JP2001281255A - 尿中関連抗原、抗原サブユニットの使用および検出方法 - Google Patents

尿中関連抗原、抗原サブユニットの使用および検出方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、β−メルカプトエタノールによる
還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる分離後に約９０から１００ｋＤの分子量を有する、
実質的に精製された、尿中腫瘍関連抗原の抗原性ポリペ
プチドサブユニットを提供する。本発明は、モノクロー
ナル抗体、腫瘍を検出する方法、免疫治療の方法、悪性
度をモニターする方法、尿中腫瘍関連抗原を検出する方
法、尿中腫瘍関連抗原に関係するワクチンおよび他の方
法もまた提供する。 【解決手段】 サンプル中の抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を検出す
るための方法であって：（ｉ）Ｕ−ＴＡＡが結合された
表面を提供する工程；（ｉｉ）該サンプルを該表面と接
触させる工程；および（ｉｉｉ）該表面上の抗Ｕ−ＴＡ
Ａ抗体を検出する工程、を包含する、方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＮＩＨ ｇｒａｎ
ｔ Ｎｏｓ．ＣＡ２９６０５、ＣＡ１２５８２およびＣ
Ａ３００１９によって一部分援助された。米国政府はあ
る権利を有し得る。 本発明は一般に腫瘍関連抗原に関
し、特に、腫瘍患者の尿に見いだされる抗原に関するこ
れらの抗原は、免疫学的診断、免疫学的予後、およびヒ
ト腫瘍の治療法に用いられ得る。
【０００２】
【従来の技術】インビボでの新生物への転換後、細胞が
生化学的および形態学的に変化することが、動物モデル
で充分実証されている。適切な量のそのような転換した
新生物細胞は、次いで、充分な数の生存している新生物
（腫瘍）細胞に接種されると、同系動物の腫瘍の発達に
対して防御免疫を誘導し得る。防御免疫は、腫瘍特異的
移植抗原と呼ばれる、ある新しい成分の出現によるもの
であると決定された。ヒトの悪性腫瘍細胞による同様の
成分（いわゆる腫瘍関連抗原）の発現は、自己のおよび
同種異系のヒト血清を用いる血清学的分析によって、抗
体の源として同定されている。ヒト腫瘍細胞で免疫した
動物からの血清、およびヒト腫瘍に対して生じたネズミ
のモノクローナル抗体の使用は、さらなる腫瘍関連抗原
の定義を提供した。しかし、異種のポリクローナル抗体
あるいはネズミのモノクローナル抗体が定義したヒト腫
瘍細胞上の抗原は、必ずしもヒトにおいて免疫原性を示
さない。異種のポリクローナル抗体およびネズミのモノ
クローナル抗体によって定義されたほとんどすべての抗
原の物理化学的性質は細部にわたって解明されている
が、このような情報は、自己抗体および同種異系抗体に
よって定義される腫瘍関連抗原については、ごくわずか
しか入手できない。このような不足の理由は、引続き均
質に精製するために充分な量の抗原の可溶化が困難であ
ること、ならびに自己抗体および同種異系抗体のポリク
ローナルな性質にある。宿主において免疫原性である充
分特徴付けられた腫瘍関連抗原が入手できない限り、免
疫学的診断、免疫学的予後、およびヒト腫瘍の治療への
適用に関してこれらの抗原の重要性は充分には理解され
ない。
【０００３】自己抗体および同種異系抗体によって定義
されてきたヒトの新生物の腫瘍関連抗原は、その分布に
関して多様である。あるものは、特有の腫瘍細胞株ある
いは腫瘍によってのみ発現される；あるものは、腫瘍が
発生する器官および胎児組織を含有する組織学的に異な
る腫瘍によって共有される。腫瘍細胞株は一般に個々の
腫瘍のすべてからは確立されず、そして別の患者には適
用し得ないため、特有の腫瘍によってのみ発現される抗
原は免疫学的診断および治療に対して重要性が乏しい。
他方、組織型の等しい異なる腫瘍あるいは組織学的に異
なる腫瘍によって共有される腫瘍抗原は、異なる腫瘍型
を有する異なる患者の免疫診断、免疫予後および治療に
適用し得る。
【０００４】ヒトの増殖する新生物に対する免疫が、腫
瘍細胞を有する抗原による能動免疫によって増強し得る
ことを示唆する、充分に実証された例がある。このよう
な能動的で特異的な免疫療法の目的は、増殖する新生物
によって自然に誘導されるレベル以上に抗腫瘍免疫のレ
ベルを増強させようとする試みに向けられる。増殖する
新生物は、含有する腫瘍関連抗原に対する宿主の最大免
疫応答を誘導しないと考えられている。ヒトの腫瘍関連
抗原の単離および精製における進歩が遅かったために、
多くの免疫療法の試みは腫瘍細胞全体から調製したワク
チンを用いてきた。生きた自己腫瘍細胞は接種部位での
腫瘍の増殖をもたらし得ることから、ヒトではこのよう
なワクチンは使用されなかった。しかし、共有される通
常の腫瘍関連抗原を高レベルで発現する腫瘍細胞は、異
なる患者を免疫するのに用い得る（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｄ．
Ｌ．ら、Ｉｎ Ｔｅｒｒｙ，Ｗ．Ｄ．，Ｒｏｓｅｎｂｅ
ｒｇ，Ｓ．Ａ．（編）：Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ
ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ．ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ１１ａｎｄ，ｐｐ２
４５−２４９（１９８２）；Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ
Ｐ．Ｏ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３１：５６７
（１９８３））。このような同種異系のワクチンを用い
る利点は二点ある：（１）同種異系のワクチンを投与さ
れた腫瘍細胞上の異種ＨＬＡ移植抗原に対して誘導され
た免疫応答は拒絶を引き起こす；（２）この免疫処置に
よって、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）がヘルパー機能とし
て役立ち得る、共有される通常の交叉反応性腫瘍関連抗
原に対して、強い免疫応答が誘導されるはずである。
ヒトの免疫療法での大部分の試みは、不活性化された腫
瘍細胞、粗抽出物、あるいは単離された膜からの調製物
から構成されるワクチンを用いてきた。このような調製
物は進行性の腫瘍の増殖を除去するのに効果的であり得
るが、単離−精製過程を体系的にたどるための免疫学的
試薬および高感度な技術が入手できない限り、ワクチン
の調製中に腫瘍関連抗原を不活性化させるという大きな
危険が常に存在する。
【０００５】能動的で特異的な免疫療法に最も応答しそ
うな腫瘍患者は、疾病の初期の患者であり、そして他の
物理療法を用いた治療後、残存する腫瘍の負荷が最小限
の患者である（Ｍｏｒｔｏｎ Ｄ．Ｌ．，Ｓｅｍｉｎａ
ｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ１３：１８０（１９８
６））。
【０００６】凍結乾燥されて再構成された腫瘍患者の尿
サンプルおよび抗体の源としての自己血清を補体結合ア
ッセイにおいて用いることによって、免疫学的反応性が
観察された。この反応性は腫瘍細胞によるこの血清の吸
収によって消失したが、ヒトの正常細胞によっては消失
しなかった。これらの観察結果は、免疫学的に類似した
抗原が尿サンプルおよび腫瘍細胞中に存在することを示
した。さらに、継続的に調査された腫瘍患者の尿サンプ
ルにおいて観察された反応性は、腫瘍の外科的切除後消
失したが、腫瘍の再発前に再び現れた（Ｇｕｐｔａ，
Ｒ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．，１１：６５
（１９７９））。おそらく凍結乾燥の過程で生じた人工
産物のために、多くの試験サンプルの抗補体活性が高か
ったため、試験用に尿サンプルを調製するための異なる
方法が開発された。この研究では、より多数の腫瘍患者
および対照の正常人から２４時間尿サンプルを得た。尿
サンプルを遠心分離および限外濾過によって１００倍に
濃縮し、そして抗体の源として自己血清を用いた補体結
合によって試験した。腫瘍患者は９２％（５５／６０）
が尿中抗原に対して陽性であったのに対して、対照の正
常人はわずか７％（２／２７）が陽性であった。腫瘍患
者からの尿に反応する血清の抗体活性は、腫瘍組織のバ
イオプシーによる吸収によって除去されたが、正常な皮
膚あるいは筋肉では除去されなかった。このことは、腫
瘍患者の尿中に検出された抗原が腫瘍と関連することを
示唆している（Ｒｏｔｅ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．
Ｒｅｓ．２９：１８（１９８０））。
【０００７】その後の研究では、尿中の抗原に対して高
力価を有する同種異系の血清が抗体の源として用いられ
た。補体結合においてこの抗体の源を用いることによっ
て、腫瘍患者の９４．７％および対照の正常人の３５．
１％の尿サンプルが陽性であることが明らかになった。
ここでも、（尿の源に対して自己の）腫瘍細胞による同
種異系の血清の吸収は抗体活性を除去した。しかし、ヒ
ト正常リンパ球、皮膚および筋肉細胞には吸収剤として
の効果がなかった。さらに、尿への抗原の排出は患者の
腫瘍の存在に依存しているようであった。なぜならば、
治療手術による腫瘍の除去によって、抗原と推定された
ものの排出が止まったからである。患者に腫瘍が見られ
ない間は、尿は陰性のままであった（Ｒｏｔｅ，Ｎ．
Ｓ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２６：２０３（１
９８０））。しかし、正常尿の３５％に抗原が存在する
ことにより、交叉反応性の抗原系が示されたため、この
試験は実用化できなかった。
【０００８】濃縮した尿をゲル濾過クロマトグラフィー
によって、抗原活性が溶出プロフィールの第一ピークに
存在することが明らかになった。しかし、この操作を６
Ｍ尿素の存在下で行うと、抗原活性はいろいろな分子の
大きさを表す３個の異なるピーク中に見いだされたが、
第一ピーク中に大部分の活性が見られた。しかし、抗体
の源として用いられた同種異系血清のポリクローナルな
性質のために、異なるピーク中の抗原活性が表している
ものが同じエピトープを有する大きな抗原性複合体の解
離産物であるのか、あるいは異なるエピトープであるの
かを決定することは不可能であった。凍結乾燥されて再
構成された尿を用いたとき、同様の結果が得られた（Ｒ
ｏｔｅ，Ｎ．Ｓ．ら、前出）。従って、自己抗体および
同種異系抗体によって認識された腫瘍患者の尿中の抗原
は、実際は巨大分子複合体であり、そして抗体のポリク
ローナルな性質のために、特定のエピトープの性質は決
定し得なかった。しかし、大部分の証拠から、抗原性の
巨大分子複合体の腫瘍患者の尿への排出は腫瘍宿主中の
腫瘍の存在に依存することが示唆された。手術前に化学
療法および放射線療法を受けた腫瘍患者の尿中腫瘍関連
抗原の連続的な測定が、補体結合によって行われた。治
療の結果としての尿への抗原の排出レベルが治療前のサ
ンプルと比較され、その変化と、インサイチュでの腫瘍
細胞の破壊の臨床病理的な証拠との相関が調べられた。
この方法で調査された５３人の腫瘍患者のうち、４４人
には手術前の治療によって誘導された腫瘍破壊の臨床病
理的な証拠が見られ、そして４４人の患者すべてについ
て治療期間中、尿中の抗原のレベルが４倍あるいはそれ
以上増加した。その他の９人の患者には腫瘍破壊の証拠
は見られず、そしてこれらの患者の抗原力価は未変化の
ままであった。これらの結果から、尿中腫瘍関連抗原の
排出は、観察しにくい腫瘍に対する殺腫瘍療法のインビ
ボでの効果を評価するのに用い得ることが示唆された
（Ｈｕｔｈ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．
Ｒｅｐ．６５：１０３７（１９８１））。同様の結果
が、高熱および化学療法を受けた結腸腫瘍の患者におい
て得られた。ここでも、見かけ上健康な個人の尿におけ
る抗原活性の発生率は高く、すなわち１０％（２／２
０）であった（Ｆｉｎｋ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．
Ｏｎｃｏｌ．２１：８１（１９８２））。
【０００９】補体結合アッセイにおいて同種異系血清が
抗体の源として用いられたので、尿サンプルとの免疫反
応の一部は組織適合性抗原によるという可能性があっ
た。従って、血清からできるだけ多くの抗−ＨＬＡ抗体
を除去するために、血清がプールしたリンパ球で吸収さ
れた。これは、しばしば血清に抗補体活性を付与した。
この問題は、抗補体活性レベル以上に希釈された血清を
用いることによって解消された。しかし、このために結
果としてアッセイの感度が低下した。さらに、試験
（尿）サンプルのいくつかはそれ自体が抗補体活性を示
し、補体結合による尿中の抗原の検出には不適当であっ
た。これらの問題に取り組むために、競合的阻害酵素免
疫アッセイが開発された。このアッセイでは、既知量の
自己抗体と腫瘍関連尿抗原との間の反応性の同種異系尿
（試験）サンプルによる競合的な阻害が、試験サンプル
が免疫学的に類似する抗原を含有する場合にのみ生じ
た。このアッセイの結果は補体結合の結果と非常によく
相関しているし、試験尿サンプル中に存在するＨＬＡに
よる抗補体活性および反応性の問題を扱う必要がない。
しかし、この試験は正常人の尿との反応性を示すめに、
特異性に欠けていた（Ｈｕｔｈ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｎｃ
ｅｒ ４７：２８５６（１９８１））。
【００１０】ゲル濾過クロマトグラフィーによる尿中腫
瘍関連抗原の分析によって、自己抗体および同種異系抗
体によって認識された抗原性複合体は３００ｋＤより大
きな分子量を有することが一貫して示された。この抗原
性物質は、単純拡散によって腎臓の糸球体の基底膜を通
過するには明かに大きすぎた。腫瘍患者におけるネフロ
ーゼ症候群の発生に関する文献がいくつか報告されてい
る。これらの患者の腎臓のバイオプシーによって、しば
しば糸球体基底膜中の免疫複合体の沈着が証明された
（Ｌａｕｇｈｒｉｄｇｅ，Ｌ．Ｗ．およびＬｅｗｉｓ，
Ｍ．Ｇ．，Ｌａｎｃｅｔ １：２５６（１９７１）；Ｃ
ｏｕｓｅｒ，Ｗ．Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．５７：９
６２（１９７４））。従って、インビボの腫瘍細胞によ
って放出されて循環する抗原は、特異的な抗体と反応し
て、循環する免疫複合体を形成するだろうと論理的に仮
定された。これらの免疫複合体は糸球体の基底膜中に沈
着し、膜の損傷を引き起こし得て、そのことが高分子量
の抗原性複合体を尿へと通過させる。腫瘍患者の循環中
の抗原非特異的免疫複合体と尿中抗原の排出との間には
相関関係が観察された。尿中抗原について陽性であった
３６人の腫瘍患者のうち、２８人（７８％）はまた、尿
採取の時に循環免疫複合体についてもまた陽性であっ
た。循環免疫複合体について陰性であった２４人の患者
のうち、２２人（９２％）は尿の抗原についてもまた陰
性であった。血清および尿サンプルを熱化学療法の過程
で連続して調査された腫瘍患者においては、循環免疫複
合体と尿中抗原の排出とのレベルの変動が相似してい
た。これらの結果は、腫瘍患者の尿への尿中腫瘍関連抗
原の排出は孤立した現象ではないこと；むしろ、腎臓に
おける免疫複合体の沈着は糸球体の損傷を引き起こし、
それが尿中にこの抗原を通過させるようであることを示
唆した（Ｈｕｔｈ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ ４９：
１１５０，（１９８２））。
【００１１】尿中腫瘍関連抗原を腫瘍患者の予後のため
に適用できるか否かを決定するための試みにおいて、抗
原性複合体が部分的に精製され、競合的阻害酵素免疫ア
ッセイの標的抗原として用いられた。対照の正常人およ
びメラノーマ患者からの１００倍に濃縮した尿サンプル
をベースライン、抗原の分布、および潜在性の再発の早
期検出を確立するために用いられた。この結果は個人を
比較するための抗原ユニット（ｎｇ抗原性タンパク質／
ｍｇクレアチニン／２４時間）として表された。メラノ
ーマ患者の尿の抗原レベル（メジアン＝５６．５ユニッ
ト、ｎ＝５６）は対照の正常人のレベル（メジアン＝
１．９ユニット、ｎ＝５６）よりも有意に高かった（ｐ
＜０．０５）。正常群の第９０％位は３４．３抗原ユニ
ットであった。この数値を陽性の基準として用いると、
メラノーマ群の６４％（３６／５６）の尿サンプルが抗
原に関して陽性であったのに対して、正常対照群は１１
％（６／５６）が陽性であった。その後、リンパ節除去
後の疾病の再発および非再発を基準に１対とした、５８
人のメラノーマ患者の波及的な分析によって、再発群で
は抗原レベルのメジアンは６８ユニットであり、非再発
群では１８．９ユニットであることが示された。疾病が
再発した２９人のメラノーマ患者のうち１８人（６２
％）および再発しなかった２９人の患者の９人（３１
％）において尿中抗原が陽性であった。これらの発生率
には有意な差が見られた（ｐ＜０．００５）（Ｇｕｐｔ
ａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１：３０３（１９８３））。上述の研究の結果は従
来観察されていた内容を確認したが、多くの（１１％）
正常人の尿中にかなりの抗原レベルがあると一貫して観
察されるために、尿中抗原の検出アッセイの有用性はは
