JPH05505596A - 尿中腫瘍関連抗原、抗原性サブユニットの使用および検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 サブユニットの　および 法 本発明は、ＮＩＨｇｒａｎｔ　Ｎｏｓ、ＣＡ　２９６０５、ＣＡ　１２５８２お よびＣＡ　３００１９によって一部分援助された。米国政府はある権利を有し得 る。

発朋コどえ景 本発明は一般に腫瘍関連抗原に関し、特に、腫瘍患者の尿に見いだされる抗原に 関するこれらの抗原は、免疫学的診断、免疫学的予後、およびヒト腫瘍の治療法 に用いられ得る。

インビボでの新生物への転換後、細胞が生化学的および形態学的に変化すること が、動物モデルで充分実証されている。

適切な量のそのような転換した新生物細胞は、次いで、充分な数の生存している 新生物（腫瘍）細胞に接種されると、同系動物の腫瘍の発達に対して防御免疫を 誘導し得る。防御免疫は、腫瘍特異的移植抗原と呼ばれる、ある新しい成分の出 現によるものであると決定された。ヒトの悪性腫瘍細胞による同様の成分（いわ ゆる腫瘍関連抗原）の発現は、自己のおよび同種異系のヒト血清を用いる血清学 的分析によって、抗体の源として同定されている。ヒト腫瘍細胞で免疫した動物 からの血清、およびヒト腫瘍に対して生じたネズミのモノクローナル抗体の使用 は、さらなる腫瘍関連抗原の定義を提供した。しかし、異種のポリクローナル抗 体あるいはネズミのモノクローナル抗体が定義したヒト腫瘍細胞上の抗原は、必 スシモヒトにおいて免疫原性を示さない。異種のポリクローナル抗体およびネズ ミのモノクローナル抗体によって定義されたほとんどすべての抗原の物理化学的 性質は細部にわたって解明されているが、このような情報は、自己抗体および同 種異系抗体によって定義される腫瘍関連抗原については、ごくわずかしか入手で きない。このような不足の理由は、引続き均質に精製するために充分な量の抗原 の可溶化が困難であること、ならびに自己抗体および同種異系抗体のポリクロー ナルな性質にある。宿主において免疫原性である充分特徴付けられた腫瘍関連抗 原が入手できない限り、免疫学的診断、免疫学的予後、およびヒト腫瘍の治療へ の適用に関してこれらの抗原の重要性は充分には理解されない。

自己抗体および同種異系抗体によって定義されてきたヒトの新生物の腫瘍関連抗 原は、その分布に関して多様である。

あるものは、特有の腫瘍細胞株あるいは腫瘍によってのみ発現される；あるもの は、腫瘍が発生する器官および胎児組織を含有する組織学的に異なる腫瘍によっ て共有される。膿瘍細胞株は一般に個々の腫瘍のすべてからは確立されず、そし て別の患者には適用し得ないため、特有の腫瘍によってのみ発現される抗原は免 疫学的診断および治療に対して重要性が乏しい。他方、組織型の等しい異なる腫 瘍あるいは組織学的に異なる腫瘍によって共有される腫瘍抗原は、異なる腫瘍型 を有する異なる患者の免疫診断、免疫予後および治療に適用し得る。

ヒトの増殖する新生物に対する免疫が、腫瘍細胞を有する抗原による能動免疫に よって増強し得ることを示唆する、充分に実証された例がある。このような能動 的で特異的な免疫療法の目的は、増殖する新生物によって自然に誘導されるレベ ル以上に抗腫瘍免疫のレベルを増強させようとする試みに向けられる。増殖する 新生物は、含有する腫瘍関連抗原に対する宿主の最大免疫応答を誘導しないと考 えられている。ヒトの腫瘍関連抗原の単離および精製における進歩が遅かったた めに、多くの免疫療法の試みは腸瘍細胞全体から調製したワクチンを用いてきた 。生きた自己腫瘍細胞は接種部位でのＩｎ瘍の増殖をもたらし得ることから、ヒ トではこのようなワクチンは使用されなかった。しかし、共有される通常の腫瘍 関連抗原を高レベルで発現する腫瘍細胞は、異なる患者を免疫するのに用い得る （　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｄ、　Ｌ、ら、Ｉｎ　Ｔｅｒｒｙ、　Ｗ、Ｄ、、　Ｒ。

ｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ、　（！＆ｉ）　：１ｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ　ｏ ｆ　Ｉｌｌｕｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　 Ｎｏｒｔｈ　１（ａｌｌａｎｄ、　ｐｐ　２４５−２４９　（１９８２）：　Ｌ ｉｖｉｎｇｓｔｏｎ　Ｐ、Ｏ，ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　ｃａｎｃｅｒ　３１：５６ ７　（１９８３））　ｏ　このような同種異系のワクチンを用いる利点は二点あ る＋（１）同種異系のワクチンを投与された腫瘍細胞上の異種ＨＬＡ移植抗原に 対して誘導された免疫応答は拒絶を引き起こす；　（２）この免疫処置によって 、ヒト白血球抗原（）ＩＬＡ）がヘルパー機能として役立ち得る、共有される通 常の交叉反応性腫瘍関連抗原に対して、強い免疫応答が誘導されるはずである。

ヒトの免疫療法での大部分の試みは、不活性化された腫瘍細胞、粗抽出物、ある いは単離された膜からの調製物から構成されるワクチンを用いてきた。このよう な調製物は進行性の腫瘍の増殖を除去するのに効果的であり得るが、単離−精製 過程を体系的にたどるための免疫学的試薬および高感度な技術が入手できない限 り、ワクチンの調製中に腫瘍関連抗原を不活性化させるという大きな危険が常に 存在する。

能動的で特異的な免疫療法に最も応答しそうな腫瘍患者は、疾病の初期の患者で あり、そして他の物理療法を用いた治療後、残存する腫瘍の負荷が最小限の患者 である（Ｍｏｒｔｏｎ　Ｄ、Ｌ、、　Ｓｅ＊１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇ ｙ　１３：１８０　（１９８６））。

凍結乾燥されて再構成された腫瘍患者の尿サンプルおよび抗体の源としての自己 血清を補体結合アッセイにおいて用いることによって、免疫学的反応性が観察さ れた。この反応性は腫瘍細胞によるこの血清の吸収によって消失したが、ヒトの 正常細胞によっては消失しなかった。これらの観察結果は、免疫学的に類似した 抗原が尿サンプルおよび腫瘍細胞中に存在することを示した。さらに、継続的に 調査された腫瘍患者の尿サンプルにおいて観察された反応性は、腫瘍の外科的切 除後消失したが、腫瘍の再発前に再び現れた（Ｇｕｐｔａ、　Ｒ，に、ら、Ｊ、 　Ｓｕｒｇ、　０ｎｃｏ１．、１１：６５　（１９７９））　ｏおそらく凍結乾 燥の過程で生じた人工産物のために、多くの試験サンプルの抗補体活性が高かっ たため、試験用に尿サンプルを調製するための異なる方法が開発された。この研 究では、より多数の腫瘍患者および対照の正常人から２４時間尿サンプルを得た 。尿サンプルを遠心分離および限外濾過によって１００倍に濃縮し、そして抗体 の源として自己血清を用いた補体結合によって試験した。

腫瘍患者は９２％（５５１５０）が尿中抗原に対して陽性であったのに対して、 対照の正常人はわずか７％（２／２７．）が陽性であった。

膿瘍患者からの尿に反応する血清の抗体活性は、腫瘍組織のバイオプンーによる 吸収によって除去されたが、正常な皮膚あるいは筋肉では除去されなかった。こ のことは、腫瘍患者の尿中に検出された抗原が腫瘍と関連することを示唆して０ る　（Ｒａｔｅ、Ｎ、Ｓ　ら、Ｊ、Ｓｕｒｇ、Ｒｅｓ、２９＋１８　（１９８０ ））。

その後の研究では、尿中の抗原に対して高力価を有する同種異系の血清が抗体の 源として用いられた。補体結合にお０てこの抗体の源を用いることによって、腫 瘍患者の９４．７％および対照の正常人の３５．１％の尿サンプルが陽性である ことが明らかになった。ここでも、（尿の源に対して自己の）腫瘍細胞による同 種異系の血清の吸収は抗体活性を除去した。しかし、ヒト正常リンパ球、皮膚お よび筋肉細胞には吸収剤としての効果がなかった。さらに、尿への抗原の排出は 患者の腫瘍の存在に依存しているようであった。なぜならば、治療手術による膿 瘍の除去によって、抗原と推定されたものの排出が止まったからである。患者に 腫瘍が見られなｔ）間は、尿（よ陰性のままであった（　Ｒａｔｅ、　Ｎ、　Ｓ 、ら、Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２６：２０３　（１９８０））。しかし 、正常尿の３５％に抗原が存在することにより、交叉反応性の抗原系が示された ため、この試験は実用化できなかった。

濃縮した尿をゲル濾過クロマトグラフィーによって、抗原活性が溶出プロフィー ルの第一ピークに存在することが明らかになった。しかし、この操作を６Ｍ尿素 の存在下で行うと、抗原活性はいろいろな分子の大きさを表す３個の異なるピー ク中に見いだされたが、第一ピーク中に大部分の活性が見られた。しかし、抗体 の源として用いられた同種異系血清のポリクローナルな性質のために、異なるピ ーク中の抗原活性力９表しているものが同じエピトープを有する大きな抗原性複 合体の解離産物であるのか、あるいは異なるエピトープであるのかを決定するこ とは不可能であった。凍結乾燥されて再構成された尿を用いたとき、同様の結果 が得られた（Ｒａｔｅ、　Ｎ。

Ｓ、ら、ｆＬＩｌｌｌｉ）。従って、自己抗体および同種異系抗体（こよって認 識されたａｍ患者の尿中の抗原は、実際は巨大分子複合体であり、そして抗体の ポリクローナルな性質のため↓こ、特定のエピトープの性質は決定し得なかった 。しかし、大１部分の証拠から、抗原性の巨大分子複合体の腫瘍患者の尿への排 出は腫瘍宿主中の腫瘍の存在に依存することが示唆された。

手術前に化学療法および放射線療法を受けた腸瘍患者の尿中膿瘍関連抗原の連続 的な測定が、補体結合によって行われた。

治療の結果としての尿への抗原の排出レベルが治療前のサンプルと比較され、そ の変化と、インサイチュでの腫瘍細胞の破壊の臨床病理的な証拠との相関が調べ られた。この方法で調査された５３人のＳ癌患者のうち、４４人には手術前の治 療菟こよって誘導された腫瘍破壊の臨床病理的な証拠力ｆ見られ、そして４４人 の患者すべてについて治療期間中、尿中の抗原のレベルが４倍あるいはそれ以上 増加した。その他の９人の患者には腫瘍破壊の証拠は見られず、そしてこれらの 患者の抗原力価は未変化のままであった。これらの結果がら、尿中腫瘍関連抗原 の排出は、観察しにくい腫瘍に対する殺腫瘍療法のインビボでの効果を評価する のに用い得ることが示唆された（Ｈｕｔｈ、　Ｊ、Ｆ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒ ｅａｔ、　Ｒａｐ、　６５：１０３７　（１９８１））　ｏ同様の結果が、高熱 および化学療法を受けた結腸膿瘍の患者において得られた。ここでも、見かけ上 健康な個人の尿における抗原活性の発生率は高く、すなわち１０％（２／２０） であった（Ｆｉｎｋ、Ｓ、Ｊ、ら、Ｊ、Ｓｕｒｇ、０ｎｃｏ！、２１：８１　（ １９８２））。

補体結合アッセイにおいて同種異系血清が抗体の源として用いられたので、尿サ ンプルとの免疫反応の一部は組織適合性抗原によるという可能性があった。従っ て、血清からできるだけ多（の抗−１（ＬＡ抗体を除去するために、血清がプー ルしたリンパ球で吸収された。これは、しばしば血清に抗補体活性を付与した。

この問題は、抗補体活性レベル以上に希釈された血清を用いることによって解消 された。しかし、このために結果としてアッセイの感度が低下した。さらに、試 験（尿）サンプルのいくつかはそれ自体が抗補体活性を示し、補体結合による尿 中の抗原の検出には不適当であった。これらの問題に取り組むために、競合的阻 害酵素免疫アッセイが開発された。このアッセイでは、既知量の自己抗体と腫瘍 関連抗原との間の反応性の同種異系床（試験）サンプルにょる競合的な阻害が、 試験サンプルが免疫学的に類似する抗原を含有する場合にのみ生じた。このアッ セイの結果は補体結合の結果と非常によく相関しているし、試験床サンプル中に 存在するＨＬＡによる抗補体活性および反応性の問題を扱う必要がない。しかし 、この試験は正常人の尿との反応性を示すめに、特異性に欠けていた（Ｈｕｔｈ 、　Ｊ、Ｆ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　４７：２８５６　（１９８１））。

ゲル濾過クロマトグラフィーによる尿中腫瘍関連抗原の分析によって、自己抗体 および同種異系抗体によってｍ！された抗原性複合体は３００　ｋＤより大きな 分子量を有することが一貫して示された。この抗原性物質は、単純拡散によって 腎臓の糸球体の基底膜を通過するには明かに大きすぎた。腫瘍患者におけるネフ ローゼ症候群の発生に関する文献がいくつか報告されている。これらの患者の腎 臓のバイオプシーによって、しばしば糸球体基底膜中の免疫複合体の沈着が証明 された（Ｌａｕｇｈｒｉｄｇｅ、　Ｌ、Ｗ、およびＬｅｖｉｓ、　Ｍ、Ｇ、、　 Ｌａｎｃｅｔ　１：２５６　（１９７１）：　Ｃｏｕｓｅｒ、Ｗ、Ｇ、ら、Ａ１ ．　Ｊ、Ｍｅｄ、５７：９６２　（１９７４））　、従って、インビボの腫瘍細 胞によって放出されて循環する抗原は、特異的な抗体と反応して、循環する免疫 複合体を形成するだろうと論理的に仮定された。これらの免疫複合体は糸球体の 基底膜中に沈着し、膜の損傷を引き起こし得て、そのことが高分子量の抗原性複 合体を尿へと通過させる。腫瘍患者の循環中の抗原非特異的免疫複合体と尿中抗 原の排出との間には相関関係が観察された。尿中抗原について陽性であった３６ 人の腫瘍患者のうち、２８人（７８％）はまた、尿採取の時に循環免疫複合体に ついてもまた陽性であった。循環免疫複合体について陰性であった２４人の患者 のうち、２２人（９２％）は尿の抗原についてもまた陰性であった。血清および 尿サンプルを熱化学療法の過程で連続して調査された腫瘍患者においては、循環 免疫複合体と尿中抗原の排出とのレベルの変動が相似していた。これらの結果は 、腫瘍患者の尿への尿中腫瘍関連抗原の排出は孤立した現象ではないこと；むし ろ、腎臓における免疫複合体の沈着は糸球体の損傷を引き起こし、それが尿中に この抗原を通過させるようであることを示唆した（　Ｈｕｔｈ、　Ｊ、Ｆ、ら、 　Ｃａｎｃｅｒ　４９：１１５０．　（１９８２））　。

尿中腫瘍関連抗原を腫瘍患者の予後のために適用できるか否かを決定するための 試みにおいて、抗原性複合体が部分的に精製され、競合的阻害酵素免疫アッセイ の標的抗原として用いられた。対照の正常人およびメラノーマ患者からの１００ 倍に濃縮した尿サンプルをベースライン、抗原の分布、および潜在性の再発の早 期検出を確立するために用いられた。この結果は個人を比較するための抗原ユニ ット（ｎｇ抗原性タンパク質／ｍｇクレアチニン／２４時間）として表された。

メラノーマ患者の尿の抗原レベル（メジアン＝　５６．５ユニツト、ｎ：５６） は対照の正常人のレベル（メジアン−１，９ユニツト、ｎ＝５６）よりも有意に 高かった（ｐ＜０．０５）。正常群の第９０％位は３４．３抗原二二ｙ）であっ た。この数値を陽性の基準として用いると、メラノーマ群の６４％（３６１５６ ）の尿サンプルが抗原に関して陽性であったのに対して、正常対照群は１１％（ ６１５６）か陽性であった。その後、リンパ節除去後の疾病の再発および非再発 を基準に１対とした、５８人のメラノーマ患者の波及的な分析によって、再発群 では抗原レベルのメジアンは６８ユニツトであり、非再発群では１８．９ユニツ トであることが示された。疾病が再発した２９人のメラノーマ患者のうち１８人 （６２％）および再発しなかった２９人の患者の９人（３１％）において尿中抗 原が陽性であった。これらの発生率には有意な差が見られた（ｐ＜０．００５） 　（Ｇｕｐｔａ、　Ｒ，に、ら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１：３０３　（１９８３））。上述の研究の結果は従来観察されていた内容を確 認したが、多くの（１１％）正常人の尿中にかなりの抗原レベルがあると一貫し て観察されるために、尿中抗原の検出アッセイの有用性ははっきりしないままで あった。

