JPS63258495A - ポリペプチド組成物、その製法、それを用いる試験法、それを含む診断用キット及びそれに対する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野］ 本発明は、ＤＮＡとエピトープを共有する表面ポリペプ
チド（狼瘡に関係した膜蛋白質即ちＬＡＭＰ）と、播種
される紅斑性狼瘡（ＬＥＤ。

ＬＵＰＵＳ　ＥＲＹＴ［（ＥＭＡＴＥＵＸ　ＤＩＳＳＥ
ＭＩＮＥ）に冒された患者の血清中に存在する、該ポリ
ペプチドに向けられた抗体を検出する検出方法に関する
。

ＬＥＤは、組織の損傷を惹起させる抗２重らせんＤＮＡ
抗体の生成に至る免疫系の乱調によって特徴付けられる
自己免疫疾患である。

即ち、ヒトのＬＥＤの症例において観察される組織の損
傷の大部分は、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ免疫複合物内のＤＮＡ
の存在が正式には実証できず、更に、動物特にウサギを
用いた免疫試験において抗原として利用されるＤＮＡに
対する抗体を生体内において誘起させることがこれまで
成功しなかったにも拘らず、本発明の完成以前には、Ｄ
ＮＡ−抗ＤＮＡ免疫複合物の形成と、この複合物が腎臓
及び他の組織に付着することに起因すると考えられてい
た。

更に、ＬＥＤに冒された個体の血清中に２重らせんＤＮ
Ａに向けられた抗体が大きな強度において存在すること
は、ＬＥＤの特徴的なマーカーであると考えられていた
。

自己免疫ハツカネズミ（ヒトと同じ形態においてこの疾
病が経過することができる）は、ＬＥＤについて責任を
もつと想定される免疫機構を研究するための良好なモデ
ルである。特にＢ／Ｗ及びＭＲＬ／Ｉ自己免疫ハツカネ
ズミは、ヒトのＬＥＤと同一のＬＥＤを発現する。ＬＥ
Ｄに冒された患者の血清は、種々の核酸に向けられた抗
体の混合物を含有している。従って、抗ＤＮＡ抗体の特
異性をよりよく特徴伺けるには、ハイプリドーマ技法を
用いることが適切と思われる。

弔らせんＤＮＡに向けられた抗体と２重らせんＤＮＡに
向けられた抗体とは区別されるに至っている。

この区別は、臨床的な相関によって多少の成功を見てい
るが、単らせんＤＮＡ又は２重らせんＤＮＡという関係
においてＤＮＡを特徴付けることが技術的に困難なため
、非常に不十分であることが今や認識されている。

またＬＥＤに冒された唐、者の血清が、ＤＮＡだけでな
くＲＮＡ（リボ核酸）とも反応可能な抗体と核蛋白質と
の混合物を含むことも確かめられている。対応する抗原
が完全には定義されないので、与えられた抗体の個別の
意味を理解することは困難となる。

狼瘡ハツカネズミにおいて自然に発生する抗ＤＮＡ抗体
の細密な分析に対する障害は、抗単らせんＤＮＡ単クコ
クローン抗体、　ｌｍ１ｕｎｏ１．。

１９８０．１２４．１４９９−１５０２）及び抗２重ら
せんＤＮＡ単クコクローン抗体、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１９８２．１２８，８９５−８９８）を合成するハイブ
リドーマの作成によって最近除去された。

この事態が、米国リューマチ協会Ｔａｎ　ＥＭコーヘン
ＡＳ　、フリーズＪ、　Ｆ等（１９８２）によって刊行
された、この疾病の臨床的な経過の評価の改訂規格（組
織の紅斑性狼瘡の分類についての改訂規格）と相関され
えないことと、ＬＥＤの臨床的な徴候を示す成る患者が
抗ＤＮＡ抗体のキャリヤではなかったこととが、実験に
よって明らかにされた。

要約すると、従来試みられたように、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ
免疫複合物の形成にＤＮＡを使用することは、十分な信
ぴょう性をもたない。

自己免疫Ｂ／Ｗハツカネズミから作製される、２重らせ
んＤＮＡに特異的に向けられた中クローン抗体が、ヒト
及びガンギエイ類のＢリンパ芽球細胞面に固定されるこ
とと、この結合が、ＤＮＡ分解酵素による該細胞の処理
によってじよう乱されないこととは、既に認識されてい
る［Ｅｎｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１４　、２８３−２８６　、１
９８４）。

２重らせんＤＮＡに向けられた特別の種類の単クローン
抗体（ＡｃＭ）例えばハイブリドーマＰＭＥ７７が、Ｌ
ＥＤに冒されたヒトのいろいろの細胞系統（回数花序、
Ｂ及び１９７７球、赤血球、血小板及び中枢神経系）の
表面のポリペプチドを認識することも確かめられている
［Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　、　８
１　、３８４３−３８４５　（１９８４）］。腸、膵臓
及び肝臓の細胞（ＬＥＤによってほとんど冒されない）
は、ハイプリドーマＰＭＥ７７によって生成する抗体に
よっては認識されない。

これらは、関係する細胞がプロティナーゼＫによって処
理された場合に、これらの細胞がＡｃＭＰＭＥ　７７に
よってもはや認識されないことから派生するので、抗体
によって認識されるポリペプチドが細胞の表面に存在し
ているという結論が導かれる。

またゲル上の電気泳動及びイムノトランスファーの後に
ＡｃＭＰＭＥ７７によって認識可能な５種のポリペプチ
ドが、相当多数の他の蛋白質との混合物として上澄み中
に含まれることが、上澄みの分析によって示された。こ
れらのポリペプチドの分子量は、３４０００．３３００
０　。

１７０００．１６０００及び１４０００である。

これらの結果は、２重らせんＤＮＡとガンギエイ類の細
胞の表面に存在するポリペプチドの間に共通の抗原決定
基が存在することを示唆する。これらのポリペプチドは
、ＬＥＤ病源病中体中係する種々の細胞形式の表面にも
存在している。

本発明は、新規な性質を備えた組成物が得られる純度条
件の下に、細胞面上のＡｃＭＰＭＥ７７によって認識可
能なポリペプチドを単離することを可能とする条件が見
出されたことに基づいている。特に、この純度状態にお
いては、ポリペプチドは、先行する抗体だけでなく、Ｌ
ＥＤに冒された個体の血清中に存在する抗体によっても
認識されることが見出された。本発明は、これらの劣化
生成物を含む蛋白質又は複数の蛋白質に対応するポリペ
プチド組成物も対象としている。

［発明の概要］ これらのポリペプチドは −Ａ　ｃ　ＭＰＭＥ　７７又は等価のＡｃＭによって特
異的に認識されることと、 −アフィニティクロマトグラフィ操作の不溶性支持体上
にそれ自体不動化されたＡ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ７７上
の固定を許容するに足る濃度において存在することと、 一播種される紅斑性狼瘡　（ＬＥＤ）に冒されたヒトの
用１者及び狼瘡ハツカネズミの血清によって認識され、
正常なヒト及び正常なハッカネズミか・ら得た血清によ
っては認識されないことと、−ポリペプチドが、ウサギ
を免疫源とし、ヒト又はハツカネズミの２重らせんＤＮ
Ａを認識しない抗体を誘起させることと、 一狼瘡ハツカネズミの腎臓から溶出した免疫グロブリン
によって認識され、非狼痢ハッカネズミの腎臓から溶出
した免疫グロブリンによっては認識されないことを特徴
とする。

なお、　ｒＡｃＭＰＭＥ７７によって認識されるポリペ
プチド」という表現は、蛋白質、真正ポリペプチド（ア
ミノ酸の連鎖）、蛋白質の断片、ペプチド、又はポリペ
プチド上に固着している他の群を含む分子、例えば糖蛋
白質、リポ蛋白質又は他のリガンドを含めた全ての分子
を表わすものとする。