っきりしないままであった。
【００１２】腫瘍宿主において免疫原性を示さない腫瘍
マーカー、例えばＣＥＡ、α−フェトプロテイン、前立
腺特異的抗原などを用いたアッセイの開発に関して著し
い進展が遂げられたにもかかわらず、腫瘍宿主において
免疫原性を示す腫瘍関連抗原を用いて腫瘍を診断し、治
療する必要性が存在する。本発明は、Ｕ−ＴＡＡを検出
すると同時に偽陽性の検出を避けることによって、いろ
いろな腫瘍の検出を可能とすることにより、このような
必要性を充足させる。さらに本発明は、Ｕ−ＴＡＡの抗
原性サブユニット、および腫瘍細胞の表面上の個々の決
定因子に対して細胞に媒介される特異性を誘導するワク
チン、および抗Ｕ−ＴＡＡ抗体産生を提供する。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、β−メルカ
プトエタノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による分離後に約９０から１００ｋ
Ｄの分子量を有する、実質的に精製された、尿中腫瘍関
連抗原の抗原性ポリペプチドサブユニットを提供する。
本発明は、モノクローナル抗体、腫瘍を検出する方法、
免疫治療の方法、悪性度をモニターする方法、尿中腫瘍
関連抗原を検出する方法、尿中腫瘍関連抗原に関係する
ワクチンおよび他の方法もまた提供する。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明のポリペプチドサ
ブユニットは、約９０から１００ｋＤの分子量を有する
尿中腫瘍関連抗原の実質的に精製された抗原性のポリペ
プチドサブユニットであって、この分子量が、β−メル
カプトエタノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法による分離の後に測定された、
ポリペプチドサブユニットを含む。
【００１５】本発明は、上記のポリペプチドに曝された
動物由来の抗体産生細胞を単離すること、該抗体産生細
胞と癌細胞との間のハイブリドーマを形成すること、お
よび該ポリペプチドと反応する抗体を産生する細胞を選
択することによって産生されるモノクローナル抗体を含
む。
【００１６】本発明は、さらに、被験者における癌を検
出する方法を提供し、この被験者の体液由来の尿中腫瘍
関連抗原を上記モノクローナル抗体と接触させること、
およびこの結合した抗体の存在、すなわち、癌の存在を
示す尿中腫瘍関連抗原の存在を検出することを包含し得
る。
【００１７】１つの局面において、本発明は、上記癌が
潜在性であり得る方法を提供する。
【００１８】別の局面において、本発明は、上記モノク
ローナル抗体が、ＩｇＧおよびＩｇＭでなる群から選択
され得るモノクローナル抗体を提供する。
【００１９】本発明は、尿中腫瘍関連抗原と反応する抗
体と反応する試薬を含む。
【００２０】１つの局面において、本発明は、抗イデオ
タイプの抗体であり得る試薬を提供する。
【００２１】本発明は、さらに、上記抗イデオタイプの
抗体の治療上の量を被験者に注射することを包含する、
免疫治療の方法を提供する。
【００２２】本発明は、悪性腫瘍をモニターする方法を
提供し、この方法は、上記モノクローナル抗体を、病気
の被験者の体液由来の尿中腫瘍関連抗原と接触させるこ
と、所定の量の体液に対する尿中腫瘍関連抗原の量を決
定すること、この量と、同等の試料のために予め決定さ
れた量とを比較することを包含し、ここで、尿中腫瘍関
連抗原の差異が該悪性腫瘍の状態の度合を示す。
【００２３】本発明は、バイオプシーの腫瘍細胞上の尿
中腫瘍関連抗原を検出する方法を提供し、この方法は、
上記モノクローナル抗体を腫瘍細胞と接触させること、
およびこの結合した抗体の存在を検出することを包含す
る。
【００２４】本発明は、腫瘍細胞に対して向けられる、
抗体または細胞が媒介する免疫を誘導するための、ある
いは増強するためのワクチンを提供し、このワクチン
は、細胞表面に尿中腫瘍関連抗原を有する不活性化され
た腫瘍細胞、およびＧＭ−２、ＧＤ−２、胎児の抗原、
またはメラノーマ腫瘍関連抗原でなる群から選択され
る、少なくとも１種の腫瘍関連抗原、および薬学上受容
し得る担体を含有する。
【００２５】本発明は、上記腫瘍細胞が、ＵＣＬＡ−Ｓ
Ｏ−Ｍ１０、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４およびＵＣＬＡ−
ＳＯ−Ｍ１０１でなる群から選択されるメラノーマ細胞
であり得る、上記のワクチンを提供する。
【００２６】１つの局面において、本発明は、上記細胞
が、さらに該細胞表面に被験者と同様のタイプのＨＬＡ
を有するワクチンであり得る。
【００２７】本発明は、被験者において約９０から１０
０ｋＤの分子量を有する尿中腫瘍関連抗原のポリペプチ
ドサブユニットと反応する抗体の産生を誘導するため
の、あるいは増強するための方法を提供し、この分子量
が、βメルカプトエタノールによる還元およびＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離の後に測
定され、上記ワクチンの有効量をこの被験者に投与する
ことを包含する。
【００２８】１つの局面において、本発明は、上記被験
者がヒトであり得る方法を提供する。
【００２９】１つの局面において、本発明は、上記被験
者が癌を患っており、そして上記ワクチンの投与後に各
個体において産生された上記抗体が該癌を抑制し得る方
法を提供する。
【００３０】１つの局面において、本発明は、上記癌が
メラノーマ、サルコーマおよびカルシノーマでなる群か
ら選択され得る方法を提供する。
【００３１】本発明は、上記ポリペプチドおよび薬学上
受容し得る担体を含有するワクチンを提供する。
【００３２】本発明はまた、被験者において、この被験
者における腫瘍細胞と反応する抗体の産生を誘導するた
めの、あるいは増強するための方法を提供し、上記ワク
チンを投与することを包含し得る。
【００３３】本発明は、被験者において、胸部または肺
のカルシノーマを検出する方法を提供し、この被験者の
試料由来の尿中腫瘍関連抗原の存在を検出することを包
含し得る。
【００３４】１つの局面において、本発明は、上記検出
が、尿中腫瘍関連抗原を抗体と結合させること、および
該抗体の存在を検出することを包含し得る方法を提供す
る。
【００３５】本発明は、被験者において腫瘍をインビボ
で検出する方法を提供し、この腫瘍細胞表面上の尿中腫
瘍関連抗原と反応する試薬をこの被験者に注射するこ
と、この尿中腫瘍関連抗原と反応するこの試薬の存在を
検出すること、およびそれによってこの腫瘍を検出する
ことを包含する。
【００３６】１つの局面において、本発明は、上記腫瘍
が、メラノーマ、サルコーマ、またはカルシノーマでな
る群から選択され得る方法を提供する。
【００３７】別の局面において、本発明は、上記試薬が
抗体である方法を提供する。
【００３８】なお別の局面において、本発明は、上記抗
体がモノクローナルである方法を提供する。
【００３９】本発明は、被験者中の腫瘍細胞表面に尿中
腫瘍関連抗原を発現する腫瘍を抑制する方法を提供し、
この方法は、この腫瘍細胞表面の尿中腫瘍関連抗原と反
応する、腫瘍を抑制する試薬をこの被験者に注射するこ
とを包含する。
【００４０】１つの局面において、本発明は、上記試薬
が抗体である方法を提供する。
【００４１】別の局面において、本発明は、上記抗体が
細胞毒性または細胞増殖抑制性の薬剤に結合してい得る
方法を提供する。
【００４２】なお別の局面において、本発明は、上記細
胞毒性または細胞増殖抑制性の薬剤が、毒素、放射線標
識された成分、および化学療法薬でなる群から選択され
得る方法を提供する。
【００４３】本発明はまた、上記のポリペプチドをコー
ドする核酸を含む。
【００４４】本発明はさらに、上記の核酸と選択的にハ
イブリダイズし得る核酸プローブを含む。
【００４５】本発明は、上記のポリペプチドの抗原性部
分をコードする核酸をさらに含む。
【００４６】１つの局面において、本発明は、上記核酸
が、抗イデオタイプの抗体における抗原性の部分の配列
に対応し得る核酸を提供する。
【００４７】本発明は、上記核酸と選択的にハイブリダ
イズし得る核酸のプローブを提供する。
【００４８】本発明はまた、低レベルの尿中腫瘍関連抗
原を検出する方法を提供し、この方法は、γ−インター
フェロンで癌細胞における尿中腫瘍関連抗原の発現を増
強すること、該尿中腫瘍関連抗原を試薬と接触させるこ
と、および該試薬の存在を検出することを包含する。
【００４９】本発明は、被験者において癌を診断する方
法を提供し、この方法は、被験者の体液において上記ポ
リペプチドを検出することを包含する。
【００５０】本発明は、上記検出することが、上記ポリ
ペプチドと試薬とを接触させること、および該ポリペプ
チドと反応する該試薬の存在を検出することを包含し得
る方法を提供する。
【００５１】本発明は、以下の（１）、（２）および
（３）を包含する、癌から得られる尿中抗原性複合体
（ｕｒｉｎａｒｙａｎｔｉｇｅｎｉｃｃｏｍｐｌｅｘ）
を有する被験者において癌を検出またはモニターする方
法を提供する：（１）この被験者から試料を除去するこ
と；（２）尿中腫瘍関連抗原に結合する試薬と結合する
ことを妨げるために、この試料中のこの尿中抗原性複合
体の炭水化物部分を改変すること；および（３）この改
変された尿中抗原性複合体の少なくとも一部を検出する
こと、およびそれによってこの癌を検出すること。
【００５２】本発明は、４５ｋＤのポリペプチドサブユ
ニットに位置した尿中腫瘍関連抗原のエピトープを提供
し、ここで、このポリペプチドサブユニットの分子量
が、β−メルカプトエタノールによる還元およびＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離の後に
測定され、そしてこのエピトープは、自己ヒト血清また
はヒヒのポリクローナル抗体と反応し得る。
【００５３】本発明はまた、１２０ｋＤのポリペプチド
サブユニットに位置した尿中腫瘍関連抗原のエピトープ
を提供し、ここで、このポリペプチドサブユニットの分
子量がβ−メルカプトエタノールによる還元およびＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離の後
に測定され、そしてこのエピトープは、ヒヒのポリクロ
ーナル抗体と反応し得る。
【００５４】本発明は、さらに、以下の（１）、
（２）、（３）および（４）を包含する、試料における
尿中腫瘍関連抗原を検出する方法を提供する：（１）こ
の尿中腫瘍関連抗原と、尿中腫瘍関連抗原上のエピトー
プと結合する第一の試薬とを接触させること；（２）こ
の尿中腫瘍関連抗原と、尿中腫瘍関連抗原上の第二のエ
ピトープと結合する第二の試薬とを接触させること；
（３）この試薬の１種を固体の支持体に結合させるこ
と；および（４）結合した試薬の存在を検出すること、
およびそれによって尿中腫瘍関連抗原の存在を検出する
こと、ここで、該試薬の１種は非ヒトポリクローナル抗
体であり得る。
【００５５】１つの局面において、本発明は、上記試薬
が両者とも抗体であり得る方法を提供する。
【００５６】別の局面において、本発明は、上記ポリク
ローナル抗体がヒヒから単離され得る方法を提供する。
【００５７】なお別の局面において、本発明は、上記試
薬が、尿中腫瘍関連抗原上のエピトープと結合する前
に、前記固体の支持体と結合し得る方法を提供する。
【００５８】本発明は、以下の（１）、（２）、（３）
および（４）を包含する、試料において尿中腫瘍関連抗
原を検出する方法を提供する：（１）β−メルカプトエ
タノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による分離の後に確認される、４５、６
５、９０−１００および１２０ｋＤのサブユニット上の
エピトープでなる群から選択される、この尿中腫瘍関連
抗原上のエピトープと結合する第一の試薬を、尿中腫瘍
関連抗原と接触させること；（２）β−メルカプトエタ
ノールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による分離の後に確認される、４５、９０
−１００および１２０ｋＤのサブユニット上のエピトー
プでなる群から選択される、この尿中腫瘍関連抗原上の
エピトープと結合する第二の試薬を尿中腫瘍関連抗原と
接触させること；（３）この試薬の１種と固体の支持体
とを結合させること；および（４）結合していない試薬
の存在を検出すること、およびそれによって尿中腫瘍関
連抗原の存在を検出すること。
【００５９】本発明はまた、β−メルカプトエタノール
による還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法による分離の後に測定された場合、６５ｋＤのポ
リペプチドサブユニットに位置する尿中腫瘍関連抗原の
エピトープを提供し、ここで、このエピトープは、自己
ヒト血清またはヒヒのポリクローナル抗体と反応し得
る。
【００６０】
【発明の実施の形態】本明細書中で用いる「尿中瘍関連
抗原（Ｕ−ＴＡＡ）」とは、メラノーマ患者の尿中に最
初に検出されたが、その後さらに他の体液中にも見いだ
された高分子量の糖タンパク質を意味する。
【００６１】本発明では、この抗原Ｕ−ＴＡＡは、ＤＥ
ＡＥセファセル陰イオン交換クロマトグラフィーによっ
て大部分の正常な血清タンバク質から分離された。ヒト
ではＵ−ＴＡＡは免疫原性を有するにもかかわらず、抗
原の大部分はカラムの第二ピークにおいて抗体を含まず
に溶出した。これらの研究において用いられた血清はネ
ズミのモノクローナル抗体との高い反応性を基準にして
選択されたので、この観察結果は不思議ではなかった。
従って、このような高レベルの循環Ｕ−ＴＡＡを有する
患者は相対的に抗原が過剰にあると見込まれ、免疫グロ
ブリンを含まない抗原を単離することが予期される。主
要なＩｇＧピークおよびＩｇＭピークと会合した少量の
Ｕ−ＴＡＡがみられることから、若干の抗Ｕ−ＴＡＡ抗
体が免疫複合体の形で存在することが示唆された。同種
異系抗体を用いたときＵ−ＴＡＡについて陽性であった
メラノーマ患者からの尿サンプルはすべて、ネズミのモ
ノクローナル抗体とも反応した。同種異系抗体アッセイ
において陰性であった尿サンプルは、モノクローナル抗
体アッセイでも陰性であった。さらに、このモノクロー
ナルは、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ−１４培養メラノーマ細胞
の上清の濃縮されて部分的に精製されたフラクションと
反応した。このことは、メラノーマ患者の尿中に排出さ
れた抗原と免疫学的に類似する抗原が、培養メラノーマ
細胞によっても産生されることを示唆している。メラノ
ーマ患者の尿中のモノクローナル反応性分子は、同種異
系抗体反応性Ｕ−ＴＡＡと多くの特徴を共有している。
【００６２】混合グリコシダーゼ処理によって、同種異
系抗体アッセイによって測定された正常人からの尿サン
プルのＵ−ＴＡＡ活性が消失した。しかし、メラノーマ
患者からのサンプルを同様に処理すると、大多数の患者
において、Ｕ−ＴＡＡ活性が有意に増加した。この観察
結果は、同種異系抗体反応性エピトープが多様なグリコ
シル化部位を有する大きな分子上に存在するタンパク質
であるという見地と矛盾しない。この筋書によれば、グ
リコシダーゼ処理は分子から炭水化物を除去して、さら
なる免疫反応性エピトープを曝すことになる。
【００６３】この理論は、モノクローナル反応性エピト
ープの酵素消化によってさらに支持される。ヒアルロニ
ダーゼで処理してもエピトープの免疫反応性に対してほ
とんど影響が見られないが、プロテアーゼで処理すると
この反応性が破壊される。混合グリコシダーゼ処理はこ
の分子の免疫反応性をも増強する。
【００６４】メラノーマに対して特異的な非常に多くの
ネズミのモノクローナル抗体が、マウスをメラノーマ細
胞全体あるいは、細胞抽出物で免疫することによって産
生されてきた（例えば、Ｌｌｏｙｄ，Ｋ．Ｏ．，Ｂａｓ
ｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ編 Ｎｉｊｈ
ｏｆｆ，Ｔｈｅ Ｈａｇｕｅ，ＰＰ１５９−２１４（１
９８３））。同種異系免疫反応性タンパク質に対して特
異的なモノクローナル抗体は、比較的まれである（Ｈａ
ｄａｓ，Ｅ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：５２０
１−５２０５（１９８６））。
【００６５】メラノーマ患者の尿および正常人の尿から
なるサンプル群に対してハイブリドーマ上清をスクリー
ニングすることによって、腫瘍関連タンパク質に対して
特異性を有する１個のクローンを同定することが可能で
あった。得られた抗体は、正常患者よりもメラノーマ患
者の尿中および血清中に高頻度に出現するタンパク質エ
ピトープを認識した。従って、ネズミのモノクローナル
抗体はヒト腫瘍の免疫診断および免疫予後に対して重要
である。
【００６６】本発明は、β−メルカブトエタノールによ
る還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分離後、分子量が約９０−１００ｋＤである尿中
腫瘍関連抗原（Ｕ−ＴＡＡ）の、実質的に精製された抗
原性ポリペプチドサブユニットを提供する（血清からの
サブユニットは約９０ｋＤであり、尿中からのサブユニ
ットは約１００ｋＤであったが、ネズミのモノクローナ
ル抗体は各サブユニットを認識するので、同じサブユニ
ットに相当する）。尿中腫瘍関連抗原は、疾病を有する
メラノーマ患者の６４％の血清中に検出されたが、見か
け上正常な個人からの血清中ではまれにしか検出されな
かった。ＤＥＡＥセファセル陰イオン交換クロマトグラ
フィーによって精製されたこの抗原は、熱に対して安定