腫瘍宿主において免疫原性を示さない腫瘍マーカー、例えばＣＥＡ、α−フェト プロティン、前立腺特異的抗原などを用いたアッセイの開発に関して著しい進展 が遂げられたにもかかわらず、腫瘍宿主において免疫原性を示す腫瘍関連抗原を 用いて腫瘍を診断し、治療する必要性が存在する。本発明は、Ｕ”ＴＡＡを検出 すると同時に偽陽性の検出を避けることによって、いろいろな腫瘍の検出を可能 とすることにより、このような必要性を充足させる。さらに本発明は、Ｕ−ＴＡ Ａの抗原性サブユニット、および腫瘍細胞の表面上の個々の決定因子に対して細 胞に媒介される特異性を誘導するワクチン、および抗Ｕ−ＴＡＡ抗体産生を提供 する。

発朋ヱど」旨 本発明は、β−メルカプトエタノールによる還元および５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動による分離後に約９０から１００　ｋＤの分子量を有する、実 質的に精製された、尿中腫瘍関連抗原の抗原性ポリペプチドサブユニットを提供 する。本発明は、モノクローナル抗体、腫瘍を検出する方法、免疫治療の方法、 悪性度をモニターする方法、尿中腫瘍関連抗原を検出する方法、尿中腫瘍関連抗 原に関係するワクチンおよび他の方法もまた提供する。

図面の簡単な説明 図１は、濃縮したメラノーマ患者の尿のセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　 Ｓ−２００ゲル濾過クロマトグラムを示す。タンノでり質含量（吸光度２８０　 ｎｍ）　、および同種異系二重決定因子ＥＩＡによって測定されたＵ−ＴＡＡ活 性（ｎｇ／１００μｌ）を示す。

図２は、ＤＥＡＥアフィゲルブルー（Ａｆｆｉ−Ｇｅｔ　Ｂｌｕｅ）りＧｌ？ト ゲラフイーによる、υ−ＴＡＡに対するひひＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の精製 を示す。最初にＩｇＧ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体が溶出し、６ｏ　＋ｎｌ／ｈｒの流速で ０．５Ｍ　ＮａＣ１によってＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体が溶出した。ＩｇＧを含有 するフラク／−Ｉンのプールはタンノ４り質濃度が３．５　ｍｇ／ｍｌであり、 そして抗ＩＪ−ＴＡＡ力価は１　：２５０．　ｏｏｏであった。１ｇＭフラクシ ョンのプールはタンパク質濃度が３．７　ｍｇ／ｍｌであり、そして抗Ｕ−ＴＡ Ａの力価は、精製されたＵ−ＴＡＡ　（３０ｎｇ／ウェル）を襟的として用いる と１：３６００であった。

図３は、補体依存細胞毒性アッセイにおける細胞溶解に対する、ＵＣＬＡ−Ｓｏ −Ｍ１４　（Ｍ１４）および自己のリンパ芽球様（Ｌｉ２）細胞によるひひ抗Ｕ −ＴＡＡ　ＩｇＭ抗体の吸収の効果を示す。ひひＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡの細胞毒性 効果はｌＸ１０７のＭ１４細胞での吸収によって完全に消失したが、同数のＬ１ ４細胞では有意な影響は見られなかった。

図４は、精製されたＵ−ＴＡＡによる、ひひＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の補体依存 性アッセイ（ＣＤＣ）に対する効果を示す。表示した最終希釈度になるように、 抗体（３，７ｍｇ／ａｔ）をＲＩ’ＭＩ（Ｑ％ＦＣ３で希釈し、等量のＵ−ＴＡ Ａ　（０，０６１ｇ／ｍｌ）と混合した。精製されたＵ−ＴＡＡは、各抗体希釈 液で細胞融解を有意に減少させた。

図５は、ＡＤＩ−４０Ｆ４反応性メラノーマ患者の血清のＤＥＡＥセファセル（ ５ｅｐｈａｃｅｌ）陰イオン交換クロマトグラムを示す。タンパク質含量（吸光 度２８０　ｎｕ）　、ＩｇＧの存在、ＩｇＭの存在、および異種二重決定因子Ｅ ＩＡによって測定したＵ−ＴＡＡ活性（０，Ｄ。

４ｏ５，１．）を示す。

図６は、メラノーマ患者の血清から精製され、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離さ れ、次にニトロセルロース紙に移されたＵ−ＴＡＡを示す。ネズミのモノクロー ナル抗体およびポリクローナルひひ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体は両方とも９０　ｋＤａサ ブユニットを認識する。

図７は、内因性標識（”Ｃ−Ｌ−ロイシン）メラノーマ（ＵＣＬＡ−Ｓｏ−Ｍ１ ４）細胞のＮＰ−４０抽出物をヒトポリクローナル抗体と反応させることによっ て形成された免疫沈降物の５ＤＳ−ＰＡＧＥのプロフィールを示す。抗体は、精 製されたＵ−ＴＡＡで処理する前（Ａ）および処理した後（Ｂ）に用いた。

図８は、メラノーマ患者の血清から精製されたＵ−ＴＡＡの等電点電気泳動を示 す。等電点電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース上にプロットし、ひひポ リクローナル抗Ｕ−ＴＡＡ抗血清で染色した。等電点６１に対応する単一のバン ドが同定された。

図９は、外科的治療を行ったメラノーマ去者の尿におけるＵ−ＴＡＡの出現と臨 床的に検出される疾病の再発との間の時間差を示す。

図１０は、３種のメラノーマ細胞株（ＵＣＬＡ−Ｓｏ−ＭＩＯｌＵＣＬＡ−ＳＯ −Ｍ２４、およびＵＣＬＡ−Ｓｏ−ＭＩＯｌ）　ｉ：よるＵ−ＴＡＡ発現レヘし ニ対するγおよびαインターフェロンの効果を示す。細胞は、５００ユニツト／ ｌｌ１ｌのγおよびαインターフェロンの存在下および非存在下で９６時間、Ｒ ＰＭＩ−１０％ＦＣＳ培地中で培養した。Ｕ−ＴＡＡレベルは、同種異系抗体お よび精製されたＵ−ＴＡＡ　（０，０８１１１ｇ／ｍｌ）を用いる競合的ＥＬＩ ＳＡによって測定した。

図１１は、同種異系抗１ｌ−ＴＡＡ血清とｔｌｃＬＡ−Ｓｏ−Ｍ２４　（メラノ ーマ）細胞との間の間接的膜免疫蛍光法によって観察された、精製されたＵ−Ｔ ＡＡによる反応阻害を示す。種々の希釈度の抗Ｕ−ＴＡＡ血清を、１．０μｇ　 Ｕ−ＴＡＡと一緒にブレインキュベーションし、次にメラ／−マ細胞と反応させ た。未処理の抗血清は１：Ｘ６希釈で反応性を維持したが（ロ）、精製されたＩ Ｉ−ＴＡＡと一緒に血清をブレインキュベーションした後は、９３％がブロック された（■）。

図１２は、ヒトリンパ芽球様細胞株の一種（ＬＣＬ　２）　ｌこよって抗Ｕ−Ｔ ＡＡ　ＩｇＭ抗体が６ケ月を越える期間連続して産生されたことを示す。細胞は 、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地中で増殖させた。培養上清を一定の時間間隔で集め、そ して精製されたＵ−ＴＡＡ　（３０ｎｇ／ウェル）を用いる直接的ＥＬ　ＩＳＡ によって、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の両方の存在について試験した。培養細胞は ＩｇＭ抗体のみを産生じた。

図１３は、内因性標識（”　Ｃ−Ｌ−ロイシン）ＵＣＬＡ−Ｓｏ−Ｍ１４　（メ ラノーマ）細胞の無細胞ＮＰ−４０抽出物のセファクリルＳ−２００溶出のプロ フィール、およびＬＣＬ　２ヒトリンパ芽球様細胞の培養上清とのいろいろなピ ークの反応性を示す。各プール１００μｍを３７℃で１時間ＬＣＬ　２培養土清 １００μｌと反応させた。抗体に結合した放射能を、ウサギ抗ヒＮｇ免疫ビーズ によって非結合の放射能から分離した。バックグラウンドを低減するために、無 細胞ＮＰ−４０抽出物を免疫ビーズで前処理した。抗原活性はフラクンコン３９ から４５までを含むピーク中に存在した。

図１４は、Ｕ−ＴＡＡに対するＬＣＬ２．６培養上清の反応性がＵ−ＴＡＡによ ってブロックされたが、ＦＡによってはブロックされなかったことを示す。上清 の各希釈液を１００μｍ（６μｇ）のＵ−ＴＡＡあるいは１００μｌ（５μｇ） のＦＡのいずれかでブロックする前およびブロックした後、この上清を直接的Ｅ ＬＩＳＡによってＵ−ＴＡＡと反応させた。

図１５は、ＦＡに対するＬＣＬ　２．６培養上清の反応性がＦＡによってブロッ クされたが、Ｕ−ＴＡＡによってブロックされなかったことを示す。ブロック法 は図１４について記載したように行っ図１６は、Ｕ−ＴＡＡ特異的免疫複合体検 出アッセイの概略図を示す。このアッセイでは抗Ｕ−ＴＡＡネズミモノクローナ ル抗体であるＡＤＩ−４０Ｆ４を利用している。免疫複合体は固定化抗体（抗Ｕ −ＴＡＡ）と反応する。抗原によるヒト免疫グロブリンの捕獲は、ＥＬＩＳＡと 類似の方法によってウサギあるいはヤギ抗ヒトＩｇを用いて測定される。

図１７は、メラノーマ患者における、［１−ＴＡＡ特異的免疫複合体レベル（Ｏ Ｄ　４０５ｎｍ）と臨床経過（再発）との間の相関関係を示す。第■期の疾病の 患者が、早期疾患の外科的切除およびリンパ節除去によって治癒された。患者が 検査のために診療所を訪れるたびに、血清サンプルを採取した。図１６に概説し たアッセイによって、血清サンプルをＵ−ＴＡＡ特異的免疫複合体についてアッ セイした。臨床的に検出できる再発よりも、患者＃１では少な（とも３４週前、 そして患者＃２では少なくとも２８週前に、血清がＵ−ＴＡＡ特異的免疫複合体 について陽性となった。ＮＥＤ＝疾病徴候なし。

１阻亘註亙ｌ説亙 本明細書中で用いる「尿中癌関連抗原（Ｕ−ＴＡＡ）　Ｊとは、メラノーマ患者 の尿中に最初に検出されたが、その後さらに他の体液中にも見いだされた高分子 量の糖タンパク質を意味する。

本発明では、この抗原Ｕ−ＴＡＡは、ＤＥＡＥセファセル陰イオン交換クロマト グラフィーによって大部分の正常な血清タンパク質から分離された。ヒトではＵ −ＴＡＡは免疫原性を有するにもがかわらず、抗原の大部分はカラムの第二ビー クにおいて抗体を含まずに溶出した。これらの研究において用いられた血清はネ ズミのモノクローナル抗体との高い反応性を基準にして選択されたので、この観 察結果は不思議ではなかった。従って、このような高レベルの循環Ｕ−ＴＡＡを 有する患者は相対的に抗原が過剰にあると見込まれ、免疫グロブリンを含まない 抗原を単離することが予期される。主要なＩｇＧピークおよび１ｇＭピークと会 合した少量のＵ−ＴＡＡがみられることがら、若干の抗Ｕ−ＴＡＡ抗体が免疫複 合体の形で存在することが示唆された。同種異系抗体を用いたときＵ−ＴＡＡに ついて陽性であったメラノーマ患者からの尿サンプルはすべて、ネズミのモノク ローナル抗体とも反応した。同種異系抗体アッセイにおいて陰性であった尿サン プルは、モノクローナル抗体アッセイでも陰性であった。さらに、このモノクロ ーナルは、ＵＣＬＡ−３ｏ−Ｍ−１４培養メラノーマ細胞の上清の濃縮されて部 分的に精製されたフラクションと反応した。このことは、メラノーマ患者の尿中 に排出された抗原と免疫学的に類似する抗原が、培養メラノーマ細胞によっても 産生されることを示唆している。メラノーマ患者の尿中のモノクローナル反応性 分子は、同種異系抗体反応性Ｕ−ＴＡＡと多くの特徴を共有している。

混合グリコシダーゼ処理によって、同種異系抗体アッセイによって測定された正 常人からの尿サンプルのＵ−ＴＡＡ活性が消失した。しかし、メラノーマ患者か らのサンプルを同様に処理すると、大多数の患者において、Ｕ−ＴＡＡ活性が有 意に増加した。この観察結果は、同種異系抗体反応性エピトープが多様なグリコ ジル化部位を有する大きな分子上に存在するタンパク質であるという見地と矛盾 しない。この筋書によれば、グリコンダーゼ処理は分子から炭水化物を除去して 、さらなる免疫反応性エピトープを曝すことになる。

この理論は、モノクローナル反応性エピトープの酵素消化によってさらに支持さ れる。ヒアルロニダーゼで処理してもエピトープの免疫反応性に対してほとんど 影響が見られないが、プロテアーゼで処理するとこの反応性が破壊される。混合 グリコシダーゼ処理はこの分子の免疫反応性をも増強する。

メラノーマに対して特異的な非常に多くのネズミのモノクローナル抗体が、マウ スをメラノーマ細胞全体あるいは、細胞抽出物で免疫することによって産生され てきた（例えば、Ｌｌｏｙｄ、に、Ｏ，、Ｂａ５ｔｅ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａ ｌ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｒ，Ｈｅｒｂｅｒ＋ｎａｎｍ　Ｎ１ ｊｈｏｆｆ、　Ｔｈｅ　Ｈａｇｕｅ、　ｐｐ　１５９−２１４　（１９８３）） 　ｏ同種異系免疫反応性タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体は、比 較的まれである（　Ｈａｄａｓ、　Ｅ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４６：５ ２０１−５２０５　（１９８６））。

メラノーマ患者の尿および正常人の尿からなるサンプル群に対してハイブリドー マ上清をスクリーニングすることによって、腫瘍関連タンパク質に対して特異性 を有する１個のクローンを同定することが可能であった。得られた抗体は、正常 患者よりもメラノーマも者の尿中および血清中に高頻度に出現するタンパク質エ ピトープを認識した。従って、ネズミのモノクローナル抗体はヒト腫瘍の免疫診 断および免疫予後に対して重要である。

本発明は、β−メルカプトエタノールによる還元および５ＤＳ＝ポリアクリルア ミドゲル電気泳動による分離後、分子量が約９０−１００　ｋＤである尿中腫瘍 関連抗原（Ｕ−ＴＡＡ）の、実質的に精製された抗原性ポリペプチドサブユニッ トを提供する（血清からのサブユニットは約９０　ｋＤであり、尿中からのサブ ユニットは約１００　ｋＤであったが、ネズミのモノクローナル抗体は各サブユ ニットを認識するので、同じサブユニットに相当する）。尿中腫瘍関連抗原は、 疾病を有するメラノーマ患者の６４％の血清中に検出されたが、見かけ上正常な 個人からの血清中ではまれにしか検出されなかった。ＤＥＡＥセファセル陰イオ ン交換クロマトグラフィーによって精製されたこの抗原は、熱に対して安定であ り、非還元条件下での５９０−６２０　ｋＤの範囲の分子量、および６．１の等 電点を有する。還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって、この高分子量の抗原は いくつかの構成成分に解離する。

ネズミのモノクローナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４によって認識されたエピトープは 、尿中腫瘍関連抗原の９０−１００　ｋＤサブユニット上にのみ存在する。しか し、このサブユニットはさらに、ひひ、およびヒトポリクローナル抗血清によっ て認識されるエピトープを含有している。これは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ免疫プロッ ト法によって決定された。ネズミのモノクローナル抗体によって４２されるエピ トープは、ヒトポリクローナル抗体によって認識されるエピトープとは異なる。

疾病患者の体液からのＵ−ＴＡＡをネズミのモノクローナル抗体に接触させるこ とによって、一定量の体液あたりのＵ−ＴＡＡの量を、同一人のサンプルについ て以前に測定した量と比較し得る；　ＩＩ−ＴＡＡの変化は悪性状態の変化を示 す。従って、悪性度をモニターすることは、疾病患者の体液を繰り返しアツセイ して、体液中に存在するυ−ＴＡＡあるいは９０−１００　ｋＤサブ二ユニノド の量を測定する工程をさしている。アッセイは、患者の治療の初期、治療中、お よび治療後において行われ得る。最初は、Ｕ−ＴＡＡレベルは非常に高（、この 抗原の高いターンオーｔｚＨ−あるいは放出を示し得る。しかし、治療後および 例えばワクチン投与による腫瘍細胞の増殖阻害後、患者の体液中のＵ−ＴＡＡレ ベルは減少し得る。

本発明は、β−メルカプトエタン−ルによる還元および５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動による分離後、患者の体液中の１３−ＴＡＡからの４５．６５ ．９０−１００、あるいは１２０　ｋＤのポリペプチド上に位置するエピトープ を検出する工程を包含する方法によって、患者の腫瘍の診断を可能にする。ポリ ペプチドをある試薬と接触させて、ポリペプチドと反応する試薬の存在を検出す ることによって、検出が行われ得る。

本発明は、患者の胸部あるいは肺のカルシノーマを検出する方法であって、該患 者のサンプルからのＵ−ＴＡＡの存在を検出する工程を包含する方法を記載する 。検出方法は、Ｕ−ＴＡＡをある試薬と結合させ、該試薬を検出する工程を包含 する。検出の一つの例として、第二の試薬によるＵ−ＴＡＡへの間接的な、ある いは直接的な結合がある。試薬は好ましくは抗体であるが、任意の適切な試薬で あり得る。

