JP3003976B2 - 抗ガングリオシドモノクローナル抗体および悪性腫瘍の特異的能動免疫療法におけるそれらの使用 - Google Patents
抗ガングリオシドモノクローナル抗体および悪性腫瘍の特異的能動免疫療法におけるそれらの使用Info
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Description
【０００１】発明の分野 本発明は、免疫学の分野、ガングリオシド（Ａｂ１’）
に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発生および選
択に関し、これらの抗体は、これらの抗原に対して特異
的で、リカレントなイディオタイプを有し、これらの抗
原に対する免疫応答の免疫調節剤として価値を有する。
さらに、本発明は上記抗ガングリオシドｍＡｂで免疫処
置することによる抗−イディオタイプｍＡｂ（Ａｂ２）
を得ることに関する。
に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発生および選
択に関し、これらの抗体は、これらの抗原に対して特異
的で、リカレントなイディオタイプを有し、これらの抗
原に対する免疫応答の免疫調節剤として価値を有する。
さらに、本発明は上記抗ガングリオシドｍＡｂで免疫処
置することによる抗−イディオタイプｍＡｂ（Ａｂ２）
を得ることに関する。
【０００２】先行技術の説明 ガングリオシドは、シアール酸を含有し大部分の哺乳動
物細胞膜中に存在するスフィンゴ糖脂質である。これら
の抗原は正常組織にも存在するが、悪性細胞の表面上に
は大量に見出され、異なる編制およびコンフォーメーシ
ョンを示すことが明らかにされている［Ｈａｋｏｍｏｒ
ｉ，Ｓ．（１９８５），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４５，２
４０５−２４１４；Ｍｉｒａｌｄｉ，Ｆ．（１９８
９），Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ ＸＩＸ，２８２−２９４；Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎら（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５
３，１−８］。
物細胞膜中に存在するスフィンゴ糖脂質である。これら
の抗原は正常組織にも存在するが、悪性細胞の表面上に
は大量に見出され、異なる編制およびコンフォーメーシ
ョンを示すことが明らかにされている［Ｈａｋｏｍｏｒ
ｉ，Ｓ．（１９８５），ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．４５，２
４０５−２４１４；Ｍｉｒａｌｄｉ，Ｆ．（１９８
９），Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ ＸＩＸ，２８２−２９４；Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎら（１９９３），Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５
３，１−８］。
【０００３】一部のｍＡｂは、ガングリオシドをそれら
が細胞表面に高密度に存在する場合にのみ認識できる。
すなわちＧＭ３に対するｍＡｂである［Ｎｏｒｅｓ，
Ｇ．Ａ．ら（１９８７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
９，３１７１−３１７６；Ｄｏｈｉ，Ｉ．ら（１９８
８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，５６８０−５６８
５］。
が細胞表面に高密度に存在する場合にのみ認識できる。
すなわちＧＭ３に対するｍＡｂである［Ｎｏｒｅｓ，
Ｇ．Ａ．ら（１９８７），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３
９，３１７１−３１７６；Ｄｏｈｉ，Ｉ．ら（１９８
８），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，５６８０−５６８
５］。
【０００４】正常な成人組織はＮｅｕＡｃのみを含有
し、ＮｅｕＧｃ−含有ガングリオシドは含まない。メラ
ノーマ、結腸直腸癌、網膜芽腫、および非精子胚細胞腫
を含めた一部のヒト腫瘍は、総シアール酸含量の０．０
５％未満を構成するにすぎないがＮ−グリコリルニュー
ラミン酸含有ガングリオシドをもつことが報告されてい
る［Ｈｉｇａｃｈｉ，Ｈ．ら（１９８４）Ｊｐｎ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ），７５，１０２５
−１０２９；Ｈｉｇａｃｈｉ，Ｈ．ら（１９８５）Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５，３７９６−３８０２；Ｈｉｒ
ａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．ら（１９８７）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ），７８，１６１４−
１６２０；Ｈｉｇａｃｈｉ，Ｈ．ら（１９８８）Ｊｐ
ｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（Ｇａｎｎ），７９，９
５２−９５６；Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ．ら（１９９０）Ｃａ
ｎｃｅｒ，６５，４９９−５０５］。他の著者は、これ
らの抗原に対するヒトｍＡｂが、検討した結腸直腸腫瘍
またはメラノーマのいずれをも認識しなかったことを明
らかにしている［Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら（１９８
８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１８５０７−