本発明は、これらのポリペプチドを製造する方法も提供
する。この方法は、エラスターゼ型の酵素の存在下に、
本発明によるポリペプチドを表面に担持することの可能
な細胞を培養し、ＡｃＭＰＭＥ７７によって認識されう
る表面ポリペプチドを含有する上澄みを回収し、必要に
応じてこれらのポリペプチドを精製する各工程を包含す
る。

換言すれば、本発明は、以上に定義されたポリペプチド
組成物を製造するために、ヒト、ハツカネズミ又はラッ
トの細胞の表面から前記ポリペプチドを選択的に抽出す
ることを可能とするように調節されたｐｏ、温度及び時
間条件の下に、調整された濃度のエラスターゼを含有す
る溶液中において、該細胞を培養し、単クローン抗体Ａ
ｃＭＰＭＥ　７７によって認識されうるポリペプチドを
含有する上澄みを回収することを含む製造方法を提供す
る。

特に、細胞の培養は、ｐＨ８−８，５、好ましくは８．
２の緩衝溶液中において、最終濃度が５−２０ｊＪ、ｇ
／ｙＪ、好ましくは１０ｐＬｇ／Ｊのエラスターゼの存
在下に、５−１５分間、好ましくは７分間、４℃の温度
において行なう。

ヒｉ・、ハツカネズミ又はラットの細胞の、どんな種類
のものも、本発明による製造方法に使用することができ
る。

好ましくは、培養可能で、表面の蛋白質含量の高い細胞
、例えば未分化細胞を使用する。

エラスターゼの存在下においてのこれらの細胞の種々の
培養パラメーターは必要に応じて変えうることは言うま
でもない。

当業者は、本発明によってもたらされた知見に基づいて
、最良のエラスターゼ効率を得るように、エラスターゼ
による蛋白分解条件を調節し、与えられた形式の細胞培
養物から所要のポリペプチドを回収するために最良の条
件を設定することができる。

前記のように定めた条件に対応するポリペプチドをエラ
スターゼによる細胞の処理を介して単離する可能性は、
多くの他のプロテアーゼによってはそうした結果が得ら
れないことから、より　・層際立ったものとなる。

本発明による組成物、特に前記の条件下の「エラスター
ゼ上澄み」は、予め精製してもよい。

好ましくは、同様の成る精製方法によれば、この七澄み
は、アフィニティクロマトグラフィ担体七に不動化した
単クローン抗体ＡｃＭＰＭＥ７７（又は、ポリペプチド
に対して予め形成した単クローン又は多クローン抗体）
と接触させられ、保持されたポリペプチドは、アフィニ
ティクロマトグラフィー担体を形成された抗原−抗体複
合物の解離溶液と接触させることによって回収される。

換言すれば、本発明による好ましい精製方法は、これら
のポリペプチドを固定させるために、（ファーマシアＡ
、　Ｇ、により商品名ＣＥＰＨＡＲＯ９Ｅ４Ｂとして市
販されている３次元のアガロース網状構造のような）適
宜の担体上に不動化した前記抗体を相持するアフィニテ
ィカラムと接触するように、前記ポリペプチドを含有す
る溶液を通過させる工程と、適切なイオン化力を有する
適宜の緩衝液を介してカラム上に形成された抗原−抗体
複合物を解離させることによって、ポリペプチドを回収
する工程とを包含する。適切な緩衝液の例は、後に調製
物の凍結乾燥を行なう際に残渣を形成しない塩溶液例え
ば好ましくは酢酸アンモニウムである。ＰＨ３−４の酸
性溶液又は同じｐＨのグリシン緩衝液を用いてもよい。

また、それ以外の精製方法を用いてもよい。

この上澄みには、分子量が前記と同様に（±１０％程度
の範囲内で）３４ＫＤ　、３３ＫＤ　。

１７ＫＤ、１６ＫＤ及び１４ＫＤであり、ＡｃＭＰＭＥ
７７によって認識されるエピトープを担持している、少
なくとも５種類の主要なポリペプチドが含まれることが
、イムノトランスファー（イムノ凹刻）による分析及び
電気泳動によって明らかにされた。特に、ＡｃＭＰＭＥ
７７は、分子量が５０ＫＤ又は約５５ＫＤのオーダーで
あるポリペプチドを同様に認識する。この最後に挙げた
ポリペプチド（５０−５５ＫＤ）は特にエラスターゼ処
理した狼瘡マウスの肺臓細胞から得られる。

本発明は、前記の方法に従ってＡ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ
７７によって認識される、ポリペプチドの精製抽出物（
主に、Ａ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７によって全て認識
される複数の分子車種から成る）も対象とする。

これらのポリペプチドは、−例として、適宜のゲル上の
電気泳動と、このゲルからの種々の帯域の回収とによっ
て、互に他のものに対して分離することができる。

本発明は、同様に、１７ＫＤ　、１６ＫＤ及び１４ＫＤ
の３種類のポリペプチドに向けられた抗体、例えば、こ
れらの３種類のポリペプチドから成る本発明による精製
抽出物を介したウサギの免疫によるこれらの生成物を対
象としている。

免疫されたこれらのウサギの血清、又は、これらの抗体
の予精製された調製物は、以下の説明において「多クロ
ーン抗体」と称されている。

本発明者らは、前記の方法による温和な条件の下にハツ
カネズミ細胞ＩＷ３２をエラスターゼで処理した結果抽
出物から得たイムノ凹刻の分析によって、この「多クロ
ーン抗体（ポリクローナル抗体）」が、４３ＫＤ　、１
７ＫＤ　、１６ＫＤ及び１４ＫＤの４つの主要なポリペ
プチドを認識することを見出した。

この多クローン抗体は、ポリペプチド１７ＫＤに対応す
る電気泳動帯域（多クローン抗体によって最もよく認識
される）の回収によって精製されたもので、多クローン
抗体は、この帯域に固定され、フーリエ等（Ｅｍｂｏ、
　Ｊ、　　２　、４６９−４７５．１９８３）に記載さ
れた方法に従って処理される。

アフィニティによる精製された多クローン抗体（単離さ
れた１７ＫＤポリペプチドに向けられる）が、イムノア
フィニティの後に、３４ＫＤポリペプチド及び４３ＫＤ
ポリペプチドと反応するという事実は、これらのポリペ
プチド種の間に存在する支配活性を裏付けている。

分子量の相異によって相互から区別される種々のポリペ
プチドが、より大きなポリペプチド、例えば分子量４３
ＫＤ又はそれ以上のものの蛋白分解によって結果した断
片であることはこの場合除外されない。

本発明は、一般に、前記の特定の分子量を有するポリペ
プチドのみを含有した組成物には限定されない。抗原決
定基もしくは部位又はＡｃＭＰＭＥ７７によって認識さ
れるエピトープを有する全てのポリペプチドは、本発明
の範囲に含まれる遊＃「ポリペプチド」の一部分をなし
ている。

「遊離」ポリペプチドとは、アフィニティクロマトグラ
フィ担体上に不動化されたＡ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ７７
によって認識されるに足る濃度において、ポリペプチド
含有組成物に含有され、その分子支持体から分離してい
るポリペプチドを意味する。

更に、多クローン抗体が２重らせんＤＮＡと反応しない
ことを勘案するべきであり、これは、複数のポリペプチ
ド又はその源としての単一のポリペプチドの主要なエピ
トープが２重らせんＤＮＡとエピトープを共有しないこ
とを示している。

