
ブロットで容易に検出できるIgE反応性を有している
（図17;患者番号155）。クロマトグラフィーで精製した
Amb a II（抗原Ｋ）が、アフィニティー精製したAmb a
Iに対して交差反応性を示すＢ細胞エピトープ類を有し
ていることも、明らかである（図17、抗Amb a I多クロ
ーン）。
ティー精製したAmb a Iが、花粉のAmb a Iの認識パター
ン、そしてラビットの多クローン抗Amb a IおよびJB1E3
−４抗Amb a I単クローン抗体の両方を用いた皮膚試験
試薬の認識パターンと同様の認識パターンを有している
ことは明らかである（図17）。これはまた、ウエスタン
ブロットで容易に検出できるIgE反応性を有している
（図17;患者番号155）。クロマトグラフィーで精製した
Amb a II（抗原Ｋ）が、アフィニティー精製したAmb a
Iに対して交差反応性を示すＢ細胞エピトープ類を有し
ていることも、明らかである（図17、抗Amb a I多クロ
ーン）。
ここに記述した実験の結果として、Amb a I調剤から
得られる蛋白質のアレルゲン性ペプチドをコード化する
cDNA、ブタクサの主要ヒトアレルゲンおよびAmb a IIの
調剤がクローン化され、単離され、配列決定され、そし
てこのコード化されたアミノ酸配列（アレルゲン類の）
が推論された後、Amb a IおよびAmb a IIから誘導され
るペプチド類が同定され、単離された。
得られる蛋白質のアレルゲン性ペプチドをコード化する
cDNA、ブタクサの主要ヒトアレルゲンおよびAmb a IIの
調剤がクローン化され、単離され、配列決定され、そし
てこのコード化されたアミノ酸配列（アレルゲン類の）
が推論された後、Amb a IおよびAmb a IIから誘導され
るペプチド類が同定され、単離された。
更に、いくつかの数のAmb a I多重遺伝子族、並びにA
mb a IIをコード化するところの、全長のそして端を切
り取ったcDNAを、発現ベクターpTrc99中にクレームを揃
えてクローン化した（Amann他、Gene、69:301−315、
（1988））後、JM109宿主中に形質転換した。1mMのイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより、組
換えAmb a IおよびAmb a II蛋白質の発現を誘導させ、
細胞を収穫し、リゾチーム処理し、音波処理した後、低
速遠心分離により不溶の含有物を回収した。この回収し
たペレット中に存在している組換えAmb a IおよびAmb a
II蛋白質を、8Mの尿素、50mMのトリスHCl pH8.0、50m
MのNaCl、1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、1mMの
フッ化フェニルメチルスルホニルの入っている緩衝液で
可溶化した。可溶化後、この粗尿素溶解産物をPBSに対
して４℃で透析した。この発現した組換えAmb a Iおよ
びAmb a II蛋白質をウエスタンブロットし、この結果を
図19および20に示す。結果（図19）は、ヤギの抗Amb a
I抗体が、特異的に、いくつかの形態のAmb a I（Ａ、Ｂ
およびＣ）並びにAmb a II（抗原Ｋ）と結合することを
示している。この抗原性交差反応性は、該cDNAの観察さ
れた配列相同性と一致している（図16参照）。これらは
更に、アレルギー性のヒトIgEが特異的にAmb a I多重遺
伝子族の一員のいくつかと結合することを示している
（図20）。患者＃295の場合、IgEは、Amb a I Bもしく
はAmb a IIよりも更に大きな度合でAmb a I A（全長）
およびAmb a I Cと結合する。IgEの結合パターンに関す
る高い水準の変動性が認められ（表３および示されてい
ないデータ）、そしてこのことは、異なる患者は異なる
Amb a I蛋白質に異なる度合で反応することを示してい
る。 表３ 要約ウエスタンブロットデータ＊ 患者 花粉 抗原I A（ｔ） I A I B I C II A 151 ＋ − ＋ − ＋ ＋ 222 ＋− ＋− ＋− ＋− ＋− ＋ 291 ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ − ＋＋＋ ＋− 295 ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ − 296 ＋＋ ＋＋ ＋＋ − − 背景に対していかなる信号もなし。
mb a IIをコード化するところの、全長のそして端を切
り取ったcDNAを、発現ベクターpTrc99中にクレームを揃
えてクローン化した（Amann他、Gene、69:301−315、
（1988））後、JM109宿主中に形質転換した。1mMのイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより、組
換えAmb a IおよびAmb a II蛋白質の発現を誘導させ、
細胞を収穫し、リゾチーム処理し、音波処理した後、低
速遠心分離により不溶の含有物を回収した。この回収し
たペレット中に存在している組換えAmb a IおよびAmb a
II蛋白質を、8Mの尿素、50mMのトリスHCl pH8.0、50m
MのNaCl、1mMのEDTA、1mMのジチオトレイトール、1mMの
フッ化フェニルメチルスルホニルの入っている緩衝液で
可溶化した。可溶化後、この粗尿素溶解産物をPBSに対
して４℃で透析した。この発現した組換えAmb a Iおよ
びAmb a II蛋白質をウエスタンブロットし、この結果を
図19および20に示す。結果（図19）は、ヤギの抗Amb a
I抗体が、特異的に、いくつかの形態のAmb a I（Ａ、Ｂ
およびＣ）並びにAmb a II（抗原Ｋ）と結合することを
示している。この抗原性交差反応性は、該cDNAの観察さ
れた配列相同性と一致している（図16参照）。これらは
更に、アレルギー性のヒトIgEが特異的にAmb a I多重遺
伝子族の一員のいくつかと結合することを示している
（図20）。患者＃295の場合、IgEは、Amb a I Bもしく
はAmb a IIよりも更に大きな度合でAmb a I A（全長）
およびAmb a I Cと結合する。IgEの結合パターンに関す
る高い水準の変動性が認められ（表３および示されてい
ないデータ）、そしてこのことは、異なる患者は異なる
Amb a I蛋白質に異なる度合で反応することを示してい
る。 表３ 要約ウエスタンブロットデータ＊ 患者 花粉 抗原I A（ｔ） I A I B I C II A 151 ＋ − ＋ − ＋ ＋ 222 ＋− ＋− ＋− ＋− ＋− ＋ 291 ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ − ＋＋＋ ＋− 295 ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋ ＋＋＋ − 296 ＋＋ ＋＋ ＋＋ − − 背景に対していかなる信号もなし。
＋− 背景に対してほとんど区別できない。
＋ 明らかに陽性 ＋＋ 強い陽性 ＋＋＋ 高度に陽性 ＊ その時までにスクリーニングした10人の患者全体か
ら選択。
ら選択。
Amb a IおよびAmb a IIのいくつかの組換え形態と結
合するIgEのSDS−PAGEウエスタンブロット分析は、異な
る患者に対して相当のパターン変化が観察されることを
示していた。検査した10人のブタクサアレルギー患者の
中で、全ての患者が少なくとも１つの組換えAmb a Iお
よびAmb a IIと結合する血清IgEを有しており、数人の
患者のIgEはいくつかの異なる組換え種と結合する（表
３に要約）。組換えAmb a IおよびAmb a II蛋白質と結
合するヒトIgEと、抗ペプチドおよび単クローン抗Amb a
I抗体との比較により、Amb a I AのＮ末端部分（歴史
的にはβ領域と呼ぶ）が主要IgEエピトープ（類）を含
んでいるとの結論に一致したデータが得られた。このデ
ータ（表３）は、Amb a I A（ｔ）（端が切り取られたA
mb a I A、アミノ酸70〜398）が全長Amb a I A（アミノ
酸10〜398）よりもうまくはブタクサアレルギー患者のI
gEと結合しないとの観察を基としている。その他のAmb
a IおよびAmb a II形態も同様のIgE結合特性を有してい
ると期待される（例えば図20参照）。
合するIgEのSDS−PAGEウエスタンブロット分析は、異な
る患者に対して相当のパターン変化が観察されることを
示していた。検査した10人のブタクサアレルギー患者の
中で、全ての患者が少なくとも１つの組換えAmb a Iお
よびAmb a IIと結合する血清IgEを有しており、数人の
患者のIgEはいくつかの異なる組換え種と結合する（表
３に要約）。組換えAmb a IおよびAmb a II蛋白質と結
合するヒトIgEと、抗ペプチドおよび単クローン抗Amb a
I抗体との比較により、Amb a I AのＮ末端部分（歴史
的にはβ領域と呼ぶ）が主要IgEエピトープ（類）を含
んでいるとの結論に一致したデータが得られた。このデ
ータ（表３）は、Amb a I A（ｔ）（端が切り取られたA
mb a I A、アミノ酸70〜398）が全長Amb a I A（アミノ
酸10〜398）よりもうまくはブタクサアレルギー患者のI
gEと結合しないとの観察を基としている。その他のAmb
a IおよびAmb a II形態も同様のIgE結合特性を有してい
ると期待される（例えば図20参照）。
混合ブタクサ花粉抽出物で予め刺激されたところの、
ブタクサに対してアレルギーを示す患者からのＴ細胞
は、花粉抽出物、ブタクサ皮膚試験試薬（RWST）、アフ
ィニティー精製Amb a I蛋白質、および組換えAmb a I遺
伝子生産物I A、I BおよびI Cを含有している粗バクテ
リア溶解産物と反応して、認識しそして増殖することが
できる（表４）。これらの患者からのＴ細胞は、等量の
対照バクテリア溶解産物JM109の存在下で増殖しない。
これらの結果は、各々の遺伝子生産物がある種のＴ細胞
反応性を刺激できることを明らかに示している。抗原と
して粗バクテリア溶解産物を使用した時の負の応答によ
っては、固定した結論が排除されるものではない、何故
ならば、溶解産物中の組換え蛋白質の相対的水準が測定