本発明は、細胞表面上にＵ−ＴＡＡ、およびＧＭ−２、ＧＤ−２、胎児抗原、あ るいはメラノーマ腫瘍関連抗原から構成される群から選択される少なくとも１個 の腫瘍関連抗原を有する膿瘍細胞、ならびに薬理学的に許容されるキャリヤー、 を包含する９０−１００　ｋＤのポリペプチドに対して、抗体あるいは細胞性免 疫を誘導あるいは増強するワクチンを提供する。該腫瘍細胞が細胞表面上に患者 と同じ型のＨＬＡを有するならば、結果は改善され得る。該ワクチンは、癌患者 において、分子量が約９０−１００　ｋＤであるＵ−ＴＡＡのポリペプチドサブ ユニ・ノドに反応性を示す抗体の産生を誘導あるいは増強する方法を提供し、該 方法は患者に効果的な投与量のワクチンを投与する工程を包含する。

本発明はヒトを被検者とするが、しかし、任意の動物に用い得る。ワクチン投与 後各個体内に産生された抗体は、癌、例えばメラノーマを阻害し、あるいは治療 する。癌を阻害することは、細胞の増殖を妨げ得る試薬に腫瘍細胞を接触させ、 その結果、細胞を殺して、腫瘍の大きさを減少させる能力をさしている。あるい は、阻害することは膿瘍細胞に対する直接的な細胞毒性効果を包含し得る。

（以下余白） また、本発明は、尿中腫瘍関連抗原に反応する抗体に反応する試薬の開発を可能 とする。これらの試薬は抗イデイオタイプ抗体であり得、抗イデイオタイプ抗体 とは、問題の抗原の内部イメージを有する免疫グロブリンを指す。イディオタイ プは抗体結合部位の抗原性決定因子であり、そのため、抗イデイオタイプ抗体は 、抗原の抗原性エピトープを模倣する。

本発明は、治療上必要な量の抗イデイオタイプ抗体を被検者に注射することを包 含する免疫療法を提供する。治療上必要な量とは、腫瘍細胞に細胞増殖抑制また は細胞毒性の効果を効果的にもたらす量であり、これらの効果は当業者によって 容易に測定し得る。

Ｕ−ＴＡＡが腫瘍細胞の表面に見られるという発見によって、腫瘍細胞表面のＵ −ＴＡＡに反応する腫瘍抑制試薬を被検者に注射することを包含する、被検者の 腫瘍細胞表面にＵ−ＴＡＡを発現させる腫瘍の治療方法が可能になる。該試薬は 抗体であり得、該抗体は細胞毒性または細胞増殖抑制剤に付加され得る。該細胞 毒性または細胞増殖抑制剤は、たとえば、トキシン、放射性同位元素で標識され た成分および化学療法剤からなる群か、ら選択し得る。

本発明は、また、腫瘍細胞をマウスのモノクローナル抗体に接触させ、結合抗体 を検出することを包含する、バイオプシーから腫瘍細胞上のＵ−ＴＡＡを検出す る方法を提供する。核酸または抗原の存在を検出する本発明の方法は、細胞の核 酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション、およびポリクローナルもしくは モノクローナル抗体を用いる細胞染色を包含する。このような技術は当業者に公 知の方法によって達成される。

本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸、および該核酸との選択的な ハイブリダイゼーションが可能な核酸プローブも提供する。該核酸は、本発明に より提供される抗原性サブユニットによって決定される、Ｕ−ＴＡＡ上のエピト ープの抗原性部位をコードし得る。さらに、該核酸は、抗イデイオタイプ抗体上 の抗原性の配列、および該抗イデイオタイプに対応する核酸との選択的なハイブ リダイゼーションが可能な核酸プローブに対応し得る。

本発明は、被検者の腫瘍をインビボ内で検出する方法を提供するが、この方法は 、腫瘍細胞表面上のＵ−ＴＡＡに反応する試薬、たとえば抗体を被検者に注射し 、Ｕ−ＴＡＡに反応する試薬の存在を検出し、それによって腫瘍を検出すること を包含する。該腫瘍は、たとえば、メラノーマ、サルコーマまたはカルシノーマ であり得る。

本発明は、さらに、低いレベルのＵ−ＴＡＡの検出方法を提供するが、この方法 は、アルファおよびガンマインターフェロン、またはレチノイン酸などの他の生 体応答調節物質を用いて癌細胞中のＵ−ＴＡＡの発現を促進し、このＵ−ＴＡＡ を試薬に接触させ、試薬の存在を検出することを包含する。抗癌剤としてインタ ーフェロンを用いることは、現在集中的に研究されている。

免疫またはガンマインターフェロンは、感作したリンパ球が特定の抗原によって 刺激を受けた際に産生される。インターフェロンは被検者に注射でも投与し得る 。ガンマインターフェロンは、いくっがの遺伝子の発現を誘導、促進または抑制 することを示されている。誘導されるものの中には、Ａ、　Ｂ。

Ｃを含むＥＩＬＡ遺伝子がある。ＨＬＡ遺伝子の発現によって、ある種の細胞は より容易に認識され免疫系によって浄化される。驚くべきことに、ガンマインタ ーフェロンは、いくっがの細胞株中でＵ−ＴＡＡの発現をも促進することがわが っている。

メラノーマ腫瘍細胞ワクチン（ＭＣＶ）は、４つのよく特徴付けられた腫瘍関連 抗原を発現する同種異系のメラノーマ細胞株を用いるが、これらはすべて人体に おいて広く免疫原性を示す。Ｕ−ＴＡＡを発現する、照射されたメラノーマの全 細胞を投与すると、ＩｇＧおよび１ｇＭアイソタイプの双方の抗Ｕ−ＴＡＡ抗体 が誘導される。抗Ｕ−ＴＡ’Ａ　ＩｇＭ力価の２〜５倍の増加が１５人の患者の うち１１人に検出された一方、ＩｇＧ反応は１５人の患者のうちたった６人に見 られただけであったことには注目すべきである。

ＩｇＭ反応が必ずしもＩｇＧ反応に翻訳されない理由は、容易に明かにはならな い。しかし、おそらく、この糖タンパク貫の高分子の多糖成分が、Ｔ細胞に依存 しない機構によってＩｇＭ抗体を誘導したのであろう。この結果、観察されたよ うに、後でＩｇＧへと切り替わることのない親和力の低いＩｇＭが少量生成され た。

ＭＣＶに反応して誘導された抗体の特異性に関しては、このワクチンは、ワクチ ンおよびアジュバントを含めてメラノーマ細胞に関連した抗原群に対する抗体を 誘導するはずである。

メラノーマ患者の尿から精製され、モしてＥＬＩＳＡにおける標的抗原としてメ ラノーマ細胞の表面に発現される１ｌ−ＴＡＡを用いた。

従って、この研究で観察される、抗体活性およびＭＣＶへの反応によるその上昇 はＵ−ＴＡＡに特異的なもののはずである。しかし、この研究で検出される抗体 の非特異的反応の可能性をなくすために、メラノーマ患者からの血清サンプルを 、標的抗原としてのＫＬ［ｌに反応させた。これらの患者における抗ＫＬＢ抗体 レベルは、免疫療法の間に変動したが、抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の上昇とは一致しなか った。さらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を希釈緩衝液に加えると、Ｕ−Ｔ ＡＡが標的抗原として用いられた時の抗体レベルに影響を及ぼす。このように、 血清サンプルのポリクローナルな性質にもかかわらず、この研究で観察された抗 体レベルの上昇はＵ−ＴＡＡに特異的なものであった。

ＭＣＶに関して一般に見られる一過性の抗体反応に対する通常の説明は、Ｔ−ヘ ルパーおよびＢ−細胞活性化に伴うＴ−サプレッサー細胞の誘導である。この特 異なサプレッサー効果を回避するために、様々な免疫学的操作が過去に試みられ 、時には成功してきた。この点において、シクロホスファミドが多く用いられて きており、Ｔ−サプレッサー活性化を抑制することが知られている。例えば、Ｂ ｅｒｄ、　Ｄ、ら、　Ｃａｎｅ、　Ｒｅｓ、４６：２５７２　（１９８６）を参 照のこと。この試みの中で、まさにこの問題に取り組む努力において、１つの治 療手段はシクロホスファミドを包含していた。シクロホスファミドが抗Ｕ−ＴＡ Ａ抗体反応の発生率または強度に影響を及ぼすという兆候はなかった。しかし、 この薬剤を受けている患者においては、抗Ｕ−ＴＡＡ免疫が持続していたことも あり得る。

正常な尿の抗原活性は、混合グリコンダーゼを用いた処理によって完全に消失し 、プロテアーゼを用いると実質的には全く消失しなかった。反対に、メラノーマ の尿における抗原活性は、混合グリコシダーゼにはほとんど影響されず、プロテ アーゼおよびカルボ牛ンベプチダーゼには非常によく影響された。これらの結果 から、正常な尿の抗原交差反応性は、癌患者の尿中腫瘍関連抗原複合体の炭水化 物部分によるものだということがわかった。これらの炭水化物部分は、正常な尿 中の分子上、および癌患者の尿中の尿ＴＡＡ複合体上に存在する。従って、本発 明は、癌に由来する尿中抗原複合体を持つ被検者において癌を検出し、モニター する方法を提供する。

この方法は、被検者からサンプルを取り出し、サンプル内の尿中抗原複合体の炭 水化物部分を、尿中膿瘍関連抗原に結合する試薬との結合を防止するように変化 させ、変化した尿中抗原複合体の少なくとも一部を検出し、それによって癌を検 出することを包含する。変化させるということは、尿中抗原複合体の炭水化物部 分との試薬の結合に由来する偽陽性の数を防止する、または減少させる、あらゆ る変化を意味する。

このような変化は、たとえば炭水化物部分を還元することによって達成し得る。

また、本発明は、β−メルカプトエタノールによる還元および５ＤＳ−ポリアク リルアミドゲル電気泳動による分離の後に４５ｋＤおよび６５ｋＤのポリペプチ ドサブユニット上に位置し、そしてヒト血清との反応性を有する、尿中腫瘍関連 抗原の２つのエピトープを提供する。さらに、本発明は、β−メルカプトエタノ ールによる還元および５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分離の後 に、１２０ｋＤのポリペプチドサブユニ’ｙト上に位置し、そしてヒヒポリクロ ーナル抗体との反応性を宵する、尿中腫瘍関連抗原のエピトープを提供する。ま た、本発明は、同様の還元の後に９Ｏ−１００ｋＤのポリペプチドサブユニット 上に位置し、そして本発明において提供されるマウスモノクローナル抗体との反 応性を有する尿中腫瘍関連抗原のエピトープをも提供する。４つの異なったエピ トープの証明は、本明細書に教示されるように、異なった型の抗体の間に交差反 応性がないことによって証明される。

抗原性の明瞭なエピトープの存在によって、サンプル中の尿中腫瘍関連抗原を検 出する方法が可能になる。この方法は、尿中腫瘍関連抗原上のあるエピトープと 結合する第一の試薬に尿中腫瘍関連抗原を接触させ、尿中腫瘍関連抗原上の第二 のエピトープと結合する第二の試薬に尿中腫瘍関連抗原を接触させ、試薬のうち の１つを固体の担体に結合させ、結合していない試薬の存在を検出し、それによ って尿中腫瘍関連抗原の存在を検出することを包含している。試薬は抗体であり 得、第一の抗体はモノクローナルであり得、第二の抗体はポリクローナルであり 得る。さらに、試薬は、尿中腫瘍関連抗凍上のエピトープと結合する前に、固体 の担体に結合され得る。

以下の実施例は本発明を説明するものであって、限定するものではない。

、ｔｌＬ五−上 か゛のＵ−ＴＡＡの　ｌ：肝臓および！ＩＸ臓に転移の見られるメラノーマ患者 の尿からＵ−ＴＡＡを調製した。尿は２４時間にわたって（１，ＩＭトソス（ｐ ｆ１８．３）および防腐剤としてのａ、ＯＺ％のアジ化ナトリウム中に集められ た。２す１トルの尿を排除限界１゜、０００ダルトンのホローファイバー濃縮器 （Ａ＋１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）を用いて２０ｍ１に 濃縮した。濃縮物７ｍｌを、１００　ｘ２　ａｍのセファクリルＳ−２００カラ ムに載せた。ＰＢＳを溶出剤として用い、流速１４．５　＋ｓｌ／ｈｒ、で、３ ．５＋＊ｌずつの画分を集めた。溶出プロフィールは２８０ｎ１１でモニターし た。画分のＵ−ＴＡＡ活性を同種異系抗体を用いて二重決定因子ＥＩＡにおいて アッセイした。

最も大きいＵ−ＴＡＡ活性を示した画分をプールし、限外濾過（ＰＭ−２０膜、 Ａ＋ｏｉｃｏｎ　Ｃａｒｐ、、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）によって７ｍｌ に濃縮した。濃縮物をさらに２０％（Ｖ／Ｖ）ウサギ抗ヒト免疫グロブリン免疫 ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｅｈｍｏｎｄ、　 ＣＡ）と共に３７℃で１時間インキニベーションして精製した。この精製した抗 原のタンパク質含量をローリ−法（Ｌｏｖｒｙ、　Ｏ，Ｈ，ら。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１９３：２６５−２７５　（１９５１）参考ま でに援用）によって算定した。このようにして調製した抗原を、免疫アッセイに おける標準または標的として、ならびに異種抗体およびネズミモノクローナル抗 体の生成のための免疫原として用いた。

得られた両分のＵ−ＴＡＡ活性を同種異系二重決定因子ＥＩＡによって測定した 。このアッセイにおいて、抗原を捕獲するために抗ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭを、検出 抗体として同種異系抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧを用いた。全タンパク質のわずか０． ５％を含有しているだけにもかかわらず、セファクリルＳ−２００カラムのボイ ド容積は、この尿中で検圧可能なＵ−ＴＡＡ活性全体の６３％を含有していた。

これは、Ｕ−ＴＡＡの１０５倍の濃縮を示している（図１）。Ｕ−ＴＡＡの１８ ％をクロマトグラムの第二のピークで検出したが、この研究では第一ピークのみ を標的抗原または免疫原として用いた。この患者から２４時間にわたって集めた 尿から、典型的には［１−ＴＡＡが０、７ｍｇ得られた。

人Ｗ−は ヒｌ−＝　ｙ、Ｕ−ＴＡＡ　Ｉ　Ｍオヨヒｌ　Ｇ　体ｔ：Ｄ　：　＊ｆ、高い抗 ＩＪ−ＴＡＡ抗体レベルを示すメラノーマ患者の血清からＩｇＧおよびＩｇＭを 単離し、Ｕ−ＴＡＡ検出のための二重決定因子ＥＲＡにおいて用いた。ＩｇＧは ＤＥＡＥアフィゲルブルークロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｅｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）によって単離した。

ＬＯｍ＋の血清を緩衝液を４回交換しながら０．０２Ｍの燐酸カリウム緩衝液（ ｐ）１８．０）　２１Ｊツトルで４８時間透析した。透析に続いて、血清を８０ ０　ｘ　ｇで１５分間遠心機にかけ、上清をＤＥＡＥアフィゲルブルーの体積３ ５ＩＩｌｌのべ／ドに通し、燐酸カリウム緩衝液で溶出した。この溶出物を１０ ｍ１ずつの画分て集めた。２８Ｏｎ田において０．０５より大きい吸光度を示し た画分をプールし、１０１ｍ１に濃縮した。濃縮物の同種異系抗Ｕ−ＴＡＡ　Ｉ ｇＧレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。調製 したＩｇＧは２．２３ｍｇタンパク質／ｍｌを含有し、１：２５６０の抗Ｕ−Ｔ ＡＡ力価を有していた。

ＤＥＡＥアフィゲルブルーに結合したままのタンパク質を、０゜５ＭノＮａＣｌ 　（ｐＨ８，０）を補充した０、０２Ｍノ燐酸緩衝液で溶出し、１０ｍ１に濃縮 した。抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ抗体をより濃縮するために、濃縮物をセファクリル Ｓ−３００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｕｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）ゲル濾過 クロマトグラフィーにかけた。ＥＬＩＳＡにより抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ抗体活性 を含有する画分をプールし、濃縮した。調製したＩｇＭは０．８９膜ｍｇタンパ ク質／ａ＋１を含有し、ｌ：１５０の抗Ｕ−ＴＡＡ力価を存していた。これらの 抗体はＵ−ＴＡＡの捕獲アッセイにうまく用いられてきた（　Ｅｕｈｕｓ、　Ｄ 、ら、　Ｔｈｅ　ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２（５）：Ａ１８３６（１９８ Ｂ））。単離した抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体はＵ−ＴＡＡに強（反 応したが、正常の尿成分にはほとんど、またはまったく反応性を示さなかった。