１８５１２］。乳房腫瘍におけるガングリオシド含量の
研究により、ＮｅｕＧｃ−含有ガングリオシドは総ガン
グリオシド含量の約５〜１１％を構成できたことが明ら
かにされている（特許出願１３１−９３）。
し、ＮｅｕＧｃ−含有ガングリオシドは含まない。メラ
ノーマ、結腸直腸癌、網膜芽腫、および非精子胚細胞腫
を含めた一部のヒト腫瘍は、総シアール酸含量の０．０
５％未満を構成するにすぎないがＮ−グリコリルニュー
ラミン酸含有ガングリオシドをもつことが報告されてい
る［Ｈｉｇａｃｈｉ，Ｈ．ら（１９８４）Ｊｐｎ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ），７５，１０２５
−１０２９；Ｈｉｇａｃｈｉ，Ｈ．ら（１９８５）Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４５，３７９６−３８０２；Ｈｉｒ
ａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．ら（１９８７）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（Ｇａｎｎ），７８，１６１４−
１６２０；Ｈｉｇａｃｈｉ，Ｈ．ら（１９８８）Ｊｐ
ｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（Ｇａｎｎ），７９，９
５２−９５６；Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ．ら（１９９０）Ｃａ
ｎｃｅｒ，６５，４９９−５０５］。他の著者は、これ
らの抗原に対するヒトｍＡｂが、検討した結腸直腸腫瘍
またはメラノーマのいずれをも認識しなかったことを明
らかにしている［Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．ら（１９８
８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１８５０７−
１８５１２］。乳房腫瘍におけるガングリオシド含量の
研究により、ＮｅｕＧｃ−含有ガングリオシドは総ガン
グリオシド含量の約５〜１１％を構成できたことが明ら
かにされている（特許出願１３１−９３）。
【０００５】ガングリオシドは良好な免疫原ではなく、
免疫応答を誘導するためには、それらは蛋白質にカップ
リングされるか、またはリポソームもしくはサルモネラ
ミネソタＲ５９５株に導入されなければならない。これ
らの抗原に対する抗体応答の一つの特徴は産生される免
疫グロブリンクラスが主としてＩｇＭであることであ
る。
免疫応答を誘導するためには、それらは蛋白質にカップ
リングされるか、またはリポソームもしくはサルモネラ
ミネソタＲ５９５株に導入されなければならない。これ
らの抗原に対する抗体応答の一つの特徴は産生される免
疫グロブリンクラスが主としてＩｇＭであることであ
る。
【０００６】ＩｇＧ抗−ガングリオシド抗体はヒトおよ
びマウスに見出すことはできるが、Ｔ細胞の協力は非特
異的で、アジュバントによって誘導されたものと思われ
る。すなわち、それぞれの免疫処置後に生じた抗体応答
は、短時間しか持続せずアフィニティーは低いものであ
り［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．（１９９１）Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ
ｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ １１，４
０１−４２５；Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ，Ｊ．ら（１
９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４９，８９３−８
９９］、Ｔ−非依存性抗原に対する典型的な応答である
［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．ら（１９８２）Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，２９
１１−２９１５；Ｔａｉ，Ｔ．ら（１９８５）Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３５，６０７−６１２；Ｌｉｖｉｎ
ｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．ら（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．４９，７０４５−７０５０］。
びマウスに見出すことはできるが、Ｔ細胞の協力は非特
異的で、アジュバントによって誘導されたものと思われ
る。すなわち、それぞれの免疫処置後に生じた抗体応答
は、短時間しか持続せずアフィニティーは低いものであ
り［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．（１９９１）Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ
ｉｃｓ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ １１，４
０１−４２５；Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎ，Ｊ．ら（１
９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４９，８９３−８
９９］、Ｔ−非依存性抗原に対する典型的な応答である
［Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．ら（１９８２）Ｐｒ
ｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，２９