されていなかったからである。
ブタクサに対してアレルギーを示す患者からのＴ細胞
は、花粉抽出物、ブタクサ皮膚試験試薬（RWST）、アフ
ィニティー精製Amb a I蛋白質、および組換えAmb a I遺
伝子生産物I A、I BおよびI Cを含有している粗バクテ
リア溶解産物と反応して、認識しそして増殖することが
できる（表４）。これらの患者からのＴ細胞は、等量の
対照バクテリア溶解産物JM109の存在下で増殖しない。
これらの結果は、各々の遺伝子生産物がある種のＴ細胞
反応性を刺激できることを明らかに示している。抗原と
して粗バクテリア溶解産物を使用した時の負の応答によ
っては、固定した結論が排除されるものではない、何故
ならば、溶解産物中の組換え蛋白質の相対的水準が測定
されていなかったからである。
主題のアレルゲン性蛋白質／ペプチド類およびこれらを
コード化するDNAの使用 ここに記述した研究によって得られる材料並びにこれ
らの材料を含有している組成物は、ブタクサアレルギー
の診断、治療および予防方法で用いられ得る。加うる
に、該cDNA（またはそれを転写したところのmRNA）は、
いかなる変種もしくは種類のブタクサ中の類似配列をも
同定するために用いられ、例えば短いブタクサ花粉から
得られるDNAに対して雑種形成（またはハイブリダイ
ズ）させるに充分な相同性を有する配列を、同定もしく
は「引き出す」ことができる。これは、例えば、厳密
（またはストリンジエント）でない条件下で行うことが
でき、そして充分な相同性（一般に40％以上）を有する
配列が、ここに記述した方法を用いて、更に一層の評価
のために選択され得る。二者択一的に、高い厳密度を有
する条件（またはストリンジエントな条件）も使用でき
る。
コード化するDNAの使用 ここに記述した研究によって得られる材料並びにこれ
らの材料を含有している組成物は、ブタクサアレルギー
の診断、治療および予防方法で用いられ得る。加うる
に、該cDNA（またはそれを転写したところのmRNA）は、
いかなる変種もしくは種類のブタクサ中の類似配列をも
同定するために用いられ、例えば短いブタクサ花粉から
得られるDNAに対して雑種形成（またはハイブリダイ
ズ）させるに充分な相同性を有する配列を、同定もしく
は「引き出す」ことができる。これは、例えば、厳密
（またはストリンジエント）でない条件下で行うことが
でき、そして充分な相同性（一般に40％以上）を有する
配列が、ここに記述した方法を用いて、更に一層の評価
のために選択され得る。二者択一的に、高い厳密度を有
する条件（またはストリンジエントな条件）も使用でき
る。
このようにして、本発明のDNAは、Amb a Iの配列と同
様のアミノ酸配列を有するペプチド類をコード化すると
ころの、他の種類のブタクサ（例えばジャイアントブタ
クサ或いはウエスタンブタクサ）中の配列を同定し、従
って、このような他の種類のブタクサ中のアレルゲンを
同定するために用いることができる。従って、本発明に
は、Amb a Iおよび本DNA配列によってコード化された他
のブタクサアレルゲン（例えばAmb a IIまたは抗原Ｋ）
ばかりでなく、本発明のDNAに対して雑種形成させたDNA
によってコード化されたところの、他のブタクサアレル
ゲンも含まれる。
様のアミノ酸配列を有するペプチド類をコード化すると
ころの、他の種類のブタクサ（例えばジャイアントブタ
クサ或いはウエスタンブタクサ）中の配列を同定し、従
って、このような他の種類のブタクサ中のアレルゲンを
同定するために用いることができる。従って、本発明に
は、Amb a Iおよび本DNA配列によってコード化された他
のブタクサアレルゲン（例えばAmb a IIまたは抗原Ｋ）
ばかりでなく、本発明のDNAに対して雑種形成させたDNA
によってコード化されたところの、他のブタクサアレル
ゲンも含まれる。
本発明のcDNAによってコード化された蛋白質もしくは
ペプチド類は、例えば「精製」アレルゲンとして使用で
きる。上記精製アレルゲンは、ブタクサアレルギーの診
断および治療のための鍵となる試薬であるところの、ア
レルゲン抽出物の標準化において有益である。更に、図
２〜16中に挙げた配列を基とするペプチド類を用いるこ
とにより、抗ペプチド抗血清または単クローン抗体が標
準方法で得られる。上記試薬は、Amb a IまたはAmb a I
Iの個々のイソ型に対して特異的に向かわせることがで
きる（即ち、この分子の分枝領域／エピトープに向かわ
せることができる）か、或は全ての形態のAmb a Iまた
はAmb a IIに対して特異的であり得る（即ち、通常の配
列／エピトープに向かわせることができる）。Amb a I
もしくはAmb a IIに向かうこれらの血清もしくは単クロ
ーン抗体は、アレルゲン抽出物の標準化のために使用で
きる。このような１つの単一特異性抗ペプチド抗血清は
既に成功裏に生産されている。Amb a II配列（アミノ酸
326〜338;配列CLRTGAQEPEWMTを有するRAE 50.Kで表示さ
れる）に向かうこのラビットの抗血清は、ウエスタンブ
ロットに関して、組換えAmb a IIと特異的に結合する
が、Amb a I A、ＢまたはＣとは結合しない（データは
示されていない）。
ペプチド類は、例えば「精製」アレルゲンとして使用で
きる。上記精製アレルゲンは、ブタクサアレルギーの診
断および治療のための鍵となる試薬であるところの、ア
レルゲン抽出物の標準化において有益である。更に、図
２〜16中に挙げた配列を基とするペプチド類を用いるこ
とにより、抗ペプチド抗血清または単クローン抗体が標
準方法で得られる。上記試薬は、Amb a IまたはAmb a I
Iの個々のイソ型に対して特異的に向かわせることがで
きる（即ち、この分子の分枝領域／エピトープに向かわ
せることができる）か、或は全ての形態のAmb a Iまた
はAmb a IIに対して特異的であり得る（即ち、通常の配
列／エピトープに向かわせることができる）。Amb a I
もしくはAmb a IIに向かうこれらの血清もしくは単クロ
ーン抗体は、アレルゲン抽出物の標準化のために使用で
きる。このような１つの単一特異性抗ペプチド抗血清は
既に成功裏に生産されている。Amb a II配列（アミノ酸
326〜338;配列CLRTGAQEPEWMTを有するRAE 50.Kで表示さ
れる）に向かうこのラビットの抗血清は、ウエスタンブ
ロットに関して、組換えAmb a IIと特異的に結合する
が、Amb a I A、ＢまたはＣとは結合しない（データは
示されていない）。
本発明のペプチド類の使用を通して、矛盾のない充分
に限定された組成および生物活性を有するアレルゲン調
剤が製造でき、そしてこれらは治療目的で投与され得る
（例えば、ブタクサ花粉に対して、ブタクサに敏感な個
人のアレルギー反応を修正するため）。上記ペプチド類
もしくは蛋白質（或はそれらの修飾型、例えば以下に示
すもの）は、例えば、ブタクサアレルゲンに対するＢ細
胞応答、ブタクサアレルゲンに対するＴ細胞応答、或は
それらの両方の応答を修正させ得る。精製アレルゲンも
また、ブタクサアレルギーの免疫治療の機構を研究する
ため用いられ、そして修飾した誘導体、或は免疫治療に
おいて未修飾の（「天然に存在する」）ペプチド類より
も有益な類似物を設計するために用いられてもよい。
に限定された組成および生物活性を有するアレルゲン調
剤が製造でき、そしてこれらは治療目的で投与され得る
（例えば、ブタクサ花粉に対して、ブタクサに敏感な個
人のアレルギー反応を修正するため）。上記ペプチド類
もしくは蛋白質（或はそれらの修飾型、例えば以下に示
すもの）は、例えば、ブタクサアレルゲンに対するＢ細
胞応答、ブタクサアレルゲンに対するＴ細胞応答、或は
それらの両方の応答を修正させ得る。精製アレルゲンも
また、ブタクサアレルギーの免疫治療の機構を研究する
ため用いられ、そして修飾した誘導体、或は免疫治療に
おいて未修飾の（「天然に存在する」）ペプチド類より
も有益な類似物を設計するために用いられてもよい。
他の研究者達の研究によって、高い服用量のアレルゲ
ンが一般に最良の結果をもたらすことが示された（即
ち、最良の症状軽減）。しかしながら、数多くの人々
は、アレルゲンのアレルギー反応のため、多量のアレル
ゲン服用には耐えられない。天然に存在している相当す
るアレルゲンと同じか或は増強された治癒特性を有して
いるが減少した副作用（特にアナフィラキシー反応）を
有する修飾ペプチド類もしくは修飾アレルゲン類が生産
できるように、天然に存在しているアレルゲンの修飾を
設計することができる。これらは、例えば、本発明のペ
プチド（例えばクローンAmb a I A、クローンAmb a I
B、クローンAmb a I C、Amb a II、IPCクローン１、IPC
クローン５またはIPCクローン６のDNA挿入断片、或はそ
れらの全長cDNAから誘導されるペプチドのアミノ酸配列
の全てもしくは一部を有するペプチド）、或は修飾ペプ
チドまたはペプチド類似物（例えば免疫原性を修飾、お
よび／またはアレルゲン性を減少させるためにアミノ酸
配列を変化させてあるか、或は同様の目的のためある種
の成分が加えられているところのペプチド）であり得
る。例えば、Amb a Iペプチド類は、A.Sehonおよび共同
研究者のポリエチレングリコール方法を用いて修飾され
得る。
ンが一般に最良の結果をもたらすことが示された（即
ち、最良の症状軽減）。しかしながら、数多くの人々
は、アレルゲンのアレルギー反応のため、多量のアレル
ゲン服用には耐えられない。天然に存在している相当す
るアレルゲンと同じか或は増強された治癒特性を有して
いるが減少した副作用（特にアナフィラキシー反応）を
有する修飾ペプチド類もしくは修飾アレルゲン類が生産
できるように、天然に存在しているアレルゲンの修飾を
設計することができる。これらは、例えば、本発明のペ
プチド（例えばクローンAmb a I A、クローンAmb a I
B、クローンAmb a I C、Amb a II、IPCクローン１、IPC
クローン５またはIPCクローン６のDNA挿入断片、或はそ
れらの全長cDNAから誘導されるペプチドのアミノ酸配列
の全てもしくは一部を有するペプチド）、或は修飾ペプ
チドまたはペプチド類似物（例えば免疫原性を修飾、お
よび／またはアレルゲン性を減少させるためにアミノ酸