支１九」ユ Ｕ−ＴＡＡ゛の　生：抗Ｕ−ＴＡＡ異種抗血清をヒヒにおいて調製し、Ｕ−ＴＡ Ａ検出のためのＥＬＩＳＡおよび免疫プロット法において使用した。体重２８ｋ ｇの１２才の雄のヒヒに、所定のく１〜４週開）間隔で、同体積のＭｙｌａｎｔ ａ　（Ｓｔｕａｒｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏ ｎ、　ＤＥ）と混合したｔｏｏμｇのＵ−ＴＡＡを筋肉的注射した。このヒヒか ら定期的に血液採取し、血清の抗Ｕ−ＴＡＡレベルをＥＬＩＳＡで測定した。

６週間にわたってＵ−ＴＡＡを４回注射した後、ヒヒの抗Ｕ−ＴＡＡＩｇＧレベ ルは検出できるほどになった。抗体力価は４０週目に最高になった。この時のＥ Ｌ　Ｉ　ＳＡによる抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力価は１：２゜Ｏ，０００であった。

ヒヒの血清からのＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を、上記実施例Ｉ＋（図２）で説明し た、ＤＥＡＥアフィゲルブルークロマトグラフィーによって精製した。ＩｇＧ抗 体は、二重決定因子ＥＩＡにおいて用いられ、ＩｇＭは細胞毒性試験のために用 いられた。

支五匠−■ ヒヒ　Ｕ−ＴＡＡ抗　の細　果：ヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体のＩｇＧおよびＩｇＭの 双方の細胞毒性効果を、標的として［ＪＣＬＡ−Ｓｏ−Ｍ１４を用いる補体依存 細胞溶解（ＣＤＣ）アッセイにおいてテストした。

ヒヒ抗１ｌ−ＴＡＡ　ＩｇＧ抗体は以下に述べる実験条件のもとでは細胞毒性を 示さなかったが、ＩｇＭ抗体は細胞毒性を示した。

標的細胞（腫瘍および対照）を対数増殖期の中間において収穫し、ＲＰＭＩ−１ ０％ＦＣＳで２回洗浄し、５１　Ｃｒ、で標識した。標識された細胞を、体積５ ０μ１１濃度１．ＯＸ　ｔｏ’細胞／ウェルで、細胞毒性アッセイプレートに接 種した。細胞をその後５０μｌのヒヒＩｇＭ抗体（３０Ｍｇタンパク質／＋１） と混合し、４℃で１．０時間インキュベーションし、続いて１：１０の希釈度の 幼生ウサギの補体１００μｌを加えた。アッセイプレートをさらに３７°Ｃで２ 時間インキュベーションした。プレートを遠心分離（５００ｘ　ｇで５分間）し た後、各ウェルからとった上清１ｏｏμｍを吸引し、ガンマ計数によって放射能 放出を計測した。溶解の最大限度（各ウェルに加えられた放射能の合計）を、Ｐ ＢＳ中０．０５％のＮｏｎａｄａｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０）を１５０Ｊｌ加え ることによって計測した。

アイソトープの自然放出は、抗体を加えなかったウェルの上清から計測した。細 胞溶解の割合は、以下の式を用いて三つのウェルの平均から計算した。

ＣＤＣニおける、希釈度１：１２０１７）　ヒｌ：抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ抗体５ ０μｌ（１，５μｇタンパク質）によるＵＣＬＡ−３ｏ−Ｍ１４細胞の細胞溶解 は５ｏから６０％であり、これに対して、自己リンパ芽球様、Ｌｉ２（正常対照 ）細胞では５％であった。Ｍ１４またはＬ１４細胞の数を増加させながらこの抗 体を吸収させることによって、Ｉ　Ｘ　１０”のＬ−１４細胞はＭ１４細胞の細 胞溶解に影響を及ぼさないものの、Ｍ１４細胞での吸収は細胞（Ｍ１４）数の増 加とともに細胞溶解を減少させることがわかった。細胞溶解は、ｌ　ｘ　１０７ のＭ１４細胞での吸収によって完全に消失したく図３）。

細胞溶解の抑制が、Ｕ−ＴＡＡがＭ１４細胞の表面に発現したことによるのかど うかを調べるために、この抗体を同量の精製Ｕ−ＴＡＡ　（０，０６ｍｇ／ｍｌ ）と様々な希釈度で混合し、３７℃で１時間インキュベーションし、ＣＤＣアッ セイでテストした。図４は、ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡの１：１２０希釈物におけ るＭ１４細胞の細胞溶解が、３５％からＵ−ＴＡＡの存在下で５％未満に減少し たことを示している。明らかに、精製Ｕ−ＴＡＡはメラノーマ（Ｍ１４）全細胞 と同じ効果を生じた。アッセイ培地に含有された、ウシの胎児の血清（１０％） などの無関係なタンパク質は細胞溶解に影響を及ぼさなかった。

ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体のＭ１４以外の細胞株に対する細胞毒性効果を測定 するために、リンパ芽球様細胞を含む様々なヒトの培養腫瘍細胞株を、補体依存 細胞毒性アッセイにおける標的として用いた。乳癌および神経芽腫などの、メラ ノーマ以外の腫瘍細胞株も、ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体によって溶解した（表 １）。リンパ芽球様細胞株（Ｌ　１５）の細胞溶解はバックグラウンド（〉５％ ）以下であった。これらの結果から、Ｕ−ＴＡＡは様々なメラノーマおよび非メ ラノーマ瘍細胞の表面に発現し、その密度は細胞株によって変化することがわか る。

（以下余白） 壺−−Ｌ 異なった標的細胞株に対するＣＤＣアッセイにおける、ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ 抗体の細胞溶解。（各細胞株の１．０ＸＩＯ’クロム標識した細胞をウサギ補体 の存在下で５０μｌ［１，ｏμｇタンパク質］の抗体と反応させた。細胞溶解は 、放射能の放出によって計測した。

Ｌｉ２　リンパ芽球様　４．９±４．９（正常対照） Ｍ９　メラノーマ　４０．０±　５．０Ｍｌ０　７１．４±０．４ Ｍ１４　６８．３±　５．６ Ｍ１６　２０．８±４．０ Ｍ２４　３６．５±２．８ Ｍｌ０１　２５．３±４．６ Ｍ１０９　２９．０±　２．７ ＣＰＲ乳癌　３６，５±　９．１ ＭＣＦ　１５．０±６．２ ＣＨＰ　神経芽腫　３５５±　１．５ （以下余白） 叉１１江−１ ネズミハイブリドーマ　術：生後８週間の茶色雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスニ、ＰＢ Ｓ中のＵ−ＴＡＡ　（Ｎｅ８７０４）　７５μｇを０日、１５日、および２８日 に腹腔的注射（ｉｐ）　した。３７日に、１５０　ｕ　ｇ（７）　Ｕ−ＴＡＡを ｉｐで追加し、３日後に殺して、高度免疫肺臓細胞を得た。これらの細胞を、Ｇ ａ１ｆｒｅ　（Ｇａｌｆｒｅ、　Ｇ、ら、　Ｎａｔｕｒｅ　２７７：１３１　（ １９７９）参考までに援用）によって説明されているものに類似の方法で、８− アザグアニン耐性の非分泌性マウス５ｐ２１０ミエローマ細胞と融合させた。Ｃ ５７ＢＬ／６マウスの腹膜を５ｍｌの１１．６％スクロースで洗浄し、そのマク ロファージを１．４５　ｘ　１０’細胞／ウエルで培養して得られた、生後３日 のマウスの腹腔マクロファージ培養を含有するプレート上に、ハイブリドーマ細 胞を接種した。

健康なコロニーを含有するウェルからの上清をＥＬＩＳＡによって抗Ｕ−ＴＡＡ 抗体についてのスクリーニングした。陽性のウェルを限界希釈法を用いてクロー ン化した。モノクローナル抗体をマウスの腹水から調製した（Ｈｏｏｇｅｎｒａ ａｄ、　Ｎ、ら、　Ｊ、Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　６１：３１７− ３２０　（１９８３）参考までに援用）。抗体のイソタイプを二重免疫拡散法に よって決定した（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｎａｐｅｒｖｉｌ ｌｅ、ＩＬ）　。

Ｋ１医−三 ハイプリドーマ上゛スクリーニングのための１・　：ハイブリドーマ上清を、様 々なＵ−ＴＡＡｇ製物および正常な尿との反応性についてＥＬＩＳＡでテストし た。３人の異なったメラノーマ患者Ｎｅ８７０４、Ｗｏ７９０７および５ｅ８７ ０３の尿サンプルから、セファクリルＳ−２００ゲル濾過クロマトグラフイーに よってＵ−ＴＡＡを精製した。１０の正常な尿を、１００倍濃縮の後に標的抗原 として用いた。各標的は１４μｇタンパク質、／＋ａｌで用いた。いずれの場合 も抗原は０．０６Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）中で希釈し、３７° Ｃで３時間のインキュベーションによってマイクロタイタープレートに固定化し た。このインキュベーションおよびその後の各インキュベーションの後には、０ ．０５％のＴｖｅｅｎ−２０を補充したＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した 。ヤギ抗マウスＩｇと接合したアルカリ性ホスファターゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ　１ ｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）が、非りロモー ゲンである燐酸Ｐ−ニトロフェニル（１０％ジェタノールアミン中に１　ｍｇ／ ｍｌ　ｐＨ９゜６）をクロモーゲンであるＰ−ニトロフェニルに変換するための 触媒となった。各ウェルの吸光度は、マルチスキャンＥＬＩＳＡプレートリーダ ーを用いて４０５止で測定した。

免疫化の過程で、マウス血清中の抗ＩＪ−ＴＡＡ抗体活性は、ＥＬＩＳＡによる と、検出できない程度からＮｅ８７０４に対して１：８０００、Ｗｏ７９０７に 対して１ニア７３０にまで増加した。免疫化したマウスの肺臓細胞の融合産物を 接種した９６のすべてのウェルにおいて、健康なハイトリドーマが成長した。こ れらのハイブリッドのうち５１の上清はＮｅ８７０４に反応する抗体を含有して いたが、Ｎｅ８７０４およびＷｏ７９０７の双方には、たった１３が陽性であっ た。これら１３のウェルから取った細胞をクローン化した。得られたクローンノ うち、ＡＤＩ−４０Ｆ４という１つだけが、Ｎｅ８７０４、ｗ０７９０４、およ び５ｅ８７０３の尿サンプルのＵ−ＴＡＡには反応するが２つの濃縮した正常尿 には反応しない抗体を産生じた。ＡＤＩ−４０Ｆ４は、二重免疫拡散法によって １ｇＭ分子であることがわかった。このクローンの未処理のハイブリドーマ上清 は１：２００の抗Ｕ−ＴＡＡ　１ｇＭ力価を有していた。マウスの腹水中で育て たＡＤＩ−４０Ｆ４は１：２０００〜１：５０００の抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ力価 を有しており、その後の実験では１　：２００〜１・５００の希釈度で用いた。

Ｋ丘璽−ユ■ ＡＤＩ−４０Ｆ４の　の　：　Ｕ−ＴＡＡと正常な尿との区別が可能なネズミモ ノクローナル抗体を、マウス腹水中で育て、様々な固定化された標的（Ｅｕｈｕ ｓ、　Ｄ、ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、　Ａｎａｌ、　３：１８４　（１９ ８９））に対する活性をテストした。以下のアッセイすべてにおいて、腹水は２ μｇ／ｍ　ｌで用いた。抗体が、いくつかの一般的なヒトまたはウシ胎児の血清 タンパク質を認識できるか否かを調べるために、ＥＬＩＳＡにおける標的として 、以下の市販のタンパク質を１０Ｍｇ／ｍｌで用いた：フェリチン、プールした ヒトＩｇＧ、プールしたヒトＩｇＭ　（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、 　Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）　、Ｂ２−ミクログロブリン、Ｂ２−糖タ ンパク質、アポリポタンパク質Ｂ１　アポリポタンパク質ＣＩＬ　アポリポタン パク質Ｃ１１ｌ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）　、 ヒト血清アルブミン（Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　 Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）　、および１・ＩＯに希釈したウシ胎児血清。

さらに、２０の正常な血清、ならびに５２の■期およびｍ期のメラノーマの血清 を１．１０に希釈し、ポリスチレンのプレートに固定化し、そして抗体と反応さ せた。モノクローナル抗体の反応性がヒト同種異系抗体の反応性と相関している かどうかを確認するために、Ｕ−ＴＡＡ陽性の５つのメラノーマの尿、同種異系 二重決定因子ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおいて陰性の５つのメラノーマの尿、および１０ の濃縮した正常な尿を、ＥＬＩＳＡにおける標的として用いた。

ネズミモノクローナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４は、フェリチン、プールしたヒトＩ ｇＧ、プールしたヒトＩｇＭ、　Ｂ２−ミクログロブリン、Ｂ２−糖タンパク質 、アポリポタンパク質Ｂ１　アポリポタンパク質ＣＩ＋、アポリポタンパク質Ｃ １１１、またはヒト血清アルブミンには反応性を示さなかった。さらに、ウシ胎 児全血清にも反応しなかった。

モノクローナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４は、血清採取の時に発病はしていたが存命 中であった■期および■期の患者から、無作為に選択したメラノーマ血清の６５ ％（３３１５２）に反応したが、正常な血清にはたった５％（１／２０）　Ｌか 反応しなかった。

ヒト同種異系二重決定因子ＥＬＩＳＡにおいてＵ−ＴＡＡ陽性であった、メラノ ーマ患者からとった５つの濃縮した尿もまた、ＡＤｌ−４０Ｆ４に強い反応性を 示した。一方、Ｕ−ＴＡＡ陰性であるとわかっている５つの尿はＡＤＩ−４０Ｆ ４に反応しなかった。

ＵＣＬＡ−Ｓ○−Ｍ１４は、合成培地中でよく増殖する、培養メラノーマ細胞株 である。セファロース６Ｂカラムで画分された濃縮された使用済培地を、ネズミ モノクローナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４の標的としてＥＬＩＳＡでテストした。カ ラムのボイド容積中の物質は、１　：２３，０００の希釈でＡＤＩ−４０Ｆ４に 反応した。この希釈は１７？　ｎｇ／ｍ１のタンパク質濃度に対応した。

犬ａｌｌ二質」− ■工状：標的抗原または捕獲抗体を０．０６Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１ ９．６）中で希釈し、１００μｍ／ウェルの部分中、３７℃で２時間のインキュ ベーションによってポリスチレンマイクロタイタープレート（１ｍｍｕｌｏｎ　 １．　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ａｌｅｘ ａｎｄｒｉａ、　’／Ａ）に結合させた。その後プレートを０．０５％Ｔｖｅｅ ｎ−２０を補充したＰＢＳ　（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。これ以後用いる各 試薬はＰＢＳ−Ｔで希釈し、ウェルごとに１．００μｌの部分として加えた。試 薬を加えるごとに、その後３７°Ｃで４５分間インキュベーションし、ＰＢＳ− Ｔで３回洗浄した。最後の工程として、１０％ジェタノールアミン中１　ｍｇ／ ｍｌの燐酸パラニトロフェニル（ｐＨ９，８）　２００μｌを酵素の基質として 各ウェルに加えた。プレートを２３°Ｃでインキュベーションし、各ウェルでの 発色をマルチスキャンＥＩＡプレートリーダー（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ、Ｉｎｃ、、　ＭｃＣｌｅａｎ、　ＶＡ）を用いて４０５ｒ＋ｍでの吸光 度として測定した。各アッセイは、陽性および陰性の対照、ならびに固定化され た抗原または抗体への非特異的なタンパク質結合および複合体結合についての対 照とともに、４つ１組で行われた。

大Ｕ ＝」１迭］【２ＬＥｌ堕≦−まず、分画したメラノーマ尿のＵ−ＴＡＡ含有量を 二重決定因子ＥＩＡを用いて測定したが、ここでは、メラノーマ患者からとった 同種異系の抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体を利用した。その後の実験の ほとんどにおいては、Ｕ−ＴＡＡ含有量を、ネズミモノクローナル抗体ＡＤＩ− ４０Ｆ４およびヒヒポリクローナル抗ＩＪ−ＴＡＡ　ＩｇＧを利用した、異種二 重決定因子ＥＲＡで測定した。

同種異系の抗体アッセイにおいては、マイクロタイタープレートを２０Ｍｇ／ｍ 　ｌのＩｇＭ（同種異系）で感作した。その後、連続的に希釈した標準、および ＰＢＳ−Ｔ中で１：１０に希釈した尿画分を用いた。ＰＢＳ−Ｔ中２０Ａｔｇ／ ｍｌの同種異系ＩｇＧ抗体を第二抗体として加えた。ＰＢＳ−Ｔ中でｌ：１ｏｏ ｏに希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ１こ結合シタアルカリ性フォスファターゼ（Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）を、酵素複合体として用ｔ）た。４０５ｎｍ ＋こおける吸光度を、基質と共に２時間インキコベーションした後に記録した。

各サンプルのＵ−ＴＡＡ濃度は、標準曲線に内挿することによってめた。アッセ イは５７０ｎｇ／＋１の感度を有して℃）る。

異種二重決定因子ＥＩＡにおいては、１７６、０Ｍｇ／ｍ　ｌのネズミモノクロ ーナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４を抗原を捕獲するためるこ用℃また。