１１−２９１５；Ｔａｉ，Ｔ．ら（１９８５）Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３５，６０７−６１２；Ｌｉｖｉｎ
ｇｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．ら（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．４９，７０４５−７０５０］。
【０００７】ＧＤ３、ＧＭ２およびＧＤ２に対する異な
るマウス抗−ガングリオシドｍＡｂおよびヒトｍＡｂが
これまでに得られている。これらの大部分は、ＩｇＭお
よびＩｇＧ３サブクラスに属する［Ｐｕｋｅｌ，Ｃ．
Ｓ．ら（１９８２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５，１１
３３−１１４７；Ｃａｈａｎ，Ｌ．Ｄ．ら（１９８２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
９，７６２９−７６３３；Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ．ら（１９
８２），７９，５６６６−５６７０；Ｔａｉ，Ｔ．ら
（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８０，５３９２−５３９６；Ｈｉｒａ−ｂａｙ
ａｓｈｉ，Ｙ．ら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６０，１３３２８−１３３３３；Ｃｈｅｕｎ
ｇ，Ｎ．Ｋ．Ｖ．ら（１９８５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．４５，２６４２；Ｎａｔｏｌｉ，Ｅ．Ｊ．ら（１９
８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６，４１１６−４１２
０；Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．＆ Ｓｈｕｌｚ，Ｇ．（１
９８６）ＷＯ８６／００９０９；Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ．ら
（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，６１５４−
６１６０；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら（１９８８）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４１，２６７−２７４；Ｔａ
ｉ，Ｔ．ら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ−ｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，９５８，１３４−１３８；Ｔａｉ，
Ｔ．ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０３，６
８２−６８７；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら（１９９０）
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２，１７
５７−１７６０；Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｍ．（１９９０）
特許番号第４，９６５，１９８；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，
Ｉ．ら（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ２９，６２５−６３２；Ｋｏｔａｎｉ，Ｍ．
ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，１１１７，９７−１０３］。
るマウス抗−ガングリオシドｍＡｂおよびヒトｍＡｂが
これまでに得られている。これらの大部分は、ＩｇＭお
よびＩｇＧ３サブクラスに属する［Ｐｕｋｅｌ，Ｃ．
Ｓ．ら（１９８２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５５，１１
３３−１１４７；Ｃａｈａｎ，Ｌ．Ｄ．ら（１９８２）
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７
９，７６２９−７６３３；Ｉｒｉｅ，Ｒ．Ｆ．ら（１９
８２），７９，５６６６−５６７０；Ｔａｉ，Ｔ．ら
（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，８０，５３９２−５３９６；Ｈｉｒａ−ｂａｙ
ａｓｈｉ，Ｙ．ら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６０，１３３２８−１３３３３；Ｃｈｅｕｎ
ｇ，Ｎ．Ｋ．Ｖ．ら（１９８５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．４５，２６４２；Ｎａｔｏｌｉ，Ｅ．Ｊ．ら（１９
８６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６，４１１６−４１２
０；Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．＆ Ｓｈｕｌｚ，Ｇ．（１
９８６）ＷＯ８６／００９０９；Ｍｉｙａｋｅ，Ｍ．ら
（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８，６１５４−
６１６０；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら（１９８８）Ｉ
ｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４１，２６７−２７４；Ｔａ