配列を変化させてあるか、或は同様の目的のためある種
の成分が加えられているところのペプチド）であり得
る。例えば、Amb a Iペプチド類は、A.Sehonおよび共同
研究者のポリエチレングリコール方法を用いて修飾され
得る。
脱感作すべき個人に対する本発明のペプチド類の投与
は公知の技術を用いて行われ得る。１つのペプチドもし
くは異なるペプチド類の組み合わせが、例えば適当な緩
衝液、担体および／またはアジュバントの入っている組
成物で、個人に投与され得る。上記組成物は、一般に、
注射、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与により
投与される。現在利用できる構造的情報を用いること
で、ブタクサに敏感な個人に対して充分な量で投与され
た時ブタクサアレルゲンに対する個人のアレルギー反応
を修正するところの、ブタクサ花粉ペプチドを設計する
ことが可能である。これは、例えば、ブタクサ蛋白質の
構造を検査し、ブタクサに敏感な個人中のＢ細胞および
／またはＴ細胞応答に影響を与えるそれらの能力を試験
するためのペプチドを作り出した後、この細胞によって
認識される適当なエピトープ類を選択することによって
行われる。このエピトープ類の配列を模擬しそしてブタ
クサアレルゲンに対するアレルギー反応を下方調整する
ことのできるところの、合成アミノ酸配列もまた使用で
きる。ブタクサアレルギーの検出および診断のために
も、本発明の蛋白質、ペプチド類または抗体が使用でき
る。例えば、ブタクサアレルゲンに対する敏感性を評価
すべき個人から得た血液もしくは血液生産物と、ブタク
サ花粉の単離アレルゲン性ペプチドとを、この血液中の
成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と該ペプチドとを
結合させそして上記結合が生じる度合を測定するに適当
な条件下で、一緒にすることによる。
は公知の技術を用いて行われ得る。１つのペプチドもし
くは異なるペプチド類の組み合わせが、例えば適当な緩
衝液、担体および／またはアジュバントの入っている組
成物で、個人に投与され得る。上記組成物は、一般に、
注射、経口投与、吸入、経皮投与または直腸投与により
投与される。現在利用できる構造的情報を用いること
で、ブタクサに敏感な個人に対して充分な量で投与され
た時ブタクサアレルゲンに対する個人のアレルギー反応
を修正するところの、ブタクサ花粉ペプチドを設計する
ことが可能である。これは、例えば、ブタクサ蛋白質の
構造を検査し、ブタクサに敏感な個人中のＢ細胞および
／またはＴ細胞応答に影響を与えるそれらの能力を試験
するためのペプチドを作り出した後、この細胞によって
認識される適当なエピトープ類を選択することによって
行われる。このエピトープ類の配列を模擬しそしてブタ
クサアレルゲンに対するアレルギー反応を下方調整する
ことのできるところの、合成アミノ酸配列もまた使用で
きる。ブタクサアレルギーの検出および診断のために
も、本発明の蛋白質、ペプチド類または抗体が使用でき
る。例えば、ブタクサアレルゲンに対する敏感性を評価
すべき個人から得た血液もしくは血液生産物と、ブタク
サ花粉の単離アレルゲン性ペプチドとを、この血液中の
成分（例えば抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と該ペプチドとを
結合させそして上記結合が生じる度合を測定するに適当
な条件下で、一緒にすることによる。
ここで、ブタクサに敏感な個人中のアレルギー反応を
誘発させるブタクサアレルゲンの能力を阻止するか或は
抑制することのできる薬剤もしくは薬を設計することも
可能である。上記薬剤は、例えば、それらが関係してい
る抗ブタクサIgEと結合し、従ってIgE−アレルゲン結合
そして次に起こるマスト細胞の脱顆粒を防止するよう
に、設計され得る。二者択一的に、上記薬剤は、免疫系
の細胞成分と結合し、結果としてブタクサアレルゲンに
対するアレルギー反応を抑制もしくは脱感作する。この
非制限的実施例では、ブタクサアレルゲンに対するアレ
ルギー反応を抑制するため、本発明のcDNA/蛋白質構造
を基とするところの、適当なＢ細胞およびＴ細胞エピト
ープペプチド、或はそれらの修飾物を使用する。これ
は、ブタクサに敏感な個人から得た血液細胞を用いたイ
ンビトロ実験でＢ細胞およびＴ細胞機能に影響を与える
ところの、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープペプチドの構
造を明らかにすることによって、行われ得る。
誘発させるブタクサアレルゲンの能力を阻止するか或は
抑制することのできる薬剤もしくは薬を設計することも
可能である。上記薬剤は、例えば、それらが関係してい
る抗ブタクサIgEと結合し、従ってIgE−アレルゲン結合
そして次に起こるマスト細胞の脱顆粒を防止するよう
に、設計され得る。二者択一的に、上記薬剤は、免疫系
の細胞成分と結合し、結果としてブタクサアレルゲンに
対するアレルギー反応を抑制もしくは脱感作する。この
非制限的実施例では、ブタクサアレルゲンに対するアレ
ルギー反応を抑制するため、本発明のcDNA/蛋白質構造
を基とするところの、適当なＢ細胞およびＴ細胞エピト
ープペプチド、或はそれらの修飾物を使用する。これ
は、ブタクサに敏感な個人から得た血液細胞を用いたイ
ンビトロ実験でＢ細胞およびＴ細胞機能に影響を与える
ところの、Ｂ細胞およびＴ細胞エピトープペプチドの構
造を明らかにすることによって、行われ得る。
ブタクサから得られるアレルゲン性蛋白質もしくはペ
プチドをコード化するcDNAは、遺伝子クローン化の如き
公知の技術を用いた追加的ペプチド類の製造に、用いら
れ得る。本発明の蛋白質もしくはペプチドの製造方法に
は、例えば、発現ベクター（これはまた、選択されたア
レルゲン性蛋白質もしくはペプチド（例えばAmb a I蛋
白質もしくはペプチド）の全てもしくは一部をコード化
するDNAを含有している）を含有している宿主細胞を培
養することが含まれる。DNA挿入断片の発現に適切な条
件下で細胞を培養する（コード化された蛋白質もしくは
ペプチドの製造）。次に、公知の技術を用いて、この発
現した生産物を回収する。二者択一的に、Amb a Iアレ
ルゲンまたはその一部は、公知の機構もしくは化学技術
を用いて合成され得る。ここで用いる言葉蛋白質もしく
はペプチドは、これらの技術のいずれかで製造された蛋
白質もしくはペプチド類を表している。また、この得ら
れるペプチド類は前述の如く使用され得る。
プチドをコード化するcDNAは、遺伝子クローン化の如き
公知の技術を用いた追加的ペプチド類の製造に、用いら
れ得る。本発明の蛋白質もしくはペプチドの製造方法に
は、例えば、発現ベクター（これはまた、選択されたア
レルゲン性蛋白質もしくはペプチド（例えばAmb a I蛋
白質もしくはペプチド）の全てもしくは一部をコード化
するDNAを含有している）を含有している宿主細胞を培
養することが含まれる。DNA挿入断片の発現に適切な条
件下で細胞を培養する（コード化された蛋白質もしくは
ペプチドの製造）。次に、公知の技術を用いて、この発
現した生産物を回収する。二者択一的に、Amb a Iアレ
ルゲンまたはその一部は、公知の機構もしくは化学技術
を用いて合成され得る。ここで用いる言葉蛋白質もしく
はペプチドは、これらの技術のいずれかで製造された蛋
白質もしくはペプチド類を表している。また、この得ら
れるペプチド類は前述の如く使用され得る。
本発明のいずれかの具体例中で用いるDNAは、ここに
記述したようにして得られるcDNAであるか、或は二者択
一的に、ここに示す配列（図２〜16参照）の全てもしく
は一部を有するいずれかのオリゴデオキシヌクレオチド
配列、或はそれらの機能的同等物であり得る。このよう
なオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知の技術を用
いて化学的もしくは機械的に製造され得る。オリゴヌク
レオチド配列を有する機能的同等物は、図２〜16の配列
（或は相当する配列部分）を雑種形成し、および／また
は、図２〜16の配列（或は相当する配列部分）によって
コード化された生産物の同様な機能特性を有する生産物
（例えば、ポリペプチドもしくはペプチド）をコード化
するところの、相補的オリゴヌクレオチド配列に対して
雑種形成し得る同等物である。機能的同等物がこの１つ
もしくは両方の判断基準に合致する必要があるか否かは
その使用に依存している（例えば、それをオリゴプロー
ブとしてのみ使用する必要がある場合、それは第一判断
基準のみに合致する必要があり、そしてAmb a Iアレル
ゲンを生産するために使用する場合は、第二判断基準に
のみ合致する必要がある）。
記述したようにして得られるcDNAであるか、或は二者択
一的に、ここに示す配列（図２〜16参照）の全てもしく
は一部を有するいずれかのオリゴデオキシヌクレオチド
配列、或はそれらの機能的同等物であり得る。このよう
なオリゴデオキシヌクレオチド配列は、公知の技術を用
いて化学的もしくは機械的に製造され得る。オリゴヌク
レオチド配列を有する機能的同等物は、図２〜16の配列
（或は相当する配列部分）を雑種形成し、および／また
は、図２〜16の配列（或は相当する配列部分）によって
コード化された生産物の同様な機能特性を有する生産物
（例えば、ポリペプチドもしくはペプチド）をコード化
するところの、相補的オリゴヌクレオチド配列に対して
雑種形成し得る同等物である。機能的同等物がこの１つ
もしくは両方の判断基準に合致する必要があるか否かは
その使用に依存している（例えば、それをオリゴプロー
ブとしてのみ使用する必要がある場合、それは第一判断
基準のみに合致する必要があり、そしてAmb a Iアレル
ゲンを生産するために使用する場合は、第二判断基準に
のみ合致する必要がある）。
Amb a Iペプチド類に対する抗体は、Amb a I族の特徴
を更に明確にするために使用できるところの、ブタクサ
アレルゲンの追加的成分を単離するために使用され得
る。更に、抗ペプチド血清、或はAmb a Iおよび／また
はAmb a IIに向かう単クローン抗体は、ブタクサ皮膚試
験試薬（RWST）の内容物を標準化しそして限定するため
に使用され得る。これには、アンブロシア・アルテミシ