一方、８９μｇ／ｍｌのヒヒＩｇＧを第二抗体として用−また。このアッセイは Ｓｏｎｇ／＋ｌの感度を有している。

寒１」Ｌ−入 Ｕ−ＴＡＡ活性のための　゛　：病気が局所のリンパ節、途中のリンパ管、また は離れた内臓組織に転移したメラノーマ患者５２人から、静脈穿刺によって血液 を採集し、それを室温で２時間凝固させた。１５分間、８００　Ｘ　ｇの遠心分 離によって、凝固した血液から血清を分離し、すぐに−３５°Ｃで凍結した。見 かけ上健康な対照２０人から血清を得、同様の方法で処理した。アッセイの日、 血清サンプルを解凍し、０．０６Ｍの炭酸塩緩衝液で１．１０に希釈し、１００ μｍの部分をマイクロタイタープレートに載せ、３７℃で２時間インキユベーシ ミンした。洗浄した後、ウェルをｌ：５００に希釈したＡＤＩ−４０Ｆ４　Ｍｏ ＡｂｌＯＱμｌと反応させた。

結合したＡＤＩ−４０Ｆ４を、１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇ＋＊ａ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、　ＭＯ）を補充したＰＢＳ−Ｔで ｌ：５００Ｇに希釈した、アルカリ性ホスファターゼに接合したヤギ抗マウス免 疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、　Ｗｅｓｔ　 Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡ）で標識した。基質を１６時間インキニベーションした後、 各サンプルの４０５ｎ１１での平均吸光度を計測し、バックグラウンド（ＡＤＩ −４０Ｆ４のプラスチックへの結合、および酵素複合体の標的血清への結合）に ついて補正を行った。メラノーマ患者の６３％（３３１５４）がＡＤＩ−４０Ｆ ４への活性を示した。反対に、見かけ上健康な志願者からの血清の５％（１／２ ０）のみが活性を示した。

しかし、この正常な血清の活性はごくわずかであった。

１１匹一旦 ゛からのＵ−ＴＡＡの単離：陽性血清から１ｌ−ＴＡＡを単離し、特徴づけるた めに、様々なりロマトグラフィーおよびアフィニティー吸収技術を採用した。Ａ ＤＩ−４０Ｆ４が新規の高分子を認識しているのであって抗体分子上のイディオ タイプ決定因子を認識しているのではないことを確認するために、調製した抗原 からのＩｇＧの除去には特別な注意を払った。

選択した血清サンプルをＤＥＡＥ−セファセルカラムに載せ、流速３０＋ｉｌ／ 時間で、０．０１５　Ｍ　ＫＨ２Ｏ４（ｐＨ８，０）　２００ｍ１を含有する槽 に０．３　Ｍ　ＫＨ２ＰＯ４（ｐａｌ　５．０）をゆっくりとサイフオンで移す ことによって形成した、ｐｌ！（８〜５）および塩（０，０１５〜０．３Ｍ）の 勾配を用いて溶出した。２ミリリツトルずつの画分を集め、２８０ｎｍでの吸光 度および各画分のｐＨを測定した。画分された血清のＵ−ＴＡＡ活性を、上述の 異種二重決定因子ＥＩＡを用いて測定した。Ｕ−ＴＡＡ活性を含有する画分をプ ールし、限外濾過によって２暑１に濃縮したく図５）。

血清１ｇＧの大半がカラムの最初のピークで溶出した。しかし、少量は第二のピ ークにも存在した。予想通り、ＩｇＭは最後のピークでだけ検出された。正常の 血清の溶出プロフィールは、メラノーマ血清のものと同様であったが、どの画分 からもＵ−ＴＡＡは検出されなかった。Ｕ−ＴＡＡ陽性メラノーマ血清において 、抗原は、主として第二ビークと共に溶出したが、少量はボイド容積においてＩ ｇＧと共に溶出し、ＩｇＭと共に痕跡が検出された。第二ピークにおけるＵ−Ｔ ＡＡはｐＨ７，２７で溶出したが、これハ００２１モル濃度＋７）Ｘ２ＨＰＯ４ ニ相当する。ＡＤＩ−４０Ｆ４　ネズミＭＯＡｂ１．ｍ反応する正常血清の陰イ オン交換溶出プロフィールは、ＩｇＭと共に抗原が検出されなかったことを除け ば、メラノーマ患者からの血清のものと同一であった。

陰イオン交換カラムの第二ビークを含有する画分をプールし、２ｍｌに濃縮した 。この調製物のタンパク質含有量は平均して３．７８ｍｇ／ｌｌ１ｌであった。

この画分が少量の［ｇＧを含有していたため、これをウサギ抗ヒトＩｇＧ免疫ビ ーズで連続的に吸収し、混入しているＩｇＧを除去した。１回の吸収がＩｇＧ力 価を９５％減少させ、４回の吸収でＩｇＧを９９．５％除去した。Ｕ−ＴＡＡ力 価は反対に殆ど影響されなかった。

陰イオン交換クロマトグラフィーで単離され、抗ヒトＩｇＧ免疫ビーズに吸収さ れたＵ−ＴＡＡを、さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。セファク リルＳ−３００クロマトグラムは、大きなタンパク質ピークを１つといくつかの 微少なピークからなっていた。抗原陽性調製物のＵ−ＴＡＡ活性は、−貫して、 大きなタンパク質ピークとは異なる、左右対称の高分子量ピークだけに見られた （このピークはＵ−ＴＡＡ陰性血清からの調製物には存在しなかった）。

ｇ／ｍｌの血清からとった５０μｌのＵ−ＴＡＡを、１２．５％グリセロール、 １．３％のドデンル硫酸ナトリウムおよび１，３％の２−メルカプトエタノール を含有ｔ　ル２５μＩ＋７）０．０６　Ｍ　ト’）　ス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，８ ）の中で１分間１００℃に加熱した。還元したサンプルを、５％ポリアクリルア ミドを含有するスタッキングゲルに載置し、４時間５０ｍＡで９％ポリアクリル アミドゲル上で分離した。泳動用緩衝液は、０．０５Ｍのトリス、０．３８Ｍの グリシンおよび０．１％のドデシル硫酸ナトリウムから構成した（ｐＨ８，４） 。すべてのゲルは２つ１組で泳動した。１つのゲルは銀試薬（Ｂｉｏ−ＲａｄＬ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）で染色し、他のゲルは 免疫プロット法で処理した。

尤丘ＪＬＪ上は Ｕユニ１２つの電気泳動されたポリアクリルアミドゲルのうち一方を３０分間０ ．０２Ｍのトリス、０．１５Ｍのグリシンおよび２０％エタノールで洗浄し、ニ トロセルロース紙（０，４５ｕＩＩＳＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ ｓ）に５０ボルト１６時間（４℃）でエレクトロプロットした。エレクトロプロ ットの後、ニトロセルロース紙をブｏ　ノド緩衝液（０，０５Ｍのトリス、０． ０９Ｍ）ＮａＣ１゜ｐＨ８，０）中で２時間２３℃で、５％カゼインを用いて処 理した。

処理された紙を、５％カゼインを補充したプロット緩衝液中で、２３℃で６時間 、その後４℃で１６時間、ＡＤＩ−４０Ｆ４　（１：５００）ネズミＭｏＡｂま タハヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧ　（１：５００）と反応させた。

抗Ｕ−ＴＡＡ抗体とのインキュベーションの後、紙を２００ｎ＋１のプロット緩 衝液で４回洗浄した。結合した抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を検出するために、５％カゼイ ンを補充したプロット緩衝液中の、ヤギ抗マウスＩｇまたはヤギ抗ヒトＩｇＧに 接合したアルカリ性ホスファターゼを用いた。２３℃で４５分間の酵素複合体と のインキュベーションの後、ニトロセルロース紙をプロット緩衝液で４回洗浄し た。基質緩衝液（１０ｍＭ　）リス、０．１Ｍ　ＮａＣ１および０．０５Ｍ　Ｍ ｇＣｌ２、ｐＨ９，５）でもう一度１分間洗浄した後、製造者の指示（Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ、　ＭＤ）に従って、紙をニトロブルーテトラゾリウムクロリド１５− ブロモ−４−クロロ−３インドリルホスフェイトｐ−トルイジン（ＮＢＴ／ＢＣ ＩＰ）と反応させた。陽性バンドの分子量を、プレスティンした分子量マーカー （Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ） の相対的移動度をもとに決定した。

Ｋ施１−」■ Ｕ−ＴＡＡの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　：　５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、銀の 試薬で染色された血清からとったＵ−ＴＡＡは、１３ｇ、９０．５０゜およヒ２ ５ｋＤの領域で４つのバンドを作った。ニトロセルロース紙に移して免疫染色し た時、９０ｋＤのバンドが唯一、ネズミモノクローナル抗体であるＡＤＩ−４０ Ｆ４とヒヒポリクローナル抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧとの両方に反応した（図６）。

唯一の交差反応性正常血清からとったＵ−ＴＡＡは同一の免疫染色のパターンを 示した。

しかし、Ｕ−ＴＡＡ陰性正常血清からとった類似の調製物は、どちらの抗体にも 活性を示さなかった。

支敷乳−■ 細　上でのＵ−ＴＡＡサブユニットの　在：同種異系の抗体によって認識される ９０ｋＤ成分の発現を確定するために、生合成的に標撒された（　”　Ｃ−Ｌ− ロイシン）メラノーマ（ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１４）細胞の無細胞ＮＰ−４０抽出 液を、Ｕ−ＴＡＡでブロックする前後に、同種異系の抗体との免疫沈降処理をし た。Ｕ−ＴＡＡ　（ブロッカ−）を、実施例■で説明したように、メラノーマ患 者の尿から精製した。メラノーマ細胞のＮＰ−４０抽出液を実施例ＸＸＸＩ＋で 説明するように調製した。免疫沈降物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％ポリアクリ ルアミド）で処理した。ブロックした、およびブロックしなかった免疫沈降物の 、ゲルの列における放射能を、シンチレーション計数によって測定した。図７に 示すように、１５０ｋＤ、　９０ｋＤおよび４５ｋＤの３つのバンドが、部分的 にまたは完全にＵ−ＴＡＡによってブｏ　ツクされた。これらの結果から、同種 異系の抗体はメラノーマ細胞の複数の抗原成分に反応することがわかる。これら のうちの１つは、メラノーマ患者の尿および血清にも存在し、ネズミモノクロー ナル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４ｉＣよって認識される９０ｋＤサブ二二、トであった 。

Ｋ血皇−ユ■ 工１式に逐に血清Ｕ−ＴＡＡの等電点電気泳動をＬＫＢ　２１１７Ｍｕｌｔｉｐ ｈｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ　（ＩＪＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）を用いて５％ポリアクリルアミドゲル中で行った。

濾紙片を２５μＩのＵ−ＴＡＡに浸し、ｐＨ勾配３．５−９．５の２゜４％（ｖ ／ｖ）両性電解溶液を含有するＰＡＧプレート（ＬＫＢ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓ、Ｉｎｃ、）上の陽極端からｌｅａのところに置いた。Ｈ３Ｐ０Ａ　（ＩＭ） およびＮａＯＨ（ＬＭ）をそれぞれ陰極、陽極において用いた。１５００ポルト 、５゜ｔａＡおよび３ｏワツトの電流を印加して１０”Ｃで１．５時間、プレー トに等電点電気泳動を行った。公知の等電点を有する、市販の色素原性タンパク 質（Ｐｈａｒｎ＋ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａ ｖａｙ、　ＮＪ）を各泳動に含有させた。ゲルの一部を切断し、クーマシーブル ーで染色した。しがし、Ｕ−ＴＡＡｇ製物のタンパク質含量が非常に低かった（ ６４μｇ／ｍｌ）ため、クーマシーブルーの染色ではＵ−ＴＡＡのバンドは発色 しなかった。この困難を克服するために、ゲルの残りはウェスタンプロット法を 用いて分析した。

集束したゲルをニトロセルロースの上にプロットし、ヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ　’　ｌ 　ｇＧに反応させた。この方法では１つのバンドだけが観測され、血清から精製 されたＵ−ＴＡＡの等電点を６．１と帰属することができた（図８）。

Ｋ度匠■旦 熟ｊシ【Ｅシー免疫反応性エピトープに熱安定性をアッセイするために、Ｕ−Ｔ ＡＡｇ製物を１００　’Ｃにて１５分間加熱、および１時間加熱した。この調製 物を、加熱しながった対応する調製物とともに、１０００ｇ／ｍｌで抗体の標的 として用いた。

溶液を１００℃で１．０時間まで加熱しても、抗原活性には大きな影響はなかっ た（表２）。

メラノーマ患者の血清から 単離したＩＪ−ＴＡＡの熱安定性 異種二重決定基ＥＩＡ 処理　の４０５ｎｍでの吸収 対照１　０．６３５±０．０３５　ｂ １００℃　１５分　０．５７８±　０．０４２１００℃　１時間　０．５９４± ０．０６５ＬＵ−ＴＡＡをタンパク質濃度２００μｇ／ｍｌで熱処理し、ｔ、４ μｇ／＋１のアッセイで標的抗原として用いた。

ゝ・　３つのサンプルの平均上標準偏差。

（以下余白） 亙１ヱＬ−■±ｌ 酵＄　匹！　６　ｉｎ北ニー同種異系の二重決定基ＥＬＩＳＡによって測定され た、正常、およびメラノーマ尿のグリコシダーゼ？Ｆｌ化のＵ−ＴＡＡ活性に対 する影響をアッセイするために、混合グリコシダーゼ（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ、　Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）を製造者の仕様に従ってＣＮＢ ｒ活性化したセファ０−ゼ４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ、　 Ｓｗｅｄｅｎ）に結合した。固定したグリコシダーゼの活性を、標ｍｐ−二トロ フェニルー２−Ｄ−グルクロニド溶液の加水分解を記録することによってアッセ イした。２４時間尿標本を、０゜１％アジ化ナトリウムで補充したＯ、　ＬＭ　 トリス（ｐＨ８，３）中に、１４個体（明らかに健康な７個体、発病しているが 存命中の■期のメラノーマ患者７体）から集めた。排除限界１０，０００ダルト ンのホローファイバー濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｌｅｘｉｎｇｔｏ ｎ。

ＭＡ）で再循環して１００倍濃縮をする前に、初期体積およびクレアチニン含宵 貢（Ｂｅｅｋｍａｎ　Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ、　Ｆｕｌｌｅ ｒｔｏｎ、　ＣＡ）をそれぞれの標本について調べた。濃縮した尿を、酵素を含 んだゲル（または別個に調製し１Ｍエタノールアミンでブロックした標識されて いないゲル）を用いて３７℃で４時間処理した。その後、処理した尿および未処 理の尿のＵ−ＴＡＡ活性を、上述の同種異系の二重決定因子ＥＬＩＳＡでテスト した。結果（Ｌｌ−ＴＡＡ　ｎｇ／１（ｔｏ　ｍｌ）を抗原ユニット（Ａｇ　Ｉ Ｊ）　／ｖｌ１ｇクレアチニンに変換し、初期の尿体積およびアッセイ間の変化 の差を以下のように補正した。

ＡｇＵ／ｍｇクレアチニン＝　Ｕ−ＴＡＡ　ｘ　Ｆ　ｘ　１００［クレアチニン ］ｘＫ 上式において、Ａｇ　０７ｍｇクレアチニンはクレアチニン１ｍｇあたりの抗原 ユニットであり、［Ｕ−ＴＡＡ］は標準曲線から内挿したサンプルのＵ−ＴＡＡ 濃度ｎｇ／ｍ＋である。Ｆは１００倍濃縮の尿サンプルの最終体積であり、［ク レアチニン］は全２４時間尿サンプルのクレアチニン含有量（Ｉｇ）であり、そ してＫは、このア・クセイで４０５ｎｍにおいて１゜０の０．Ｄ、を生成するＵ −ＴＡＡ標準のタンノくり質濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。この濃度は１００抗原 ユニ・ノドの値に相当する。

７人の明らかに健康なドナーから取った尿サンプルは、平均Ｕ−ＴＡＡ含有量、 ２１．９±４．０抗原ユニット／ｍｇクレアチニンを有していた（同種異系抗体 アッセイによる）が、一方、発病しているが存命中の二重のメラノーマ患者７人 からとったサンプルは、平均Ｕ−ＴＡＡ含有量が６９．８±１７．４抗原二二・ ット／ＩｇクリアチクレアチニンＣＰｒｏ、　０２５）。正常なドナーからの標 本を混合グリコシダーゼ処理すると、平均抗原レベルが１４８　±　２．８　Ｐ ＞０．１とわずかに低くなった一方、メラノーマ尿を同様に処理すると、その抗 原レベルは１６３．７±４９．４．　Ｐｒ。

、Ｏ２５へとかなり増大した。

Ｘ七ｌ−一１区 １王と袴３ｕ丈刃＝−ＡＤＩ−４０Ｆ４と反応するエピトープの化学的性質を明 らかにするために、Ｕ−ＴＡＡを、アガロースビーズ上に固定化された様々な酵 素で分解した。混合グリコシダーゼ　（Ｍｉｌｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と ヒアルｏニダーゼ（ｌＶｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｆ ｒｅｅｈｏｌｄ、　ＮＪ）とはＣＮＢｒ−活性化アガロースビーズ（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ　４Ｂ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕ ｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）に結合した。固定化されたプロテアーゼはＳｉ ｇ鳳ａ　Ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ。