であり、非還元条件下での５９０−６２０ｋＤの範囲の
分子量、および６．１の等電点を有する。還元条件下の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、この高分子量の抗原はいく
つかの構成成分に解離する。
【００６７】ネズミのモノクローナル抗体ＡＤ１−４０
Ｆ４によって認識されたエピトープは、尿中腫瘍関連抗
原の９０−１００ｋＤサブユニット上にのみ存在する。
しかし、このサブユニットはさらに、ひひ、およびヒト
ポリクローナル抗血清によって認識されるエピトープを
含有している。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロット
法によって決定された。ネズミのモノクローナル抗体に
よって認識されるエピトープは、ヒトポリクローナル抗
体によって認識されるエピトープとは異なる。
【００６８】疾病患者の体液からのＵ−ＴＡＡをネズミ
のモノクローナル抗体に接触させることによって、一定
量の体液あたりのＵ−ＴＡＡの量を、同一人のサンプル
について以前に測定した量と比較し得る；Ｕ−ＴＡＡの
変化は悪性状態の変化を示す。従って、悪性度をモニタ
ーすることは、疾病患者の体液を繰り返しアッセイし
て、体液中に存在するＵ−ＴＡＡあるいは９０−１００
ｋＤサブユニットの量を測定する工程をさしている。ア
ッセイは、患者の治療の初期、治療中、および治療後に
おいて行われ得る。最初は、Ｕ−ＴＡＡレベルは非常に
高く、この抗原の高いターンオーバーあるいは放出を示
し得る。しかし、治療後および例えばワクチン投与によ
る腫瘍細胞の増殖阻害後、患者の体液中のＵ−ＴＡＡレ
ベルは減少し得る。
【００６９】本発明は、β−メルカプトエタノールによ
る還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分離後、患者の体液中のＵ−ＴＡＡからの４５、
６５、９０−１００、あるいは１２０ｋＤのポリペプチ
ド上に位置するエピトープを検出する工程を包含する方
法によって、患者の腫瘍の診断を可能にする。ポリペプ
チドをある試薬と接触させて、ポリペプチドと反応する
試薬の存在を検出することによって、検出が行われ得
る。
【００７０】本発明は、患者の胸部あるいは肺のカルシ
ノーマを検出する方法であって、該患者のサンプルから
のＵ−ＴＡＡの存在を検出する工程を包含する方法を記
載する。検出方法は、Ｕ−ＴＡＡをある試薬と結合さ
せ、該試薬を検出する工程を包含する。検出の一つの例
として、第二の試薬によるＵ−ＴＡＡへの間接的な、あ
るいは直接的な結合がある。試薬は好ましくは抗体であ
るが、任意の適切な試薬であり得る。
【００７１】本発明は、細胞表面上にＵ−ＴＡＡ、およ
びＧＭ−２、ＧＤ−２、胎児抗原、あるいはメラノーマ
腫瘍関連抗原から構成される群から選択される少なくと
も１個の腫瘍関連抗原を有する腫瘍細胞、ならびに薬理
学的に許容されるキャリヤー、を包含する９０−１００
ｋＤのポリペプチドに対して、抗体あるいは細胞性免疫
を誘導あるいは増強するワクチンを提供する。該腫瘍細
胞が細胞表面上に患者と同じ型のＨＬＡを有するなら
ば、結果は改善され得る。該ワクチンは、癌患者におい
て、分子量が約９０−１００ｋＤであるＵ−ＴＡＡのポ
リペプチドサブユニットに反応性を示す抗体の産生を誘
導あるいは増強する方法を提供し、該方法は患者に効果
的な投与量のワクチンを投与する工程を包含する。本発
明はヒトを被検者とするが、しかし、任意の動物に用い
得る。ワクチン投与後各個体内に産生された抗体は、
癌、例えばメラノーマを阻害し、あるいは治療する。癌
を阻害することは、細胞の増殖を妨げ得る試薬に腫瘍細
胞を接触させ、その結果、細胞を殺して、腫瘍の大きさ
を減少させる能力をさしている。あるいは、阻害するこ
とは腫瘍細胞に対する直接的な細胞毒性効果を包含し得
る。
【００７２】また、本発明は、尿中腫瘍関連抗原に反応
する抗体に反応する試薬の開発を可能とする。これらの
試薬は抗イディオタイプ抗体であり得、抗イディオタイ
プ抗体とは、問題の抗原の内部イメージを有する免疫グ
ロブリンを指す。イディオタイプは抗体結合部位の抗原
性決定因子であり、そのため、抗イディオタイプ抗体
は、抗原の抗原性エピトープを模倣する。本発明は、治
療上必要な量の抗イディオタイプ抗体を被検者に注射す
ることを包含する免疫療法を提供する。治療上必要な量
とは、腫瘍細胞に細胞増殖抑制または細胞毒性の効果を
効果的にもたらす量であり、これらの効果は当業者によ
って容易に測定し得る。
【００７３】Ｕ−ＴＡＡが腫瘍細胞の表面に見られると
いう発見によって、腫瘍細胞表面のＵ−ＴＡＡに反応す
る腫瘍抑制試薬を被検者に注射することを包含する、被
検者の腫瘍細胞表面にＵ−ＴＡＡを発現させる腫瘍の治
療方法が可能になる。該試薬は抗体であり得、該抗体は
細胞毒性または細胞増殖抑制剤に付加され得る。該細胞
毒性または細胞増殖抑制剤は、たとえば、トキシン、放
射性同位元素で標識された成分および化学療法剤からな
る群から選択し得る。
【００７４】本発明は、また、腫瘍細胞をマウスのモノ
クローナル抗体に接触させ、結合抗体を検出することを
包含する、バイオプシーから腫瘍細胞上のＵ−ＴＡＡを
検出する方法を提供する。核酸または抗原の存在を検出
する本発明の方法は、細胞の核酸と核酸プローブとのハ
イブリダイゼーション、およびポリクローナルもしくは
モノクローナル抗体を用いる細胞染色を包含する。この
ような技術は当業者に公知の方法によって達成される。
【００７５】本発明は、本発明のポリペプチドをコード
する核酸、および該核酸との選択的なハイブリダイゼー
ションが可能な核酸プローブも提供する。該核酸は、本
発明により提供される抗原性サブユニットによって決定
される、Ｕ−ＴＡＡ上のエピトープの抗原性部位をコー
ドし得る。さらに、該核酸は、抗イディオタイプ抗体上
の抗原性の配列、および該抗イディオタイプに対応する
核酸との選択的なハイブリダイゼーションが可能な核酸
プローブに対応し得る。
【００７６】本発明は、被検者の腫瘍をインビボ内で検
出する方法を提供するが、この方法は、腫瘍細胞表面上
のＵ−ＴＡＡに反応する試薬、たとえば抗体を被検者に
注射し、Ｕ−ＴＡＡに反応する試薬の存在を検出し、そ
れによって腫瘍を検出することを包含する。該腫瘍は、
たとえば、メラノーマ、サルコーマまたはカルシノーマ
であり得る。
【００７７】本発明は、さらに、低いレベルのＵ−ＴＡ
Ａの検出方法を提供するが、この方法は、アルファおよ
びガンマインターフェロン、またはレテノイン酸などの
他の生体応答調節物質を用いて癌細胞中のＵ−ＴＡＡの
発現を促進し、このＵ−ＴＡＡを試薬に接触させ、試薬
の存在を検出することを包含する。抗癌剤としてインタ
ーフェロンを用いることは、現在集中的に研究されてい
る。免疫またはガンマインターフェロンは、感作したリ
ンパ球が特定の抗原によって刺激を受けた際に産生され
る。インターフェロンは被検者に注射でも投与し得る。
ガンマインターフェロンは、いくつかの遺伝子の発現を
誘導、促進または抑制することを示されている。誘導さ
れるものの中には、Ａ、Ｂ、Ｃを含むＨＬＡ遺伝子があ
る。ＨＬＡ遺伝子の発現によって、ある種の細胞はより
容易に認識され免疫系によって浄化される。驚くべきこ
とに、ガンマインターフェロンは、いくつかの細胞株中
でＵ−ＴＡＡの発現をも促進することがわかっている。
【００７８】メラノーマ腫瘍細胞ワクチン（ＭＣＶ）
は、４つのよく特徴付けられた腫瘍関連抗原を発現する
同種異系のメラノーマ細胞株を用いるが、これらはすべ
て人体において広く免疫原性を示す。Ｕ−ＴＡＡを発現
する、照射されたメラノーマの全細胞を投与すると、Ｉ
ｇＧおよびＩｇＭアイソタイプの双方の抗Ｕ−ＴＡＡ抗
体が誘導される。抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価の２〜５倍
の増加が１５人の患者のうち１１人に検出された一方、
ＩｇＧ反応は１５人の患者のうちたった６人に見られた
だけであったことには注目すべきである。ＩｇＭ反応が
必ずしもＩｇＧ反応に翻訳されない理由は、容易に明か
にはならない。しかし、おそらく、この糖タンパク質の
高分子の多糖成分が、Ｔ細胞に依存しない機構によって
ＩｇＭ抗体を誘導したのであろう。この結果、観察され
たように、後でＩｇＧへと切り替わることのない親和力
の低いＩｇＭが少量生成された。
【００７９】ＭＣＶに反応して誘導された抗体の特異性
に関しては、このワクチンは、ワクチンおよびアジュバ
ントを含めてメラノーマ細胞に関連した抗原群に対する
抗体を誘導するはずである。メラノーマ患者の尿から精
製され、そしてＥＬＩＳＡにおける標的抗原としてメラ
ノーマ細胞の表面に発現されるＵ−ＴＡＡを用いた。従
って、この研究で観察される、抗体活性およびＭＣＶへ
の反応によるその上昇はＵ−ＴＡＡに特異的なもののは
ずである。しかし、この研究で検出される抗体の非特異
的反応の可能性をなくすために、メラノーマ患者からの
血清サンプルを、標的抗原としてのＫＬＨに反応させ
た。これらの患者における抗ＫＬＨ抗体レベルは、免疫
療法の間に変動したが、抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の上昇とは一
致しなかった。さらに、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を希釈緩衝液に加えると、Ｕ−ＴＡＡが標的抗原として
用いられた時の抗体レベルに影響を及ぼす。このよう
に、血清サンプルのポリクローナルな性質にもかかわら
ず、この研究で観察された抗体レベルの上昇はＵ−ＴＡ
Ａに特異的なものであった。
【００８０】ＭＣＶに関して一般に見られる一過性の抗
体反応に対する通常の説明は、Ｔ−ヘルパーおよびＢ−
細胞活性化に伴うＴ−サプレッサー細胞の誘導である。
この特異なサプレッサー効果を回避するために、様々な
免疫学的操作が過去に試みられ、時には成功してきた。
この点において、シクロホスファミドが多く用いられて
きており、Ｔ−サプレッサー活性化を抑制することが知
られている。例えば、Ｂｅｒｄ，Ｄ．ら，Ｃａｎｃ．Ｒ
ｅｓ．４６：２５７２（１９８６）を参照のこと。この
試みの中で、まさにこの問題に取り組む努力において、
１つの治療手段はシクロホスファミドを包含していた。
シクロホスファミドが抗Ｕ−ＴＡＡ抗体反応の発生率ま
たは強度に影響を及ぼすという兆候はなかった。しか
し、この薬剤を受けている患者においては、抗Ｕ−ＴＡ
Ａ免疫が持続していたこともあり得る。
【００８１】正常な尿の抗原活性は、混合グリコシダー
ゼを用いた処理によって完全に消失し、プロテアーゼを
用いると実質的には全く消失しなかった。反対に、メラ
ノーマの尿における抗原活性は、混合グリコシダーゼに
はほとんど影響されず、プロテアーゼおよびカルポキシ
ペプチダーゼには非常によく影響された。これらの結果
から、正常な尿の抗原交差反応性は、癌患者の尿中腫瘍
関連抗原複合体の炭水化物部分によるものだということ
がわかった。これらの炭水化物部分は、正常な尿中の分
子上、および癌患者の尿中の尿ＴＡＡ複合体上に存在す
る。従って、本発明は、癌に由来する尿中抗原複合体を
持つ被検者において癌を検出し、モニターする方法を提
供する。この方法は、被検者からサンプルを取り出し、
サンプル内の尿中抗原複合体の炭水化物部分を、尿中腫
瘍関連抗原に結合する試薬との結合を防止するように変
化させ、変化した尿中抗原複合体の少なくとも一部を検
出し、それによって癌を検出することを包含する。変化
させるということは、尿中抗原複合体の炭水化物部分と
の試薬の結合に由来する偽陽性の数を防止する、または
減少させる、あらゆる変化を意味する。このような変化
は、たとえば炭水化物部分を還元することによって達成
し得る。
【００８２】また、本発明は、β−メルカプトエタノー
ルによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分離の後に４５ｋＤおよび６５ｋＤのポリ
ペプチドサブユニット上に位置し、そしてヒト血清との
反応性を有する、尿中腫瘍関連抗原の２つのエピトープ
を提供する。さらに、本発明は、β−メルカプトエタノ
ールによる還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分離の後に、１２０ｋＤのポリペプチド
サブユニット上に位置し、そしてヒヒポリクローナル抗
体との反応性を有する、尿中腫瘍関連抗原のエピトープ
を提供する。また、本発明は、同様の還元の後に９０−
１００ｋＤのポリペプチドサブユニット上に位置し、そ
して本発明において提供されるマウスモノクローナル抗
体との反応性を有する尿中腫瘍関連抗原のエピトープを
も提供する。４つの異なったエピトープの証明は、本明
細書に教示されるように、異なった型の抗体の間に交差
反応性がないことによって証明される。
【００８３】抗原性の明瞭なエピトープの存在によっ
て、サンプル中の尿中腫瘍関連抗原を検出する方法が可
能になる。この方法は、尿中腫瘍関連抗原上のあるエピ
トープと結合する第一の試薬に尿中腫瘍関連抗原を接触
させ、尿中腫瘍関連抗原上の第二のエピトープと結合す
る第二の試薬に尿中腫瘍関連抗原を接触させ、試薬のう
ちの１つを固体の担体に結合させ、結合していない試薬
の存在を検出し、それによって尿中腫瘍関連抗原の存在
を検出することを包含している。試薬は抗体であり得、
第一の抗体はモノクローナルであり得、第二の抗体はポ
リクローナルであり得る。さらに、試薬は、尿中腫瘍関
連抗原上のエピトープと結合する前に、固体の担体に結
合され得る。
【００８４】以下の実施例は本発明を説明するものであ
って、限定するものではない。
【００８５】
【実施例】（実施例Ｉ：尿からのＵ−ＴＡＡの精製）肝
臓および脾臓に転移の見られるメラノーマ患者の尿から
Ｕ−ＴＡＡを調製した。尿は２４時間にわたって０．１
Ｍトリス（ｐＨ８．３）および防腐剤としての０．０２
％のアジ化ナトリウム中に集められた。２リットルの尿
を排除限界１０，０００ダルトンのホローファイバー濃
縮器（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，Ｍ
Ａ）を用いて２０ｍｌに濃縮した。濃縮物７ｍｌを、１
００×２ｃｍのセファクリルＳ−２００カラムに載せ
た。ＰＢＳを溶出剤として用い、流速１４．５ｍｌ／ｈ
ｒ．で、３．５ｍｌずつの画分を集めた。溶出プロフィ
ールは２８０ｎｍでモニターした。画分のＵ−ＴＡＡ活
性を同種異系抗体を用いて二重決定因子ＥＩＡにおいて
アッセイした。最も大きいＵ−ＴＡＡ活性を示した画分
をプールし、限外濾過（ＰＭ−２０膜、Ａｍｉｃｏｎ
Ｃｏｒｐ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）によって７ｍ
ｌに濃縮した。濃縮物をさらに２０％（ｖ／ｖ）ウサギ
抗ヒト免疫グロブリン免疫ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）と
共に３７℃で１時間インキュベーションして精製した。
この精製した抗原のタンパク質含量をローリー法（Ｌｏ
ｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９
３：２６５−２７５（１９５１）参考までに援用）によ
って算定した。このようにして調製した抗原を、免疫ア
ッセイにおける標準または標的として、ならびに異種抗
体およびネズミモノクローナル抗体の生成のための免疫
原として用いた。
【００８６】得られた画分のＵ−ＴＡＡ活性を同種異系
二重決定因子ＥＩＡによって測定した。このアッセイに
おいて、抗原を捕獲するために抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ
を、検出抗体として同種異系抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧを用
いた。全タンパク質のわずか０．６％を含有しているだ
けにもかかわらず、セファクリルＳ−２００カラムのボ
イド容積は、この尿中で検出可能なＵ−ＴＡＡ活性全体
の６３％を含有していた。これは、Ｕ−ＴＡＡの１０５
倍の濃縮を示している（図１）。Ｕ−ＴＡＡの１８％を
クロマトグラムの第二のピークで検出したが、この研究
では第一ピークのみを標的抗原または免疫原として用い
た。この患者から２４時間にわたって集めた尿から、典
型的にはＵ−ＴＡＡが０．７ｍｇ得られた。
【００８７】（実施例ＩＩ：ヒト同種異系抗Ｕ−ＴＡＡ
ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体の精製）まず、高い抗Ｕ−Ｔ
ＡＡ抗体レベルを示すメラノーマ患者の血清からＩｇＧ
およびＩｇＭを単離し、Ｕ−ＴＡＡ検出のための二重決
定因子ＥＩＡにおいて用いた。ＩｇＧはＤＥＡＥアフィ
ゲルブルークロマトグラフィー（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によっ
て単離した。１０ｍｌの血清を緩衝液を４回交換しなが
ら０．０２Ｍの燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２リ
ットルで４８時間透析した。透析に続いて、血清を８０
０×ｇで１５分間遠心機にかけ、上清をＤＥＡＥアフィ
ゲルブルーの体積３５ｍｌのベッドに通し、燐酸カリウ
ム緩衝液で溶出した。この溶出物を１０ｍｌずつの画分
で集めた。２８０ｎｍにおいて０．０５より大きい吸光
度を示した画分をプールし、１ｍｌに濃縮した。濃縮物
の同種異系抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧレベルを酵素結合免疫
吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。調製し
たＩｇＧは２．２３ｍｇタンパク質／ｍｌを含有し、
１：２５６０の抗Ｕ−ＴＡＡ力価を有していた。
【００８８】ＤＥＡＥアフィゲルブルーに結合したまま
のタンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）を
補充した０．０２Ｍの燐酸緩衝液で溶出し、１０ｍｌに
濃縮した。抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ抗体をより濃縮するた
めに、濃縮物をセファクリルＳ−３００（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）ゲル濾過クロ
マトグラフィーにかけた。ＥＬＩＳＡにより抗Ｕ−ＴＡ
Ａ ＩｇＭ抗体活性を含有する画分をプールし、濃縮し
た。調製したＩｇＭは０．８９ｍｇタンパク質／ｍｌを
含有し、１：１５０の抗Ｕ−ＴＡＡ力価を有していた。
これらの抗体はＵ−ＴＡＡの捕獲アッセイにうまく用い
られてきた（Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．ら，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ
Ｊｏｕｒｎａ１ ２（６）：Ａ１８３６（１９８
８））。単離した抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭおよびＩｇＧ抗
体はＵ−ＴＡＡに強く反応したが、正常の尿成分にはほ
とんど、またはまったく反応性を示さなかった。
【００８９】（実施例ＩＩＩ：異種抗Ｕ−ＴＡＡ血清の
産生）抗Ｕ−ＴＡＡ異種抗血清をヒヒにおいて調製し、
Ｕ−ＴＡＡ検出のためのＥＬＩＳＡおよび免疫ブロット
法において使用した。体重２８ｋｇの１２才の雄のヒヒ
に、所定の（１〜４週間）間隔で、同体積のＭｙｌａｎ
ｔａ（ＳｔｕａｒｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，
Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）と混合した１００μｇの
Ｕ−ＴＡＡを筋肉内注射した。このヒヒから定期的に血
液採取し、血清の抗Ｕ−ＴＡＡレベルをＥＬＩＳＡで測
定した。
【００９０】６週間にわたってＵ−ＴＡＡを４回注射し
た後、ヒヒの抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧレベルは検出できる
ほどになった。抗体力価は４０週目に最高になった。こ
の時のＥＬＩＳＡによる抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力価は１：２
００，０００であった。
【００９１】ヒヒの血清からのＩｇＧおよびＩｇＭ抗体
を、上記実施例ＩＩ（図２）で説明した、ＤＥＡＥアフ
ィゲルブルークロマトグラフィーによって精製した。Ｉ
ｇＧ抗体は、二重決定因子ＥＩＡにおいて用いられ、Ｉ
ｇＭは細胞毒性試験のために用いられた。
【００９２】（実施例ＩＶ：ヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の細
胞毒性効果）ヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体のＩｇＧおよびＩｇ
Ｍの双方の細胞毒性効果を、標的としてＵＣＬＡ−ＳＯ
−Ｍ１４を用いる補体依存細胞溶解（ＣＤＣ）アッセイ
においてテストした。ヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ抗体は
以下に述べる実験条件のもとでは細胞毒性を示さなかっ
たが、ＩｇＭ抗体は細胞毒性を示した。
【００９３】標的細胞（腫瘍および対照）を対数増殖期
の中間において収穫し、ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳで２回
洗浄し、５１Ｃｒ．で標識した。標識された細胞を、体
積５０μｌ、濃度１．０×１０4細胞／ウェルで、細胞
毒性アッセイプレートに接種した。細胞をその後５０μ
ｌのヒヒＩｇＭ抗体（３０μｇタンパク質／ｍｌ）と混
合し、４℃で１．０時間インキュベーションし、続いて
１：１０の希釈度の幼生ウサギの補体１００μｌを加え
た。アッセイプレートをさらに３７℃で２時間インキュ
ベーションした。プレートを遠心分離（５００×ｇで５
分間）した後、各ウェルからとった上清１００μｌを吸
引し、ガンマ計数によって放射能放出を計測した。溶解
の最大限度（各ウェルに加えられた放射能の合計）を、
ＰＢＳ中０．０５％のＮｏｎａｄｅｔＰ−４０（ＮＰ−
４０）を１５０μｌ加えることによって計測した。アイ
ソトープの自然放出は、抗体を加えなかったウェルの上
清から計測した。細胞溶解の割合は、以下の式を用いて
三つのウェルの平均から計算した。 ＣＤＣにおける、希釈度１：１２０のヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ
ＩｇＭ抗体５０μｌ（１．５μｇタンパク質）による
ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１４細胞の細胞溶解は５０から６０
％であり、これに対して、自己リンパ芽球様、Ｌ１４
（正常対照）細胞では５％であった。Ｍ１４またはＬ１
４細胞の数を増加させながらこの抗体を吸収させること
によって、１×１０7のＬ−１４細胞はＭ１４細胞の細
胞溶解に影響を及ぼさないものの、Ｍ１４細胞での吸収
は細胞（Ｍ１４）数の増加とともに細胞溶解を減少させ
ることがわかった。細胞溶解は、１×１０7のＭ１４細
胞での吸収によって完全に消失した（図３）。
【００９４】細胞溶解の抑制が、Ｕ−ＴＡＡがＭ１４細
胞の表面に発現したことによるのかどうかを調べるため
に、この抗体を同量の精製Ｕ−ＴＡＡ（０．０６ｍｇ／
ｍｌ）と様々な希釈度で混合し、３７℃で１時間インキ
ュベーションし、ＣＤＣアッセイでテストした。図４
は、ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡの１：１２０希釈物におけ
るＭ１４細胞の細胞溶解が、３５％からＵ−ＴＡＡの存
在下で５％未満に減少したことを示している。明らか
に、精製Ｕ−ＴＡＡはメラノーマ（Ｍ１４）全細胞と同
じ効果を生じた。アッセイ培地に含有された、ウシの胎
児の血清（１０％）などの無関係なタンパク質は細胞溶
解に影響を及ぼさなかった。
【００９５】ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体のＭ１４以外
の細胞株に対する細胞毒性効果を測定するために、リン
パ芽球様細胞を含む様々なヒトの培養腫瘍細胞株を、補
体依存細胞毒性アッセイにおける標的として用いた。乳
癌および神経芽腫などの、メラノーマ以外の腫瘍細胞株
も、ヒヒＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体によって溶解した（表
１）。リンパ芽球様細胞株（Ｌ１５）の細胞溶解はバッ
クグラウンド（＞５％）以下であった。これらの結果か
ら、Ｕ−ＴＡＡは様々なメラノーマおよび非メラノーマ
瘍細胞の表面に発現し、その密度は細胞株によって変化
することがわかる。
【００９６】
【表１】 （実施例Ｖ：ネズミハイフリトーマ技術）生後８週間の
茶色雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ中のＵ−ＴＡＡ
（Ｎｅ８７０４）７５μｇを０日、１５日、および２８
日に腹腔内注射（ｉｐ）した。３７日に、１５０μｇの
Ｕ−ＴＡＡをｉｐで追加し、３日後に殺して、高度免疫
脾臓細胞を得た。これらの細胞を、Ｇａｌｆｒｅ（Ｇａ
ｌｆｒｅ，Ｇ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ２７７：１３１（１
９７９）参考までに援用）によって説明されているもの
に類似の方法で、８−アザグアニン耐性の非分泌性マウ
スＳｐ２／０ミエローマ細胞と融合させた。Ｃ５７ＢＬ
／６マウスの腹膜を５ｍｌの１１．６％スクロースで洗
浄し、そのマクロファージを１．４５×１０4細胞／ウ
ェルで培養して得られた、生後３日のマウスの腹腔マク
ロファージ培養を含有するプレート上に、ハイブリドー
マ細胞を接種した。
【００９７】健康なコロニーを含有するウェルからの上
清をＥＬＩＳＡによって抗Ｕ−ＴＡＡ抗体についてのス
クリーニングした。陽性のウェルを限界希釈法を用いて
クローン化した。モノクローナル抗体をマウスの腹水か
ら調製した（Ｈｏｏｇｅｎｒａａｄ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６１：３１７−３２０
（１９８３）参考までに援用）。抗体のアイソタイプを
二重免疫拡散法によって決定した（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）。
【００９８】（実施例ＶＩ：ハイブリドーマ上清スクリ
ーニングのための標的抗原）ハイブリドーマ上清を、様
々なＵ−ＴＡＡ調製物および正常な尿との反応性につい
てＥＬＩＳＡでテストした。３人の異なったメラノーマ
患者Ｎｅ８７０４、Ｗｏ７９０７およびＳｅ８７０３の
尿サンプルから、セファクリルＳ−２００ゲル濾過クロ
マトグラフィーによってＵ−ＴＡＡを精製した。１０の
正常な尿を、１００倍濃縮の後に標的抗原として用い
た。各標的は１．４μｇタンパク質／ｍｌで用いた。い
ずれの場合も抗原は０．０６Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．６）中で希釈し、３７℃で３時間のインキュ
ベーションによってマイクロタイタープレートに固定化
した。このインキュベーションおよびその後の各インキ
ュベーションの後には、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０
を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。ヤギ
抗マウスＩｇと接合したアルカリ性ホスファターゼ（Ｊ
ａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓ
ｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）が、非クロモーゲンである燐酸
Ｐ−ニトロフェニル（１０％ジエタノールアミン中に１
ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９．６）をクロモーゲンであるＰ−ニ
トロフェニルに変換するための触媒となった。各ウェル
の吸光度は、マルチスキャンＥＬＩＳＡプレートリーダ
ーを用いて４０５ｎｍで測定した。
【００９９】免疫化の過程で、マウス血清中の抗Ｕ−Ｔ
ＡＡ抗体活性は、ＥＬＩＳＡによると、検出できない程
度からＮｅ８７０４に対して１：８０００、Ｗｏ７９０
７に対して１：７７３０にまで増加した。免疫化したマ
ウスの脾臓細胞の融合産物を接種した９６のすべてのウ
ェルにおいて、健康なハイドリドーマが成長した。これ
らのハイブリッドのうち５１の上清はＮｅ８７０４に反
応する抗体を含有していたが、Ｎｅ８７０４およびＷｏ
７９０７の双方には、たった１３が陽性であった。これ
ら１３のウェルから取った細胞をクローン化した。得ら
れたクローンのうち、ＡＤ１−４０Ｆ４という１つだけ
が、Ｎｅ８７０４、Ｗｏ７９０４、およびＳｅ８７０３
の尿サンプルのＵ−ＴＡＡには反応するが２つの濃縮し
た正常尿には反応しない抗体を産生した。ＡＤ１−４０
Ｆ４は、二重免疫拡散法によってＩｇＭ分子であること
がわかった。このクローンの未処理のハイブリドーマ上
清は１：２００の抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価を有してい
た。マウスの腹水中で育てたＡＤ１−４０Ｆ４は１：２
０００〜１：５０００の抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価を有
しており、その後の実験では１：２００〜１：５００の
希釈度で用いた。
【０１００】（実施例ＶＩＩ：ＡＤ１−４０Ｆ４の特異
性の分析）Ｕ−ＴＡＡと正常な尿との区別が可能なネズ
ミモノクローナル抗体を、マウス腹水中で育て、様々な
固定化された標的（Ｅｕｈｕｓ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｌａｂ．Ａｎａ１．３：１８４（１９８９））に対
する活性をテストした。以下のアッセイすべてにおい
て、腹水は２μｇ／ｍｌで用いた。抗体が、いくつかの
一般的なヒトまたはウシ胎児の血清タンパク質を認識で
きるか否かを調べるために、ＥＬＩＳＡにおける標的と
して、以下の市販のタンパク質を１０μｇ／ｍｌで用い
た：フェリチン、プールしたヒトＩｇＧ、プールしたヒ
トＩｇＭ（ＣｏｏｐｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｅｓ
ｔｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）、Ｂ２−ミクログロブリン、
Ｂ２−糖タンパク質、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポ
タンパク質ＣＩＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（Ｃａ
ｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ヒト血
清アルブミン（Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）、および
１：１０に希釈したウシ胎児血清。さらに、２０の正常
な血清、ならびに５２のＩＩ期およびＩＩＩ期のメラノ
ーマの血清を１：１０に希釈し、ポリスチレンのプレー
トに固定化し、そして抗体と反応させた。モノクローナ
ル抗体の反応性がヒト同種異系抗体の反応性と相関して
いるかどうかを確認するために、Ｕ−ＴＡＡ陽性の５つ
のメラノーマの尿、同種異系二重決定因子ＥＬＩＳＡに
おいて陰性の５つのメラノーマの尿、および１０の濃縮
した正常な尿を、ＥＬＩＳＡにおける標的として用い
た。
【０１０１】ネズミモノクローナル抗体ＡＤ１−４０Ｆ
４は、フェリチン、プールしたヒトＩｇＧ、プールした
ヒトＩｇＭ、Ｂ２−ミクログロブリン、Ｂ２−糖タンパ
ク質、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質ＣＩ
Ｉ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、またはヒト血清アル
ブミンには反応性を示さなかった。さらに、ウシ胎児全
血清にも反応しなかった。
【０１０２】モノクローナル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４は、
血清採取の時に発病はしていたが存命中であったＩＩ期
およびＩＩＩ期の患者から、無作為に選択したメラノー
マ血清の６５％（３３／５２）に反応したが、正常な血
清にはたった５％（１／２０）しか反応しなかった。
【０１０３】ヒト同種異系二重決定因子ＥＬＩＳＡにお
いてＵ−ＴＡＡ陽性であった、メラノーマ患者からとっ
た５つの濃縮した尿もまた、ＡＤ１−４０Ｆ４に強い反
応性を示した。一方、Ｕ−ＴＡＡ陰性であるとわかって
いる５つの尿はＡＤ１−４０Ｆ４に反応しなかった。
【０１０４】ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１４は、合成培地中で
よく増殖する、培養メラノーマ細胞株である。セファロ
ース６Ｂカラムで画分された濃縮された使用済培地を、
ネズミモノクローナル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４の標的とし
てＥＬＩＳＡでテストした。カラムのボイド容積中の物
質は、１：２３，０００の希釈でＡＤ１−４０Ｆ４に反
応した。この希釈は１７７ｎｇ／ｍｌのタンパク質濃度
に対応した。
【０１０５】（実施例ＶＩＩＩ：ＥＬＩＳＡ）標的抗原
または捕獲抗体を０．０６Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ９．６）中で希釈し、１００μｌ／ウェルの部分
中、３７℃で２時間のインキュベーションによってポリ
スチレンマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ
Ｉ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．，Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ，ＶＡ）に結合させた。
その後プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充し
たＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。これ以後用い
る各試薬はＰＢＳ−Ｔで希釈し、ウェルごとに１００μ
ｌの部分として加えた。試薬を加えるごとに、その後３
７℃で４５分間インキュベーションし、ＰＢＳ−Ｔで３
回洗浄した。最後の工程として、１０％ジエタノールア
ミン中１ｍｇ／ｍｌの燐酸パラニトロフェニル（ｐＨ
９．８）２００μｌを酵素の基質として各ウェルに加え
た。プレートを２３℃でインキュベーションし、各ウェ