イホリアＩ（Ambrosia artemisiifolia I.）から誘導さ
れるもの以外のRWSTが含まれる（例えばウエスタン、砂
漠、ジャイアントブタクサなど）。
を更に明確にするために使用できるところの、ブタクサ
アレルゲンの追加的成分を単離するために使用され得
る。更に、抗ペプチド血清、或はAmb a Iおよび／また
はAmb a IIに向かう単クローン抗体は、ブタクサ皮膚試
験試薬（RWST）の内容物を標準化しそして限定するため
に使用され得る。これには、アンブロシア・アルテミシ
イホリアＩ（Ambrosia artemisiifolia I.）から誘導さ
れるもの以外のRWSTが含まれる（例えばウエスタン、砂
漠、ジャイアントブタクサなど）。
構造に関する現在利用可能な情報（例えばDNA、蛋白
質／ペプチド配列）もまた、ブタクサアレルギー反応に
重要なＴ細胞エピトープペプチド類および／またはＢ細
胞エピトープペプチド類を同定もしくは限定し、そして
これらの反応が生じる介在物もしくは機構（例えばイン
ターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマイン
ターフェロン）を明らかにするために、用いられ得る。
この知識により、これらの反応を和らげるために用いら
れ得るペプチドを基としたブタクサ治療剤もしくは薬剤
を設計することも可能である。
質／ペプチド配列）もまた、ブタクサアレルギー反応に
重要なＴ細胞エピトープペプチド類および／またはＢ細
胞エピトープペプチド類を同定もしくは限定し、そして
これらの反応が生じる介在物もしくは機構（例えばイン
ターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマイン
ターフェロン）を明らかにするために、用いられ得る。
この知識により、これらの反応を和らげるために用いら
れ得るペプチドを基としたブタクサ治療剤もしくは薬剤
を設計することも可能である。
いかなる様式でも範囲を限定することを意図するもの
ではない以下の実施例により、ここに本発明を更に詳し
く説明する。
ではない以下の実施例により、ここに本発明を更に詳し
く説明する。
実施例１ オリゴヌクレオチドプローブを用いたλgt10
のcDNA収集のスクリーニング ベクターλgt10中のcDNA収集を構成させるため、プー
ルした短いブタクサ花頭から抽出したところの、PolyA+
が豊富なRNAを用いた。GulberおよびHoffmanの方法そし
てAmersham供給キットを用いて、cDNA収集を構成させ
た。Gulber,U.およびB.J.Hoffman、Gene、25:263（198
3）。約7x104個の組換え体を構成している1.4x105プラ
ークの収集を構成させた。この収集をプレートアウトさ
せた後、BentonおよびDavisの方法に従ってスクリーニ
ングした。Benton,W.D.およびR.W.Davis、Science、19
6:180（1977）。
のcDNA収集のスクリーニング ベクターλgt10中のcDNA収集を構成させるため、プー
ルした短いブタクサ花頭から抽出したところの、PolyA+
が豊富なRNAを用いた。GulberおよびHoffmanの方法そし
てAmersham供給キットを用いて、cDNA収集を構成させ
た。Gulber,U.およびB.J.Hoffman、Gene、25:263（198
3）。約7x104個の組換え体を構成している1.4x105プラ
ークの収集を構成させた。この収集をプレートアウトさ
せた後、BentonおよびDavisの方法に従ってスクリーニ
ングした。Benton,W.D.およびR.W.Davis、Science、19
6:180（1977）。
cDNA収集のスクリーニング： cDNA収集をスクリーニングするためのオリゴヌクレオ
チドプローブを推論するため、抗原Ｅから誘導されたと
考えられるアミノ酸配列（VWVKPWENFKK）を用いた。
チドプローブを推論するため、抗原Ｅから誘導されたと
考えられるアミノ酸配列（VWVKPWENFKK）を用いた。
AGE＃１オリゴプローブ このAGE＃１オリゴプローブは32pで末端標識した後、
以下に挙げる雑種形成条件（ストリンジエントなハイブ
リダイゼーシヨン条件）を用いて70,000の組換え体を試
験するために用いた： ６ ｘ SSC １ ｘ Denhardtの 30℃で22時間 50μg/mL大腸菌tRNA 10個の重複した信号が検出され、そしてこれらのクロー
ン体に、同じAGE＃１オリゴプローブを用いた第二スク
リーニングを受けさせた。結果として、正確なアミノ酸
配列はWENFKEであることが分かった。クローン化操作の
要約を以下に挙げる： 第一スクリーン:70,000プラーク 32P−AGE＃１オリゴプローブ 重複フィルター上に、10個の信号を有する数多くの斑点
が明らかに観察された。
以下に挙げる雑種形成条件（ストリンジエントなハイブ
リダイゼーシヨン条件）を用いて70,000の組換え体を試
験するために用いた： ６ ｘ SSC １ ｘ Denhardtの 30℃で22時間 50μg/mL大腸菌tRNA 10個の重複した信号が検出され、そしてこれらのクロー
ン体に、同じAGE＃１オリゴプローブを用いた第二スク
リーニングを受けさせた。結果として、正確なアミノ酸
配列はWENFKEであることが分かった。クローン化操作の
要約を以下に挙げる： 第一スクリーン:70,000プラーク 32P−AGE＃１オリゴプローブ 重複フィルター上に、10個の信号を有する数多くの斑点
が明らかに観察された。
第二スクリーニング： 10個の重複信号からのプラークを取り上げ、低密度で
プレートアウトさせた後、Clontechのカタログ中に概略
が示されている方法により再びスクリーニングした。
プレートアウトさせた後、Clontechのカタログ中に概略
が示されている方法により再びスクリーニングした。
第三スクリーン： ３つの第二陽性番号＃１、＃５および＃６が重複して
明らかに検出された。各々のクローン体を増殖させた
後、サザンブロット分析により陽性であることを確かめ
た。
明らかに検出された。各々のクローン体を増殖させた
後、サザンブロット分析により陽性であることを確かめ
た。
陽性クローン体の配列決定： 該クローン体の各々から得られるcDNA挿入断片を単離
した後、M1M3mp18中にクローン化させた。Sangerジデオ
キシ方法を用いて各々のクローン体を配列決定した後、
推論アミノ酸配列を測定した。Sanger,F.他、Proc.Nat
l.Acad.Sci.、USA、74:5463（1977）。
した後、M1M3mp18中にクローン化させた。Sangerジデオ
キシ方法を用いて各々のクローン体を配列決定した後、
推論アミノ酸配列を測定した。Sanger,F.他、Proc.Nat
l.Acad.Sci.、USA、74:5463（1977）。
WENFKKおよび周辺配列の同定： このcDNAクローン体のDNA配列を図５、６および７に
示す。このcDNAクローン体は全長ではなく、その長さは
500個のヌクレオチド未満である。このAGE＃１オリゴプ
ローブヌクレオチドの配列は図５、６および７中にアン
ダーラインで示してある。配列決定したcDNA中のオープ
ン読み取り構造物を検査し、図８、９および10中に示
す。AGE＃１オリゴプローブ配列を推論するために用い
たところの、翻訳したアミノ酸配列（WENFK）に、Ｎ末
端周辺配列（VWVKPWENFK;図８、９および10参照）と同
様にアンダーラインを引く。IPCクローン１および５に
関しては、10個の残基の中の１つのみ（即ち、Ｐの代わ
りにＬ）においてアミノ酸配列が一致していない。正確
な周辺配列（VWVKP）が存在していることにより、このc
DNAは花粉中の蛋白質をコード化していることが立証さ
れる。更に、EFPILGGITEVKDNDNSVDFC配列を有するとこ
ろの、PAE4で表示されるcDNA配列を基とする合成ペプチ
ドは、インビトロの増殖評価においてブタクサアレルギ
ー患者のＴ細胞を刺激する（表５および図８、９および
10の配列参照）。
示す。このcDNAクローン体は全長ではなく、その長さは
500個のヌクレオチド未満である。このAGE＃１オリゴプ
ローブヌクレオチドの配列は図５、６および７中にアン
ダーラインで示してある。配列決定したcDNA中のオープ
ン読み取り構造物を検査し、図８、９および10中に示
す。AGE＃１オリゴプローブ配列を推論するために用い
たところの、翻訳したアミノ酸配列（WENFK）に、Ｎ末
端周辺配列（VWVKPWENFK;図８、９および10参照）と同
様にアンダーラインを引く。IPCクローン１および５に
関しては、10個の残基の中の１つのみ（即ち、Ｐの代わ
りにＬ）においてアミノ酸配列が一致していない。正確
な周辺配列（VWVKP）が存在していることにより、このc
DNAは花粉中の蛋白質をコード化していることが立証さ
れる。更に、EFPILGGITEVKDNDNSVDFC配列を有するとこ
ろの、PAE4で表示されるcDNA配列を基とする合成ペプチ
ドは、インビトロの増殖評価においてブタクサアレルギ
ー患者のＴ細胞を刺激する（表５および図８、９および
10の配列参照）。
実施例２ 全長cDNAを得るために用いたクロス雑種形成
方法 抗原Ｅは分子量が約38,000の蛋白質であると報告され
ており、従ってこの蛋白質をコード化する全長cDNAの長
さは少なくとも1.1Kbである必要がある（King,T.P.他、
Arch.Biochem.Biophys.、212:127（1981））。従って、
IPCクローン体１、５および６、並びにUNCクローン１、
６および15（それぞれAmb a I A、I BおよびI Cで表示
されている）は全長ではない。
方法 抗原Ｅは分子量が約38,000の蛋白質であると報告され
ており、従ってこの蛋白質をコード化する全長cDNAの長
さは少なくとも1.1Kbである必要がある（King,T.P.他、
Arch.Biochem.Biophys.、212:127（1981））。従って、
IPCクローン体１、５および６、並びにUNCクローン１、
６および15（それぞれAmb a I A、I BおよびI Cで表示
されている）は全長ではない。
全長クローン体を単離する目的で、ニック翻訳された
32P標識のAmb a I cDNAプローブをブタクサ花頭λgt10