ｉ，Ｔ．ら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏ−ｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ，９５８，１３４−１３８；Ｔａｉ，
Ｔ．ら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０３，６
８２−６８７；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓ．ら（１９９０）
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８２，１７
５７−１７６０；Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｍ．（１９９０）
特許番号第４，９６５，１９８；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，
Ｉ．ら（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ ２９，６２５−６３２；Ｋｏｔａｎｉ，Ｍ．
ら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ
ｔａ，１１１７，９７−１０３］。
【０００８】これまでに、マウス抗ガングリオシドｍＡ
ｂは、受動腫瘍免疫療法のために、それらの特異性およ
びサブクラスについて選択されてきた。ＧＤ３およびＧ
Ｄ２ガングリオシドに対するＩｇＧ３マウスｍＡｂはそ
れぞれ、メラノーマおよび神経芽腫患者の処置の臨床試
験に使用され、結果は有望であったにもかかわらず、少
数の患者に完全または部分的緩解が得られたのみであっ
た［Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．ら（１９８５）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２
４２；Ｄｉｐｐｏｌｄ，Ｗ．Ｇ．ら（１９８８）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４，
８６５；Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら（１９８８）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６，１６３６；Ｓａｌｅ
ｈ，Ｍ．Ｎ．ら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５
２，４３３２−４３４７］。
ｂは、受動腫瘍免疫療法のために、それらの特異性およ
びサブクラスについて選択されてきた。ＧＤ３およびＧ
Ｄ２ガングリオシドに対するＩｇＧ３マウスｍＡｂはそ
れぞれ、メラノーマおよび神経芽腫患者の処置の臨床試
験に使用され、結果は有望であったにもかかわらず、少
数の患者に完全または部分的緩解が得られたのみであっ
た［Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．ら（１９８５）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２
４２；Ｄｉｐｐｏｌｄ，Ｗ．Ｇ．ら（１９８８）Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４，
８６５；Ｖａｄｈａｎ−Ｒａｊ，Ｓ．ら（１９８８）
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．６，１６３６；Ｓａｌｅ
ｈ，Ｍ．Ｎ．ら（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５
２，４３３２−４３４７］。
【０００９】特異的抗ガングリオシドｍＡｂ（自己Ｔ−
非依存性抗原）の免疫調節性は検討されたことがない。
すなわち、この事実は、腫瘍免疫療法のための抗体の選
択に際しては考慮されなかった。自己認識現象は免疫応
答を調節する機構に関与する。これらの大部分は抗体お
よびリンパ球イディオタイプの認識によって仲介される
すなわち、自己抗原の認識は、イディオタイプネットワ
ークの動的平衡によって調節されている［Ｋａｔｚ，
Ｄ．Ｈ．（１９７８）Ｃｅｌｌ−Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｓ．Ｇ．Ｃｕｒｔｉｓ編，Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，４１１１頁；Ｚｅｎｅｔｔｉ，Ｍ．
（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ６，２
９９；Ｍａｒｔｉｎｅｓｚ，Ａ．Ｃ．ら（１９８８）Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １０１，１
９１−２１５］。
非依存性抗原）の免疫調節性は検討されたことがない。
すなわち、この事実は、腫瘍免疫療法のための抗体の選
択に際しては考慮されなかった。自己認識現象は免疫応
答を調節する機構に関与する。これらの大部分は抗体お
よびリンパ球イディオタイプの認識によって仲介される
すなわち、自己抗原の認識は、イディオタイプネットワ
ークの動的平衡によって調節されている［Ｋａｔｚ，
Ｄ．Ｈ．（１９７８）Ｃｅｌｌ−Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｏｇ
ｎｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｓ．Ｇ．Ｃｕｒｔｉｓ編，Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａ
ｍｂｒｉｄｇｅ，４１１１頁；Ｚｅｎｅｔｔｉ，Ｍ．
（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ６，２