（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）より購入した。各々の固定化酵素の比活性は、 抗原の処理前に適切な基質系に対してテストした。

３６μｇ／ｍｌのＵ−ＴＡＡを、同量のバックされた固定化酵素ビーズと、室温 で４時間、回転させながら連続して混合した。ＩＭのエタノールアミンでブロッ クされたＣＮＢｒ活性型アガロースビーズを未処理コントロールとして使用した 。酵素で処理した、および未処理の上澄のＵ−ＴＡＡ活性を以下のように、競合 的阻害アッセイで評価した：処理および未処理のＵ−ＴＡＡを０．６３μｇ／ｍ 　ｌに希釈し、１・３７５に希釈したＡＤＩ−４０Ｆ４のマウスモノ単クローナ ル抗体腹水と共に３７℃で４５分間インキュベートした。その後、この混合物中 のＡＤＩ−４０Ｆ４の、固定化したＵ−ＴＡＡに対する結合をＥＬＩＳＡで定量 した。プラスチックおよび標的抗原に対する非特異的結合について訂正した後、 ４０５ｒｖｉこおける吸光度を阻害パーセントに変換した。個々のアッセイは３ 反復で行い、平均阻害パーセント±ＳＥＭを計算した。酵素処理された抗原の阻 害活性を単純な比（処理の抑制率％／未処理の抑制率％）で、未処理抗原のそれ と比較した。これらの比はＵ−ＴＡＡに対する３つの酵素の影響を比較する基準 を提供した。

Ｕ−ＴＡＡを免疫反応性エピトープに影響を与えない酵素で処理すると１０＝１ に近い活性比になることが期待されるであろう。

これはヒアルロニダーゼによる処理の場合であり、未処理抗原に対する処理抗原 の活性比は１．５１であった。グリフジダーゼ処理は、抗原活性を高め（３，２ ：１の比）、一方、プロテアーゼ処理はＵ−ＴＡＡ活性を有意に減少させる結果 ０．２：ｌの比になった。プロテアーゼによるインキュベージコン時間を８時間 に延長すると、全てのＵ−ＴＡＡ活性が破壊された。

Ｋ１五−■ １皇：　ＭＣＶによる特異的な能動免疫療法を受けている患者１５人から、免疫 の前におよびその後２から４週間ごとに、抗Ｕ−ＴＡＡ抗体のレベルを分析する ために血清サンプルを集めた。

評価される１５人の患者のうち７人は、ＭＣＶと共にシクロフォスフアミドを投 与された。比較のために、ワクチンを投与されていない第に■および第■期のメ ラノーマ働者１人からもサンプルを集めた。サンプルは一４０℃で貯蔵し、ある 患者に関する全てのサンプルを、同じ日に解凍し、分析した。被検者の少なくと も半分が細胞膜抗原に対する抗体反応を生じることができることを保証するため に、Ｍ−ＴＡＡに対する抗体反応を基に患者を選んだ；１５人の患者のうち８人 が、ワクチンを投与されている間、抗Ｍ−ＴＡＡ抗体の誘導を示し、７人が示さ なかった。これは、また、１つの膜抗原に対する抗体反応が、同じ細胞表面上の 他の抗原に対する抗体反応を保証するかどうかを、決定することを可能にした。

ワクチン　プロトコル：第１回目のワクチン投与は２，４００万個のグラクツＢ ＣＧ生体を混合した、２．４００万個の生きている、放射線照射された腫瘍細胞 （抗原変異性のために選ばれた、ｔｌｃＬＡ−Ｓｏ−ＭＬＯ５ＵＣＬＡ−３ｏ− Ｍ２４、およびＵＣＬＡ−Ｓｏ−ＭＩＯ１と指定された細胞系より）を含有した 。第２回目のワクチン投与は２，４００万個の生きている、放射線照射された膿 瘍細胞と１．２００万個のグラクツＢＣＧ生体との混合物から成った。その後の ワクチン投与はＢＣＧを含まない、Ｚ、　４００万個の生きている、放射線照射 された腫瘍細胞から成った。免疫スケジュールは、最初の６週間は２週間ごと、 そしてその後は４週間ごとにワクチン投与することから成った。

匠り比丘：様々なグループの抗体力価は、平均上平均の標準誤差（ＳＥＭ）とし て表される。ステニープント２点比較Ｔ検定およびカイ２乗分析を用いて、関連 した比較を行った。これらの分析に用いられた統計用ソフトウェアは　Ｍａｃｉ ｎｔｏｓｈ　コンビエータ用の５ｔａｔＶｉｅｖ　（Ｂｒａｉｎ　Ｐｏｗｅｒ、 Ｉｎｃ、、　Ｃａ１ａｂａｓａｓ。

ＣＡ）　であった。

爽上ｌ−ユ■ ゛抗Ｕ−ＴＡＡ　体　価の沖　：　０．０６Ｍ炭酸緩衝液（ｐＦ１９．６）１０ ０μｍ中のＵ−ＴＡＡ、　４０ナノグラムを９６ウエルのポリスチレン製マイク ロタイタープレートに分配した。３７°Ｃで３時間インキュベートした後、ウェ ルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、順に希釈した血清１００μｍを与えた。３７℃で ４５分間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、そしてアルカリ性ホスファタ ーゼに複合させヤギ抗ヒトＩｇＧ　（１：５００に希釈）またはＩｇＭ　（１： １０００に希釈）を用いて抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を検出した。プレートを４５分間イ ンキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。基質を与え、２３℃で１時間イン キュベートした後、各々のウェルに対して０．　Ｄ、　４ｔＩＳｎｍを測定した 。全てのアッセイは２反復で、複合体のプラスチックおよび標的抗原に対する非 特異な結合のための適切な対照と共に実施した。血清希釈度（ｌｏｇ２）に対し て、２反復サンプルについての平均修正０．　Ｄ、　Ａｌｌ５ｎｓをプロットす ることによって、タイトレージョン曲線を作成した。タイトレージョン曲線の直 線部分を補外して、Ｏ，Ｄ、０．０５に対応する血清希釈度を、そのサンプルの 抗Ｕ−ＴＡＡ　ｒ力価」と呼んだ。

１良丘−■旦 メラノーマ愚者における抗Ｕ−ＴＡＡＩＭ　体反応：ワクチンを投与される前に は、ワクチン投与されないメラノーマ対照患者とＭＣＶ患者とでは抗［ｊ−ＴＡ Ａ　ＩｇＭ力価に関して有意な差は無かった（１：１３２４＊２５４．　Ｎ＝７ ．１：１１３８±１９８．　Ｎ＝１５．　Ｐ＞０．３７５＞。ところが、これら のレベルは、見かけ上健康な８人のドナ一群では、有意に低かった。ＭＣＶを受 けた１５人の患者のワクチン投与前の抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ力価は、ｌ：１１２ から１２４６６の範囲であった（表３）。ＭＣＶを受けた１５人の患者のうち、 １１人は、ワクチン投与の間に、これらの力価の２から５倍の増加を示した。こ れら１１人の患者の平均１ｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ力価は、ワクチン投与前の１：１０ ５１±２５９から投与後、１：２５１８±５７６に上昇した（Ｐｒｏ、　００５ ）　。

個々の抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ力価のピークは１：４３５から１：５１４０の範囲 であった。

大１」［−■月ユ Ｕ−ＴＡＡＩＧ　伸反応：１５人のＭＣＶ患者におけるワクチン投与前の抗Ｕ− ＴＡＡ　ＩｇＧ力価はＬ：１０６２から１・８３６１の範囲であった（表３）。

この患者群のワクチン投与前の平均力価１：３９８４±６０２はワクチンを投与 されないメラノーマ対照患者７人のそれ（１：２５９５±４２３．　Ｐ＜０．１ ）よりも高い。見かけ上健康な対照８人の平均抗Ｕ−ＴＡＡレベルは、ワクチン を投与されないメラノーーｙ対照患者群のそれよりも有意に低かった。ＭＣＶを 受けた１５人の患者のうち６人が、抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧ力価の２から７倍の増 加を示した。

この６人の反応者群の平均抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧ力価は、ワクチン投与前の１： ２９６４±１０４６から投与後、１：９９５８±２６７７まで上昇した（Ｐ＜０ ．０１）。　この群の個々の力価は１・２，１７６から１：２０．４８１の範囲 であった。

（以下余白） にヨヱＢユ Ｍλ：抗ＥＩＬＡ抗体が、我々が観察した抗体反応の一部または、全部を説明し 得るのかを判断するために、以下の実験を行った。まず、我々のＵ−ＴＡＡ標本 がＨＬＡに汚染されている可能性を減らすために、Ｕ−ＴＡＡをポリスチレンマ イクロ力価プレートに固定化し、ＥＩＡでマウスのモノクローナルナル抗［ＩＬ Ａ抗体との反応性をテストした（ＡＸＬ　８５９Ｍ、　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　ａｎｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃａｒｐ、、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ 、　ＮＹ）。この抗体はクラスＩＨＬＡの４５ｋＤポリペプチド産物上に存在す るモノモルフイックなエピトープに対するものである。このようにして、Ｕ−Ｔ ＡＡ標本中に存在する全てのクラス１サブタイプが検出される。１ニア５０に希 釈したネズミのモノクローナル抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を陽性対照として同時にテスト した。

次に、抗腫瘍抗体の誘導とＨＬＡ抗体の誘導との間の関係を決定する研究の一環 として、メラノーマ細胞ワクチン（ＭＣＶ）を投与されたメラノーマ患者の、ワ クチン投与前および投与後の８つの血清を、個別にクラス１およびＤＲ抗原（Ｔ ｅｒａｓａｋｉ、　Ｐ、１ｅｔ　ａｌ、、　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ 　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　ＤＨＥＷ　Ｐｕｂｌ、（ＮＩＢ＞　 ７４−５４５　Ｕ、Ｓ、　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　０ｆｆｉ ｃｅ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ，Ｐ、　５４、参考のために引用）との 反応性を定量する細胞障害抗体アッセイで、抗ＨＬＡ抗体についてテストした。

これらのワクチン投与前及び投与後の反応性を、次に抗Ｕ−ＴＡＡ抗体レベルと 比較した。

ＨＬＡクラス１抗原のモノモルフイックなエピトープに対するマウスのモノクロ ーナル抗体は、ｌ−５から１：８０の範囲の希釈率においても、我々のＵ−ＴＡ Ａ標本と反応しなかった。１　ニア５０の希釈率で同時に行った抗Ｕ−ＴＡＡネ ズミのモノクローナル抗体は１時間以内に濃い色を示した。

加えて、抗ＦＩＬＡ抗体の発生は、抗Ｕ−ＴＡＡ抗体反応とは、いかようにも関 連しなかった。テストした８人の患者のうち１人だけが、ワクチン投与の間に強 い抗ＨＬＡ抗体反応を発生させた。

ワクチン投与前、この患者は、検出できない抗ＨＬＡ抗体レベルであったが、抗 Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧのレベルは高かった（１：５０Ｓ６）。ワクチン投与の間、 彼は、様々なりラス１１（ＬＡに対して高レベルの抗体を発生させたが、彼の抗 Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧレベルは変化を示さなかった。抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ力価は 、この間２倍にしかならなかった。

別の去者第８号は有意な抗ＨＬＡレベルは一度も発生させなかったが、彼の抗Ｕ −ＴＡＡ　ＩｇＧおよびＩｇＭ力価は、ワクチン投与の間に、各々６，５倍と３ ．５倍に上昇した。他の４人の患者は、抗ＨＬＡ抗体の誘導の証拠なしに、抗Ｕ −ＴＡＡ　ＩｇＭのレベルの２から４倍の上昇を示した。

Ｋ血ヨーユ■ ＫＬＨＩＧ　体反応：　ＥＬＩＳＡによるメラノーマ患者で検出されたＭＣＶに 対する抗体反応がＵ−ＴＡＡに特異的なものかどうかを判定するために、同じ血 清サンプル（ＭＣＶ前と後）を標的抗原としてのＫＬ旧こ対して反応させた。表 ４に示す結果は、患者の大半（１４／Ｉｓ）がＭＣＶ処置前に検出可能なレベル の抗ＫＬＨ抗体を持っていたことを示している。これらの続伸レベルは、ＭＣＶ Ｃ再投与後人の患者でのみ、２倍より大きく増加した。他の、患者においては、 抗ＫＬＨレベルはほぼ同じに留まるか、或は減少した。ＭＣＶに対する反応にお いて抗ＫＬＦＩおよび抗Ｕ−ＴＡＡ抗体（ＩｇＧまたは　ＩｇＭ）の増加に一部 は見られなかった。

（以下余白） 紅 ＥＬＩＳＡによって評価したＭＣ’／処置前および後の、メラノーマ患者におけ る抗ＫＬＩＩ抗体レベル Ｌ■Ｌｌヒ 墨１」−ロエ　煕’ｉ　ＭＣＶ＆二週 ３　＜２０　４．０００　２ ４　６８　２０　Ｒ ７６０１ｉ００　８ １２　１、０００　１．０５０　１２ １力価の反復測定値は、希釈血清曲線の０．０５０．Ｄ、ａａｓｎａを示す点か ら決定した。

Ｒ１五−猛■ ・の　日・　・：、１１人の抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ被検者のうち４人が最初のワ クチン投与後２から６週間後に、６人が７から１６週間後に、そして１人が免疫 の２０週間後に、これらの抗体レベルの２倍以上の上昇を示した。抗Ｕ−ＴＡＡ 　ＩｇＭ反応の中央値の時間は８週間であった。これら１１人の患者において、 抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＭ力価は４から＞２０週間上昇したままであり、中央値は８ 週間であった。

良好な抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧ反応を示した６人の患者のうち３人は、最初のワク チン投与後４から８週間後、これらの力価の２倍以上の上昇を示し、１人は２０ 週間後に反応し、２人はＩｇＧ反応を生じるのに４０週間のワクチン投与を必要 とした。反応までの時間の中央値は１４週間であった。これら６人の患者の反応 は４から〉４０週間持続し、中央値は〉１０週間であった。

Ｋ鳳±−１江■ 気のステージと　′−する　Ｍ−ＴＡＡ反応：この研究で評価した１５人の患者 のうち１１人がリンパ節または局所領域の皮下組織内に病気を限定して持ち、一 方４人が遠方に転移していた。

内臓に転移している４人全員（３人が肺に、１人が肝臓に転移）が良好な抗Ｕ− ＴＡＡ　ＩｇＧ反応を生じた。ワクチン投与前は、これらの抗Ｕ−ＴＡＡ　Ｉｇ Ｇレベルは１：１１４９から１：２８１６　（平均１：２１８４±３６２）の範 囲であった。ワクチン投与後、力価は１：５０００からｌ：１４．８４８で平均 値１：８７７７±２１１７のピークを示し、このグループでは４倍増であった。

連続した血清サンプルからの抗メラノーマＴＡＡ抗体レベルが、この研究（Ｇｕ ｐｔａ、　Ｒ，に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ａｍｅｒ、　Ｓａｃ、　Ｃ ｌ１ｎ、　０ｎｃｏ１．６：２４９　（１９８７）参考のために引用）で評価し た１５人の患者全員に対して入手できた。これら１５人の患者のうち８人がＭＣ Ｖに対して良好な抗Ｍ−ＴＡＡ抗体反応を生じた。抗メラノーマＴＡＡ抗体レベ ルの増加は、抗Ｕ−ＴＡＡ　ＩｇＧレベルの増加とは相関しなかった（Ｒ２・０ ．２７９）。全搬的に、抗Ｕ−ＴＡＡ反応率（ＩｇＭおよび／マタはＩｇＧ）は 、Ｍ−ＴＡＡの非反応者においてよりもＭ−ＴＡＡの反応者において高いが、差 は有意ではない（Ｘ２．　Ｐ＞０．３）。

大１！Ｌ」１買」− 慎　および　を　っ、−の　におけるＵ−ＴＡＡの旌上：乳癌、結腸癌、および 肺癌にかかっている患者から得り尿サンプルを、実施例ＩＸで述べたマウスのモ ノクローナルＡＤＩ−４０Ｆ４およびヒヒの多ポリクローナル抗Ｕ−ＴＡＡ　Ｉ ｇＧを用いた２重決定基ＥＩＡを用いてＵ−ＴＡＡの存在を分析した。検出可能 なレベルのＵ−ＴＡＡの存在する率を表５に示す。これらの率はメラノーマ種患 者のそれ（６３，４％）に全く匹敵する。

（以下余白） 表５ ２重決定基ＥＩＡによる、乳癌、結腸癌、および肺癌の患者から得た尿中のＵ− ＴＡＡ率 組織のタイプ　二三上ユニ呈　隻１監　ｉ民、乳癌　１４　９　６４．３ 結腸癌　１３　９　６９．２ 肺癌　７　３　４２．８ 肉履　１７　１０　５８．８ 正常　７７　２　２．５ メラノーマ　１１５　７３　６３．４ ＊実施例ＩＸで述べたようにマウスのモノクローナル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４を抗 原を捕獲するために、およびヒヒのポリクローナル抗体捕獲した抗原を検出する ために用いた。０．６８を超えるＥＩＡ値を陽性と考えた。