（実施例１参照）および標準方法使用ブタクサ花粉λgt
11収集のスクリーニング用として使用した（Maniatis
他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laborato
ry、（1982））。この方法を用いて、Amb a I B（図12
および16）およびAmb a I C（図13および16）をコード
化するところの、全長もしくは全長に近いcDNAを単離し
た（図1B）。約145個のアミノ酸（アミノ酸253〜398;図
15）のオープン読み取り構造物を有するところの、１つ
のクロス雑種形成用cDNAクローン体（K6−５と呼ぶ）
が、先に単離されたAmb a I A、Amb a I B、Amb a I C
およびAmb a I Dから著しく分枝していることを見い出
し、そしてこれは、通常に精製した抗原Ｋ（T.P.King、
New Yorkから贈与）から誘導されたペプチド配列に対し
て完全な一致を示していた（表２）。その結果、この部
分的cDNAをAmb a IIで表示した（図15および以下を参
照）。
32P標識のAmb a I cDNAプローブをブタクサ花頭λgt10
（実施例１参照）および標準方法使用ブタクサ花粉λgt
11収集のスクリーニング用として使用した（Maniatis
他、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laborato
ry、（1982））。この方法を用いて、Amb a I B（図12
および16）およびAmb a I C（図13および16）をコード
化するところの、全長もしくは全長に近いcDNAを単離し
た（図1B）。約145個のアミノ酸（アミノ酸253〜398;図
15）のオープン読み取り構造物を有するところの、１つ
のクロス雑種形成用cDNAクローン体（K6−５と呼ぶ）
が、先に単離されたAmb a I A、Amb a I B、Amb a I C
およびAmb a I Dから著しく分枝していることを見い出
し、そしてこれは、通常に精製した抗原Ｋ（T.P.King、
New Yorkから贈与）から誘導されたペプチド配列に対し
て完全な一致を示していた（表２）。その結果、この部
分的cDNAをAmb a IIで表示した（図15および以下を参
照）。
実施例３ 全長cDNAを得るために用いたポリメラーゼ連
鎖反応（PCR）方法 レア・メッセージ（rare message）cDNA並びに公知の
配列を有するゲノム状クローン体の両方を単離するため
PCR方法が成功裏に使用できる（Mullis他、Cold Spring
Harbor Symposium Quant.Biol.、51:263−273（198
6））。５′および３′オリゴヌクレオチドプライマー
を合成し、そしてこれらを、鋳型として働くブタクサ花
粉cDNA使用PCR実験で用いた。この５′プライマーは、A
mb a I B（図12）およびAmb a I C（図13）のＮ末端保
護領域から推論した。該３′プライマーは、cDNAの３′
末端の、Amb a I Aに特異な（UNCクローン１、Amb a I
Aで表示、図２）およびAmb a IIに特異な（クローンK6
−５、図15の部分的３′配列）非コード化ストランド配
列から推論した。PCRクローンAmb a I Dに対して用いた
３番目の３′プライマーは、Amb a I A、ＢおよびＣの
Ｃ末端の保護領域から誘導した（GAPC.末端に相当する
アミノ酸395〜398）。増幅させるために用いたオリゴヌ
クレオチドプライマーおよびクローン体Amb a I A、Amb
a I DおよびAmb a IIのcDNAを以下に挙げる： 全長Amb a I AおよびAmb a IIを製造するために用い
たＮ末端プライマー（アミノ酸10〜15） 端を切り取ったAmb a I AおよびAmb a IIを製造するた
めに用いたＮ末端プライマー（アミノ酸70〜75） 全長および端を切り取ったAmb a I Aを製造するために
用いたＣ末端プライマー（TAA終止コドンの非コード化
ストランド３′の12〜29ヌクレオチド；図２参照）。
鎖反応（PCR）方法 レア・メッセージ（rare message）cDNA並びに公知の
配列を有するゲノム状クローン体の両方を単離するため
PCR方法が成功裏に使用できる（Mullis他、Cold Spring
Harbor Symposium Quant.Biol.、51:263−273（198
6））。５′および３′オリゴヌクレオチドプライマー
を合成し、そしてこれらを、鋳型として働くブタクサ花
粉cDNA使用PCR実験で用いた。この５′プライマーは、A
mb a I B（図12）およびAmb a I C（図13）のＮ末端保
護領域から推論した。該３′プライマーは、cDNAの３′
末端の、Amb a I Aに特異な（UNCクローン１、Amb a I
Aで表示、図２）およびAmb a IIに特異な（クローンK6
−５、図15の部分的３′配列）非コード化ストランド配
列から推論した。PCRクローンAmb a I Dに対して用いた
３番目の３′プライマーは、Amb a I A、ＢおよびＣの
Ｃ末端の保護領域から誘導した（GAPC.末端に相当する
アミノ酸395〜398）。増幅させるために用いたオリゴヌ
クレオチドプライマーおよびクローン体Amb a I A、Amb
a I DおよびAmb a IIのcDNAを以下に挙げる： 全長Amb a I AおよびAmb a IIを製造するために用い
たＮ末端プライマー（アミノ酸10〜15） 端を切り取ったAmb a I AおよびAmb a IIを製造するた
めに用いたＮ末端プライマー（アミノ酸70〜75） 全長および端を切り取ったAmb a I Aを製造するために
用いたＣ末端プライマー（TAA終止コドンの非コード化
ストランド３′の12〜29ヌクレオチド；図２参照）。
全長Amb a I Dを製造するために用いたＣ末端プライマ
ー（Ｃ末端が保護されたGAPCコード化領域に相当）。こ
のプライマーは非コード化ストランドであり、そしてこ
れには、終止コドンおよび人工的に導入したPst Iクロ
ーン化部位が含まれる（図15参照）。
ー（Ｃ末端が保護されたGAPCコード化領域に相当）。こ
のプライマーは非コード化ストランドであり、そしてこ
れには、終止コドンおよび人工的に導入したPst Iクロ
ーン化部位が含まれる（図15参照）。
全長および端を切り取ったAmb a IIを製造するために
用いたＣ末端プライマー（TAA終止コドンの非コード化
ストランド３′の44〜76ヌクレオチド；図15参照）。
用いたＣ末端プライマー（TAA終止コドンの非コード化
ストランド３′の44〜76ヌクレオチド；図15参照）。
プライマーとしてpoly dTを用いそしてcDNA合成シス
テムとキット（Amersham）を用いて、第１ストランドcD
NAを１μｇのRNAから合成した。この単一ストランド化
したcDNAを、GeneAmpキット（US Biochemicals、Clevel
and、OH）中に推奨されている方法に従うプライマーの
組（IG38とIG32;IG33とIG32;IG38とIG49;IG38とAgK2;IG
33とAgK2）を用いて、増幅させた。このサンプルを、プ
ログラム可能な熱調整装置で増幅させ、この最初５回の
増幅は94度で30秒間の変性から成り、鋳型に対してプラ
イマーを45度で１分30秒アニールし、そして70度で４分
間鎖伸長を行う。最終20回の増幅は上と同じ変性から成
り、55度で１分30秒アニールした後、上と同じに伸長を
行う。このPCRは、分析用ゲル上に、推論された大きさ
に相当する帯を生じさせ、そしてDNA配列決定は、このc
DNAが、全長および端が切り取られたAmb a I AおよびAm
b a II（それぞれ図11および15）並びに全長Amb a I D
（図14）に相当していることを立証した。
テムとキット（Amersham）を用いて、第１ストランドcD
NAを１μｇのRNAから合成した。この単一ストランド化
したcDNAを、GeneAmpキット（US Biochemicals、Clevel
and、OH）中に推奨されている方法に従うプライマーの
組（IG38とIG32;IG33とIG32;IG38とIG49;IG38とAgK2;IG
33とAgK2）を用いて、増幅させた。このサンプルを、プ
ログラム可能な熱調整装置で増幅させ、この最初５回の
増幅は94度で30秒間の変性から成り、鋳型に対してプラ
イマーを45度で１分30秒アニールし、そして70度で４分
間鎖伸長を行う。最終20回の増幅は上と同じ変性から成
り、55度で１分30秒アニールした後、上と同じに伸長を
行う。このPCRは、分析用ゲル上に、推論された大きさ
に相当する帯を生じさせ、そしてDNA配列決定は、このc
DNAが、全長および端が切り取られたAmb a I AおよびAm
b a II（それぞれ図11および15）並びに全長Amb a I D
（図14）に相当していることを立証した。
図11〜15中に示すほぼ全長のcDNAは、その第一ヌクレ
オチドを番号１と表示して番号付けをしたところのヌク
レオチド配列を有している。いくつかのcDNAは、恐らく
はＮ末端のメチオニンと思われる部分で開始しているが
（Amb a I B、図12;Amb a I C、図13）、あるものはそ
うでない（Amb a I A、図11;Amb a I D、図14;Amb a I
I、図15）。このように、これらのcDNAは異なる長さを
有しているため、それらのヌクレオチド番号は必ずしも
１つの配列ともう１つの配列とが一致しているとは限ら
ない。cDNA配列からアミノ酸配列を推論するため万国共
通の遺伝コードを用い、クローン体同士の完全アミノ酸
配列比較を図16に示す。図16において、アミノ酸は、Am
b a I B配列の可能なＮ末端メチオニン（番号１で表
示）から連続的に番号付けする。
オチドを番号１と表示して番号付けをしたところのヌク
レオチド配列を有している。いくつかのcDNAは、恐らく
はＮ末端のメチオニンと思われる部分で開始しているが
（Amb a I B、図12;Amb a I C、図13）、あるものはそ
うでない（Amb a I A、図11;Amb a I D、図14;Amb a I
I、図15）。このように、これらのcDNAは異なる長さを