９９；Ｍａｒｔｉｎｅｓｚ，Ａ．Ｃ．ら（１９８８）Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ １０１，１
９１−２１５］。
【００１０】天然の抗体およびそれらの相互作用の研究
から、高度に連結し、広範囲に分布した可変領域ネット
ワークの存在に関する知識が得られた。これらのネット
ワークは、古典的なβ抗−イディオタイプワクチンの概
念の基盤（内部イメージ）を構成する抗原調節「イディ
オタイプカスケード」とは異なる［Ｋａｚａｔｃｈｋｉ
ｎｅ，Ｍ．Ｄ．＆ Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ａ．（１９９
３）］。抗−ガングリオシドｍＡｂに対するβ抗−イデ
ィオタイプｍＡｂは、能動腫瘍免疫療法に使用するため
に発生されている［Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９０）
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２，１７５
７−１７６０；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．＆ Ｈｏｕｇ
ｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．８８，１８６−１９２］。
から、高度に連結し、広範囲に分布した可変領域ネット
ワークの存在に関する知識が得られた。これらのネット
ワークは、古典的なβ抗−イディオタイプワクチンの概
念の基盤（内部イメージ）を構成する抗原調節「イディ
オタイプカスケード」とは異なる［Ｋａｚａｔｃｈｋｉ
ｎｅ，Ｍ．Ｄ．＆ Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ａ．（１９９
３）］。抗−ガングリオシドｍＡｂに対するβ抗−イデ
ィオタイプｍＡｂは、能動腫瘍免疫療法に使用するため
に発生されている［Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９０）
Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２，１７５
７−１７６０；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．＆ Ｈｏｕｇ
ｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．（１９９１）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ
ｅｓｔ．８８，１８６−１９２］。
【００１１】しかしながら、抗原の内部イメージの特徴
のみに基づいた抗−イディオタイプｍＡｂの選択は免疫
療法には適当でないことが報告されている。一つのイデ
ィオタイプのレベルの疾患の進行および退行との相関に
基づく抗−イディオタイプの選択が適当な抗−イディオ
タイプ免疫療法の設計に重要である［Ｋｏｈｌｅｒ，
Ｈ．（１９８９）ＷＯ８９／０５３０９］。
のみに基づいた抗−イディオタイプｍＡｂの選択は免疫
療法には適当でないことが報告されている。一つのイデ
ィオタイプのレベルの疾患の進行および退行との相関に
基づく抗−イディオタイプの選択が適当な抗−イディオ
タイプ免疫療法の設計に重要である［Ｋｏｈｌｅｒ，
Ｈ．（１９８９）ＷＯ８９／０５３０９］。
【００１２】異なる抗原モデルにおいて、ハプテンおよ
び自己抗原に対する抗体上に存在するある種のイディオ
タイプの調節的役割が明らかにされている。これらは、
特異的抗原の不存在下には、Ｂ細胞およびＴ細胞ネット
ワークの両者を活性化する性質を有し、それらが刺激す
るＴ−細胞集団に依存する抗体応答の免疫サプレッサー
またはスティミュレーターとして作用する［Ｔｅｉｔｅ
ｌｂａｕｍ，Ｄ．ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ−ｌ
ｏｇｙ １３２，１２８２−１２８５；Ｚａｎｅｔｔ
ｉ，Ｍ．ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
３７，３１４０−３１４６；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら
（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４０，３２２
６−３２７２；Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４５，２０２−２０８；
Ｆｕｒｕｙａ，Ａら（１９９２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．１２，２７−３２］
び自己抗原に対する抗体上に存在するある種のイディオ
タイプの調節的役割が明らかにされている。これらは、
特異的抗原の不存在下には、Ｂ細胞およびＴ細胞ネット
ワークの両者を活性化する性質を有し、それらが刺激す
るＴ−細胞集団に依存する抗体応答の免疫サプレッサー
またはスティミュレーターとして作用する［Ｔｅｉｔｅ
ｌｂａｕｍ，Ｄ．ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ−ｌ
ｏｇｙ １３２，１２８２−１２８５；Ｚａｎｅｔｔ
ｉ，Ｍ．ら（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １
３７，３１４０−３１４６；Ｐｏｗｅｌｌ，Ｔ．Ｊ．ら
（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１４０，３２２
６−３２７２；Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ｇ．（１９９０）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４５，２０２−２０８；
Ｆｕｒｕｙａ，Ａら（１９９２）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．１２，２７−３２］