ルでの発色をマルチスキャンＥＩＡプレートリーダー
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍ
ｃＣｌｅａｎ，ＶＡ）を用いて４０５ｎｍでの吸光度と
して測定した。各アッセイは、陽性および陰性の対照、
ならびに固定化された抗原または抗体への非特異的なタ
ンパク質結合および複合体結合についての対照ととも
に、４つ１組で行われた。
【０１０６】（実施例ＩＸ：二重決定因子ＥＩＡ）ま
ず、分画したメラノーマ尿のＵ−ＴＡＡ含有量を二重決
定因子ＥＩＡを用いて測定したが、ここでは、メラノー
マ患者からとった同種異系の抗Ｕ−ＴＡＡＩｇＭおよび
ＩｇＧ抗体を利用した。その後の実験のほとんどにおい
ては、Ｕ−ＴＡＡ含有量を、ネズミモノクローナル抗体
ＡＤ１−４０Ｆ４およびヒヒポリクローナル抗Ｕ−ＴＡ
Ａ ＩｇＧを利用した、異種二重決定因子ＥＩＡで測定
した。
【０１０７】同種異系の抗体アッセイにおいては、マイ
クロタイタープレートを２０μｇ／ｍｌのＩｇＭ（同種
異系）で感作した。その後、連続的に希釈した標準、お
よびＰＢＳ−Ｔ中で１：１０に希釈した尿画分を用い
た。ＰＢＳ−Ｔ中２０μｇ／ｍｌの同種異系ＩｇＧ抗体
を第二抗体として加えた。ＰＢＳ−Ｔ中で１：１０００
に希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧに結合したアルカリ性フ
ォスファターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、酵素複合体として
用いた。４０５ｎｍにおける吸光度を、基質と共に２時
間インキュベーションした後に記録した。各サンプルの
Ｕ−ＴＡＡ濃度は、標準曲線に内挿することによって求
めた。アッセイは５７０ｎｇ／ｍｌの感度を有してい
る。
【０１０８】異種二重決定因子ＥＩＡにおいては、１７
６．０μｇ／ｍｌのネズミモノクローナル抗体ＡＤ１−
４０Ｆ４を抗原を捕獲するために用いた。一方、８．９
μｇ／ｍｌのヒヒＩｇＧを第二抗体として用いた。この
アッセイは５０ｎｇ／ｍｌの感度を有している。
【０１０９】（実施例Ｘ：Ｕ−ＴＡＡ活性のための血
清）病気が局所のリンパ節、途中のリンパ管、または離
れた内臓組織に転移したメラノーマ患者５２人から、静
脈穿刺によって血液を採集し、それを室温で２時間凝固
させた。１５分間、８００×ｇの遠心分離によって、凝
固した血液から血清を分離し、すぐに−３５℃で凍結し
た。見かけ上健康な対照２０人から血清を得、同様の方
法で処理した。アッセイの日、血清サンプルを解凍し、
０．０６Ｍの炭酸塩緩衝液で１：１０に希釈し、１００
μｌの部分をマイクロタイタープレートに載せ、３７℃
で２時間インキュベーションした。洗浄した後、ウェル
を１：５００に希釈したＡＤ１−４０Ｆ４ ＭｏＡｂ
１００μｌと反応させた。結合したＡＤ１−４０Ｆ４
を、１％のウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充し
たＰＢＳ−Ｔで１：５０００に希釈した、アルカリ性ホ
スファターゼに接合したヤギ抗マウス免疫グロブリン
（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗ
ｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で標識した。基質を１６時
間インキュベーションした後、各サンプルの４０５ｎｍ
での平均吸光度を計測し、バックグラウンド（ＡＤ１−
４０Ｆ４のプラスチックヘの結合、および酵素複合体の
標的血清への結合）について補正を行った。メラノーマ
患者の６３％（３３／５４）がＡＤ１−４０Ｆ４への活
性を示した。反対に、見かけ上健康な志願者からの血清
の５％（１／２０）のみが活性を示した。しかし、この
正常な血清の活性はごくわずかであった。
【０１１０】（実施例ＸＩ：血清からのＵ−ＴＡＡの単
離）陽性血清からＵ−ＴＡＡを単離し、特徴づけるため
に、様々なクロマトグラフィーおよびアフィニティー吸
収技術を採用した。ＡＤ１−４０Ｆ４が新規の高分子を
認識しているのであって抗体分子上のイディオタイプ決
定因子を認識しているのではないことを確認するため
に、調製した抗原からのＩｇＧの除去には特別な注意を
払った。
【０１１１】選択した血清サンプルをＤＥＡＥ−セファ
セルカラムに載せ、流速３０ｍｌ／時間で、０．０１５
Ｍ Ｋ2ＨＰＯ4（ｐＨ８．０）２００ｍｌを含有する槽
に０．３Ｍ ＫＨ2ＰＯ4（ｐＨ５．０）をゆっくりとサ
イフォンで移すことによって形成した、ｐＨ（８〜５）
および塩（０．０１５〜０．３Ｍ）の勾配を用いて溶出
した。２ミリリットルずつの画分を集め、２８０ｎｍで
の吸光度および各画分のｐＨを測定した。画分された血
清のＵ−ＴＡＡ活性を、上述の異種二重決定因子ＥＩＡ
を用いて測定した。Ｕ−ＴＡＡ活性を含有する画分をプ
ールし、限外濾過によって２ｍｌに濃縮した（図５）。
【０１１２】血清ＩｇＧの大半がカラムの最初のピーク
で溶出した。しかし、少量は第二のピークにも存在し
た。予想通り、ＩｇＭは最後のピークでだけ検出され
た。正常の血清の溶出プロフィールは、メラノーマ血清
のものと同様であったが、どの画分からもＵ−ＴＡＡは
検出されなかった。Ｕ−ＴＡＡ陽性メラノーマ血清にお
いて、抗原は、主として第二ピークと共に溶出したが、
少量はボイド容積においてＩｇＧと共に溶出し、ＩｇＭ
と共に痕跡が検出された。第二ピークにおけるＵ−ＴＡ
ＡはｐＨ７．２７で溶出したが、これは０．０２１モル
濃度のＫ2ＨＰＯ4に相当する。ＡＤ１−４０Ｆ４ネズミ
ＭｏＡｂに反応する正常血清の陰イオン交換溶出プロフ
ィールは、ＩｇＭと共に抗原が検出されなかったことを
除けば、メラノーマ患者からの血清のものと同一であっ
た。
【０１１３】陰イオン交換カラムの第二ピークを含有す
る画分をプールし、２ｍｌに濃縮した。この調製物のタ
ンパク質含有量は平均して３．７８ｍｇ／ｍｌであっ
た。この画分が少量のＩｇＧを含有していたため、これ
をウサギ抗ヒトＩｇＧ免疫ビーズで連続的に吸収し、混
入しているＩｇＧを除去した。１回の吸収がＩｇＧ力価
を９５％減少させ、４回の吸収でＩｇＧを９９．５％除
去した。Ｕ−ＴＡＡ力価は反対に殆ど影響されなかっ
た。
【０１１４】陰イオン交換クロマトグラフィーで単離さ
れ、抗ヒトＩｇＧ免疫ビーズに吸収されたＵ−ＴＡＡ
を、さらに、ゲル濾過クロマトグラフィーで精製した。
セファクリルＳ−３００クロマトグラムは、大きなタン
パク質ピークを１つといくつかの微少なピークからなっ
ていた。抗原陽性調製物のＵ−ＴＡＡ活性は、一貫し
て、大きなタンパク質ピークとは異なる、左右対称の高
分子量ピークだけに見られた（このピークはＵ−ＴＡＡ
陰性血清からの調製物には存在しなかった）。
【０１１５】（実施例ＸＩＩ：ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミトゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ））６４μｇ／ｍ
ｌの血清からとった５０μｌのＵ−ＴＡＡを、１２．５
％グリセロール、１．３％のドデシル硫酸ナトリウムお
よび１．３％の２−メルカプトエタノールを含有する２
５μｌの０．０６Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）の中
で１分間１００℃に加熱した。還元したサンプルを、５
％ポリアクリルアミドを含有するスタッキングゲルに載
置し、４時間５０ｍＡで９％ポリアクリルアミドゲル上
で分離した。泳動用緩衝液は、０．０５Ｍのトリス、
０．３８Ｍのグリシンおよび０．１％のドデシル硫酸ナ
トリウムから構成した（ｐＨ８．４）。すべてのゲルは
２つ１組で泳動した。１つのゲルは銀試薬（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，
ＣＡ）で染色し、他のゲルは免疫ブロット法で処理し
た。
【０１１６】（実施例ＸＩＩＩ：免疫ブロット法）２つ
の電気泳動されたポリアクリルアミドゲルのうち一方を
３０分間０．０２Ｍのトリス、０．１５Ｍのグリシンお
よび２０％エタノールで洗浄し、ニトロセルロース紙
（０．４５ｕｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）に５０ボルト１６時間（４℃）でエレクトロブ
ロットした。エレクトロブロットの後、ニトロセルロー
ス紙をブロット緩衝液（０．０５Ｍのトリス、０．０９
ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中で２時間２３℃で、５％
カゼインを用いて処理した。処理された紙を、５％カゼ
インを補充したブロット緩衝液中で、２３℃で６時間、
その後４℃で１６時間、ＡＤ１−４０Ｆ４（１：５０
０）ネズミＭｏＡｂまたはヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ
（１：５００）と反応させた。抗Ｕ−ＴＡＡ抗体とのイ
ンキュベーションの後、紙を２００ｍｌのブロット緩衝
液で４回洗浄した。結合した抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を検出す
るために、５％カゼインを補充したブロット緩衝液中
の、ヤギ抗マウスＩｇまたはヤギ抗ヒトＩｇＧに接合し
たアルカリ性ホスファターゼを用いた。２３℃で４５分
間の酵素複合体とのインキュベーションの後、ニトロセ
ルロース紙をブロット緩衝液で４回洗浄した。基質緩衝
液（１０ｍＭ トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌおよび０．
０５Ｍ ＭｇＣ１2、ｐＨ９．５）でもう一度１分間洗
浄した後、製造者の指示（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒ
ｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って、紙をニトロブルーテトラ
ゾリウムクロリド／５−ブロモー４−クロロー３インド
リルホスフェイトｐ−トルイジン（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ）
と反応させた。陽性バンドの分子量を、プレステインし
た分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）の相対的移動度を
もとに決定した。
【０１１７】（実施例ＸＩＶ：血清Ｕ−ＴＡＡのＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、
銀試薬で染色された血清からとったＵ−ＴＡＡは、１３
８、９０、５０、および２５ｋＤの領域で４つのバンド
を作った。ニトロセルロース紙に移して免疫染色したと
き、９０ｋＤのバンドが唯一、ネズミモノクローナル抗
体であるＡＤ１−４０Ｆ４とヒヒポリクローナル抗Ｕ−
ＴＡＡ ＩｇＧとの両方に反応した（図６）。唯一の交
差反応性正常血清からとったＵ−ＴＡＡは同一の免疫染
色のパターンを示した。しかし、Ｕ−ＴＡＡ陰性正常血
清からとった類似の調製物は、どちらの抗体にも活性を
示さなかった。
【０１１８】（実施例ＸＶ：腫瘍細胞上でのＵ−ＴＡＡ
サフユニットの存在）同種異系の抗体によって認識され
る９０ｋＤ成分の発現を確定するために、生合成的に標
識された（14Ｃ−Ｌ−ロイシン）メラノーマ（ＵＣＬＡ
−ＳＯ−Ｍ１４）細胞の無細胞ＮＰ−４０抽出液を、Ｕ
−ＴＡＡでブロックする前後に、同種異系の抗体との免
疫沈降処理をした。Ｕ−ＴＡＡ（ブロッカー）を、実施
例Ｉで説明したように、メラノーマ患者の尿から精製し
た。メラノーマ細胞のＮＰ−４０抽出液を実施例ＸＸＸ
ＩＩで説明するように調製した。免疫沈降物をＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド）で処理した。ブ
ロックした、およびブロックしなかった免疫沈降物の、
ゲルの列における放射能を、シンチレーション計数によ
って測定した。図７に示すように、１５０ｋＤ、９０ｋ
Ｄおよび４５ｋＤの３つのバンドが、部分的にまたは完
全にＵ−ＴＡＡによってブロックされた。これらの結果
から、同種異系の抗体はメラノーマ細胞の複数の抗原成
分に反応することがわかる。これらのうちの１つは、メ
ラノーマ患者の尿および血清にも存在し、ネズミモノク
ローナル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４によって認識される９０
ｋＤサブユニットであった。
【０１１９】（実施例ＸＶＩ：等電点電気泳動）血清Ｕ
−ＴＡＡの等電点電気泳動をＬＫＢ ２１１７ Ｍｕｌ
ｔｉｐｈｏｒｓｙｓｔｅｍ（ＬＫＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉ１１ｅ，ＭＤ）を用い
て５％ポリアクリルアミドゲル中で行った。濾紙片を２
５μｌのＵ−ＴＡＡに浸し、ｐＨ勾配３．５−９．５の
２．４％（ｗ／ｖ）両性電解溶液を含有するＰＡＧプレ
ート（ＬＫＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）上
の陽極端から１ｃｍのところに置いた。Ｈ3ＰＯ4（１
Ｍ）およびＮａＯＨ（１Ｍ）をそれぞれ陰極、陽極にお
いて用いた。１５００ボルト、５０ｍＡおよび３０ワッ
トの電流を印加して１０℃で１．５時間、プレートに等
電点電気泳動を行った。公知の等電点を有する、市販の
色素原性タンパク質（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を
各泳動に含有させた。ゲルの一部を切断し、クーマシー
ブルーで染色した。しかし、Ｕ−ＴＡＡ調製物のタンパ
ク質含量が非常に低かった（６４μｇ／ｍｌ）ため、ク
ーマシーブルーの染色ではＵ−ＴＡＡのバンドは発色し
なかった。この困難を克服するために、ゲルの残りはウ
ェスタンブロット法を用いて分析した。
【０１２０】集束したゲルをニトロセルロースの上にブ
ロットし、ヒヒ抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧに反応させた。こ
の方法では１つのバンドだけが観測され、血清から精製
されたＵ−ＴＡＡの等電点を６．１と帰属することがで
きた（図８）。
【０１２１】（実施例ＸＶＩＩ：熱安定性）免疫反応性
エピトープに熱安定性をアッセイするために、Ｕ−ＴＡ
Ａ調製物を１００℃にて１５分間加熱、および１時間加
熱した。この調製物を、加熱しなかった対応する調製物
とともに、１．４μｇ／ｍｌで抗体の標的として用い
た。
【０１２２】溶液を１００℃で１．０時間まで加熱して
も、抗原活性には大きな影響はなかった（表２）。
【０１２３】
【表２】 （実施例ＸＶＩＩＩ：酵素による消化）同種異系の二重
決定基ＥＬＩＳＡによって測定された、正常、およびメ
ラノーマ尿のグリコシダーゼ消化のＵ−ＴＡＡ活性に対
する影響をアッセイするために、混合グリコシダーゼ
（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎａｐｅｒｖｉ
ｌｌｅ，ＩＬ）を製造者の仕様に従ってＣＮＢｒ活性化
したセファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓ
ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に結合した。固定したグリコシ
ダーゼの活性を、標準ｐ−ニトロフェニルー２−Ｄ−グ
ルクロニド溶液の加水分解を記録することによってアッ
セイした。２４時間尿標本を、０．１％アジ化ナトリウ
ムで補充した０．１Ｍトリス（ｐＨ８．３）中に、１４
個体（明らかに健康な７個体、発病しているが存命中の
ＩＩ期のメラノーマ患者７体）から集めた。排除限界１
０，０００ダルトンのホローファイバー濃縮器（Ａｍｉ
ｃｏｎＣｏｒｐ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で再循
環して１００倍濃縮をする前に、初期体積およびクレア
チニン含有量（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ
Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）をそ
れぞれの標本について調べた。濃縮した尿を、酵素を含
んだゲル（または別個に調製し１Ｍエタノールアミンで
ブロックした標識されていないゲル）を用いて３７℃で
４時間処理した。その後、処理した尿および未処理の尿
のＵ−ＴＡＡ活性を、上述の同種異系の二重決定因子Ｅ
ＬＩＳＡでテストした。結果（Ｕ−ＴＡＡ ｎｇ／１０
０ｍｌ）を抗原ユニット（Ａｇ Ｕ）／ｍｇクレアチニ
ンに変換し、初期の尿体積およびアッセイ間の変化の差
を以下のように補正した。 上式において、ＡｇＵ／ｍｇクレアチニンはクレアチニ
ン１ｍｇあたりの抗原ユニットであり、［Ｕ−ＴＡＡ］
は標準曲線から内挿したサンプルのＵ−ＴＡＡ濃度ｎｇ
／ｍｌである。Ｆは１００倍濃縮の尿サンプルの最終体
積であり、［クレアチニン］は全２４時間尿サンプルの
クレアチニン含有量（ｍｇ）であり、そしてＫは、この
アッセイで４０５ｎｍにおいて１．０のＯ．Ｄ．を生成
するＵ−ＴＡＡ標準のタンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）で
ある。この濃度は１００抗原ユニットの値に相当する。
【０１２４】７人の明らかに健康なドナーから取った尿
サンプルは、平均Ｕ−ＴＡＡ含有量、２１．９±４．０
抗原ユニット／ｍｇクレアチニンを有していた（同種異
系抗体アッセイによる）が、一方、発病しているが存命