本発明者らは、この知見に基づいて、ＬＥＤの経過に関
係した生理学的病理学上の状態に当面した場合に細胞表
面ポリペプチド（ＬＡＭＰ）が潜在的な免疫源として作
用し、ＤＮＡはその場合関与しないのではないかという
ことに気付いた。

別の事実がこの仮説を支持する。即ち、狼瘡ハツカネズ
ミ特に自己免疫ハツカネズミＭＲＬ／ｎｐｒの腎臓から
溶離された免疫グロブリンは、この１以上のポリペプチ
ドと特異的に反応する。

この事実は、ネズミのＬＥＤにおいて観察される腎組織
の損傷に、この１以上のポリペプチド（ＬＡＭＰ）が成
る役割を果たして、抗原抗体複合物の生成に関与し、こ
の複合物中には、狼庶ハツカネズミの腎中に存在する多
量の抗体がおそらくは介在していることを証明している
と思われる。

同様に、前記仮説を支持するものとして、ＤＮＡ−抗Ｄ
ＮＡ免疫複合物が必ずしも正式に実証されたわけではな
いことも想起されたい。

最後に、本発明においては、ＬＥＤに冒されたヒトの血
清中に存在する抗体によって特異的に認識されるべき表
面ポリペプチドの性質は、ＬＥＤの試験管内の診断の実
験に有利に使用される。

実際に、本発明者らは、前記のようにＬＥＤに冒された
２５人の患者のグループに由来する全部のヒト梅漬（希
釈率１：２０）が前記「エラスターゼ上澄み」に存在す
るポリペプチドを認識する抗体を含有していることを見
出した。

本発明は、一般に、播種される紅斑性狼瘡（ＬＥＤ）を
含みうる生物学的流体又は組織中の該ＬＥＤに相関させ
うる抗体を試験管中において検出するために、ＡｃＭＰ
ＭＥ７７によって認識されるポリペプチドを、該生物学
的流体又は組織中に時に存在する抗体とポリペプチドと
の間の試験管内の免疫反応を許容する条件の下に、該生
物学的流体又は組織と接触させ、時に形成される抗原−
抗体複合物を試験管内において検出することから検出方
法も提供する。

生物学的媒質は、好ましくは、ヒト血清によって形成さ
れる。

この検出を行なうために、全ての既知の方法を使用する
ことができる。

その−例としての好ましい方法は、ＥＬＩＳＡ技法によ
る免疫酵素法、免疫蛍光法又はラジオイムノ法（ＲＩＡ
）又はその均等物を使用する。

本発明は、酵素、蛍光、放射能その他適切な形式のマー
カーによって標識された本発明による全てのポリペプチ
ドも包含する。

これらの方法は例えば次の各工程から成る。

−滴定板のピントに、未発明によるポリペプチド組成物
の所定量を供与する工程。

−診断しようとする血清を徐々に増大する濃度において
これらのピットに導入する工程。

−滴定板を培養する工程。

一滴定板を繰返し洗浄する工程。

一血液の免疫グロブリンに対して標識された抗体を滴定
板のピントに導入する工程（抗体の標識は、基体の放射
吸収を少なくとも所定の１波長分変更するように基体を
加水分解することの可能な酵素の中から選択された１種
の酵素を用いて予め行なわれるものとする）。

一加水分解基体の駄を比較対照系との比較によって検出
する工程。

本発明は、 −Ａ　ｃ　ＭＰＭＥ　７７によって認識される少なくと
も１種のポリペプチド（標識されていてもいなくてもよ
い）を含有する組成物と。

−免疫反応を行なうのに適した媒質を形成する反応物質
と、 一免疫反応によって生成した抗原−抗体複合物の検出を
可能とするための反応物質（この反応物質は、マーカー
を担持していても、標識された別の反応物質によって認
識可能であってもよい（特にポリペプチド組成物が標識
されていない場合））と、 −ポリペプチド組成物によって認識される抗体を含まな
い基準の生物学的流体組織 を備えた、ＬＥＤを試験管内において診断するための診
断用キットも提供する。

本発明は、本発明のポリペプチドに対してそれ自身形成
された固体も提供する。

この作成が多クローン抗体に限定されないことは言うま
でもない。

本発明は、本発明の精製された−のポリペプチドに対し
て免疫された動物特にハツカネズミ又はラットの肺臓の
細胞及び適当な骨髄腫の細胞から慣用法に従って生成さ
せうると共に、動物の免疫用に最初使用されたポリペプ
チドを認識する単クローン抗体を生成させる能力によっ
て選択しうるような、全てのハイブリドーマによって生
成される、全ての単クローン抗体にも適用される。

本発明によるポリペプチドは、前記の特性を備えた抗体
を含有した免疫グロブリン混合物からこれらの抗体を分
離するためにも使用することができる。本発明によるポ
リペプチドは、この場合、例えば前記の形式のアフィニ
ティクロマトグラフィの支持体りにおいて不動化される
。従って、分離方法は、不動化されたポリペプチドと接
触するように、多クローン抗体含有溶液を通過させる工
程と、前記と同様の緩衝液又は溶液によって、保持され
た抗体を回収する工程とから成っている。

最後に、本発明は、前記ポリペプチドについて免疫を宿
主に与えるように宿主に投与することを可能とする薬理
学的な賦形剤に、前記の免疫源としての−の抗原を組合
せたことを特徴とする特許痰中組成物も提供する。これ
らのポリペプチドは、それに対する生体内の保護が必要
とされるつとその免疫源性を使用することの可能な活性
物質を形成する。

本発明は、同一の単クローン抗体によって認識されうる
抗原サイト（基）を担持しているものであれば、分子量
がそれよりも小さくてもよいポリペプチド断片にももち
ろん適用される。当業者には明らかなように、前記単ク
ローン抗体が作成されたら、比較的大きなポリペプチド
を特定の複数のサイトに切断する酵素によるポリペプチ
ド切断のためのそれ自体として既知の技法に従って、同
一の抗原サイトを含むより小さな複数のペプチド連鎖に
前記抗原から分離することを試みてもよい。これらの蛋
白質の例には、スタフィロコッカス・アウレウス（ｓｔ
ａ　ｈ　１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）ｖ８、α
−キモトリプシン、マウス・サプマキシラリ・グランド
・プロテアーゼ（ベーリンガー社から市販）、並びに、
ｃｌｙ−Ｅ’ｒＯ１ａｔｙ−Ａｌａその他のペプチドを
特異的に認識するビブリオ拳アルジノリティクス・ケモ
バー・イオファクス（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｌ　１ｎｏｌ　
ｔｉｃｕｓ　ｃｈｅｍｏｖａｒ江担Ｉ烈りのコラゲナー
ゼなどがある。ＡｃＭＰＭＥ７７によって認識されるペ
プチドの比較的小さな断片は、単離し、特徴を定め、合
成することができる 他方では、本発明によるポリペプチドのペプチド連鎖を
定めた後は、対応するヌクレオチド連鎖を再構成してよ
く、これらのヌクレオチド連鎖は、合成し、クローニン
グすることができる。

本発明の他の特徴は、本発明によるポリペプチドを得る
ための技法及び条件を示した以下の説明によって一層明
らかとなろう。

工、　　　　ポリペプチド　　　　び １）虹！及μ方並 分子量のマーカーは次の通りである。ホスホリラーゼｂ
（９３，０００）。ウシの血清アルブミン（６６，００
０）。オバルブミン（４３，０００）。炭酸脱水酵素（
３０，０００）。

トリプシン禁止剤（２０，０００）。乳アルブミン（１
４，０００）。

血清は、ＬＥＤに冒された２５個の個体から得た。これ
らの血清は、補体を不活性とするために、３０分間５６
℃で加熱し、−２０℃にて保存した。正常なヒトの血清
（ＳＨＮ）は対照用として用いた。