【００１３】いわゆるリカレントなイディオタイプは、
すべてのイディオタイプネットワーク回路を活性化し、
抗原の不存在下に抗体応答を発生できるイディオタイプ
である。これらのイディオタイプはヘルパーＴ細胞を刺
激できることが示唆されている［Ｆｏｒｎｉ，Ｌ．ら
（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７７，１１２５−１１２８；Ｈｏｌｍｂｅｒ
ｇ，Ｄ．ら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１６
２，５６−６５；Ｉｖａｒｓ，Ｆ．ら（１９８３）Ｓｃ
ａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，２３１−２４
０］。
すべてのイディオタイプネットワーク回路を活性化し、
抗原の不存在下に抗体応答を発生できるイディオタイプ
である。これらのイディオタイプはヘルパーＴ細胞を刺
激できることが示唆されている［Ｆｏｒｎｉ，Ｌ．ら
（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，７７，１１２５−１１２８；Ｈｏｌｍｂｅｒ
ｇ，Ｄ．ら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．１６
２，５６−６５；Ｉｖａｒｓ，Ｆ．ら（１９８３）Ｓｃ
ａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，２３１−２４
０］。
【００１４】本発明の新規性は、これらの抗原に対する
免疫応答を刺激できるイディオタイプ（リカレントなイ
ディオタイプ）を有する特異的抗−ガングリオシド抗体
の発生ならびに選択にある。これらは、上記ガングリオ
シドが現れる腫瘍を有する患者の特異的能動免疫療法
に、また上述の性質を有するこれらの抗ガングリオシド
ｍＡｂに対する抗−イディオタイプｍＡｂの発生に使用
することができる。
免疫応答を刺激できるイディオタイプ（リカレントなイ
ディオタイプ）を有する特異的抗−ガングリオシド抗体
の発生ならびに選択にある。これらは、上記ガングリオ
シドが現れる腫瘍を有する患者の特異的能動免疫療法
に、また上述の性質を有するこれらの抗ガングリオシド
ｍＡｂに対する抗−イディオタイプｍＡｂの発生に使用
することができる。
【００１５】要約：抗ガングリオシドモノクローナル抗
体および悪性腫瘍の特異的能動免疫療法におけるそれら
の使用 本発明は、免疫学の分野、とくにガングリオシド（Ａｂ
１’）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発生お
よび選択に関し、これらの抗体は、これらの抗原に対し
て特異的で、リカレントなイディオタイプを有し、これ
らの抗原に対する免疫応答の免疫調節剤として価値を有
する。さらに、本発明は上記抗ガングリオシドｍＡｂで
免疫処置することによる抗−イディオタイプｍＡｂ（Ａ
ｂ２）を得ることに関する。
体および悪性腫瘍の特異的能動免疫療法におけるそれら
の使用 本発明は、免疫学の分野、とくにガングリオシド（Ａｂ
１’）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発生お
よび選択に関し、これらの抗体は、これらの抗原に対し
て特異的で、リカレントなイディオタイプを有し、これ
らの抗原に対する免疫応答の免疫調節剤として価値を有
する。さらに、本発明は上記抗ガングリオシドｍＡｂで
免疫処置することによる抗−イディオタイプｍＡｂ（Ａ
ｂ２）を得ることに関する。
【００１６】したがって、本発明の目的は、抗原の不存
在下に抗原特異的応答の誘導が可能なイディオタイプ
（Ａｂ１’）抗ガングリオシドｍＡｂ（Ａｂ１）および
その発生方法を提供することにある。本発明の他の目的
は、上述の性質を有しまたＡｂ１’応答を産生できる抗
ガングリオシドによる免疫処置によって発生される抗−
イディオタイプｍＡｂ（Ａｂ２）を提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、特異的抗ガングリオシ
ドｍＡｂ（Ａｂ１）を発生させ、この抗体でマウスおよ
び他の種を免疫処置し、抗原特異的応答を発生できる抗
体（Ａｂ１’）を選択し、上述の抗ガングリオシドｍＡ
ｂによるマウスまたは他の動物種の免疫処置によって抗
−イディオタイプｍＡｂを発生させることからなる。
在下に抗原特異的応答の誘導が可能なイディオタイプ
（Ａｂ１’）抗ガングリオシドｍＡｂ（Ａｂ１）および
その発生方法を提供することにある。本発明の他の目的
は、上述の性質を有しまたＡｂ１’応答を産生できる抗
ガングリオシドによる免疫処置によって発生される抗−
イディオタイプｍＡｂ（Ａｂ２）を提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、特異的抗ガングリオシ
ドｍＡｂ（Ａｂ１）を発生させ、この抗体でマウスおよ
び他の種を免疫処置し、抗原特異的応答を発生できる抗
体（Ａｂ１’）を選択し、上述の抗ガングリオシドｍＡ
ｂによるマウスまたは他の動物種の免疫処置によって抗
−イディオタイプｍＡｂを発生させることからなる。
【００１７】ここで用いられる抗体の語は、類似の抗原
結合性を有するそのフラグメント、誘導体等も意図して
用いられることを理解すべきである。誘導体および／ま
たはフラグメントに到達する多くの方法が本技術分野に
おいて知られている。誘導体および／またはフラグメン
トの製造方法には、それらに限定されるものではない
が、化学的切断および／または（再）アッセンブリー、
単一鎖抗体および／または分子認識ユニット（ＭＲＵ）
の組換え製造、ＣＤＲ−グラフト、クラススイッチ等が
包含される。
結合性を有するそのフラグメント、誘導体等も意図して
用いられることを理解すべきである。誘導体および／ま
たはフラグメントに到達する多くの方法が本技術分野に
おいて知られている。誘導体および／またはフラグメン
トの製造方法には、それらに限定されるものではない