支良五一旦■ 癌患　の　中のＵ−ＴＡＡレベルを　いた５、性　のモニター二治癒的外科治療 を受けた３１人のメラノーマ患者から、先を見越した方法で連続的に集めた尿サ ンプルを、実施例ＩＸで述べたように２重決定基ＥＩＡを、以下のように修正し て、Ｕ−ＴＡＡしベルの分析を行った。サンプルは沸騰した湯槽中で１００　” Ｃで２．５分間熱し、氷水槽中で５分間冷却し、０．５％のＴｖｅｅｎ−２０を 補った、同量（Ｚｏｏｕｌ）の０．０２５Ｍのリン酸緩衝生理食塩液と混合した 。これらの混合物のうち１００マイクロリツトルを、捕獲アッセイでテストした 。３１人の患者のうち、１０人の患者のＵ−ＴＡＡ　ＥＬＩＳＡ値が、１年間ノ モニタ中、陰性（＜０．６８０Ｄ４１１Ｓ）　０）　＊　＊であった。今のとこ ろ、これらのうち、１人だけ（１０％）が、臨床上、検出可能な病気の再発をし た（表６）。この患者の再発は研究を始めてから２４週間後に起こった。これと 対照的に、３１人の患者のうち２１人の尿サンプルがＵ−ＴＡＡ陽性（＞０．６ ０Ｄ４ａｓ）になった。これらＵ−ＴＡＡ陽性の患者のうち、１２人（５７％） が０から２４週間のうちに臨床上、検出可能な再発をした。Ｕ−ＴＡＡの陽性結 果から見ると、この患者グループは高い再発の危険にある高いと考えられ得る。

他の悪性ａｍの患者の連続的な尿サンプルの分析は、病気の準臨床的な再発をモ ニターするために使用できる。

（以下余白） 表６ １年間の予後研究における、メラノーマ患者の尿中Ｕ−丁ＡＡの検出と、臨床上 に検出可能な病気の再発との間の関係Ｕ−ＴＡＡ　再発した　再発していない　 合計患者の数　患者の数 陰性　１９１゜ 陽性　１２９本　２１ ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりｐ＜ｏ、ｏｓ本再発の危険性の高い患者 に鬼旦−ユ■ イン　−フェロンによるＵ−ＴＡＡ　の　：主要組織適合性抗原の変調は腫瘍発 生性と関連づけられてきた（Ｈａｙａｓｈｉ、　Ｈ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　４３：２６３−２６７、（１９８５）参考のために 引用）。クラスエ抗原発現の減少或は欠如が腫瘍細胞の免疫認識を減少させ、そ れらが免疫破壊を逃れることを可能にするということを証拠が示している。イン ターフェロンによってクラス■ＨＬＡの発現が減少したか、或は発現していない 腫瘍細胞の処置の結果、腫瘍発生性の減少を生じた（Ｔａｎａｋａ、　Ｋ、に、 　ｅｔ　ａｌ、。

５ｃｉｅｎｃｅ　（Ｗａｓｈ、　ＤＣ）　２２８：２５−３０　（１９８５）； 　Ｅａｇｅｒ、　Ｋ、Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｔ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：５５２５−５５２９　（１９８５）参考のために 引用）。

ヒトの、培養した腫瘍細胞をインターフェロンで処置すると、しばしば、組織適 合性抗原（クラスＩ）の発現が増加し、腫瘍抗原の発現が変調される（増加或は 減少）ことが知られている（１ｍａｉ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、ｌＩＩｌ ｍｕｎｏｌ、　１２７：５０５−５０９：　Ｇｉａｃｏｍｉｎｉ、Ｐ、ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｊ、　Ｉｍａ＋ｕｎｏ１．１３３：１６４９−１６５５；　Ｐｅｒｏｓ ａ、　Ｆ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　ｌ＋ｎｍｕｎｏ１．１３８：２２０２−２２ ０７　（１９８７）各々参考のために引用〉。我々は、３つのメラノーマ細胞系 、ＵＣＬＡ−Ｓｏ−ＭＩＯ，ＵＣＬＡ−Ｓｏ−Ｍ２４．およびＵＣＬＡ−Ｓｏ− ＭＩＯＩ、をガンマおよびアルファインターフェロンで処置し、それによって、 これがＵ−ＴＡＡ発現のレベルに影響するかどうかを判定した。各々の細胞系の 細胞は、インターフェロン５００ユニツト／ｍｌを補った場合としない場合の両 方のＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中で、３７℃で９６時間、培養した。

処置後、細胞をスクラップにより集め出してＰＲＭＩ−１０％ＦＣＳで２回洗浄 し、Ｕ−ＴＡＡの量を評価した。同種異系抗体および精製Ｕ−ＴＡＡを用いた競 合ＥＬＩＳＡを使った。インターフェロンの存在下および不在下で成育させた、 様々な数のメラノーマ細胞で、吸収させる荊と吸収した後に、同種異系抗体を精 製Ｕ−ＴＡＡと反応させた。精製Ｕ−ＴＡＡ　（０，０６μｍｌ）を、ＥＬＩＳ Ａの標準阻害曲線を作成するために標準ブｏ　’ｙカーとして用いた。

ガンマインターフェロンまたはアルファインターフェロンのどちらかの存在下で 細胞を生育させることにより、ＵＣＬＡ−５Ｏ−ＭＩＯおよびＵＣＬＡ−Ｓｏ− ＭＩＯｌ細胞系によるＵ−ＴＡＡの発現が増加した。しかし、ＵＣＬＡ−３ｏ− Ｍ２４によるＵ−ＴＡＡの発現は、どちらのインターフェロンによる処置によっ ても影響を受けなかった（表１０）。対照として、細胞を１２５■標識モノクロ ーナル抗体（抗１（ＬＡ−ＤＲ）と、懸濁液アッセイで反応させることによって 、ＨＬＡ−ＤＲ抗原の発現を測定した。インターフェロンの存在下で成長した３ つの培養吻合ての細胞による放射標識抗体の結合は、その非在下で成育させたも のよりも有意に高かった（２から３倍）。

（以下余白） 実Ｗ五■ ＩＩ−ＴＡＡは　で　る：　ＥＬＩＳＡで高い抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力価を示したＭ ＣＶ患者から無作為に選択された血清を、培養メラノーマ細胞の表面に結合し得 る抗体について、免疫蛍光法によって試験した。強い膜の蛍光を示す血清を、細 胞表面上のＵ−ＴＡＡがこの反応性の一部に起図するものであるかどうかを決定 スルタメに、間接的膜免疫蛍光法を用いることによってさらに試験した。血清試 料を段階希釈し、そして３７°Ｃで３０分間おヨヒ４°Ｃで３０分間、等量（５ ０μｌ）のＰＢＳのみ（陰性コントロール）または１μｇのＵ−ＴＡＡを有する ＰＢＳとともにインキュベートした。培養ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ　２４メラノーマ 細胞をベルセン（０，０５ｍＷ　ＥＤＴＡナトリウム、０．０１４Ｍ　ＮａＣ１ ，０，５＋＊Ｍ　ＫＣＩおよび０．５５ｍＭデキストロース）および０．２５％ トリプシンで処理することにより採収した。これらの採収した細胞を、０．０１ ％のヒト血清アルブミンを含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗 浄し、そして５Ｘ１０’細胞／ｍｌの濃度でｌｌＢ５５−アルブミン中に再懸濁 した。５０マイクロリｙトルのこの細胞懸濁液を種々の希釈濃度のメラノーマ血 ／＊５０μｍと混合し、そして３７℃で１時間および４℃で１時間インキュベー トした。これらの細胞をＨＢＳＳ−アルブミンで３回洗浄し、そして５０μｌの フルオレセイン結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンと２３°Ｃで２０分間、反応させ た。洗浄後、これらの細胞を０．０２５Ｍ　ＰＢＳ中の５０％グリセロール２５ μｌに再懸濁し、スライドガラス上に置き、そして蛍光顕微鏡のもとて膜の免疫 蛍光を調べた。細胞膜上に３個またはそれ以上の蛍光ドｌトが存在する場合には 、抗体に対して陽性であるとみなした。拡散または細胞質の蛍光は、陽性とはみ なさなかった。

陽性細胞のパーセンテージを５０個の細胞を数えて計算した。

高い抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力価を有する血清は間接的膜免疫蛍光法で試験した場合に 、抗体のＵＣＬＡ−Ｓｏ−Ｍ　２４培養メラノーマ細胞に対する結合を示した。

１つの血清を上述のようにＵ−ＴＡＡによる阻害研究のために選択した。この血 清は１：１６の割合に希釈した場合でさえ、５０−６０％のメラノーマ細胞と結 合することを示した。１μｇの精製Ｕ−ＴＡＡと共にこの血清をブレインキュベ ーションした結果、１：１６の血清の希釈濃度で免疫蛍光を示す細胞数の９３％ の減少を生じた（図１１）。Ｕ−ＴＡＡの、間接的膜免疫蛍光アッセイにおける 高力価抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の結合を阻害する能力は、腫瘍細胞の表面の細胞膜上に おけるυ−ＴＡＡの発現を説得力をもって実証した。

Ｌ施Ｂ Ｕ−ＴＡに・　るヒト　のインビトロにおシる　：　フィコール−ハイパツク遠 心分難法を用いて、癌患者のヘパリン処理した（ｈｅｐｒａｎ　１ｚｅｄ）血液 ３０１から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を得た。

高レベルの抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を基準として、ＭＣＶ治験の参加者から血液ドナー を選択した。赤血球ロゼノティング法（ここで参考のために援用されているＢａ ｋａｃｓらのＣｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７７））の適用に よって、単離したＰＢＬからＴ細胞を除去した。それによってそのＰＢＬはＢ細 胞（抗体産生細胞）について富化された。エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ ）をそれらに感染させることによって、この富化されたＢ細胞を形質変換した。

この目的のために、ＥＢＶを産生ずるマーマセノト（ｍａｒｍａｓｅｔ）細胞系 Ｂ９５−８＋７）５０％上清液を含有ｔルＲＰＭｌ　１６４０−１０Ｓ　ＦＣＳ 中に、１０×１０６細胞／ｍｌの濃度で、富化されたＢ細胞を懸濁した。３７° Ｃで一部インキユベートした後、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地に再懸濁 した。これらの培養物からの上清液を１週間毎に集め、標的抗原として精製した Ｕ−ＴＡＡを用いたＥＬＩＳＡの直接法で抗Ｕ−ＴＡＡ活性の存在を試験した（ 実施例Ｉ）。３５個の培養物のうち１７個の培養物がＵ−ＴＡＡに対する抗体を 産生じたが、しかし多くの培養物が３力月以内にこれらの抗体を産生ずることを やめた。６力月より長くこれらの抗体を産生じ続けた２つの培養物からの細胞（ 図１２）を、一定間隔で低温保存した。

該上清液中の該抗体が認識する免疫反応性成分が腫瘍細胞によって発現されるこ とを証明するために、インビボで産生されたＵ−ＴＡＡに対する抗体の供給源と して、これらの培養物の１０倍濃度の上清液を用いた。１４ｃｍｔ−ロイシン（ ５０μＣｉ／箇ｌ）を補ったＲＰＭＩ中で５日間、メラノーマ細胞（ＵＣＬＡ− Ｓｏ−Ｍ１４）を培養した。細胞を採収し、完全ＲＰＭ　Ｉ−ＦＣＳ培地で３回 洗浄し２、そして、０．５％（Ｖ／Ｖ）ＮＰ−４０（Ｎｏｎａｄｅｔ　Ｐ−４０ ）で抽出して生合成により標識された抗原を得た。細胞を含んでいない抽出物を 、固定化した小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で処理した。結合した物質をキ）　ｌ− １／アーゼ（ｃｈｉｔｏｔｒｉａｓｅ）で溶離し、モして溶離液として０．０２ ５Ｍリン酸緩衝生理食塩水を用いて、セファクリルＳ−２００カラム（０゜５Ｘ １０ｃ■）を通してクロマトグラフィーを行った。２００マイクロリツトルの両 分を集めた。この溶離プロフィールを、１０μｍ部分をシンチレーション計数に 供することによってモニターした（図１３）。放射活性の各々のピーク下の画分 をプールし、１０倍濃度のヒドリンホブラストイド（ｈｕｍａｎ　１ｕｓｐｈｏ ｂｌａｓｔｏｉｄ）培養土清液（インビトロで産生された抗体の供給源）１゜Ｏ μｌと反応させた。抗体と結合した放射活性を、ウサギ抗ヒト１ｇ免疫ビーズの ５０％懸濁液（Ｂｉｏｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、リッチモンド、カリ フォルニア州）２００μｌによって沈澱させた。図１３に示すように、画分３９ から４５のプールの約６５％の放射活性が、リンホブラストイド（ｌｙｍｐｈｏ ｂｌａｓｔｏｉｄ）培養上清液に存在するヒト抗体に結合した。

我々はまだ、単一細胞由来のクローンを開発することには成功していないが、フ ィーダ層として胸腺細胞を用いて軟質寒天（１駕）中に培養することによって、 リンホブラストイド細胞系（ＬＣＬ　１およびＬＣＬ　Ｚ）由来のサブクローン を作成することに成功した。理論上、この軟質寒天において発育するコロニーは 、単一細胞由来である。しかし、このことはいつも真実であるというわけではな い。なぜならば、しばしば、２つまたはそれ以上の細胞がお互いに癒着するから である。従って、このようなコロニーの単一クローン性については保証し得ない 。ＬＣＬ２培養物の２種のサブクローン（ＬＣＬ　２．６およびＬＣＬ　２゜１ １）を分析することによって、それらが抗Ｕ−ＴＡＡおよび抗ＰＡ　１ｇＭ抗体 を産生ずることが明かにされた。

サブクローンＬＣＬ２．６および２．１１の培養上清液の免疫反応性の特異性を 、精製したＦＡおよびＵ−ＴＡＡでブｏ　ツクし、次いでＥしＩｓＡで２種の標 的抗原に対して反応させることによって確認した。２倍希釈法を用いてこの培養 上、ｌｆ液を段階希釈した。

各８釈Ｈの一部分く１００μｌ）を、非ブロックのコントロールとして０．１５ Ｍ　ＮａＣ１および０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補った０、０２５Ｍリン酸緩衝 液と混合し；第２の部分を等量（１００Ａｔｌ　）のＦＡ　（０，０５ｍｇ／ｍ ｌ）でブロックし；そして、第３の部分をＵ−ＴＡＡ（０，０６ｍｇ／ｍｌ）と 反応させた。この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。Ｕ−ＴＡＡおよ びＦＡに対する各混合物中の抗Ｕ−ＴＡＡおよび抗ＦＡ抗体レベルをＥＬＩＳＡ によって測定した。図１４および１５に表されたデータは、Ｕ−ＴＡＡに対する サブクローンＬＣＬ２．６の培養上清液の反応性が、Ｕ−ＴＡＡによってブロッ クされ、ＦＡによってブロックされないことを示す。また、ＦＡに対するその反 応性も、ＦＡによってブロックされ、Ｕ−ＴＡＡによってブロックされなかった 。

抗体の供給源として、もう一方のサブクローンであるＬＣＬ　２゜１１の培養土 清液を用いた場合、同様の結果が見られた。サブクローンＬＣＬ　２．６および ＬＣＬ　２．１１は、この時点においてモノクローナルでないが、それらは抗Ｕ −ＴＡＡ（ＩｇＭ）抗体を産生ずるということを、これらの結果は明白に示して いる。これらのサブクローンを引き続いてサブクローニングすることによって、 モノクローナルの性質を有するクローンが生じるはずである。

（以下余白） 実ＪｆＬＬｕ■二ｌ −一　の　に　ム　の≦で　るＵ−ＴＡＡの　：癌働者においてＵ−ＴＡＡは免 疫原であるため、免疫反応を引き出す。そのため、Ｕ−ＴＡＡに対する抗体は、 特に腫瘍の苦痛が少ない時には、癌患者の血液中を循環する。これらの抗体は、 腸瘍細胞表面上のＵ−ＴＡＡに反応し得る。我々は、腫瘍細胞表面における抗体 の存在を証明し、それらが特に腫瘍抗原と反応することを解明した（Ｇｕｐｔａ 、　Ｒ，に、　ａｎｄ　Ｍｏｒｔｏｎ、　Ｄ、Ｌ、　Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ 　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　１５：１０５３　（１９ ８４）参考のため援用）。腫瘍結合抗体は、生体において対応する抗原との免疫 相互作用の証拠だと考え得る。細胞表面上に形成された抗原−抗体（免疫）複合 体は、細胞によって内面化し、または抗原の転形、キャップ形成および発散の行 程（Ｌｅｏｎｇ　Ｓ、Ｐ、Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３ ９：２１２５　（１９７９）参考のために援用）によって周囲に放出され得る。

他に考え得る腫瘍抗原が血行中に放出される機構としては、細胞死、表面出血、 亜致死の自己分解および細胞からの分泌（Ｐｒｉｃｅ、　Ｍ、Ｒ，ａｎｄ　Ｒｏ ｂｉｎｓ、　Ｒ，Ｗ、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｃ ａｎｃｅｒ、　ｐｐ、　１５５　（１９７８）参考のため援用）が挙げられる。

血行中に発散された抗原は、体液性抗体と結合し、循環免疫複合体を形成するこ とになる。このように、人間の癌の免疫診断および免疫予後のためのマーカーと して免疫複合体を利用するための数多くの努力が様々な研究者によってなされて きたが、いくらかが成功している。