中の二期のメラノーマ患者７人からとったサンプルは、
平均Ｕ−ＴＡＡ含有量が６９．８±１７．４抗原ユニッ
ト／ｍｇクレアチニンであった（Ｐ＜０．０２５）。正
常なドナーからの標本を混合グリコシダーゼ処理する
と、平均抗原レベルが１４．８±２．８ Ｐ＞０．１と
わずかに低くなった一方、メラノーマ尿を同様に処理す
ると、その抗原レベルは１６３．７±４９．４，Ｐ＜
０．０２５へとかなり増大した。
【０１２５】（実施例ＸＩＸ：マウスモノクローナル抗
体（ＡＤ１−４０Ｆ４）と反応するエピトープの特徴付
け）ＡＤ１−４０Ｆ４と反応するエピトープの化学的性
質を明らかにするために、Ｕ−ＴＡＡを、アガロースビ
ーズ上に固定化された様々な酵素で分解した。混合グリ
コシダーゼ（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とヒ
アルロニダーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）とはＣＮＢｒ
−活性化アガロースビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，
Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に結合した。固定化さ
れたプロテアーゼはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。各々の
固定化酵素の比活性は、抗原の処理前に適切な基質系に
対してテストした。
【０１２６】３６μｇ／ｍｌのＵ−ＴＡＡを、同量のパ
ックされた固定化酵素ビーズと、室温で４時間、回転さ
せながら連続して混合した。１Ｍのエタノールアミンで
ブロックされたＣＮＢｒ活性型アガロースビーズを未処
理コントロールとして使用した。酵素で処理した、およ
び未処理の上澄のＵ−ＴＡＡ活性を以下のように、競合
的阻害アッセイで評価した：処理および未処理のＵ−Ｔ
ＡＡを０．６３μｇ／ｍｌに希釈し、１：３７５に希釈
したＡＤ１−４０Ｆ４のマウスモノクローナル抗体腹水
と共に３７℃で４５分間インキュベートした。その後、
この混合物中のＡＤ１−４０Ｆ４の、固定化したＵ−Ｔ
ＡＡに対する結合をＥＬＩＳＡで定量した。プラスチッ
クおよび標的抗原に対する非特異的結合について訂正し
た後、４０５ｎｍにおける吸光度を阻害パーセントに変
換した。個々のアッセイは３反復で行い、平均阻害パー
セント±ＳＥＭを計算した。酵素処理された抗原の阻害
活性を単純な比（処理の抑制率％／未処理の抑制率％）
で、未処理抗原のそれと比較した。これらの比はＵ−Ｔ
ＡＡに対する３つの酵素の影響を比較する基準を提供し
た。
【０１２７】Ｕ−ＴＡＡを免疫反応性エピトープに影響
を与えない酵素で処理すると１．０：１に近い活性比に
なることが期待されるであろう。これはヒアルロニダー
ゼによる処理の場合であり、未処理抗原に対する処理抗
原の活性比は１．５：１であった。グリコシダーゼ処理
は、抗原活性を高め（３．２：１の比）、一方、プロテ
アーゼ処理はＵ−ＴＡＡ活性を有意に減少させる結果
０．２：１の比になった。プロテアーゼによるインキュ
ベーション時間を８時間に延長すると、全てのＵ−ＴＡ
Ａ活性が破壊された。
【０１２８】（実施例ＸＸ：患者）ＭＣＶによる特異的
な能動免疫療法を受けている患者１５人から、免疫の前
におよびその後２から４週間ごとに、抗Ｕ−ＴＡＡ抗体
のレベルを分析するために血清サンプルを集めた。評価
される１５人の患者のうち７人は、ＭＣＶと共にシクロ
フォスファミドを投与された。比較のために、ワクチン
を投与されていない第ＩＩおよび第ＩＩＩ期のメラノー
マ患者７人からもサンプルを集めた。サンプルは−４０
℃で貯蔵し、ある患者に関する全てのサンプルを、同じ
日に解凍し、分析した。被検者の少なくとも半分が細胞
膜抗原に対する抗体反応を生じることができることを保
証するために、Ｍ−ＴＡＡに対する抗体反応を基に患者
を選んだ；１５人の患者のうち８人が、ワクチンを投与
されている間、抗Ｍ−ＴＡＡ抗体の誘導を示し、７人が
示さなかった。これは、また、１つの膜抗原に対する抗
体反応が、同じ細胞表面上の他の抗原に対する抗体反応
を保証するかどうかを、決定することを可能にした。
【０１２９】（ワクチン投与プロトコル）第１回目のワ
クチン投与は２，４００万個のグラクソＢＣＧ生体を混
合した、２，４００万個の生きている、放射線照射され
た腫瘍細胞（抗原変異性のために選ばれた、ＵＣＬＡ−
ＳＯ−Ｍ１０、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４、およびＵＣＬ
Ａ−ＳＯ−Ｍ１０１と指定された細胞株より）を含有し
た。第２回目のワクチン投与は２，４００万個の生きて
いる、放射線照射された腫瘍細胞と１，２００万個のグ
ラクソＢＣＧ生体との混合物から成った。その後のワク
チン投与はＢＣＧを含まない、２，４００万個の生きて
いる、放射線照射された腫瘍細胞から成った。免疫スケ
ジュールは、最初の６週間は２週間ごと、そしてその後
は４週間ごとにワクチン投与することから成った。
【０１３０】（統計分析）様々なグループの抗体力価
は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。
ステユーデント２点比較Ｔ検定およびカイ２乗分析を用
いて、関連した比較を行った。これらの分析に用いられ
た統計用ソフトウェアはＭａｃｉｎｔｏｓｈコンピュー
タ用のＳｔａｔＶｉｅｗ（Ｂｒａｉｎ Ｐｏｗｅｒ，Ｉ
ｎｃ．，Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡ）であった。
【０１３１】（実施例ＸＸＩ：血清抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力
価の測定）０．０６Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）１００
μｌ中のＵ−ＴＡＡ、４０ナノグラムを９６ウェルのポ
リスチレン製マイクロタイタープレートに分配した。３
７℃で３時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ−
Ｔで３回洗浄し、順に希釈した血清１００μｌを与え
た。３７℃で４５分間インキュベートした後、ウェルを
洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼに複合させた
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：５００に希釈）またはＩｇＭ
（１：１０００に希釈）を用いて抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を検
出した。プレートを４５分間インキュベートし、ＰＢＳ
−Ｔで３回洗浄した。基質を与え、２３℃で１時間イン
キュベートした後、各々のウェルに対してＯ．Ｄ．
405nmを測定した。全てのアッセイは２反復で、複合体
のプラスチックおよび標的抗原に対する非特異な結合の
ための適切な対照と共に実施した。血清希釈度（ｌｏｇ
2）に対して、２反復サンプルについての平均修正Ｏ．
Ｄ．405nmをブロットすることによって、タイトレーシ
ョン曲線を作成した。タイトレーション曲線の直線部分
を補外して、Ｏ．Ｄ．０．０５に対応する血清希釈度
を、そのサンプルの抗Ｕ−ＴＡＡ「力価」と呼んだ。
【０１３２】（実施例ＸＸＩＩ：メラノーマ患者におけ
る抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ抗体反応）ワクチンを投与され
る前には、ワクチン投与されないメラノーマ対照患者と
ＭＣＶ患者とでは抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価に関して有
意な差は無かった（１：１３２４±２５４，Ｎ＝７，
１：１１３８±１９８，Ｎ＝１５，Ｐ＞０．３７５）。
ところが、これらのレベルは、見かけ上健康な８人のド
ナー群では、有意に低かった。ＭＣＶを受けた１５人の
患者のワクチン投与前の抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価は、
１：１１２から１：２４６６の範囲であった（表３）。
ＭＣＶを受けた１５人の患者のうち、１１人は、ワクチ
ン投与の間に、これらの力価の２から５倍の増加を示し
た。これら１１人の患者の平均ＩｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ力価
は、ワクチン投与前の１：１０５１±２５９から投与
後、１：２５１８±５７６に上昇した（Ｐ＜０．００
５）．個々の抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価のピークは１：
４３５から１：５１４０の範囲であった。
【０１３３】（実施例ＸＸＩＩＩ：抗Ｕ−ＴＡＡ Ｉｇ
Ｇ抗体反応）１５人のＭＣＶ患者におけるワクチン投与
前の抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ力価は１：１０６２から１：
８３６１の範囲であった（表３）。この患者群のワクチ
ン投与前の平均力価１：３９８４±６０２はワクチンを
投与されないメラノーマ対照患者７人のそれ（１：２５
９５±４２３，Ｐ＜０．１）よりも高い。見かけ上健康
な対照８人の平均抗Ｕ−ＴＡＡレベルは、ワクチンを投
与されないメラノーマ対照患者群のそれよりも有意に低
かった。ＭＣＶを受けた１５人の患者のうち６人が、抗
Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ力価の２から７倍の増加を示した。
この６人の反応者群の平均抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ力価
は、ワクチン投与前の１：２９６４±１０４６から投与
後、１：９９５８±２６７７まで上昇した（Ｐ＜０．０
１）。この群の個々の力価は１：２，１７６から１：２
０，４８１の範囲であった。
【０１３４】
【表３】 （実施例ＸＸＩＶ：ＨＬＡ研究）抗ＨＬＡ抗体が、我々
が観察した抗体反応の一部または、全部を説明し得るの
かを判断するために、以下の実験を行った。まず、我々
のＵ−ＴＡＡ標本がＨＬＡに汚染されている可能性を減
らすために、Ｕ−ＴＡＡをポリスチレンマイクロタイタ
ープレートに固定化し、ＥＩＡでマウスのモノクローナ
ルナル抗ＨＬＡ抗体との反応性をテストした（ＡＸＬ
８５９Ｍ，Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎ
ｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｗｅｓｔｂｕ
ｒｙ，ＮＹ）。この抗体はクラスＩ ＨＬＡの４５ｋＤ
ポリペプチド産物上に存在するモノモルフィックなエピ
トープに対するものである。このようにして、Ｕ−ＴＡ
Ａ標本中に存在する全てのクラス１サブタイプが検出さ
れる。１：７５０に希釈したネズミのモノクローナル抗
Ｕ−ＴＡＡ抗体を陽性対照として同時にテストした。
【０１３５】次に、抗腫瘍抗体の誘導とＨＬＡ抗体の誘
導との間の関係を決定する研究の一環として、メラノー
マ細胞ワクチン（ＭＣＶ）を投与されたメラノーマ患者
の、ワクチン投与前および投与後の８つの血清を、個別
にクラス１およびＤＲ抗原（Ｔｅｒａｓａｋｉ，Ｐ．Ｉ
ら，Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＤＨＥＷ Ｐｕｂ１．（ＮＩ
Ｈ）７４−５４５ Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐ
ｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ，ＤＣ，Ｐ．５４、参考のために引用）との反応性を
定量する細胞障害抗体アッセイで、抗ＨＬＡ抗体につい
てテストした。これらのワクチン投与前及び投与後の反
応性を、次に抗Ｕ−ＴＡＡ抗体レベルと比較した。
【０１３６】ＨＬＡクラス１抗原のモノモルフィックな
エピトープに対するマウスのモノクローナル抗体は、
１：５から１：８０の範囲の希釈率においても、我々の
Ｕ−ＴＡＡ標本と反応しなかった。１：７５０の希釈率
で同時に行った抗Ｕ−ＴＡＡネズミのモノクローナル抗
体は１時間以内に濃い色を示した。
【０１３７】加えて、抗ＨＬＡ抗体の発生は、抗Ｕ−Ｔ
ＡＡ抗体反応とは、いかようにも関連しなかった。テス
トした８人の患者のうち１人だけが、ワクチン投与の間
に強い抗ＨＬＡ抗体反応を発生させた。ワクチン投与
前、この患者は、検出できない抗ＨＬＡ抗体レベルであ
ったが、抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧのレベルは高かった
（１：５０５６）。ワクチン投与の間、彼は、様々なク
ラスＩ ＨＬＡに対して高レベルの抗体を発生させた
が、彼の抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧレベルは変化を示さなか
った。抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価は、この間２倍にしか
ならなかった。別の患者第８号は有意な抗ＨＬＡレベル
は一度も発生させなかったが、彼の抗Ｕ−ＴＡＡＩｇＧ
およびＩｇＭ力価は、ワクチン投与の間に、各々６．５
倍と３．５倍に上昇した。他の４人の患者は、抗ＨＬＡ
抗体の誘導の証拠なしに、抗Ｕ−ＴＡＡＩｇＭのレベル
の２から４倍の上昇を示した。
【０１３８】（実施例ＸＸＶ：抗ＫＬＨ ＩｇＧ抗体反
応）ＥＬＩＳＡによるメラノーマ患者で検出されたＭＣ
Ｖに対する抗体反応がＵ−ＴＡＡに特異的なものかどう
かを判定するために、同じ血清サンプル（ＭＣＶ前と
後）を標的抗原としてのＫＬＨに対して反応させた。表
４に示す結果は、患者の大半（１４／１５）がＭＣＶ処
置前に検出可能なレベルの抗ＫＬＨ抗体を持っていたこ
とを示している。これらの抗体レベルは、ＭＣＶ投与
後、２人の患者でのみ、２倍より大きく増加した。他の
患者においては、抗ＫＬＨレベルはほぼ同じに留まる
か、或は減少した。ＭＣＶに対する反応において抗ＫＬ
Ｈおよび抗Ｕ−ＴＡＡ抗体（ＩｇＧまたはＩｇＭ＞の増
加に一致は見られなかった。
【０１３９】
【表４】 （実施例ＸＸＶＩ：抗体反応の時間的経過）１１人の抗
Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ被検者のうち４人が最初のワクチン
投与後２から６週間後に、６人が７から１６週間後に、
そして１人が免疫の２０週間後に、これらの抗体レベル
の２倍以上の上昇を示した。抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ反応
の中央値の時間は８週間であった。これら１１人の患者
において、抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ力価は４から＞２０週
間上昇したままであり、中央値は８週間であった。
【０１４０】良好な抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ反応を示した
６人の患者のうち３人は、最初のワクチン投与後４から
８週間後、これらの力価の２倍以上の上昇を示し、１人
は２０週間後に反応し、２人はＩｇＧ反応を生じるのに
４０週間のワクチン投与を必要とした。反応までの時間
の中央値は１４週間であった。これら６人の患者の反応
は４から＞４０週間持続し、中央値は＞１０週間であっ
た。
【０１４１】（実施例ＸＸＶＩＩ：病気のステージと先
行する抗Ｍ−ＴＡＡ反応）この研究で評価した１５人の
患者のうち１１人がリンパ節または局所領域の皮下組織
内に病気を限定して持ち、一方４人が遠方に転移してい
た。内臓に転移している４人全員（３人が肺に、１人が
肝臓に転移）が良好な抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ反応を生じ
た。ワクチン投与前は、これらの抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧ
レベルは１：１１４９から１：２８１６（平均１：２１
８４±３６２）の範囲であった。ワクチン投与後、力価
は１：５０００から１：１４，８４８で平均値１：８７
７７±２１１７のピークを示し、このグループでは４倍
増であった。
【０１４２】連続した血清サンプルからの抗メラノーマ
ＴＡＡ抗体レベルが、この研究（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．
ら．，Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ
ｏｌ．６：２４９（１９８７）参考のために引用）で評
価した１５人の患者全員に対して入手できた。これら１
５人の患者のうち８人がＭＣＶに対して良好な抗Ｍ−Ｔ
ＡＡ抗体反応を生じた。抗メラノーマＴＡＡ抗体レベル
の増加は、抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＧレベルの増加とは相関
しなかった（Ｒ2＝０．２７９）。全搬的に、抗Ｕ−Ｔ
ＡＡ反応率（ＩｇＭおよび／またはＩｇＧ）は、Ｍ−Ｔ
ＡＡの非反応者においてよりもＭ−ＴＡＡの反応者にお
いて高いが、差は有意ではない（ｘ2，Ｐ＞０．３）。
【０１４３】（実施例ＸＸＶＩＩＩ：乳癌、結腸癌、お
よび肺癌を持つ患者の尿におけるＵ−ＴＡＡの検出）乳
癌、結腸癌、および肺癌にかかっている患者から得た尿