１鳳及蒼（セルライン） カンギエイ類のリンパ芽球Ｂの細胞系統とエリスロロイ
セミンＩＷ３２ハツカネズミ細胞とを、Ｅｕｒ、　Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１４，２８３〜２８６．１９８
４に記録されたように取得し保存した。

ＡｃＭネズミ 非分泌の骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８６５３）と肺臓
細胞（ＮＺＢＸＮＺＷ）ｆ　１との融合の後に、抗ＤＮ
Ａ抗体分泌ハイブリドーマＰＭＥ　７７の上済みを単離
した。ＡｃＭＰＭＥ７７は、免疫グロブリンＧ２ｂとし
て記述され、に鎖の抗体であり、ＤＮＡ特異性である（
Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　　１２５　。

２８０５〜２８０９　（１９８０）及びＪ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、。

１ヱ８．８９５〜８９８（１９８２）］。

ＡｃＭＰＭＥ７７分泌ハイブリドーマは、番号ｌ−５５
５の下に、１９８６年５月１５日付で、Ｃ，Ｍ、Ｃ，Ｍ
、に寄託された。

ガンギエイ類の細胞及び生存可能なＩＷ３２の細胞２０
０万個を３５３メチオニン２００７ｈＣｉを含有するＲ
ＰＭＩ培地上において４時間培養した。

この期間の後に、２００Ｘｇ、４℃において細胞を遠心
分離し、７分間、冷所（氷結麦芽エキス）において、ト
リス５０ｍＷ、Ｎａ（，９，０、１５Ｍ含有緩衝液（ｐ
Ｈ８、０）中エラスターゼｌ−（最終濃度１０ＪＬ／ｄ
）（メルク）中に再懸濁させた。

表面蛋白質から細胞を分離し、低速の遠心分離（２００
Ｘｇ、７分間）によって、エラスターゼによる培地中に
おいて塩析した。「エラスターゼｌ−澄み」を保持し、
分析した。

レムリ（Ｎａｔｕｒｅ（Ｌａｎｄ）、２２７　、６８０
〜６８４）に従って、ドデシル［８ナトリウム（Ｓｏｄ
　ｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔｅ、　５ＤＳ）
　（７）ポリアクリルアミドのゲル−１−において、「
エラスターゼ上澄み」の一部を電気泳動に付した。

電気泳動後に、バーネッｈ　（ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ。

１９８１．１１２，１９５〜２０３）に示されクードリ
エ等［ＥＩＩＩｂｏ、　Ｊ、　２　、４６９〜４７５（
１９８３）］によって修正された方法に従って、イムノ
トランスファーを行なった。

「エラスターゼ」ゾ、」のイムノ″　にょる折 「エラスターゼ」二澄み」を、ＡｃＭＰＭＥ７７の存在
下に、１８時間４℃で培養した。

免疫複合物を３０分間室温でウサギ抗ハッカネズミ抗体
（２０ｐ−ｇ）によって、また同じ条件の下に商品名５
ＥＰＨＡＲＯ３Ｅ　４Ｂ　（ファーマシア）にょって市
販されている担体上に固定した蛋白質Ａ（以下「セファ
ローズ４Ｂ−蛋白質Ａ」と称する）４０μｇによって沈
殿させた。

これらの試料は、ＮａＣ文１９０ｍＭ、トリス５０ｍＭ
、ＥＤＴＡ６ｍＭ、トライトンＸ−１００（２，５容量
／容量％）を含有する緩衝液中において、７回洗浄し、
レムリの方法に従って電気泳動に付した。

蛍光写真を撮影するため、増幅器（ＮＥＮ）中において
ゲルを硬化させた。乾燥ゲルは、８００Ｃ１２４時間か
けて、コダックＡＲＸ５フィルムに露光させた。

抗ＤＮＡ抗体ＰＭＥ７７を分泌するハイブリドーマのＬ
澄みを、セファローズ４Ｂ蛋白質Ａのカラムに導いた。

次に、フーリエ等（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１５２．４９〜６６）に記載されたように
、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ、架橋剤）を介して
ＡｃＭを蛋白質Ａに共役状に結合させ３ま た。

払１し１誌 Ａ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ　７７に結合させたセファロー
ズ４Ｂ蛋白質Ａのカラムに「エラスターゼ上澄み」を導
いた。

トライトン の存在下に０．５ＭＮａＣｕ及びＰＢＳ（ｐ）Ｉ７、４
に調整）の溶液によって、カラムを洗浄した。

グリシンと共にｐＨ２　、　２に調整したＨＣＱＯ．２
Ｍを含有する緩衝溶液中においてポリペプチドを溶離し
た。

溶出物は、ｌ・リス−塩基（溶液ＬＭ）によって中和さ
れるまで緩衝した。

メチオニン３５Ｓによって標識した溶出ポリペプチドの
一部分をポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）Ｉ−、に
おいて電気泳動に伺し、蛍光写真を撮影した。

別の実験によって、ポリペプチドの−・部分を同様にＡ
　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ　７　７によってイムノ沈殿させ
た。

ニトロセルローズに吸収された抗原として使用した精製
細胞面ポリペプチドによってウサギを免疫した。１７Ｋ
Ｄ．１６ＫＤ及び１４ＫＤの３種類のポリペプチドを、
クードリエ等（前出のＥｍｂｏ．　Ｊ．）に従って、ボ
ンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）　Ｓ　テもってニトロセルロ
ースのシート−Ｌにｉ＝Ｔ　Ｉ　化した。

次に、ニトロセルロースの小片を、液体窒素中において
固化させ、次に、液体窒素中において冷却させたモルタ
ル中において乳棒によってかき混ぜた。粉末状ニトロセ
ルロースを塩化ナトリウムの通常の溶液５００ｇ文中に
再懸濁させ、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ，
ＤＩＦＣＯ、デトロイト、ＭＩ）５００ｐＭによって乳
化させた。

ウサギに最初の注射をするため、この物質を、１１１（
ひかがみ）のリンパ節に（約５ｔｂｇ）注射し、またを
柱に沿ぢて背部に皮内注射によって（約５ＪＬｇ）注射
した。

第１回のブースターは粉末状ニトロセルロース上に吸収
させた同じ用量の抗原を用いて、３週後に行なった。こ
れは、フロイントの不完全アジュバント（Ｄ　Ｉ　ＦＣ
Ｏ）中に乳化させ、皮内注射（５ＩＬｇ）及び腹腔内注
射（５ＩＬｇ）によって投与された。

第２回のブースター（皮内）は、ニトロセルロースに吸
着させてＰＢＳに再懸濁させた抗原を用いて、２１日日
日行なった。

第１回の血液試料は３回目のブースターの後１週間して
から行ない、その後は、少くとも１力月間、１週間に１
回ずつ採取した。

ウサギの　クローン　　の　　への　　のこれらの実験
は、対照用として使用したウサギの非免疫血清と、ウサ
ーギの多クローン抗原と、Ａ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ　７
７とを用いて、Ｅｕｒｏ、　Ｊ、　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌ
、（１９８４）、１４，２８３〜２８６に記載された技
法に従って行なった。

細胞ＩＷ３２の全エキスと「エラスターゼ上澄み」の一
部分とを、前記と同様に調製した。

ポリペプチドの電子トランスファーの後、ヒトのＬＥＤ
血清２５サンプル（１：５０に希釈）と多クローン抗原
（１：ｌｏＯに希釈）とを、ニトロセルロースシートに
、９０分間周囲温度で培養した。