有しているため、それらのヌクレオチド番号は必ずしも
１つの配列ともう１つの配列とが一致しているとは限ら
ない。cDNA配列からアミノ酸配列を推論するため万国共
通の遺伝コードを用い、クローン体同士の完全アミノ酸
配列比較を図16に示す。図16において、アミノ酸は、Am
b a I B配列の可能なＮ末端メチオニン（番号１で表
示）から連続的に番号付けする。
実施例４ ブタクサ蛋白質およびペプチド類に対するＴ
細胞応答 末梢血液の単核細胞（PBMC）を、ブタクサアレルギー
の患者から得た60mLのヘパリン化した血液から精製し
た。次に、PBMCを以下の如く処理したが、個々の場合と
して、刺激のために用いたIL−２およびIL−４そして特
異性を示すブタクサ蛋白質およびペプチドを用い、培養
時間を変化させた。例として、106/mLで患者222PBMCの1
0mLを、プールした５％のヒトAB血清を補充した1mLのRP
MI−1640当たり20ミクログラムのブタクサ花粉水抽出物
存在下、37℃で７日間培養した。Ficoll−Hypaque遠心
分離機で生細胞を精製した後、1mL当たり５単位の組換
えヒトIL−２および1mL当たり５単位の組換えヒト1L−
４で３週間培養した。その後、３日間Ｘ線照射した（35
00RADS）自系のPBMC（5x105/mL）存在下、試験用Ｔ細胞
を、2x105個Ｔ細胞/mLの密度で、1mL当たり20ミクログ
ラムのブタクサ花粉水抽出物を用いて再び刺激（第二）
し、Ficoll−Hypaque遠心分離機で精製した後、２週
間、５単位のIL−2/mLおよび５単位のIL−4/mL中で増殖
させた。評価に関して、96個のウエルを有する丸底評価
プレート中、200ミクロリットルの容積で３日間、種々
の濃度のアレルゲンもしくはそれらのフラグメントを用
いて、2x104個の静止第二Ｔ細胞を、5x104個のＸ線照射
した（3500RADS）自系PBMCまたは2x104個の自系のEpste
in−Barrウイルスで形質転換したＢ細胞（20,000RADS）
の存在下、再び刺激（第三）した。次に、各々のウエル
に16時間１ミクロキューリーのトリチル化した（メチ
ル）チミジンを入れた。計数用を一緒にしてガラス繊維
フィルター上に採取した後、液体シンチレーション計数
のために処理した。図21は代表的な定量結果を示してお
り、これは、ブタクサ花粉蛋白質に対するＴ細胞培養物
の反応性および特異性を示している。使用した抗原は、
IPC花粉水抽出物（花粉）、Hollister−Stierブタクサ
皮膚試験抽出物（RWST）、ALKネコ上皮皮膚試験抽出物
（CST）、アフィニティー4B5/B7抗体精製した（透析し
た）Amb a I（B7）およびクロマトグラフィー精製したA
mb a I（Amb a I）である。媒体のみの対照区は、記号
なしで線として示す。二者択一的にPBMCを、時には単
に、20ミクログラムの花粉水抽出物を用いた７日間の第
二分析（第三評価用として上に概略を示した）に従わ
せ、そして続いて、２〜３週間、５単位のIL−2/mLおよ
び５単位のIL−4/mLで培養した。１人のブタクサアレル
ギー患者のＴ細胞は、第二評価で、花粉抽出物、RWST、
B7またはAmb a Iに反応したが、CSTもしくは媒体のみに
は反応しなかった（図21）。１つのパネルのブタクサア
レルギー患者の第二および第三評価を、種々のブタクサ
花粉蛋白質の配列から誘導される合成ペプチド類を用い
て行った。いくつかの実験結果を表５に示す。３つの異
なるAmb a IのcDNAの配列から誘導されるところの３種
のペプチド（RAE16.6、RAE45.15、RAE24.E）は、その患
者のＴ細胞のいずれをも刺激できなかった。同じ３種の
cDNAの配列から誘導された他の４種のペプチド（RAE15.
6、RAE3.D、RAE28.1、RAE26.15）は、その患者のＴ細胞
の35〜58％を刺激することができた。IPCクローン５のc
DNAから誘導されるところの１つのペプチド（RAE4）も
またその患者のＴ細胞の25％を刺激することができた。
これらの結果は、ブタクサ花粉蛋白質をコード化する上
記cDNAと一致している。それらは更に、ブタクサアレル
ギー患者から得られたＴ細胞中の応答を刺激する、ペプ
チド状フラグメントと刺激しない他のものとを同定する
ための、Amb a I/II族（類）の蛋白質構造の知識により
得られる機会を示している。この方法により、ブタクサ
アレルギー治療および診断における使用のための新規
な、治療および診断上の本質を同定することが可能とな
る。 表５ ブタクサペプチド類に対するヒトのブタクサアレルギーＴ細胞応答 ペプチドの名称ｂ 基となる配列 試験患者番号 陽性の数 陽性の％ RAE16.6 Amb a I B ７ ０ ０ RAE45.15 Amb a I C ２ ０ ０ RAE24.E Amb a I A ９ ０ ０ RAE4 クローン＃５ 28 ７ 25 RAE15.6 Amb a I B 20 ７ 35 RAE3.D Amb a I A 35 13 37 RAE28.1 Amb a I A 33 17 52 RAE26.15 Amb a I C 24 14 58 ａ 応答は、ブタクサ花粉に特異性を示すＴ細胞のＴ細胞
増殖応答が培地対照区よりも２倍大きくなったとき、陽
性として記録した。ｂ 名前を付けたペプチドの配列は下記の通りである： 実施例５ 組換えアフィニティー精製Amb a Iと結合す
る抗体、並びに花粉抽出物誘導Amb a IおよびAmb a II アフィニティー精製したAmb a Iを電気泳動にかけ、
ウエスタン転移させた（Towbin他、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、76:4350（1979））後、アレルギー患者から得た
IgEを含む種々の抗体で試験した（図17）。花粉抽出物
において、Amb a Iは、損傷を受けていない38−KD種と
して存在しているのみでなく、酵素開裂によって生じる
ところの、その成分26−KDアルファ鎖および12−KDベー
タ鎖によって、特徴づけられる。この損傷を受けていな
い38−KD種および該アルファ鎖は、ラビットの抗Amb a
I、多クローンアフィニティー精製した抗RAE16および単
クローン抗Amb a I JBIE3−４を用いて、明らかに検出
される（図17;RAE16ペプチドは、Amb a I Bのアミノ酸3
42〜353から誘導される配列RTDKDLLENGAICを有してい
る）。アフィニティー精製したAmb a I（表１に部分的
配列が示されている）並びにクロマトグラフィー精製し
たAmb a II（表２に部分的配列が示されている）は、こ
れらの抗体並びに患者のIgEと、ウエスタンブロットで
結合する（図17）。ヤギの抗Amb a I多クローン抗体も
また、花粉抽出物の二次ウエスタンブロットで、多重Am
b a IおよびAmb a II種と結合する（図18）。このウエ
スタンブロットは以下に概略を示すようにして行った。
細胞応答 末梢血液の単核細胞（PBMC）を、ブタクサアレルギー
の患者から得た60mLのヘパリン化した血液から精製し
た。次に、PBMCを以下の如く処理したが、個々の場合と
して、刺激のために用いたIL−２およびIL−４そして特
異性を示すブタクサ蛋白質およびペプチドを用い、培養
時間を変化させた。例として、106/mLで患者222PBMCの1
0mLを、プールした５％のヒトAB血清を補充した1mLのRP
MI−1640当たり20ミクログラムのブタクサ花粉水抽出物
存在下、37℃で７日間培養した。Ficoll−Hypaque遠心
分離機で生細胞を精製した後、1mL当たり５単位の組換
えヒトIL−２および1mL当たり５単位の組換えヒト1L−
４で３週間培養した。その後、３日間Ｘ線照射した（35
00RADS）自系のPBMC（5x105/mL）存在下、試験用Ｔ細胞
を、2x105個Ｔ細胞/mLの密度で、1mL当たり20ミクログ
ラムのブタクサ花粉水抽出物を用いて再び刺激（第二）
し、Ficoll−Hypaque遠心分離機で精製した後、２週
間、５単位のIL−2/mLおよび５単位のIL−4/mL中で増殖
させた。評価に関して、96個のウエルを有する丸底評価
プレート中、200ミクロリットルの容積で３日間、種々
の濃度のアレルゲンもしくはそれらのフラグメントを用
いて、2x104個の静止第二Ｔ細胞を、5x104個のＸ線照射
した（3500RADS）自系PBMCまたは2x104個の自系のEpste
in−Barrウイルスで形質転換したＢ細胞（20,000RADS）
の存在下、再び刺激（第三）した。次に、各々のウエル
に16時間１ミクロキューリーのトリチル化した（メチ
ル）チミジンを入れた。計数用を一緒にしてガラス繊維
フィルター上に採取した後、液体シンチレーション計数
のために処理した。図21は代表的な定量結果を示してお
り、これは、ブタクサ花粉蛋白質に対するＴ細胞培養物
の反応性および特異性を示している。使用した抗原は、
IPC花粉水抽出物（花粉）、Hollister−Stierブタクサ
皮膚試験抽出物（RWST）、ALKネコ上皮皮膚試験抽出物
（CST）、アフィニティー4B5/B7抗体精製した（透析し
た）Amb a I（B7）およびクロマトグラフィー精製したA
mb a I（Amb a I）である。媒体のみの対照区は、記号
なしで線として示す。二者択一的にPBMCを、時には単
に、20ミクログラムの花粉水抽出物を用いた７日間の第
二分析（第三評価用として上に概略を示した）に従わ
せ、そして続いて、２〜３週間、５単位のIL−2/mLおよ
び５単位のIL−4/mLで培養した。１人のブタクサアレル
ギー患者のＴ細胞は、第二評価で、花粉抽出物、RWST、
B7またはAmb a Iに反応したが、CSTもしくは媒体のみに
は反応しなかった（図21）。１つのパネルのブタクサア
レルギー患者の第二および第三評価を、種々のブタクサ
花粉蛋白質の配列から誘導される合成ペプチド類を用い
て行った。いくつかの実験結果を表５に示す。３つの異
なるAmb a IのcDNAの配列から誘導されるところの３種
のペプチド（RAE16.6、RAE45.15、RAE24.E）は、その患
者のＴ細胞のいずれをも刺激できなかった。同じ３種の
cDNAの配列から誘導された他の４種のペプチド（RAE15.