サンプルを、実施例ＩＸで述べたマウスのモノクローナ
ルＡＤ１−４０Ｆ４およびヒヒの多ポリクローナル抗Ｕ
−ＴＡＡ ＩｇＧを用いた２重決定基ＥＩＡを用いてＵ
−ＴＡＡの存在を分析した。検出可能なレベルのＵ−Ｔ
ＡＡの存在する率を表５に示す。これらの率はメラノー
マ種患者のそれ（６３．４％）に全く匹敵する。
【０１４４】
【表５】 （実施例ＸＸＩＸ：癌患者の尿中のＵ−ＴＡＡレベルを
用いた悪性腫瘍のモニター）治癒的外科治療を受けた３
１人のメラノーマ患者から、先を見越した方法で連続的
に集めた尿サンプルを、実施例ＩＸで述べたように２重
決定基ＥＩＡを、以下のように修正して、Ｕ−ＴＡＡレ
ベルの分析を行った。サンプルは沸騰した湯槽中で１０
０℃で２．５分間熱し、氷水槽中で５分間冷却し、０．
５％のＴｗｅｅｎ−２０を補った、同量（２００μｌ）
の０．０２５Ｍのリン酸緩衝生理食塩液と混合した。こ
れらの混合物のうち１００マイクロリットルを、捕獲ア
ッセイでテストした。３１人の患者のうち、１０人の患
者のＵ−ＴＡＡ ＥＬＩＳＡ値が、１年間のモニタ中、
陰性（＜０．６８ ＯＤ４０５）のままであった。今の
ところ、これらのうち、１人だけ（１０％）が、臨床
上、検出可能な病気の再発をした（表６）。この患者の
再発は研究を始めてから２４週間後に起こった。これと
対照的に、３１人の患者のうち２１人の尿サンプルがＵ
−ＴＡＡ陽性（＞０．６ ＯＤ４０５）になった。これ
らＵ−ＴＡＡ陽性の患者のうち、１２人（５７％）が０
から２４週間のうちに臨床上、検出可能な再発をした。
Ｕ−ＴＡＡの陽性結果から見ると、この患者グループは
高い再発の危険にある高いと考えられ得る。他の悪性腫
瘍の患者の連続的な尿サンプルの分析は、病気の準臨床
的な再発をモニターするために使用できる。
【０１４５】
【表６】 （実施例ＸＸＸ：インターフェロンによるＵ−ＴＡＡ発
現の刺激）主要組織適合性抗原の変調は腫瘍発生性と関
連づけられてきた（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．ら，Ｃｅ１１
４３：２６３−２６７，（１９８５）参考のために引
用）。クラス１抗原発現の減少或は欠如が腫瘍細胞の免
疫認識を減少させ、それらが免疫破壊を逃れることを可
能にするということを証拠が示している。インターフェ
ロンによってクラスＩ ＨＬＡの発現が減少したか、或
は発現していない腫瘍細胞の処置の結果、腫瘍発生性の
減少を生じた（Ｔａｎａｋａ，Ｋ．Ｋ．ら．，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）２２８：２６−３０（１９８
５）；Ｅａｇｅｒ，Ｋ．Ｂ．ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５５２５−５５
２９（１９８５）参考のために引用）。
【０１４６】ヒトの、培養した腫瘍細胞をインターフェ
ロンで処置すると、しばしば、組織適合性抗原（クラス
１）の発現が増加し、腫瘍抗原の発現が変調される（増
加或は減少）ことが知られている（Ｉｍａｉ，Ｋ．ら，
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５０５−５０９：Ｇｉａ
ｃｏｍｉｎｉ，Ｐ．ｅｔａ１．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１３３：１６４９−１６５５；Ｐｅｒｏｓａ，Ｆ．
ら．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２２０２−２２０
７（１９８７）各々参考のために引用）。我々は、３つ
のメラノーマ細胞株、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１０，ＵＣＬ
Ａ−ＳＯ−Ｍ２４，およびＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１０１、
をガンマおよびアルファインターフェロンで処置し、そ
れによって、これがＵ−ＴＡＡ発現のレベルに影響する
かどうかを判定した。各々の細胞株の細胞は、インター
フェロン５００ユニット／ｍｌを補った場合としない場
合の両方のＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中で、３７℃で９６
時間、培養した。処置後、細胞をスクラップにより集め
出してＰＲＭＩ−１０％ＦＣＳで２回洗浄し、Ｕ−ＴＡ
Ａの量を評価した。同種異系抗体および精製Ｕ−ＴＡＡ
を用いた競合ＥＬＩＳＡを使った。インターフェロンの
存在下および不在下で成育させた、様々な数のメラノー
マ細胞で、吸収させる前と吸収した後に、同種異系抗体
を精製Ｕ−ＴＡＡと反応させた。精製Ｕ−ＴＡＡ（０．
０６μｇ／ｍｌ）を、ＥＬＩＳＡの標準阻害曲線を作成
するために標準ブロッカーとして用いた。
【０１４７】ガンマインターフェロンまたはアルファイ
ンターフェロンのどちらかの存在下で細胞を生育させる
ことにより、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１０およびＵＣＬＡ−
ＳＯ−Ｍ１０１細胞株によるＵ−ＴＡＡの発現が増加し
た。しかし、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４によるＵ−ＴＡＡ
の発現は、どちらのインターフェロンによる処置によっ
ても影響を受けなかった（表１０）。対照として、細胞
を125Ｉ標識モノクローナル抗体（抗ＨＬＡ−ＤＲ）
と、懸濁液アッセイで反応させることによって、ＨＬＡ
−ＤＲ抗原の発現を測定した。インターフェロンの存在
下で成長した３つの培養物全ての細胞による放射標識抗
体の結合は、その非在下で成育させたものよりも有意に
高かった（２から３倍）。
【０１４８】（ＸＸＸＩ：Ｕ−ＴＡＡは細胞表面抗原で
ある）ＥＬＩＳＡで高い抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力価を示した
ＭＣＶ患者から無作為に選択された血清を、培養メラノ
ーマ細胞の表面に結合し得る抗体について、免疫蛍光法
によって試験した。強い膜の蛍光を示す血清を、細胞表
面上のＵ−ＴＡＡがこの反応性の一部に起因するもので
あるかどうかを決定するために、間接的膜免疫蛍光法を
用いることによってさらに試験した。血清試料を段階希
釈し、そして３７℃で３０分間および４℃で３０分間、
等量（５０μｌ）のＰＢＳのみ（陰性コントロール）ま
たは１μｇのＵ−ＴＡＡを有するＰＢＳとともにインキ
ュベートした。培養ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４メラノーマ
細胞をベルセン（０．０５ｍＭＥＤＴＡナトリウム、
０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＫＣｌおよび０．
５５ｍＭ デキストロース）および０．２５％トリプシ
ンで処理することにより採収した。これらの採収した細
胞を、０．０１％のヒト血清アルブミンを含有するハン
クス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、そして５
×１０4細胞／ｍｌの濃度でＨＢＳＳ−アルブミン中に
再懸濁した。５０マイクロリットルのこの細胞懸濁液を
種々の希釈濃度のメラノーマ血清５０μｌと混合し、そ
して３７℃で１時間および４℃で１時間インキュベート
した。これらの細胞をＨＢＳＳ−アルブミンで３回洗浄
し、そして５０μｌのフルオレセイン結合ヤギ抗ヒト免
疫グロブリンと２３℃で２０分間反応させた。洗浄後、
これらの細胞を０．０２５ＭＰＢＳ中の５０％グリセロ
ール２５μｌに再懸濁し、スライドガラス上に置き、そ
して蛍光顕微鏡のもとで膜の免疫蛍光を調べた。細胞膜
上に３個またはそれ以上の蛍光ドットが存在する場合に
は、抗体に対して陽性であるとみなした。拡散または細
胞質の蛍光は、陽性とはみなさなかった。陽性細胞のパ
ーセンテージを５０個の細胞を数えて計算した。
【０１４９】高い抗Ｕ−ＴＡＡ抗体力価を有する血清は
間接的膜免疫蛍光法で試験した場合に、抗体のＵＣＬＡ
−ＳＯ−Ｍ２４培養メラノーマ細胞に対する結合を示し
た。１つの血清を上述のようにＵ−ＴＡＡによる阻害研
究のために選択した。この血清は１：１６の割合に希釈
した場合でさえ、５０−６０％のメラノーマ細胞と結合
することを示した。１μｇの精製Ｕ−ＴＡＡと共にこの
血清をプレインキュベーションした結果、１：１６の血
清の希釈濃度で免疫蛍光を示す細胞数の９３％の減少を
生じた（図１１）。Ｕ−ＴＡＡの、間接的膜免疫蛍光ア
ッセイにおける高力価抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の結合を阻害す
る能力は、腫瘍細胞の表面の細胞膜上におけるＵ−ＴＡ
Ａの発現を説得力をもって実証した。
【０１５０】（実施例：ＸＸＸＩＩ：Ｕ−ＴＡＡに対す
るヒト抗体のインビトロにおける産生）フィコール−ハ
イパック遠心分離法を用いて、癌患者のヘパリン処理し
た（ｈｅｐｒａｎｉｚｅｄ）血液３０ｍｌから末梢血リ
ンパ球（ＰＢＬ）を得た。高レベルの抗Ｕ−ＴＡＡ抗体
を基準として、ＭＣＶ治験の参加者から血液ドナーを選
択した。赤血球ロゼッティング法（ここで参考のために
援用されているＢａｋａｃｓらのＣｅｌｌｕｌａｒ Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７７））の適用によって、単
離したＰＢＬからＴ細胞を除去した。それによってその
ＰＢＬはＢ細胞（抗体産生細胞）について富化された。
エプスタインーバーウィルス（ＥＢＶ）をそれらに感染
させることによって、この富化されたＢ細胞を形質変換
した。この目的のために、ＥＢＶを産生するマーマセッ
ト（ｍａｒｍａｓｅｔ）細胞株Ｂ９５−８の５０％上清
液を含有するＲＰＭＩ １６４０−１０％ＦＣＳ中に、
１０×１０6細胞／ｍｌの濃度で、富化されたＢ細胞を
懸濁した。３７℃で一晩インキュベートした後、細胞を
洗浄し、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地に再懸濁した。これらの
培養物からの上清液を１週間毎に集め、標的抗原として
精製したＵ−ＴＡＡを用いたＥＬＩＳＡの直接法で抗Ｕ
−ＴＡＡ活性の存在を試験した（実施例Ｉ）。３５個の
培養物のうち１７個の培養物がＵ−ＴＡＡに対する抗体
を産生したが、しかし多くの培養物が３ヵ月以内にこれ
らの抗体を産生することをやめた。６ヵ月より長くこれ
らの抗体を産生し続けた２つの培養物からの細胞（図１
２）を、一定間隔で低温保存した。
【０１５１】該上清液中の該抗体が認識する免疫反応性
成分が腫瘍細胞によって発現されることを証明するため
に、インビボで産生されたＵ−ＴＡＡに対する抗体の供
給源として、これらの培養物の１０倍濃度の上清液を用
いた。14Ｃ−Ｌ−ロイシン（５０μＣｉ／ｍｌ）を補っ
たＲＰＭＩ中で５日間、メラノーマ細胞（ＵＣＬＡ−Ｓ
Ｏ−Ｍ１４）を培養した。細胞を採収し、完全ＲＰＭＩ
−ＦＣＳ培地で３回洗浄し、そして、０．５％（Ｖ／
Ｖ）ＮＰ−４０（ＮｏｎａｄｅｔＰ−４０）で抽出して
生合成により標識された抗原を得た。細胞を含んでいな
い抽出物を、固定化した小麦胚芽凝集素（ＷＧＡ）で処
理した。結合した物質をキトトリアーゼ（ｃｈｉｔｏｔ
ｒｉａｓｅ）で溶離し、そして溶離液として０．０２５
Ｍリン酸緩衝生理食塩水を用いて、セファクリルＳ−２
００カラム（０．５×１０ｃｍ）を通してクロマトグラ
フィーを行った。２００マイクロリットルの画分を集め
た。この溶離プロフィールを、１０μｌ部分をシンチレ
ーション計数に供することによってモニターした（図１
３）。放射活性の各々のピーク下の画分をプールし、１
０倍濃度のヒトリンホブラストイド（ｈｕｍａｎｌｕｍ
ｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）培養上清液（インビトロで産
生された抗体の供給源）１００μｌと反応させた。抗体
と結合した放射活性を、ウサギ抗ヒトＩｇ免疫ビーズの
５０％懸濁液（Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、リッチモンド、カリフォルニア州）２００μｌによ
って沈澱させた。図１３に示すように、画分３９から４
５のプールの約６５％の放射活性が、リンホブラストイ
ド（１ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）培養上清液に存在
するヒト抗体に結合した。
【０１５２】我々はまだ、単一細胞由来のクローンを開
発することには成功していないが、フィーダ層として胸
腺細胞を用いて軟質寒天（１％）中に培養することによ
って、リンホブラストイド細胞株（ＬＣＬ １およびＬ
ＣＬ ２）由来のサブクローンを作成することに成功し
た。理論上、この軟質寒天において発育するコロニー
は、単一細胞由来である。しかし、このことはいつも真
実であるというわけではない。なぜならば、しばしば、
２つまたはそれ以上の細胞がお互いに癒着するからであ
る。従って、このようなコロニーの単一クローン性につ
いては保証し得ない。ＬＣＬ ２培養物の２種のサブク
ローン（ＬＣＬ ２．６およびＬＣＬ ２．１１）を分
析することによって、それらが抗Ｕ−ＴＡＡおよび抗Ｆ
ＡＩｇＭ抗体を産生することが明かにされた。
【０１５３】サブクローンＬＣＬ ２．６および２．１
１の培養上清液の免疫反応性の特異性を、精製したＦＡ
およびＵ−ＴＡＡでブロックし、次いでＥＬＩＳＡで２
種の標的抗原に対して反応させることによって確認し
た。２倍希釈法を用いてこの培養上清液を段階希釈し
た。各希釈液の一部分（１００μｌ）を、非ブロックの
コントロールとして０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５
％ Ｔｗｅｅｎ−２０を補った０．０２５Ｍリン酸緩衝
液と混合し；第２の部分を等量（１００μｌ）のＦＡ
（０．０５ｍｇ／ｍｌ）でブロックし；そして、第３の
部分をＵ−ＴＡＡ（０．０６ｍｇ／ｍｌ）と反応させ
た。この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。
Ｕ−ＴＡＡおよびＦＡに対する各混合物中の抗Ｕ−ＴＡ
Ａおよび抗ＦＡ抗体レベルをＥＬＩＳＡによって測定し
た。図１４および１５に表されたデータは、Ｕ−ＴＡＡ
に対するサブクローンＬＣＬ ２．６の培養上清液の反
応性が、Ｕ−ＴＡＡによってブロックされ、ＦＡによっ
てブロックされないことを示す。また、ＦＡに対するそ
の反応性も、ＦＡによってブロックされ、Ｕ−ＴＡＡに
よってブロックされなかった。抗体の供給源として、も
う一方のサブクローンであるＬＣＬ ２．１１の培養上
清液を用いた場合、同様の結果が見られた。サブクロー
ンＬＣＬ ２．６およびＬＣＬ ２．１１は、この時点
においてモノクローナルでないが、それらは抗Ｕ−ＴＡ
Ａ（ＩｇＭ）抗体を産生するということを、これらの結
果は明白に示している。これらのサブクローンを引き続
いてサブクローニングすることによって、モノクローナ
ルの性質を有するクローンが生じるはずである。
【０１５４】（実施例ＸＸＸＩＩＩ：癌患者の血清中に
免疫複合体の形で存在するＵ−ＴＡＡの検出）癌患者に
おいてＵ−ＴＡＡは免疫原であるため、免疫反応を引き
出す。そのため、Ｕ−ＴＡＡに対する抗体は、特に腫瘍
の苦痛が少ない時には、癌患者の血液中を循環する。こ
れらの抗体は、腫瘍細胞表面上のＵ−ＴＡＡに反応し得
る。我々は、腫瘍細胞表面における抗体の存在を証明
し、それらが特に腫瘍抗原と反応することを解明した
（Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．およびＭｏｒｔｏｎ，Ｄ．Ｌ，
Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １５：１０５３（１９８４）
参考のため援用）。腫瘍結合抗体は、生体において対応
する抗原との免疫相互作用の証拠だと考え得る。細胞表
面上に形成された抗原−抗体（免疫）複合体は、細胞に
よって内面化し、または抗原の転形、キャップ形成およ
び発散の行程（Ｌｅｏｎｇ Ｓ．Ｐ．Ｌ．ら，Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ．３９：２１２５（１９７９）参考のため
に援用）によって周囲に放出され得る。他に考え得る腫
瘍抗原が血行中に放出される機構としては、細胞死、表
面出血、亜致死の自己分解および細胞からの分泌（Ｐｒ
ｉｃｅ，Ｍ．Ｒ．およびＲｏｂｉｎｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ
ｎｃｅｒ，ｐｐ．１５５（１９７８）参考のため援用）
が挙げられる。血行中に発散された抗原は、体液性抗体
と結合し、循環免疫複合体を形成することになる。この
ように、人間の癌の免疫診断および免疫予後のためのマ
ーカーとして免疫複合体を利用するための数多くの努力
が様々な研究者によってなされてきたが、いくらかが成
功している。しかし、複合体の抗体性は知られておら
ず、癌患者の治療行程との相関関係は不明瞭であった。
これは、主に、抗原非特異性免疫複合体検出アッセイの
利用のためである。
【０１５５】ヒト腫瘍細胞によって生成された９０−１
００ｋＤサブユニットを認識する、ネズミモノクローナ
ル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４の有用性を用いて、我々は抗原
非特異性免疫複合体検出アッセイを開発してきた。図１
６に示すように、このアッセイは、ネズミモノクローナ
ル抗体ＡＤ１−４０Ｆ４の固体マトリクスヘの固定を利
用する。固体マトリクスは、たとえば、ポリビニルまた