抗原−抗血清複合物を、ペルオキシダーゼ技法によって
検出した。

支持された帯域から、抗体のマイクロスケールのアフィ
ニティ（ａｆｆｉｎｉｔｅ　ｍ１ｃｒｏ４ｃｈｅｌｌｅ
）による精製を行なった。

ＩＷ３２細胞の全エキスの複数のサンプルを、前記のよ
うに、イムノトランスファーによって分析した。

多クローン抗体によって特異的に再認識される１７ＫＤ
の帯域をフィルター上に正確に局在化した。これらの帯
域の各々を切離し、クードリエ等（前記のＥｍｂｏ、　
Ｊ、）に従って、以上に詳細に説明したように処理した
。

クローンの−のＤＮＡ Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２８　、８９５〜８９８
（１９８２）に従って固相ラジオイムノ試験法を利用し
て、多クローンの抗体のＤＮＡ固定能力を測定した。

２）結果 細胞面に接近可能な領域について、ＡｃＭＰＭＥ７７に
よって認識された抗原の性質をより正確に定めるために
、複数のプロテアーゼによる処理を行なった。これらの
抗原は、パパイン及びトリプシンによる処理に非常に敏
感なことが確かめられた。

プロテアーゼの濃度を非常に低く　（１０ｇｇ／−）シ
、処理時間を冷間（４℃）で非常に短く（５分間）して
も、ＡｃＭＰＭＥ７７によって認識可能ないかなる断片
も上澄みから単離することはできなかった。

しかし、これらの抗原は、蛋白分解後に細胞のカップ（
ｃｕｌｏｔ　ｃｅｌｌｕｌｏｉｒｅ）中に検出できたこ
とによって細胞面から分離された。

しかしエラスターゼによる温和な処理を使用した際に、
細胞面の接近可能な断片は、遊離され、上澄み中におい
て検出された。またエラスターゼを、ｐＨ８，２、濃度
１０ｇｇ／ｒｒＪにおいて７分間利用した場合に、Ａｃ
ＭＰＭＥ７７によって検出された断片の主要部を上澄み
から有効に単離することができた。

この結果は、ポリペプチドがプロテアーゼに感度をもつ
ことを示している。

最も頻繁に、３４ＫＤ、３３ＫＤ、１７ＫＤ、１６ＫＤ
及び１４ＫＤに移行するポリペプチド科は、ポリペプチ
ドのイムノトランスファーの分析（イムノブロッティン
グ）の分析によって、ＡｃＭＰＭＥ７７による「エラス
ターゼ上澄み」中において検出された。

しかし、これらのポリペプチドが高感度なため、実験条
件の関数として、主要な帯域のほかに、他のいくつかの
帯域が検出された。

イムノ・殿による「エラスターゼ−Ｌ澄み」の析 「エラスターゼ上澄み」を利用したイムノ沈殿の実験に
おいて、ＡｃＭＰＭＥ７７は、１７ＫＤ、１６ＫＤ及び
１４ＫＤの３種類のポリペプチドを特異的にイムノ沈殿
させる。３４ＫＤ及び３３ＫＤの２種のポリペプチドの
不在は、長い培養時間と、この技法において必要とされ
る多数回の洗浄とによって、これらのポリペプチドが蛋
白分解されることによって説明される。

変形例として、ポリペプチド３４ＫＤ、３３ＫＤに存在
するエピトープは、抗原の本来の形状の下では接近でき
ず、単にＳＤＳによる変性の後に認識されるにすぎない
。これとは反対に、これらのポリペプチドは、比較対照
として用いられるＡｃＭ抗ゴルジによってイムノ沈殿さ
れることはできなかった［Ｅｍｂｏ、　Ｊｏｕｒｎａｌ
、　（１９８２）　　。

ユ、１６２１〜１６２８］。

１脂ｒポリペプチドの−１ 細胞ＩＷ３２の表面から１６された少くとも４種の主要
なポリペプチド（４３ＫＤ、１７ＫＤ、１６ＫＤ及び１
４ＫＤ）は、セファローズ４Ｂ蛋白質Ａに結合された、
イムノアブシーバントとじてのＡ　ｃ　Ｍ　Ｐ　Ｍ　Ｅ
　７７と共にアフィニティクロマトグラフィーによって
単離することができた。

これらのポリペプチドの純度は、ポリアクリルアミドゲ
ル上に単離されたポリペプチドの部分の電気泳動によっ
て示された。

その反対に、同じ実験において、セファローズ４Ｂ蛋白
質Ａに結合されたＡｃＭ抗ゴルジを対照用として利用し
た場合、どのポリペプチドも非特異的にイムノアブシー
バント−Ｌにトラップされなかった。

別の実験において、ＡｅＭＰＭＥ７７溶液を用いて溶離
ポリペプチドをイムノ沈殿させると共に分析した。

１７ＫＤ、１６ＫＤ及び１４ＫＤの３種のポリペプチド
が認識されたが、４３ＫＤは認識されなかった。これは
、イムノ沈殿の過程において４３ＫＤがおそらくはより
小さな断片に劣化したであろうという推測と合致する。

狼ｉ　ハツカネズミ（ＭＲＬ／ｌ　ｐ　ｒ／ｌ　ｐ　ｒ
）の肺臓の全リンパ球を利用して、同一の条件の下に調
製した「エラスターゼ」上澄みから、５０〜５５ＫＤポ
リペプチドを得た。

免疫アフィニティとポリアクリルアミドのゲル上の予備
的な電気泳動とニトロセルロースのフィルター上のトラ
ンスファーとによって回収された、１７ＫＤ、１６ＫＤ
及び１４ＫＤに免疫学的に所属する３種のポリペプチド
によってウサギを免疫して、抗血清を作成した。

多クローンの抗体と、　１２５　工として標識された蛋
白質Ａとを細胞上に固定させる実験を行なった。

表Ｉに示した結果から、細胞−りに特定の結合が存在し
ていることが明瞭に示される。

多クローン抗体を利用し、ＩＷ３２セルの全エキスによ
るイムノトランスファーの分析によって、４３ＫＤ、１
７ＫＤ、１６ＫＤ及び１４ＫＤの少くとも４つの主要な
帯域を検出することができた。

４３ＫＤ、１７ＫＤの２つの帯域は、強い反応性を示し
、他の２つは、より弱い反応性を示す。

ウサギの非免疫血清を対照用として同一の希釈において
使用した場合には、特異性の帯域は検出されなかった。

多クローン抗体によって認識される抗原の細胞面の接近
可能性を定めてその蛋白質の性質を確かめるために、生
きている細胞についてエラスターゼ（１００ルｇ／ｒｎ
りによる処理を行なった。

その場合、４つの帯域は、ほぼ完全に消失した。

ポリペプチドとＤＮＡｄｂとの間の可能な交雑反応につ
いて試験するために、ポリクローナル抗体に、ＤＮＡｄ
ｂ１ｍｇ／ｍ／を予め接種した。

他の４つの帯域は常に同一の強度でもって観察された。

更に、抗体は、ラジオイムノ検出試験（ＲＩＡ、即ちラ
ジオイムノアッセイ）によれば、ＤＮＡｄｂに結合され
ていない（表ＩＩ）。

これらの結果は、ＤＮＡｄｂを認識しないエピトープと
反応する抗体をポリクローナル抗体が主に含有している
ことを示している。

帯域１７ＫＤからの多クローン抗体のアフィニティによ
るマイクロスケール精製は、前記のように行なった。

表　　Ｉ 血清源　　　　　　　　　固定能力 ＰＢＳ　　　　　　　　　　　　　　　　２２８±２４
ＡｃＭ　ＰＭＥ　７？（１００Ｊｊ−ｇ／ｍｌ）　　　
　　　８５２０±５２９（希釈率１：５００） 表ＩＩ 血清源　　　　　　固定・テスト板当りｍ ＡｃＭ　ＰＭＥ　７？上澄み　　　　　　　　２３５５
±１７８ＡｃＭゴルジの上澄み　　　　　　　２３３±
６４精製した抗体を、細胞ＩＷ３２の全エキス上のイム
ノトランスファーによる分析に付した。