6、RAE3.D、RAE28.1、RAE26.15）は、その患者のＴ細胞
の35〜58％を刺激することができた。IPCクローン５のc
DNAから誘導されるところの１つのペプチド（RAE4）も
またその患者のＴ細胞の25％を刺激することができた。
これらの結果は、ブタクサ花粉蛋白質をコード化する上
記cDNAと一致している。それらは更に、ブタクサアレル
ギー患者から得られたＴ細胞中の応答を刺激する、ペプ
チド状フラグメントと刺激しない他のものとを同定する
ための、Amb a I/II族（類）の蛋白質構造の知識により
得られる機会を示している。この方法により、ブタクサ
アレルギー治療および診断における使用のための新規
な、治療および診断上の本質を同定することが可能とな
る。 表５ ブタクサペプチド類に対するヒトのブタクサアレルギーＴ細胞応答 ペプチドの名称ｂ 基となる配列 試験患者番号 陽性の数 陽性の％ RAE16.6 Amb a I B ７ ０ ０ RAE45.15 Amb a I C ２ ０ ０ RAE24.E Amb a I A ９ ０ ０ RAE4 クローン＃５ 28 ７ 25 RAE15.6 Amb a I B 20 ７ 35 RAE3.D Amb a I A 35 13 37 RAE28.1 Amb a I A 33 17 52 RAE26.15 Amb a I C 24 14 58 ａ 応答は、ブタクサ花粉に特異性を示すＴ細胞のＴ細胞
増殖応答が培地対照区よりも２倍大きくなったとき、陽
性として記録した。ｂ 名前を付けたペプチドの配列は下記の通りである： 実施例５ 組換えアフィニティー精製Amb a Iと結合す
る抗体、並びに花粉抽出物誘導Amb a IおよびAmb a II アフィニティー精製したAmb a Iを電気泳動にかけ、
ウエスタン転移させた（Towbin他、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA、76:4350（1979））後、アレルギー患者から得た
IgEを含む種々の抗体で試験した（図17）。花粉抽出物
において、Amb a Iは、損傷を受けていない38−KD種と
して存在しているのみでなく、酵素開裂によって生じる
ところの、その成分26−KDアルファ鎖および12−KDベー
タ鎖によって、特徴づけられる。この損傷を受けていな
い38−KD種および該アルファ鎖は、ラビットの抗Amb a
I、多クローンアフィニティー精製した抗RAE16および単
クローン抗Amb a I JBIE3−４を用いて、明らかに検出
される（図17;RAE16ペプチドは、Amb a I Bのアミノ酸3
42〜353から誘導される配列RTDKDLLENGAICを有してい
る）。アフィニティー精製したAmb a I（表１に部分的
配列が示されている）並びにクロマトグラフィー精製し
たAmb a II（表２に部分的配列が示されている）は、こ
れらの抗体並びに患者のIgEと、ウエスタンブロットで
結合する（図17）。ヤギの抗Amb a I多クローン抗体も
また、花粉抽出物の二次ウエスタンブロットで、多重Am
b a IおよびAmb a II種と結合する（図18）。このウエ
スタンブロットは以下に概略を示すようにして行った。
15μｇの粗可溶花粉蛋白質を用い、Hoefferゲル装置
上で等電点電気泳動を行った。このゲルは、3.5％のPha
rmalytes pH4.5〜5.3（Pharmacia）および3.5％のAmpho
lines pH3.5〜10（LKB）と一緒に7.5％のアクリルアミ
ドから成っており、一定電圧に到達するまで3.5時間13W
で流した。このゲル部分を、10％のアクリルアミドSDS
−PAEGのスラブ上に置き、引用されているプロトコルに
従って40mAで3.5時間電気泳動させた。この蛋白質を、
0.2Aでホスフェート緩衝液中0.1ミクロンのニトロセル
ロース（SchleicherおよびSchuell）に、一晩移動させ
た。このブロットを、このブロット溶液（25mMのトリス
−HCl pH7.5、0.171MのNaCl、0.05％のTween−20;Sigm
a）中ですすいだ。ブロット溶液中のヤギ抗Amb a I IgG
（David Marsh博士から入手）の1:000希釈を用いて室温
で一晩、第一抗体培養を行った。ブロット溶液で15分間
３回すすぐことによって、過剰の第一抗体を除去した。
第二抗体に関しては、ブロット溶液中のビオチン化した
ブタの抗ヤギIgG（Boehringer−Manneheim）の1:2,500
希釈液を用いて２時間培養した。次に、このブロット
を、ブロット溶液で15分間３回すすいだ後、２μCiのI
125ストレプトアビジン（Amersham）含有ブロット溶液
中で１時間培養した。洗浄廃液が背景レベルに低下する
まで、このブロットをブロット溶液ですすいだ。その
後、このブロットを−80℃で一晩フィルムに暴露した。
一次SDS−PAGEウエスタンブロットの場合（図17、19お
よび20）、等電点電気泳動段階は削除した。このウエス
タンブロットを試験するためヒトの血清を用いた場合
（図17および20）、ブロット溶液中の１％ミルク中10％
のヒトの血漿を、第二抗体ビオチン化したヤギの抗ヒト
IgEとしての使用に先立って一晩、該ブロットと一緒に
培養した。
上で等電点電気泳動を行った。このゲルは、3.5％のPha
rmalytes pH4.5〜5.3（Pharmacia）および3.5％のAmpho
lines pH3.5〜10（LKB）と一緒に7.5％のアクリルアミ
ドから成っており、一定電圧に到達するまで3.5時間13W
で流した。このゲル部分を、10％のアクリルアミドSDS
−PAEGのスラブ上に置き、引用されているプロトコルに
従って40mAで3.5時間電気泳動させた。この蛋白質を、
0.2Aでホスフェート緩衝液中0.1ミクロンのニトロセル
ロース（SchleicherおよびSchuell）に、一晩移動させ
た。このブロットを、このブロット溶液（25mMのトリス
−HCl pH7.5、0.171MのNaCl、0.05％のTween−20;Sigm
a）中ですすいだ。ブロット溶液中のヤギ抗Amb a I IgG
（David Marsh博士から入手）の1:000希釈を用いて室温
で一晩、第一抗体培養を行った。ブロット溶液で15分間
３回すすぐことによって、過剰の第一抗体を除去した。
第二抗体に関しては、ブロット溶液中のビオチン化した
ブタの抗ヤギIgG（Boehringer−Manneheim）の1:2,500
希釈液を用いて２時間培養した。次に、このブロット
を、ブロット溶液で15分間３回すすいだ後、２μCiのI
125ストレプトアビジン（Amersham）含有ブロット溶液
中で１時間培養した。洗浄廃液が背景レベルに低下する
まで、このブロットをブロット溶液ですすいだ。その
後、このブロットを−80℃で一晩フィルムに暴露した。
一次SDS−PAGEウエスタンブロットの場合（図17、19お
よび20）、等電点電気泳動段階は削除した。このウエス
タンブロットを試験するためヒトの血清を用いた場合
（図17および20）、ブロット溶液中の１％ミルク中10％
のヒトの血漿を、第二抗体ビオチン化したヤギの抗ヒト
IgEとしての使用に先立って一晩、該ブロットと一緒に
培養した。
同等物 常規以下の実験を用いることで、本分野の技術者は、
詳細に本文中に記述した本発明の特定の具体例に対する
数多くの類似物を認識するか或は確かめることができる
であろう。このような同等物は、以下に示す請求の範囲
内に包含されることを意図している。
詳細に本文中に記述した本発明の特定の具体例に対する
数多くの類似物を認識するか或は確かめることができる
であろう。このような同等物は、以下に示す請求の範囲
内に包含されることを意図している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/08 Ｃ０７Ｋ 16/16 14/415 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/16 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 21/08 Ｑ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ロジヤーズ，ブルース アメリカ合衆国マサチユセツツ州02138 ケンブリツジ・ナンバー４・オツクスフ オードストリート64 (72)発明者 クラツパー，デビツド・ジー アメリカ合衆国ノースカロライナ州 27514 チヤペルヒル・シヤロンロード 501 (72)発明者 ラフナー，ソラン アメリカ合衆国ノースカロライナ州 27514 チヤペルヒル・ボリンウツドド ライブ （番地なし) (72)発明者 クオ，メイ―チヤン アメリカ合衆国マサチユセツツ州01890 ウインチエスター・コツクスロード５ (56)参考文献 米国特許4338297（ＵＳ，Ａ) Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．25［４］（1988）ｐ. 355−365 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏ ｌ．26（1987）ｐ．230−236 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．22［８］（1985）ｐ. 899−906
Claims (20)
- 【請求項１】ブタクサに敏感な個体におけるＢ細胞およ
び／またはＴ細胞の応答に影響を及ぼしうる単離された
蛋白質またはペプチドであって、 （ａ） Amb ａ Ｉ族の他の構成員を含まず、そして
下記図式11に示される配列におけるアミノ酸配列（一文
字記号による）からなるAmb ａ I A、または図式11に
示されるアミノ酸配列の少なくとも一部分であって、Ｔ
細胞エピトープもしくはＢ細胞エピトープを包含する部
分、 （ｂ） Amb ａ Ｉ族の他の構成員を含まず、そして
下記図式12に示されるアミノ酸配列（一文字記号によ
る）からなるAmb ａ I B、または図式12に示されるア
ミノ酸配列の少なくとも一部分であって、Ｔ細胞エピト
ープもしくはＢ細胞エピトープを包含する部分、 （ｃ） Amb ａ Ｉ族の他の構成員を含まず、そして
下記図式13に示されるアミノ酸配列（一文字記号によ
る）からなるAmb ａ I C、または図式13に示されるア
ミノ酸配列の少なくとも一部分であって、Ｔ細胞エピト
ープもしくはＢ細胞エピトープを包含する部分、 （ｄ） Amb ａ Ｉ族の他の構成員を含まず、そして
下記図式14に示されるアミノ酸配列（一文字記号によ
る）からなるAmb ａ I D、または図式14に示されるア
ミノ酸配列の少なくとも一部分であって、Ｔ細胞エピト
ープもしくはＢ細胞エピトープを包含する部分 から選ばれる蛋白質またはペプチド。 図式11: - 【請求項２】（ａ） 蛋白質またはペプチドが請求項１
で言及した図式11に示されたAmb ａ I Aであるか、あ
るいは （ｂ） 蛋白質またはペプチドが請求項１で言及した図
式12に示されたAmb ａ I Bであるか、あるいは （ｃ） 蛋白質またはペプチドが請求項１で言及した図
式13に示されたAmb ａ I Cであるか、あるいは （ｄ） 蛋白質またはペプチドが請求項１で言及した図
式14に示されたAmb ａ I Dであるか、あるいは （ｅ） 蛋白質またはペプチドが上記（ａ）〜（ｄ）の
いずれかの蛋白質またはペプチドのアミノ酸配列中に少
なくとも１つの多型性が組み入れられ、かつ上記（ａ）
〜（ｄ）のいずれかの蛋白質またはペプチドをコードす
るヌクレオチドにストリンジエントな条件下でハイブリ
ダイズするヌクレオチド配列からなる核酸によりコード
されたものである、請求項１記載の蛋白質またはペプチ
ド。 - 【請求項３】蛋白質またはペプチドが、 から選ばれるアミノ酸配列からなる請求項１または２記