はポリスチレンのマイクロタイタープレートまたはチュ
ーブまたはビーズ、テフロン（登録商標）のディスク、
ガラスビーズ、あるいは、グラスファイバーディスクの
ようにあらゆる適切な物質を物理的に適当なあらゆる形
状にしたものであり得る。固定は、たとえば、物理的吸
収、または、ホモ−またはヘテロ−二官能性もしくは多
官能性結合剤を用いた化学的反応による共有付着によっ
て行い得る。固定されたモノクローナル抗体を、Ｕ−Ｔ
ＡＡ（抗原）−抗Ｕ−ＴＡＡ（抗体）複合体、または血
清もしくは他の体液からの精製免疫複合体を含有すると
思われる、血清サンプルまたは他の体液と反応させる。
固体マトリクスを洗浄した後、その表面のヒト免疫グロ
ブリンの存在を、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなどの各アイ
ソタイプに一般的なあるいは特異的な酵素もしくはヒト
免疫グロブリンヘのビオチン標識された抗体によって認
識する。固体マトリクスに固定されたネズミモノクロー
ナル抗体は血清成分のいずれとも反応しないため、固体
マトリクス上のヒト免疫グロブリンの存在は、すでに生
体内で患者の抗体と反応した抗原を捕獲したためであ
る。固体マトリクスを反応させた複合体を適当な基板に
曝すと、色発現によって抗原（Ｕ−ＴＡＡ）特異性免疫
複合体がテストサンプル中に存在することがわかる。
【０１５６】我々は、ポリスチレンマイクロタイタープ
レート（ｌｍｍｕｌｏｎ Ｉ，Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）で
の上記の技術を開発してきた。ネズミモノクローナル抗
体ＡＤ１−４０Ｆ４をウェルに付着させた（ウェルにっ
き１：３００希釈物１００μｌ）。テスト血清（１：２
０希釈物１００μｌ）をネズミ抗体感作ウェルに付加
し、３７℃で１．０時間インキュベーションした。洗浄
後、テストウェル中のヒトＩｇＧの存在（免疫複合体の
形で存在している）を、基板としてヤギ抗ヒトＩｇＧお
よび燐酸Ｐ−ニトロフェニルに接合したアルカリ性ホス
ファターゼによって計測した。その結果を４０５ｎｍに
おける光密度（ＯＤ）として表した。２４人のメラノー
マ患者から取った血清は０．４５６±０．１１４の平均
±ＳＥ ＯＤ４０５を有していた。この値は、明らかに
健康な正常対照３２人の血清の０．１±０．０２５とい
う平均±ＳＥより有意に大きい（ｐ＜０．００１）。正
常対照の、平均プラス２標準偏差値（０．３９２ ＯＤ
４０５）より大きな値を、Ｕ−ＴＡＡ特異性免疫複合体
の存在の示度として用いると、メラノーマ患者から取っ
た血清の３７．５％（９／２４）は陽性であり、それに
対して正常対照ではたった６％（２／３２）であった
（Ｐ＜０．０１）。
【０１５７】予期研究において、９人のメラノーマ患者
の治療期間の間に連続的に集められた血清サンプルを分
析して、その再発が臨床的に明白になる数ヶ月前に、患
者が潜伏的な病状であることを知るために、このＵ−Ｔ
ＡＡ特異性免疫複合体検出アッセイを利用し得ることが
わかった。図１７は、２人の代表的な患者のデータを用
いてこの事実を説明したものである。Ｕ−ＴＡＡ特異性
免疫複合体の陽性レベルを、再発が臨床的に検出できる
４〜２４週間（平均＝１４．１週間）前に検出した。こ
のように、本発明は、外科的治療をした癌患者の血清中
のＵ−ＴＡＡ特異性免疫複合体の存在を検知することに
よって、微視的な潜在的病状を確認する、有用な手段を
提供する。
【０１５８】（ＸＸＸＩＶ：ヒト抗イディオタイプ抗体
調製）治療に適用するために大量の抗原が必要である。
培養した腫瘍細胞抽出液または癌患者の尿から得られる
量は、生体内での血清学または免疫化学アッセイでの使
用にのみ十分なだけである。抗原を適切に提供するため
には、２つの方法が可能である：１）分子生物学技術に
よって、Ｕ−ＴＡＡの生成に携わる遺伝子をクローン化
する；２）癌患者からＥＢＶ変換したリンパ芽球様細
胞、または、抗Ｕ−ＴＡＡの抗イディオタイプ抗体（抗
Ｕ−ＴＡＡ抗体の内部鏡像）を分泌するこれらの細胞の
ヒトーヒトハイブリドーマを同定する。これらの方法
は、当業者ならばうまく利用し得る。我々はすでに、Ｅ
ＢＶ変換したリンパ芽球様細胞および癌患者のリンパ球
から取ったヒトーヒトハイブリドーマを有しているた
め、現在のところは第二の方法の方が好ましい。
【０１５９】これらのリンパ芽球様細胞株の多くが免疫
グロブリンを分泌し、Ｕ−ＴＡＡと反応しない。これら
の免疫グロブリンのいくつかがＵ−ＴＡＡの抗イディオ
タイプであってもよい。ＩｇＭアイソタイプの抗Ｕ−Ｔ
ＡＡを生成するリンパ芽球様サブクローンを我々は同定
した（実施例ＸＸＸＩＩ）。大量のこれらの抗体を精製
された形状で得ると、それらを酵素またはその他の適切
な放射線核種に結合して、クローンを抗イディオタイプ
活性であると同定するために、Ｕ−ＴＡＡに反応しない
リンパ芽球様クローンの上清に反応する性質を用い得
る。陽性クローンを用いた、Ｕ−ＴＡＡに対する抗イデ
ィオタイプ抗体の製造は、クローン上清を製造する抗イ
ディオタイプ抗体と思われるものとの反応の前に、Ｕ−
ＴＡＡによって抗Ｕ−ＴＡＡをブロックすることによっ
て確実となる。Ｕ−ＴＡＡの内部鏡像とは異なる抗イデ
ィオタイプの検出を確実にするために、標識をつけられ
た抗体は精製したヒト正常血清免疫グロブリンを含有し
ている（２％ｖ／ｖ）。このように同定される抗イディ
オタイプは、活性特異性免疫治療、およびアミノ酸配
列、ヌクレオチド配列などのＵ−ＴＡＡの抗原エピトー
プの化学的分析に広く利用することができる。
【０１６０】本発明は、現在のところ好ましい実施態様
を参照して説明をしてきたが、本発明から離れることな
く変形を加えることも可能である。従って、本発明は以
下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。
【０１６１】
【発明の効果】本発明の、サンプル中の抗尿中腫瘍関連
抗原（Ｕ−ＴＡＡ）抗体を検出するための方法を患者に
適用することにより、患者の腫瘍の診断を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、濃縮したメラノーマ患者の尿のセファ
クリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−２００ゲル濾過クロ
マトグラムを示す。タンパク質含量（吸光度２８０ｎ
ｍ）、および同種異系二重決定因子ＥＩＡによって測定
されたＵ−ＴＡＡ活性（ｎｇ／１００μｌ）を示す。
【図２】図２は、ＤＥＡＥアフィゲルブルー（Ａｆｆｉ
−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ）クロマトグラフィーによる、Ｕ−
ＴＡＡに対するひひＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の精製
を示す。最初にＩｇＧ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体が溶出し、６０
ｍｌ／ｈｒの流速で０．５Ｍ ＮａＣｌによってＩｇＭ
抗Ｕ−ＴＡＡ抗体が溶出した。ＩｇＧを含有するフラク
ションのプールはタンパク質濃度が３．５ｍｇ／ｍｌで
あり、そして抗Ｕ−ＴＡＡ力価は１：２５０，０００で
あった。ＩｇＭフラクションのプールはタンパク質濃度
が３．７ｍｇ／ｍｌであり、そして抗Ｕ−ＴＡＡの力価
は、精製されたＵ−ＴＡＡ（３０ｎｇ／ウェル）を標的
として用いると１：３６００であった。
【図３】図３は、補体依存細胞毒性アッセイにおける細
胞溶解に対する、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１４（Ｍ１４）お
よび自己のリンパ芽球様（Ｌ１４）細胞によるひひ抗Ｕ
−ＴＡＡ ＩｇＭ抗体の吸収の効果を示す。ひひＩｇＭ
抗Ｕ−ＴＡＡの細胞毒性効果は１×１０7のＭ１４細胞
での吸収によって完全に消失したが、同数のＬ１４細胞
では有意な影響は見られなかった。
【図４】図４は、精製されたＵ−ＴＡＡによる、ひひＩ
ｇＭ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体の補体依存性アッセイ（ＣＤＣ）
に対する効果を示す。表示した最終希釈度になるよう
に、抗体（３．７ｍｇ／ｍｌ）をＲＰＭＩ−１０％ＦＣ
Ｓで希釈し、等量のＵ−ＴＡＡ（０．０６ｍｇ／ｍｌ）
と混合した。精製されたＵ−ＴＡＡは、各抗体希釈液で
細胞融解を有意に減少させた。
【図５】図５は、ＡＤ１−４０Ｆ４反応性メラノーマ患
者の血清のＤＥＡＥセファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）陰
イオン交換クロマトグラムを示す。タンパク質含量（吸
光度２８０ｎｍ）、ＩｇＧの存在、ＩｇＭの存在、およ
び異種二重決定因子ＥＩＡによって測定したＵ−ＴＡＡ
活性（Ｏ．Ｄ．405nm）を示す。
【図６】図６は、メラノーマ患者の血清から精製され、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、次にニトロセルロ
ース紙に移されたＵ−ＴＡＡを示す。ネズミのモノクロ
ーナル抗体およびポリクローナルひひ抗Ｕ−ＴＡＡ抗体
は両方とも９０ｋＤａサブユニットを認識する。
【図７】図７は、内因性標識（14Ｃ−Ｌ−ロイシン）メ
ラノーマ（ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１４）細胞のＮＰ−４０
抽出物をヒトポリクローナル抗体と反応させることによ
って形成された免疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥのプロフ
ィールを示す。抗体は、精製されたＵ−ＴＡＡで処理す
る前（Ａ）および処理した後（Ｂ）に用いた。
【図８】図８は、メラノーマ患者の血清から精製された
Ｕ−ＴＡＡの等電点電気泳動を示す。等電点電気泳動
後、タンパク質をニトロセルロース上にブロットし、ひ
ひポリクローナル抗Ｕ−ＴＡＡ抗血清で染色した。等電
点６．１に対応する単一のバンドが同定された。
【図９】図９は、外科的治療を行ったメラノーマ患者の
尿におけるＵ−ＴＡＡの出現と臨床的に検出される疾病
の再発との間の時間差を示す。
【図１０】図１０は、３種のメラノーマ細胞株（ＵＣＬ
Ａ−ＳＯ−Ｍ１０、ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４、およびＵ
ＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１０１）によるＵ−ＴＡＡ発現レベル
に対するγおよびαインターフェロンの効果を示す。細
胞は、５００ユニット／ｍｌのγおよびαインターフェ
ロンの存在下および非存在下で９６時間、ＲＰＭＩ−１
０％ＦＣＳ培地中で培養した。Ｕ−ＴＡＡレベルは、同
種異系抗体および精製されたＵ−ＴＡＡ（０．０６ｍｇ
／ｍｌ）を用いる競合的ＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１１】図１１は、同種異系抗Ｕ−ＴＡＡ血清とＵＣ
ＬＡ−ＳＯ−Ｍ２４（メラノーマ）細胞との間の間接的
膜免疫蛍光法によって観察された、精製されたＵ−ＴＡ
Ａによる反応阻害を示す。種々の希釈度の抗Ｕ−ＴＡＡ
血清を、１．０μｇ Ｕ−ＴＡＡと一緒にプレインキュ
ベーションし、次にメラノーマ細胞と反応させた。未処
理の抗血清は１：１６希釈で反応性を維持したが（白四
角）、精製されたＵ−ＴＡＡと一緒に血清をプレインヰ
ユベーションした後は、９３％がブロックされた（黒四
角）。
【図１２】図１２は、ヒトリンパ芽球様細胞株の一種
（ＬＣＬ ２）によって抗Ｕ−ＴＡＡ ＩｇＭ抗体が６
ヶ月を越える期間連続して産生されたことを示す。細胞
は、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地中で増殖させた。培養上清を
一定の時間間隔で集め、そして精製されたＵ−ＴＡＡ
（３０ｎｇ／ウェル）を用いる直接的ＥＬＩＳＡによっ
て、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の両方の存在について試験
した。培養細胞はＩｇＭ抗体のみを産生した。
【図１３】図１３は、内因性標識（14Ｃ−Ｌ−ロイシ
ン）ＵＣＬＡ−ＳＯ−Ｍ１４（メラノーマ）細胞の無細
胞ＮＰ−４０抽出物のセファクリルＳ−２００溶出のプ
ロフィール、およびＬＣＬ ２ヒトリンパ芽球様細胞の
培養上清とのいろいろなピークの反応性を示す。各プー
ル１００μｌを３７℃で１時間ＬＣＬ ２培養上清１０
０μｌと反応させた。抗体に結合した放射能を、ウサギ
抗ヒトＩｇ免疫ビーズによって非結合の放射能から分離
した。バックグラウンドを低減するために、無細胞ＮＰ
−４０抽出物を免疫ビーズで前処理した。抗原活性はフ
ラクション３９から４５までを含むピーク中に存在し
た。
【図１４】図１４は、Ｕ−ＴＡＡに対するＬＣＬ ２．
６培養上清の反応性がＵ−ＴＡＡによってブロックされ
たが、ＦＡによってはブロックされなかったことを示
す。上清の各希釈液を１００μｌ（６μｇ）のＵ−ＴＡ
Ａあるいは１００μｌ（５μｇ）のＦＡのいずれかでブ
ロックする前およびブロックした後、この上清を直接的
ＥＬＩＳＡによってＵ−ＴＡＡと反応させた。
【図１５】図１５は、ＦＡに対するＬＣＬ ２．６培養
上清の反応性がＦＡによってブロックされたが、Ｕ−Ｔ
ＡＡによってブロックされなかったことを示す。ブロッ
ク法は図１４について記載したように行った。
【図１６】図１６は、Ｕ−ＴＡＡ特異的免疫複合体検出
アッセイの概略図を示す。このアッセイでは抗Ｕ−ＴＡ
Ａネズミモノクローナル抗体であるＡＤ１−４０Ｆ４を
利用している。免疫複合体は固定化抗体（抗Ｕ−ＴＡ
Ａ）と反応する。抗原によるヒト免疫グロブリンの捕獲
は、ＥＬＩＳＡと類似の方法によってウサギあるいはヤ
ギ抗ヒトＩｇを用いて測定される。
【図１７】図１７は、メラノーマ患者における、Ｕ−Ｔ
ＡＡ特異的免疫複合体レベル（ＯＤ４０５ｎｍ）と臨床
経過（再発）との間の相関関係を示す。第ＩＩＩ期の疾
病の患者が、早期疾患の外科的切除およびリンパ節除去
によって治癒された。患者が検査のために診療所を訪れ
るたびに、血清サンプルを採取した。図１６に概説した
アッセイによって、血清サンプルをＵ−ＴＡＡ特異的免
疫複合体についてアッセイした。臨床的に検出できる再
発よりも、患者＃１では少なくとも３４週前、そして患
者＃２では少なくとも２８週前に、血清がＵ−ＴＡＡ特
異的免疫複合体について陽性となった。ＮＥＤ＝疾病徴
候なし。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 501088992 デイビッド エム． ユーフス アメリカ合衆国 カリフォルニア 90045 ロサンゼルス，ラムズゲイト プレイス 7038 (72)発明者 ドナルド エル． モートン アメリカ合衆国 カリフォルニア 90272 パシフィック パリセイズ，コロナ デ ル マール 15054 (72)発明者 リシャブ ケイ． グプタ アメリカ合衆国 カリフォルニア 91405 バン ニュイス，コステロ アベニュー 7118 (72)発明者 デイビッド エム． ユーフス アメリカ合衆国 カリフォルニア 90045 ロサンゼルス，ラムズゲイト プレイス 7038

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル中の抗尿中腫瘍関連抗原（Ｕ−
    ＴＡＡ）抗体を検出するための方法であって： （ｉ）Ｕ−ＴＡＡが結合された表面を提供する工程； （ｉｉ）該サンプルを該表面と接触させる工程；および （ｉｉｉ）該表面上の抗Ｕ−ＴＡＡ抗体を検出する工
    程、を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 前記サンプルが血清である、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記Ｕ−ＴＡＡが非共有結合的手段によ
    って結合された、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 工程（ｉｉｉ）が、以下の工程を包含す
    る、請求項１に記載の方法： （ａ）前記表面を抗ヒトＩｇ抗体と接触させる工程；お
    よび（ｂ）該表面上に結合した抗ヒトＩｇ抗体を検出す
    る工程。
  5. 【請求項５】 前記抗ヒトＩｇが抗ヒトＩｇＭである、
    請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記抗ヒトＩｇが抗ヒトＩｇＧである、
    請求項４に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記抗ヒトＩｇ抗体が、検出可能なマー
    カーで標識されている、請求項４に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記検出可能なマーカーが、アルカリ性
    ホスファターゼである、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 工程（ｂ）が、以下の工程を包含する、
    請求項８に記載の方法： （１）前記表面をアルカリ性ホスファターゼの基質と接
    触させる工程；および（２）該基質のアルカリ性ホスフ
    ァターゼによる変換をアッセイする工程。
  10. 【請求項１０】 前記アッセイが、光学的密度（Ｏ．
    Ｄ．）測定を含む、請求項９に記載の方法。
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