しかし、複合体の抗体性は知られておらず、癌患者の治療行程との相関関係は不 明瞭であった。これは、主に、抗原非特異性免疫複合体検出アッセイの利用のた めである。

ヒト腫瘍細胞によって生成された９Ｏ−１００ｋＤサブユニツトをｆＨａする、 ネズミモノクローナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４の有用性を用いて、我々は抗原非特 異性免疫複合体検出アッセイを開発してきた。図１６に示すように、このアッセ イは、ネズミモノクローナル抗体ＡＤＩ−４０Ｆ４の固体マトリクスへの固定を 利用する。

固体マトリクスは、たとえば、ポリビニルまたはポリスチレンのマイクロタイタ ブレートまたはチューブまたはビーズ、テフロンのディスク、ガラスピーズ、あ るいは、グラスファイバーディスクのようにあらゆる適切な物質を物理的に適当 なあらゆる形状にしたものであり得る。固定は、たとえば、物理的吸収、または 、ホモ−またはへテロ−二官能性もしくは多官能性結合剤を用いた化学的反応に よる共有付着によって行い得る。固定されたモノクローナル抗体を、Ｕ−ＴＡＡ 　（抗原）−抗Ｕ−ＴＡＡ　（抗体）複合体、または血清もしくは他の体液がら の精製免疫複合体を含有すると思われる、血清サンプルまたは池の体液と反応さ せる。固体マトリクスを洗浄した後、その表面のヒト免疫グロブリンの存在を、 ＩｇＧ、ＩｇＭ、　ＩｇＡなどの各アイソタイプに一峻的なあるいは特異的な酵 素もしくはヒト免疫グロブリンへのピオチン標識された抗体によって認識する。

固体マトリクスに固定されたネズミモノクローナル抗体は血清成分のいずれとも 反応しないため、固体マトリクス上のヒト免疫グロブリンの存在は、すでに生体 内で患者の抗体と反応した抗原を捕獲したためである。固体マトリクスを反応さ せた複合体を適当な基板に曝すと、色発現によって抗原（Ｕ−ＴＡＡ）特異性免 疫複合体がテストサンプル中に存在することがわかる。

我々は、ポリスチレンマイクロタイタープレート（１ｍｍｕｌ。

ｎ　Ｉ、　Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｈａｎｔｉｌｌ ｙ、　ＶＡ）での上記の技術を開発してきた。ネズミモノクローナル抗体ＡＤ１ 〜４０Ｆ４をウェルに付着させた（ウェルにっき１：３００希釈物１００μｌ） 。テスト血清（１・２０希釈物１００μｌ）をネズミ抗体感作ウェルに付加し、 ３７°Ｃで１．０時間インキュベーションした。洗浄後、テストウェル中のヒ） ＩｇＧの存在（免疫複合体の形で存在している）を、基板としてヤギ抗ヒトＩｇ Ｇおよび燐酸ｐ−ニトロフェニルに接合したアルカリ性ホスファターゼによって 計測した。その結果を４０５ｒ＋ｍにおける光密度（ＯＤ）として表した。２４ 人のメラノーマ患者から取った血清は０．４５６±０．１１４の平均±ＳＥ　０ Ｄａａｓを宵していた。この値は、明らかに健康な正常対照３２人の血清の０． １±０．０２５という平均±ＳＥより有意に大きい（ｐ＜０．００１）。

正常対照の、平均プラス２標４偏差値（０，３９２０Ｄ４ａ５）より大きな値を 、Ｕ−ＴＡＡ特異特異性免疫体合体在の示度として用いると、メラノーマ患者か ら取った血清の３７．５％（９／２４）は陽性であり、それに対して正常対照で はたった６％（２／３２）であった（　Ｐｒｏ、　０１）。

予期研究において、９人のメラノーマ患者の治療期間の間に連続的に集められた 血清サンプルを分析して、その再発が臨床的に明白になる数カ月前に、患者が潜 伏的な病状であることを知るために、このＵ−ＴＡＡ特異性免疫複合体検出アッ セイを利用し得ることがわかった。図１７は、２人の代表的な患者のデータを用 いてこの事実を説明したものである。Ｕ−ＴＡＡ特異性免疫複合体の陽性レベル を、再発が臨床的に検出できる４〜２４週間（平均＝１４．１週間）前に検出し た。このように、本発明は、外科的治療をした癌患者の血清中のＵ−ＴＡＡ特異 性免疫複合体の存在を検知することによって、微視的な潜在的病状を確認する、 宵月な手段を提供する。

灸施史−天猛■ ヒト　イディオ　イブ　の　′：治療に適用するために大量の抗原が必要である 。培養した腫瘍細胞抽出液または癌患者の尿から得られる量は、生体内での血清 学または免疫化学アッセイでの使用にのみ十分なだけである。仇原を適切に提供 するためには、２つの方法が可能である：１）分子生物学技術によって、Ｕ−Ｔ ＡＡの生成に携わる遺伝子をクローン化する；２）癌患者からＥＢＶ変換したリ ンパ芽球様細胞、または、抗Ｕ−ＴＡＡの抗イデイオタイプ抗体（抗Ｕ−ＴＡＡ 抗体の内部鏡像）を分泌するこれらの細胞のヒト−ヒトハイブリドーマを同定す る。これらの方法は、当業者ならばうまく利用し得る。我々はすでに、ＥＢＶ変 換したリンパ芽球様細胞および癌患者のリンパ球から取ったヒト−ヒトハイブリ ドーマを有しているため、現在のところは第二の方法の方が好ましい。

これらのリンパ芽球様細胞株の多くが免疫グロブリンを分泌し、Ｕ−ＴＡＡと反 応しない。これらの免疫グロブリンのいくつかがＵ−ＴＡＡの抗イデイオタイプ であってもよい。１ｇＭアイソタイプの抗Ｕ−ＴＡＡを生成するリンパ芽球様サ ブクローンを我々は同定した（実施例ＸＸＸ１１）。大量のこれらの抗体を精製 された形状で得ると、それらを酵素またはその他の適切な放射線核種に結合して 、クローンを抗イデイオタイプ活性であると同定するために、Ｕ−ＴＡＡに反応 しないリンパ芽球様クローンの上清に反応する性質を用い得る。陽性クローンを 用いた、ＩＪ−ＴＡＡに対する抗イデイオタイプ抗体の製造は、クローン上清を 製造する抗イデイオタイプ抗体と思われるものとの反応の前に、Ｕ−ＴＡＡによ って抗Ｕ−ＴＡＡをブロックすることによって確実となる。Ｕ−ＴＡＡの内部鏡 像とは異なる抗イデイオタイプの検出を確実にするために、標識をつけられた抗 体は精製したヒト正常血清免疫グロブリンを含有している（２％ｖ／ｖ）。この ように同定される抗イデイオタイプは、活性特異性免疫治療、およびアミノ酸配 列、ヌクレオチド配列などのＵ−ＴＡＡの抗原エピトープの化学的分析に広く利 用することができる。

本発明は、現在のところ好ましい実施態様を参照して説明をしてきたが、本発明 から離れることなく変形を加えることも可能である。従って、本発明は以下の請 求の範囲によってのみ限定されるものである。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　５ メラノーマ　正常　メラ／−７Ｌ９ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、８ ２　４　９　１６　：（２６４ 汲昂Ａ１人の（Ｉ＋♀ ＦＩＧ、ＩＩ ＩＣ−ＭｕＭｏＡｂ−テアｇ−７＋　Ｅ−ＲｘＨｕｌｇＧｂ−＋＄−１ｇＭ８　 Ｓ　ｉＥ］　ｉｓ　２Ｂ　２５　３８週 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年５月６日ｐ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．約９０から１００ｋＤの分子量を有する尿中腫瘍関連抗原の実質的に精製さ れた抗原性のポリペプチドサブユニットであって、該分子量が、β−メルカプト エタノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による 分離の後に測定された、ポリペプチドサブユニット。 ２．請求項１に記載のポリペプチドに曝された動物由来の抗体産生細胞を単離す ること、該抗体産生細胞と癌細胞との間のハイプリドーマを形成すること、およ び該ポリペプチドと反応する抗体を産生する細胞を選択することによって産生さ れるモノクローナル抗体。 ３．被験者における癌を検出する方法であって、該被験者の体液由来の尿中腫瘍 関連抗原を請求項２に記載のモノクローナル抗体と接触させること、および該結 合した抗体の存在、すなわち、癌の存在を示す尿中腫瘍関連抗原の存在を検出す ることを包含する、方法。 ４．前記癌が潜在性である、請求項３に記載の方法。 ５．ＩｇＧおよびｌｇＭでなる群から選択される、請求項２に記載のモノクロー ナル抗体。 ６．尿中腫瘍関連抗原と反応する抗体と反応する試薬。 ７．抗イデオタイプの抗体である、請求項６に記載の試薬。 ８．請求項７の抗イデオタイプの抗体の治療上の量を被験者に注射することを包 含する、免疫治療の方法。 ９．悪性腫瘍をモニターする方法であって、請求項２のモノクローナル抗体を、 病気の被験者の体液由来の尿中腫瘍関連抗原と接触させること、所定の量の体液 に対する尿中腫瘍関連抗原の量を決定すること、該量と、同等の試料のために予 め決定された量とを比較することを包含する方法であって、尿中腫瘍関連抗原の 差異が該悪性腫瘍の状態の度合を示す、方法。 １０．バイオプシーの腫瘍細胞上の尿中腫瘍関連抗原を検出する方法であって、 請求項２に記載のモノクローナル抗体を腫瘍細胞と接触させること、および該結 合した抗体の存在を検出することを包含する、方法。 １１．腫瘍細胞に対して向けられる、抗体または細胞が媒介する免疫を誘導する ための、あるいは増強するためのワクチンであって、細胞表面に尿中腫瘍関連抗 原を有する不活性化された腫瘍細胞、およびＧＭ−２、ＧＤ−２、胎児の抗原、 またはメラノーマ腫瘍関連抗原でなる群から選択される、少なくとも１種の腫瘍 開運抗原、および薬学上受容し得る担体を含有する、ワクチン。 １２．前記腫瘍細胞が、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１０、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４およ びＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１０１でなる群から選択されるメラノーマ細胞である、請 求項１１に記載のワクチン。 １３．前記細胞が、さらに該細胞表面に被験者と同様のタイプのＨＬＡを有する 、請求項１１に記載のワクチン。 １４．被験者において約９０から１００ｋＤの分子量を有する尿中腫瘍関連抗原 のポリペプチドサブユニットと反応する抗体の産生を誘導するための、あるいは 増強するための方法であって、該分子量が、βメルカプトエタノールによる還元 およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離の後に測定された 方法であって、請求項１１に記載のワクチンの有効量を該被験者に投与すること を包含する、方法。 １５．前記被験者が、ヒトである、請求項１４に記載の方法。 １６．前記被験者が癌を患っており、そして前記ワクチンの投与後に各個体にお いて産生された前記抗体が該癌を抑制する、請求項１４に記載の方法。 １７．前記癌がメラノーマ、サルコーマおよびカルシノーマでなる群から選択さ れる、請求項１６に記載の方法。 １８．請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学上受容し得る担体を含有する、 ワクチン。 １９．被験者において、該被験者における腫瘍細胞と反応する抗体の産生を誘導 するための、あるいは増強するための方法であって、請求項１８に記載のワクチ ンを投与することを包含する、方法。 ２０．被験者において、胸部または肺のカルシノーマを検出する方法であって、 該被験者の試料由来の尿中腫瘍関連抗原の存在を検出することを包含する、方法 。 ２１．前記検出が、尿中腫瘍関連抗原を抗体と結合させること、および該抗体の 存在を検出することを包含する、請求項２０に記載の方法。 ２２．被験者において腫瘍をインビボで検出する方法であって、該腫瘍細胞表面 上の尿中腫瘍関連抗原と反応する試薬を該被験者に注射すること、該尿中腫瘍関 連抗原と反応する該試薬の存在を検出すること、およびそれによって該腫瘍を検 出することを包含する、方法。 ２３．前記腫瘍が、メラノーマ、サルコーマ、またはカルシノーマでなる群から 選択される、請求項２２に記載の方法。 ２４．前記試薬が抗体である、請求項２３に記載の方法。 ２５．前記抗体がモノクローナルである、請求項２４に記載の方法。 ２６．被験者中の腫瘍細胞表面に尿中腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を抑制する方 法であって、該腫瘍細胞表面の尿中腫瘍関連抗原と反応する、腫瘍を抑制する試 薬を該被験者に注射することを包含する、方法。 ２７．前記試薬が抗体である、請求項２６に記載の方法。 ２８．前記抗体が細胞毒性または細胞増殖抑制性の薬剤に結合している、請求項 ２７に記載の方法。 ２９．前記細胞毒性または細胞増殖抑制性の薬剤が、毒素、放射線標識された成 分、および化学療法薬でなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。 ３０．請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。 ３１．請求項３０に記載の核酸と選択的にハイブリダイズし得る核酸プローブ。 ３２．請求項１に記載のポリペプチドの抗原性の部分をコードする核酸。 ３３．前記核酸が、抗イデオクイブの抗体における抗原性の部分の配列に対応す る、請求項３２に記載の核酸。 ３４．請求項３３に記載の核酸と選択的にハイブリダイズし得る核酸のプローブ 。 ３５．低レベルの尿中腫瘍関連抗原を検出する方法であって、γ−インターフェ ロンで癌細胞における尿中腫瘍関連抗原の発現を増強すること、該尿中腫瘍関連 抗原を試薬と接触させること、および該試薬の存在を検出することを包含する、 方法。 ３６．被験者において癌を診断する方法であって、被験者の体液において請求項 １に記載のポリペプチドを検出することを包含する、方法。 ３７．前記検出することが、前記ポリペプチドと試薬とを接触させること、およ び核ポリペプチドと反応する該試薬の存在を検出することを包含する、方法。 ３８．以下の（１）、（２）および（３）を包含する、癌から得られる尿中抗原 性複合体（ｕｒｉｎａｒｙ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ）を有する被 験者において癌を検出またはモニターする方法：（１）該被験者から試料を除去 すること；（２）尿中腫瘍関連抗原に結合する試薬と結合することを妨げるため に、該試料中の該尿中抗原性複合体の炭水化物部分を政変すること；および （３）該改変された尿中抗原性複合体の少なくとも一部を検出すること、および それによって該癌を検出すること。 ３９．４５ｋＤのポリペプチドサブユニットに位置した尿中腫瘍関連抗原のエピ トープであって、該ポリペプチドサブユニットの分子量がβ−メルカプトエタノ ールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離の 後に測定され、そして自己ヒト血清またはヒヒのポリクローナル抗体と反応する 、エピトープ。 ４０．１２０ｋＤのポリペプチドサブユニットに位置した尿中腫瘍関連抗原のエ ピトープであって、該ポリペプチドサブユニットの分子量がβ−メルカプトエタ ノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離 の後に測定され、そしてヒヒのポリクローナル抗体と反応する、エピトープ。 ４１．以下の（１）、（２）、（３）および（４）を包含する、試料における尿 中腫瘍関連抗原を検出する方法：（１）該尿中腫瘍関連抗原と、尿中腫瘍関連抗 原上のエピトープと結合する第一の試薬とを接触させること；（２）該尿中腫瘍 関連抗原と、尿中腫瘍関連抗原上の第二のエピトープと結合する第二の試薬とを 接触させること；（３）該試薬の１種を固体の支持体に結合させること；および （４）結合した試薬の存在を検出すること、およびそれによって尿中腫瘍関連抗 原の存在を検出すること、ここで、該試薬の１種は非ヒトポリクローナル抗体で ある。 ４２．前記試薬が両者とも抗体である、請求項４１に記載の方法。 ４３．前記ポリクローナル抗体がヒヒから単離される、請求項４１に記載の方法 。 ４４．前記試薬が、尿中腫瘍関連抗原上のエピトープと結合する前に、前記固体 の支持体と結合する、請求項４１に記載の方法。 ４５．以下の（１）、（２）、（３）および（４）を包含する、試料において尿 中腫瘍関連抗原を検出する方法：（１）β−メルカプトエタノールによる還元お よびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離の後に確認される、 ４５、６５、９０−１００および１２０ｋＤのサブユニット上のエピトープでな る群から選択される、該尿中腫瘍関連抗原上のエピトープと結合する第一の試薬 を、尿中腫瘍関連抗原と接触させること； （２）β−メルカプトエタノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法による分離の後に確認される、４５、９０−１００および１２０ ｋＤのサブユニット上のエビトープでなる群から選択される、該尿中腫瘍関連抗 原上のエピトープと結合する第二の試薬を尿中腫瘍関連抗原と接触させること； （３）該試薬の１種と固体の支持体とを結合させること；および （４）結合していない試薬の存在を検出すること、およびそれによって尿中腫瘍 関連抗原の存在を検出すること。 ４６．β−メルカプトエタノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法による分離の後に測定された場合、６５ｋＤのポリペプチドサブ ユニットに位置する尿中腫瘍関連抗原のエピトープであって、自己ヒト血清また はヒヒのポリクローナル抗体と反応する、エピトープ。