ポリペプチド科４３ＫＤ、３４ＫＤ、１７ＫＤ、１６Ｋ
Ｄ及び１４ＫＤが、特異的に検出され、種々のポリペプ
チドの間に存在する抗原関係が示された。おそらくは実
験条件の変動によってポリペプチド２３ＫＤが、この特
別の実験において観察された。

ヒトのＬＥＤ血°のイムノトランスフ　−の折 「エラスターゼ上澄み」を抗原として使用し、１：５０
に希釈したヒトのＬＥＤ血清について、３４ＫＤ、１７
ＫＤ及び１６ＫＤの、３つの帯域が検出された。

１：５０に希釈したヒトのＬＥＤ血清に、ＤＮＡ　ｄ　
ｂ　（１ｍｇ／＋ｎｌ）を予接種したところ、３４ＫＤ
、１７ＫＤの２つの帯域の強度は著しく減少し、１６Ｋ
Ｄの帯域の強度の減少はそれほど大きくなかった。

同様の結果は、ヒトの他の５つのＬＥＤ血清についても
得られ、これによって、ヒトのＬＥＤ血清中の細胞面ポ
リペプチドに向けられた抗体の存在が明らかに示された
。４つのヒトの正常な血清を対照用として使用した場合
には帯域は全く認められなかった。

１、　糎月Ｊαムが法 ハツカネズミ アンメチチュー１−−バストウール（フランス、パリ市
所在）から、年令１６週のノ＼ツカズミＭ　ＲＬ　／　
ｌ　ｐ　ｒ　／　１　ｐ　ｒを入手した。

ハッカネズミＢ／Ｗは、雌ＮＺＢと雄ＮＺＷとの交雑に
よって生まれ、年令６か月である。

ハッカネズミＮＺＢ、ＢＡＬＢ／ｃは、ＣＮＲ５（フラ
ンス、う・スールス・オルレアンス）のＣ３ＥＡＬ研究
所が供給された。

１請 ハツカネズミＭＲＬ／１　ｐ　ｒ、Ｂ／Ｗ及びＢ　Ａ　
Ｌ　Ｂ　／　ｃの血清は、補体を不活性化するために、
３０分間５６℃で加熱され、−２０℃で貯蔵された。

以下の試験に使用したポリペプチドは、ＩＷ３２系統の
細胞から得た前記「エラスターラゼ上澄み」のポリペプ
チドであった。

８匹の狼瘡ハツカネズミＭＲＬ／ｌｐｒと８匹の正常な
ハツカネズミＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｅとに、塩化ナトリ
ウム溶液２０−を潅流させ、腎臓を液体窒素中に凝固さ
せた。

ハツカネズミＭＲＬ／ｌｐｒの１６個の腎臓とハッカネ
ズミＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃの１６個の腎臓とを、それ
ぞれ分類し、凝固した状態のまま小片に切離し、塩化す
トリウムＯ，１５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７、２）中に
懸濁させ、０℃でホモジナイズ（均質化）した。

均質化物を、４０００Ｘｇの遠心分離によって、ＰＢＳ
５００−にて４℃で洗節した。この洗浄を３回反復し、
遠心分離残液を懸濁させ、０．０２Ｍクエン酸塩緩衝液
（ｐＨ３、２）２０容量部中において２時間３７℃で培
養した（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（
１９８２）　４８　：１３３）。

溶離後に腎組織を遠心分ｌｌＩ（４００Ｘｇ、３０分間
）し、溶出生成物をｐ）１７　、　ｏ−ｔ’Ｎａ２　Ｈ
ＰＯ４（ＩＭ）によって中和し、ｌ昼夜かけてＰＢＳに
対して透析し、濃縮し、２ｗＪに調節し、−２０℃にお
いて貯蔵した。光の密度は、ＭＲＬ／ｌｐｒについては
３．７、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃについては１．１であ
った。

旦↓」」辷り区験 腎臓からの溶出ＩｇＧのこの検出試験は、Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８
３）　８０　。

６２６９〜６２７３に記載されたように行なつた。

簡単に説明すると、０．２Ｍ、ｐＨ８，２ホウ酸塩緩衝
液ＤＢＳ溶液中に２ルｇ／−の濃度に希釈した抗ハツカ
ネズミＩｇＧ牝山羊抗血清を、商品名ＬＵＸＬＯＮの下
に市販されているマイクロテスト板（フランス、ネムー
ル、ＣＥＢ）上に固着させた。

４　’０で１昼夜培養した後、ウシの血清アルブミン（
ＢＳＡ）、ＰＢＳ　１％を含有する緩衝液中においてこ
れらのテスト板を周囲温度で１時間洗浄した。

次に腎臓の溶出ＩｇＧを添加した。３７℃で１時間テス
ト板を培養し、ＴＷＥＥＮ２０−ＰＢＳによって３回テ
スト板を洗浄した後、１：５００に希釈しβ−ガラクト
シダーゼで標識した抗ハツカネズミＩｇＧ牝山羊血清１
００ｕＱを添加し、３７℃で１時間テスト板を培養した
。

基質としてのオルニ］・ロフェニルーβ−Ｄ−ガラク）
・ピラノシド（ＯＮＰＧ）（シグマ）１００壓立を添加
する前に３０分間３７℃でＴＷＥ　Ｅ　Ｎ２Ｏ−ＰＢＳ
によってテスト板を３回洗節した。

次に、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　（１９８０）　１２
５　。

２８０５〜２８０８に記載された固相ラジオイムノ試験
方法によって、狼瘡ハツカネズミ血清抗体のＤＮＡへの
固定能力を測定した。

腎臓のＩｇＧと共に「エラスターゼ］二澄み」に含まれ
てでいる膜蛋白質の免疫活性を、前記イムノトランスフ
ァー技法に従って測定した。

２）　　ｔＪ！： ・叫」した−　工　Ｇの！　　ヒ 前記ＥＬＩＳＡ試験において溶出され定量されたＩｇＧ
の量は、ハッカネズミＭＲＬ／ｌｐｒについては１８５
ｇｇ、ハッカネズミＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃについては
１．８．ｇであった。

ｌｖのＤＮＡへのＪＳ１ノ七− ハツカネズミＭＲＬ／ｌｐｒ及びＢ／Ｗの血清は、同相
ラジオイムノ試験により、ＤＮＡｄｂに結合する（表■
）。

ハッカネズミＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃは、ＤＮＡｄｂに
結合しない（表■）。

少なくとも５つの主要な帯域即ち３４ＫＤ。

３３ＫＤ、１７ＫＤ、１６ＫＤ、１４ＫＤが、ＩＷ３２
細胞エキスの利用により、ハッカネズミＭＲＬ／ｌｐｒ
の溶出ＩｇＧと共に、［エラスターセ′１−澄みｊ中に
検出された。

表■ （希釈率１＋１００） ハッカネズミＢ／Ｗ血清　　　　　３４０８±２７０（
希釈率１：１００） 正常な血清（希釈率１：１００）　　　　５２？±７４
ＡｃＭ　ＰＭＥ　７７の上澄み　　　　　　５３７８±
２８５ＡｃＭ抗ゴルジの上澄み　　　　　２１４±７３
これら５種類のポリペプチドとＤＮＡｄｂとの間に存在
する交雑反応を試験するために、溶出ＩｇＧに、ＤＮＡ
ｄｂ１ｍｇ／−を予め接種した。