が、化学的切断および／または（再）アッセンブリー、
単一鎖抗体および／または分子認識ユニット（ＭＲＵ）
の組換え製造、ＣＤＲ−グラフト、クラススイッチ等が
包含される。
【００１８】発明の詳細な説明 ガングリオシドの単離 ガングリオシドは既知の天然原料からＨａｋｏｍｏｒｉ
の技術［ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．ら（１９７４）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３２巻，Ｂ
部，３５０頁］の改良によって得られた。
の技術［ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．ら（１９７４）Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３２巻，Ｂ
部，３５０頁］の改良によって得られた。
【００１９】リポソーム小胞の調製 ガングリオシド含有リポソーム構造はＤＰＰＣおよびコ
レステロールから調製した。既知量のＤＤＰＣとコレス
テロールのクロロホルム溶液を丸底フラスコに加え、リ
ン脂質：コレステロールのモル比が１：１．５〜１：２
であることを確認した。ガングリオシドはクロロホル
ム：メタノール：水（６０：３０：４．５）に溶解して
加え、脂質混合物をガラスビーズの存在下にロータリー
エバポレーターで蒸発させた。
レステロールから調製した。既知量のＤＤＰＣとコレス
テロールのクロロホルム溶液を丸底フラスコに加え、リ
ン脂質：コレステロールのモル比が１：１．５〜１：２
であることを確認した。ガングリオシドはクロロホル
ム：メタノール：水（６０：３０：４．５）に溶解して
加え、脂質混合物をガラスビーズの存在下にロータリー
エバポレーターで蒸発させた。
【００２０】大部分の溶媒を除去したのち、薄い脂質膜
を約３０分間真空下に保持する。脂質の水和は、脂質濃
度が２〜１０ｍｇ／ｍｌの間になる容量のＰＢＳ溶液中
で実施する。最終プレパレーション中、ＤＤＰＣおよび
コレステロールとガングリオシドの比は、モル比で４
０：１〜２０：１に保持される。破傷風トキソイド毒素
を含有するリポソームプレパレーションでは、後者を最
終濃度０５〜１ｍｇ／ｍｌになるように加える。懸濁液
を超音波浴中、１分間隔で５〜１０分間、超音波処理す
る。リポソームプレパレーションを４５℃で絶えず撹拌
しながら、３０〜６０分間インキュベートする。必要な
場合は、被膜に包まれていない蛋白質を、１×６５Ｃｍ
のセファロースカラムＣＬ−４Ｂを用い流速約２０ｃｍ
／ｈでゲルろ過して除去する。溶出はＰＢＳ中で行い、
１．５ｍｌの分画を集める。
を約３０分間真空下に保持する。脂質の水和は、脂質濃
度が２〜１０ｍｇ／ｍｌの間になる容量のＰＢＳ溶液中
で実施する。最終プレパレーション中、ＤＤＰＣおよび
コレステロールとガングリオシドの比は、モル比で４
０：１〜２０：１に保持される。破傷風トキソイド毒素
を含有するリポソームプレパレーションでは、後者を最
終濃度０５〜１ｍｇ／ｍｌになるように加える。懸濁液
を超音波浴中、１分間隔で５〜１０分間、超音波処理す
る。リポソームプレパレーションを４５℃で絶えず撹拌
しながら、３０〜６０分間インキュベートする。必要な
場合は、被膜に包まれていない蛋白質を、１×６５Ｃｍ
のセファロースカラムＣＬ−４Ｂを用い流速約２０ｃｍ
／ｈでゲルろ過して除去する。溶出はＰＢＳ中で行い、
１．５ｍｌの分画を集める。
【００２１】リポソームプレパレーションの特性 ａ）リポソーム小胞中におけるガングリオシドの固定化
の評価 リポソーム膜中のガングリオシドの量は、前述のように
して調製し１４Ｃ（１〜２μＣｉ）で標識したガングリ
オシドを含むリポソーム懸濁液０．５〜１ｍｌを用い、
１．５×５０ｃｍカラム中セファロース４Ｂにより流速
約７ｃｍ／ｈでゲルろ過クロマトグラフィーを実施して
評価する。溶出はＰＢＳで行い、１ｍｌの分画を集め
る。３５０〜５００ｎｍの間の吸光度の変動のコントロ
ールによりクロマトグラフィー像中のリポソームおよび
ミセルの検出が可能となり、一方各分画中のｃｐｍの測
定によりリポソームプレパレーション中に結合したガン
グリオシドの％の評価が可能になり、これは２０〜８０
％である。
の評価 リポソーム膜中のガングリオシドの量は、前述のように
して調製し１４Ｃ（１〜２μＣｉ）で標識したガングリ
オシドを含むリポソーム懸濁液０．５〜１ｍｌを用い、
１．５×５０ｃｍカラム中セファロース４Ｂにより流速
約７ｃｍ／ｈでゲルろ過クロマトグラフィーを実施して
評価する。溶出はＰＢＳで行い、１ｍｌの分画を集め
る。３５０〜５００ｎｍの間の吸光度の変動のコントロ
ールによりクロマトグラフィー像中のリポソームおよび
ミセルの検出が可能となり、一方各分画中のｃｐｍの測
定によりリポソームプレパレーション中に結合したガン
グリオシドの％の評価が可能になり、これは２０〜８０
％である。
【００２２】ｂ）リポソーム構造中に包まれた蛋白質％
の測定１２５ Ｉ（１〜２μＣｉ）で標識した蛋白質を含有する
非遠心分離リポソームプレパレーション０．５〜１ｍｌ
を用いて、１．５×５０ｃｍカラム中セファデックスＧ
−５０により流速約７ｃｍ／ｈでゲルろ過クロマトグラ
フィーを実施した。溶出はＰＢＳで行い、１ｍｌの分画
を集める。各分画中の６００ｎｍにおける濁度およびｃ
ｐｍの評価により、さらに上記構造中のリポソーム小胞
の存在の検出および包まれた蛋白質の概算％の評価が可
能になる。包まれた蛋白質の量は常に１０％未満であ
る。
の測定１２５ Ｉ（１〜２μＣｉ）で標識した蛋白質を含有する
非遠心分離リポソームプレパレーション０．５〜１ｍｌ
を用いて、１．５×５０ｃｍカラム中セファデックスＧ
−５０により流速約７ｃｍ／ｈでゲルろ過クロマトグラ
フィーを実施した。溶出はＰＢＳで行い、１ｍｌの分画
を集める。各分画中の６００ｎｍにおける濁度およびｃ
ｐｍの評価により、さらに上記構造中のリポソーム小胞
の存在の検出および包まれた蛋白質の概算％の評価が可
能になる。包まれた蛋白質の量は常に１０％未満であ
る。