載の蛋白質またはペプチド。 - 【請求項４】蛋白質またはペプチドが、短茎ブタクサ、
ジャイアントブタクサまたはウェスターンブタクサに由
来する請求項１記載の蛋白質またはペプチド。 - 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質ま
たはペプチドの１種以上からなるブタクサに敏感な個体
におけるＢ細胞および／またはＴ細胞の応答を増強また
は低減するための組成物。 - 【請求項６】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質ま
たはペプチドの１種または２種以上の組み合わせからな
るブタクサアレルギーの診断用組成物。 - 【請求項７】（ａ） 請求項１で言及した図式11、12、
13または14に示されるDNA配列とストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするブタクサアレルゲンをコード
するDNA配列を同定する工程、 （ｂ） 工程（ａ）で同定されたDNAを発現ベクターに
挿入する工程、 （ｃ） 工程（ｂ）で得られた発現ベクターを宿主細胞
に挿入する工程、 （ｄ） 工程（ｂ）で挿入されたDNAの発現に適する条
件下で、工程（ｃ）で得られた宿主細胞を培養する工
程、および （ｅ） 発現産物を回収する工程、 を含んでなるブタクサの蛋白質またはペプチドアレルゲ
ンの生産方法。 - 【請求項８】工程（ａ）で同定されたDNA配列が請求項
１で言及した図式11、12、13または14に示されるDNA配
列と40％を超える相同性を有する請求項７記載の方法。 - 【請求項９】請求項７または８に記載の方法によって生
産されたブタクサアレルゲン。 - 【請求項１０】（ａ） 請求項１〜４および請求項９の
いずれかに記載の蛋白質またはペプチドあるいはアレル
ゲンのいずれかを用意する工程、 （ｂ） ある一つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加
を伴うブタクサアレルゲンを生成するための、工程
（ａ）で用意した蛋白質またはペプチドあるいはアレル
ゲンを改変する工程 からなるある一つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加
を伴うブタクサアレルゲンの製造方法。 - 【請求項１１】請求項10に記載の方法により製造された
ある一つのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加を伴うブ
タクサアレルゲン。 - 【請求項１２】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質
またはペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる
核酸。 - 【請求項１３】請求項１で言及した図式11、12、13また
は14に示されたアミノ酸配列をコードする請求項12記載
の核酸。 - 【請求項１４】請求項１で言及した図式11、12、13また
は14に示されたヌクレオチド配列からなる請求項13記載
の核酸。 - 【請求項１５】請求項１〜４、請求項９および請求項11
のいずれかに記載の蛋白質またはペプチド、ならびに緩
衝剤、キャリアーおよび／またはアジュパントからなる
ブタクサの花粉に対する個体の感受性を低減するための
組成物。 - 【請求項１６】請求項１〜４、請求項９および請求項11
のいずれかに記載の蛋白質もしくはペプチドまたはアレ
ルゲンからなるブタクサの花粉に対する個体の感受性を
決定する際のイン・ビボ診断用の組成物。 - 【請求項１７】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質
またはペプチドに特異的に結合する、Amb ａ Ｉ蛋白
質またはペプチドの分岐領域またはエピトープに対する
モノクローナルまたはポリクローナル抗体。 - 【請求項１８】請求項１〜４のいずれかに記載の蛋白質
またはペプチドに特異的に結合する、Amb ａ Ｉ蛋白
質またはペプチドの共通領域またはエピトープに対する
モノクローナルまたはポリクローナル抗体。 - 【請求項１９】個体に由来する血液試料を、請求項１〜
４、請求項９および請求項11のいずれかに記載の蛋白質
またはペプチドあるいはアレルゲンと、該蛋白質または
ペプチドあるいはアレルゲンを血液成分と結合させるの
に適する条件下で接触させて、結合の生じる程度を測定
することを特徴とするブタクサ花粉の蛋白質またはペプ
チドに対する個体の感受性を検出する方法。 - 【請求項２０】結合の生じる程度が、Ｔ細胞機能、Ｔ細
胞増殖もしくはＢ細胞機能の評価、血液中に存在する抗
体に対する前記蛋白質もしくはペプチドの結合性の評価
またはそれらの組み合わせによって決定される請求項19
記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US32536589A | 1989-03-17 | 1989-03-17 | |
| US325,365 | 1989-03-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04504119A JPH04504119A (ja) | 1992-07-23 |
| JP3220451B2 true JP3220451B2 (ja) | 2001-10-22 |
Family
ID=23267582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50483890A Expired - Lifetime JP3220451B2 (ja) | 1989-03-17 | 1990-03-09 | ブタクサからのアレルゲン蛋白質およびそれらの使用 |
Country Status (6)
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|---|---|
| EP (2) | EP0463059B1 (ja) |
| JP (1) | JP3220451B2 (ja) |
| AT (1) | ATE175209T1 (ja) |
| CA (1) | CA2049921C (ja) |
| DE (1) | DE69032868D1 (ja) |
| WO (1) | WO1990011293A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010518813A (ja) * | 2007-02-13 | 2010-06-03 | ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト | ブタクサ（アンブロシアアルテミシーフォリア）の主要アレルゲンから得られるペプチドおよびこれらの使用 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| AT401180B (de) * | 1990-08-13 | 1996-07-25 | Biomay Biotech Prod | Für das baumpollenallergen p14 codierende rekombinante dna-moleküle, daraus hergestellte und abgeleitete polypeptide und deren verwendung |
| US6555116B1 (en) * | 1991-10-12 | 2003-04-29 | Regents Of The University Of California | Alleviation of the allergenic potential of airborne and contact allergens by thioredoxin |
| AU2926492A (en) * | 1991-11-15 | 1993-06-15 | University Of Melbourne, The | Protein allergens of the species cynodon dactylon |
| US6441157B1 (en) | 1991-11-15 | 2002-08-27 | University Of Melbourne | Nucleic acid sequences encoding protein allergens of the species Cynodon dactylon |
| AU685392B2 (en) * | 1992-04-09 | 1998-01-22 | Immulogic Pharmaceutical Corporation | T cell epitopes of the major allergens from (ambrosia artemisiifolia) |
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| US8821887B2 (en) | 2008-08-15 | 2014-09-02 | Circassia Limited | T-cell antigen peptide from allergen for stimulation of IL-10 production |
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-
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- 1990-03-09 AT AT90905020T patent/ATE175209T1/de not_active IP Right Cessation
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- 1990-03-09 DE DE69032868T patent/DE69032868D1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1990-03-09 WO PCT/US1990/001310 patent/WO1990011293A1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２６（１９８７）ｐ．２３０−２３６ |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２２［８］（１９８５）ｐ．８９９−９０６ |
| Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２５［４］（１９８８）ｐ．３５５−３６５ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010518813A (ja) * | 2007-02-13 | 2010-06-03 | ビオマイ アクチエンゲゼルシャフト | ブタクサ（アンブロシアアルテミシーフォリア）の主要アレルゲンから得られるペプチドおよびこれらの使用 |
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| CA2049921C (en) | 2004-06-15 |
| DE69032868D1 (de) | 1999-02-11 |
| ATE175209T1 (de) | 1999-01-15 |
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| WO1990011293A1 (en) | 1990-10-04 |
| EP0463059B1 (en) | 1998-12-30 |
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