この場合、全部の蛋白帯域の強度は著しく減少した。

反対に、比較対照用としてハッカネズミＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ
　／　ｃのＩｇＧを使用した場合、いかなる帯域も同じ
条件の下には検出されなかった。

この結果から、ハツカネズミＭＲＬ／１　ｐ　ｒから溶
離されたＩｇＧが、ＤＮＡｄｂと共通のエピトープをも
った１以りの表面蛋白質と特異的に反応することが示さ
れた。

１己　−ハツカネズミの　　ｆ″）相 細胞ＩＷ３２の「エラスターゼ士澄み」を使用して、ハ
ッカネズミＭＲＬ／ｌｐｒ及びＢ／Ｗの血清（希釈率１
：５０）及びＡｃＭＰＭＥ７７によって、同一の主要な
帯域３４ＫＤ、３３ＫＤ、１７ＫＤ、１６ＫＤ及びｌ　
４ｋｄが検出された。

しかし、多分プロテアーゼに対する１以上の蛋白質の高
感度によって、実験の条件に従って、前記の主要な帯域
のほかに、他のいくつかの帯域も、成る実験においては
検出された。

これら全ての場合に強い反応が認められた。

これらの帯域は、１：５０に希釈したハツカネズミＭＲ
Ｌ／ｌｐｒ及びＢ／Ｗ（７）血清にＤＮＡｄｂ１ｍｇ／
ｄを予め接種した場合に、著しく減少した。対照として
使用したハツカネズミＢＡ　ＬＢ／Ｃの血清をＡｃＭＰ
ＭＥ７７と接触させた場合には帯域は全く認められなか
った。

これらの結果から、細胞面ペプチドに向けられた抗体が
ハツカネズミＭＲＬ／ｌｐｒ及びＢ／Ｗの血清中に多量
に存在することが示された。

１）医五盈Ｉユ羞 ■ この明細書の冒頭に述べたＬＥＤに冒された２５個体の
グループ並びにポリアルスライド・リューマドイド（ｐ
ｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｅ　ｒｈｕｍａｔｏｉｄｅ）に冒
された１０人の患者、當皮症に冒された４人の患者、ゲ
ージエロージョングレン症候群を示す２人の患者及び正
常な１０個体から成る別のグループにそれぞれ由来する
血清試料を検査した。

これらの血清と「エラスターゼ上澄み」との間の免疫反
応生成物を前記のようにイムノトランスファーによって
分析した。

ＤＮＡへの　　゛ ７ｙ−（Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　（１９６９
）　２８１　。

７０１〜７０５）の方法によって、抗ＤＮＡ抗体の存在
について全部の血清を試験した。

これらのうち２種は、固相のラジオイムノ試験と、クリ
チディアΦルシレー（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ　Ｉｕｃｉｌ
ａｅ。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　（１９８０）　１２５　、
２８０５〜２８０８）を用いた試験とによって同様に分
析した。

２）　紋型 ＬＥＤ血°　　イムノ　ランスフ　− 「エラスターゼ上澄み」を抗原として使用し、１：２０
に希釈したヒトの２５ＬＥＤ血清において、ポリペプチ
ド３４ＫＤ、３３ＫＤ、１７ＫＤ　、１６ＫＤ及び１４
ＫＤの対応する帯域を検出した。

前記疾病のうち成るものについては全部の帯域は観察さ
れなかった。更に、実験条件の関数として、プロテアー
ゼに対するポリペプチドの高感度によって、前記の主要
な帯域のほかに、他のいくつかの帯域が検出された。

ＬＥＤ血清の大部分は（特に１７ＫＤポリペプチドに対
して）強い反応を示し、他のものは弱い反応を示した。

ここで特に注目すべきこととして、抗ＤＮＡ抗体の検出
試験（ファーの試験）と固相のラジオイムノ試験及びク
リチディア・ルシレー（免疫蛍光）が負の結果をもたら
した２つの疾病を含めて、ＬＥＤによって冒された全て
の疾病において、米国リューマチ協会によって改訂され
た分類に定められた規格に従って、前記帯域がはっきり
検出された。

１：２０に希釈したＬＥＤ疾病血清にＤＮＡｄｂ　（ｌ
ａｇ／ｌ＋ａ／）を予接種すると、これらの帯域は著し
く減少する。

この結果から、ＤＮＡｄｂとエピトープを共通に有する
細胞面ペプチドに対する抗体が被検ＬＥＤ血清中に存在
することが示される。

その逆に、正常なヒトの１０血清、並びに、ポリアルス
ライド・リューマドメト、當皮症及びグージエロ・ショ
グレン症候群に冒された他の群の血清については、いか
なる免疫反応も認められなかった。

しい１ＤＮＡｄｂ　　との この研究のために、ファーの技法によって、抗ＤＮＡｄ
ｂ抗体を測定した。

ファーの方法による抗ＤＮＡｄｂ抗体の強度と抗ポリペ
プチド（又は抗ＬＡＭＰ）抗体の強度との間には明瞭な
相関は全く存在しないことが、イムノトランスファー分
析によって示された。

しかしこの最後に述べた技法は単に半定量的であるが非
常に高感度であることを想起すべきである。

狼瘡ハツカネズミＭＲＬ／ｌ　ｐｒ／１　ｐ　ｒ及びＢ
／Ｗの肺臓細胞を、エラスターゼ、パパイン及びトリプ
シンでそれぞれ処理し、エラスターゼ上澄み、パパイン
上澄み及びトリプシン上澄みを回収した。この条件の下
でのイムノトランスファー（イムノブロッティング）に
おいて、ＰＭＥ　７７は、エラスターゼ上澄み、パパイ
ン上澄み及びトリプシン上澄み中に存在する５５ＫＤの
主要なポリペプチドを認識した。

その反対に、正常なハツカネズミＢＡＬＢ／ｃ又はＣＢ
　Ａ　／　ｃ　ａをエラスターゼ、パパイン及びトリプ
シンで処理した場合、ＰＭＥ７７は、エラスターゼ上澄
みの場合に、３４ＫＤ、３３ＫＤ、１７ＫＤ、１６ＫＤ
及び１４ＫＤのポリペプチドを検出するが、パパイン」
二澄み及びトリプシン上澄みについては、いかなるポリ
ペプチドも認識しない。これは、正常な細胞の表面に存
在する膜蛋白質（ＬＡＭＰ）が蛋白分解酵素に対して高
感度を示すためである。

これら全てのデータは、狼瘡ハツカネズミＢ／Ｗ及びＭ
ＲＬ／　ｌ　ｐ　ｒ／　ｌ　ｐ　ｒｃｒ＋細胞中細胞内
分解酵素に対してＬＡＭＰが耐性をもつことを示してい
る。この耐性は、膜に対するＬＡＭＰの環境又は構造の
変化によって説明される。

ポリペプチド５５ＫＤに対する抗体が、狼痕ハツカネズ
ミＢ／Ｗ及びＭＲＬ／１　ｐ　ｒ／ｌ　ｐ　ｒ血清中に
存在していることが、イムノブロッティングによって示
された。

前述の条件の下でのアフィニティクロマトグラフィによ
って単離されるこのポリペプチド５５ＫＤは、播種され
る紅斑性狼石に冒された患者の４つの血清によるイムノ
ブロッティングにおいて認識される。従って、このポリ
ペプチドは、ＬＥＤの感知性及び特異性の試験管内の診
断のためにも利用することができる。

発展性狼瘡に冒された３０人の患者から得られた２９の
陽性血清は、膜ポリペプチド（Ｐ３４、Ｐ３３、ＰＩ３
、ＰｌＢ、ＰＩ３）に対する抗体を有していた。

特に、狼庸に冒された５人の患者を発病期及び寛解期（
臨床上、正常に戻る時期）において試験したところ、発
病期において、これらの患者は、膜ポリペプチドに対す
る抗体を有していたが、これは、正常な状態では消失し
た。

寛解期にある狼庶患者の他の１０個の血清は、膜ポリペ
プチドに対する抗体を有していなかった。

従って、ポリペプチドに対する抗体のチェックは、狼瘡
の患者の発展の検査用マーカーとして利用することがで
きる。この点から、これらの蛋白質又はポリペプチドは
、抗ＤＮＡ抗体よりもすぐれたマーカーを形成する。実
際に、この抗ＤＮＡ抗体は、実際に、発病期にある患者
にも、寛解期にある患者にも屡々検出される。

単クローン抗体ＰＭＥ７７を用いたネズミの」−皮細胞
の電子顕微鏡検査により、細胞の内部に、表面分子特に
膜受容体を運ぶ「クラスリン」（Ｃ１ａｓｒｉｎ）の小
胞（コーテッドビッツ（ｃｏａｔｅｄｐｉｔｓ））中に
蛋白質ＬＡＭＰが存在していることが示された。

ＬＡＭＰは、ハッカネズミのリンパ球の表面においてだ
けでなく、狼庸ハツカネズミの糸球体細胞の表面におい
ても変更される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ＡｃＭＰＭＥ７７によって特異的に認識されること
   ； ポリペプチドが、播種される紅斑性狼瘡（ＬＥＤ）に冒
   されたヒトの患者及び狼瘡ハツカネズミの血清によって
   認識され、正常なヒト及び正常なハツカネズミから得た
   血清によっては認識されないこと； ポリペプチドが、ウサギを免疫源とし、また２重らせん
   ＤＮＡを認識しない抗体を誘起させること； ポリペプチドが、狼瘡ハツカネズミの腎臓の免疫グロブ
   リンによって認識され、非狼瘡ハツカネズミの腎臓の免
   疫グロブリンによっては認識されないこと； を特徴とするポリペプチド組成物。 ２）アフィニティクロマトグラフィ操作の不溶性支持体
   上にそれ自体不動化されたＡｃＭＰＭＥ７７上の固定を
   許容するに足る濃度において存在すること； ポリペプチドが、播種される紅斑性狼瘡（ＬＥＤ）に冒
   されたヒトの患者及び狼瘡ハツカネズミの血清によって
   認識され、正常なヒト及び正常なハツカネズミから得た
   血清によっては認識されないこと； ポリペプチドがウサギを免疫源とし、ヒト又はハツカネ
   ズミの２重らせんＤＮＡを認識しない抗体を誘起させる
   こと； ペプチドが、狼瘡ハツカネズミの腎臓の免疫グロブリン
   によって認識され、非狼瘡ハツカネズミの腎臓の免疫グ
   ロブリンによっては認識されないこと； を特徴とする１以上の別々の分子量種に所属するポリペ
   プチド組成物。 ３）ポリペプチドが２重らせんＤＮＡと共通のエピトー
   プを有する特許請求の範囲第１項又は第２項記載のポリ
   ペプチド組成物。 ４）ポリペプチドが、ほぼ５５ＫＤ、５０ＫＤ、４３Ｋ
   Ｄ、３４ＫＤ、３３ＫＤ、１７ＫＤ、１６ＫＤ及び１４
   ＫＤの分子量によって特徴付けられる少なくとも１の分
   子量種に所属するか、又は、ＡｃＭＰＭＥ７７によって
   認識される高分子量の蛋白質の劣化生成物である特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載のポリペプチド組成物。 ５）分子量１７ＫＤ、１６ＫＤ及び１４ＫＤの３つの分
   子量種に所属する特許請求の範囲第４項によるペプチド
   組成物によってウサギを免疫することによって得たウサ
   ギの抗体によって認識される特許請求の範囲第１項又は
   第２項記載のポリペプチド組成物。 ６）アフィニティクロマトグラフィの支持体上に不動化
   したＡｃＭＰＭＥ７７上にポリペプチドのほぼ全量が固
   定可能とした特許請求の範囲第１−５項のいずれか１項
   記載のポリペプチド組成物。 ７）播種される紅斑性狼瘡（ＬＥＤ）を含み得る生物学
   的流体又は組織中の該ＬＥＤに相関させうる抗体を試験
   管中において検出するために、特許請求の範囲第１−６
   項のいずれか１項記載の組成物を、該生物学的流体又は
   組織中に時に存在する抗体とポリペプチドとの間の試験
   管内の免疫反応を許容する条件の下に、該生物学的流体
   又は組織と接触させ、時に形成される抗原−抗体複合物
   を試験管内において検出することから成る検出方法。 ８）播種される紅斑性狼瘡（ＬＥＤ）を含みうる生物学
   的流体又は組織中の該ＬＥＤに相関させうる抗体を試験
   管中において検出するために、ＡｃＭＰＭＥ７７によっ
   て認識されるポリペプチドを、該生物学的流体又は組織
   中に時に存在する抗体とポリペプチドとの間の試験管内
   の免疫反応を許容する条件の下に、該生物学的流体又は
   組織と接触させ、時に形成される抗原−抗体複合物を試
   験管内において検出することから成る検出方法。 ９）検査される生物学的媒質がヒトの血清である、ＬＥ
   Ｄの試験管内の診断に適用される特許請求の範囲第７項
   又は第８項記載の検出方法。 １０）生物学的流体又は組織中のＬＥＤの特徴的な抗体
   を試験管内において検出するための診断用キットであっ
   て、 ＡｃＭＰＭＥ７７によって認識される少なくとも１種の
   ポリペプチド、特に特許請求の範囲第１−６項のいずれ
   か１項記載の組成物と、 免疫反応を実現するための媒質を形成する反応物質と、 免疫反応によって生成する抗原−抗体複合物を検出可能
   とするための反応物質と、 必要ならば、特許請求の範囲第１−６項のいずれか１項
   記載の組成物によって認識される抗体を含まない基準の
   生物学的流体又は組織と、 必要ならば、該抗体を含む比較試料と を有する診断用のキット。 １１）抗原−抗体複合物を検出するための該反応物質が
   、標識を担持するか、又は、標識された反応物質によっ
   てそれ自体認識されうる特許請求の範囲第１０項記載の
   診断用のキット。 １２）特許請求の範囲第１−６項のいずれか１項記載の
   組成物によって特徴付けられるポリペプチドに対する抗
   体。 １３）ヒト、ハツカネズミ又はラットの細胞の表面から
   該ポリペプチドを選択的に抽出することを許容するよう
   に量を定めたエラスターゼ溶液中において、該細胞を培
   養し、単クローン抗体ＰＭＥ７７によって認識される該
   ポリペプチドを含有する上澄みを回収することによる特
   許請求の範囲第１−６項のいずれか１項記載の組成物の
   製造方法。 １４）４℃の温度で、５−１５分間、特に７分間、最終
   濃度５−２０μｇ／ｍｌ、特に１０μｇ／ｍｌのエラス
   ターゼの存在下に、ｐＨ８−８．５、特に８．２の緩衝
   溶液中において細胞の培養を行なう特許請求の範囲第１
   ３項記載の製造方法。 １５）アフィニティクロマトグラフィ支持体上において
   不動化した特許請求の範囲第１２項記載の抗体又は単ク
   ローン抗体ＰＭＥ７７に、該上澄みを接触させ、形成さ
   れた抗原−抗体複合物の解離溶液にアフィニティクロマ
   トグラフィの支持体を接触させて、保持されたポリペプ
   チドを回収することによって、補助的な精製を行なう特
   許請求の範囲第１３項又は第１４項記載の製造方法。