【００２３】ガングリオシドに対する抗体応答（Ａｂ
１）を発生させるための免疫操作 マウスおよび他の哺乳動物種を、１用量あたり２０〜５
０μｇのガングリオシドを含有するリポソームプレパレ
ーションで免疫する。蛋白質を含むプレパレーション
も、５〜１０μｇ／用量を添加する。免疫処置期間前お
よび期間中、動物の血清サンプルを採取して、抗原とし
て用いたガングリオシドに対して動物に発生した抗体力
価を、抗原−抗体反応を検出する任意の既知方法でモニ
タリングする。最初の免疫用量の投与３日前に、動物に
低用量のシクロフォスファミド（動物の体重１ｋｇあた
り１５ｍｇ）を注射してサプレッサー細胞の活性を低下
させた［Ｌｉｖｉｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．ら（１９８７）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１，２６０１；Ｈｏｏ，Ｄ．
Ｓ．Ｂ．ら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５
０，５３５８−５３５４］。
１）を発生させるための免疫操作 マウスおよび他の哺乳動物種を、１用量あたり２０〜５
０μｇのガングリオシドを含有するリポソームプレパレ
ーションで免疫する。蛋白質を含むプレパレーション
も、５〜１０μｇ／用量を添加する。免疫処置期間前お
よび期間中、動物の血清サンプルを採取して、抗原とし
て用いたガングリオシドに対して動物に発生した抗体力
価を、抗原−抗体反応を検出する任意の既知方法でモニ
タリングする。最初の免疫用量の投与３日前に、動物に
低用量のシクロフォスファミド（動物の体重１ｋｇあた
り１５ｍｇ）を注射してサプレッサー細胞の活性を低下
させた［Ｌｉｖｉｎｓｔｏｎ，Ｐ．Ｏ．ら（１９８７）
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１，２６０１；Ｈｏｏ，Ｄ．
Ｓ．Ｂ．ら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５
０，５３５８−５３５４］。
【００２４】動物は様々な用量のリポソームプレパレー
ションによって、３〜４日から１週の間隔で免疫するこ
とができる。リポソームプレパレーションは、０．１〜
０．２ｍｌの容量で皮下に投与する。他の可能な免疫経
路は静脈内および腹腔内である。５〜９累積用量のリポ
ソームプレパレーションを短時間間隔で投与された動物
は、抗原として用いたガングリオシドに対する抗体応答
を発現する。
ションによって、３〜４日から１週の間隔で免疫するこ
とができる。リポソームプレパレーションは、０．１〜
０．２ｍｌの容量で皮下に投与する。他の可能な免疫経
路は静脈内および腹腔内である。５〜９累積用量のリポ
ソームプレパレーションを短時間間隔で投与された動物
は、抗原として用いたガングリオシドに対する抗体応答
を発現する。
【００２５】特異的抗ガングリオシドモノクローナル抗
体（ｍＡｂ）の製造 ガングリオシドに対する血清抗体力価を有するマウス
に、リポソームプレパレーションによって新たな免疫処
置を行い、３日後に抗体産生細胞を得る。脾臓細胞の使
用が好ましいが、他の抗体産生細胞も選択できる。これ
らの細胞を、インビトロおよびインビボ増殖性のハイブ
リッド細胞またはハイブリドーマを与えるミエローマ細
胞と融合させる。細胞融合は既知の任意の方法で実施で
きる。ハイブリドーマによって産生される抗体につい
て、イムノアッセイ法により、好ましくは、ハイブリド
ーマ上清をガングリオシドと反応させ、抗原−抗体結合
を適当な条件下で抗体に結合できる第二の酵素標識抗体
を用いて検出するイムノ酵素アッセイによって試験す
る。
体（ｍＡｂ）の製造 ガングリオシドに対する血清抗体力価を有するマウス
に、リポソームプレパレーションによって新たな免疫処
置を行い、３日後に抗体産生細胞を得る。脾臓細胞の使
用が好ましいが、他の抗体産生細胞も選択できる。これ
らの細胞を、インビトロおよびインビボ増殖性のハイブ
リッド細胞またはハイブリドーマを与えるミエローマ細
胞と融合させる。細胞融合は既知の任意の方法で実施で
きる。ハイブリドーマによって産生される抗体につい
て、イムノアッセイ法により、好ましくは、ハイブリド
ーマ上清をガングリオシドと反応させ、抗原−抗体結合
を適当な条件下で抗体に結合できる第二の酵素標識抗体
を用いて検出するイムノ酵素アッセイによって試験す
る。
【００２６】所望のハイブリドーマが選択され少なくと
も２回クローン化（すなわち、限界希釈法）されたなら
ば、得られたｍＡｂは適当な培地中で適当な時間インビ
トロで培養させ、ついで上清から所望の抗体を回収する
ことによって製造できる。選択される培地および適当な
培養時間は既知であるかまたは容易に決定できる。
も２回クローン化（すなわち、限界希釈法）されたなら
ば、得られたｍＡｂは適当な培地中で適当な時間インビ
トロで培養させ、ついで上清から所望の抗体を回収する
ことによって製造できる。選択される培地および適当な
培養時間は既知であるかまたは容易に決定できる。
【００２７】他の製造方法には、動物（すなわち同系マ
ウス）にハイブリドーマを注射する方法がある。ハイブ
リドーマは非固形腫瘍の形成を生じ、これが宿主動物の
血流および腹腔内滲出液（腹水）中に高濃度の所望の抗
体を産生させることになる。得られたｍＡｂは異なるガ
ングリオシドに対して異なる特異性を有する。
ウス）にハイブリドーマを注射する方法がある。ハイブ
リドーマは非固形腫瘍の形成を生じ、これが宿主動物の
血流および腹腔内滲出液（腹水）中に高濃度の所望の抗
体を産生させることになる。得られたｍＡｂは異なるガ
ングリオシドに対して異なる特異性を有する。
【００２８】抗ガングリオシドｍＡｂに対する抗イディ
オタイプ（Ａｂ２）および抗−抗−イディオタイプ（Ａ
ｂ１’）抗体応答を得るための免疫操作マウスおよび他
の哺乳動物種を、２５〜２００μｇ用量の精製抗−ガン
グリオシドｍＡｂにより、アジュバントの存在下または
非存在下に、また所望により輸送蛋白質とカップリング
させて、免疫処置する。動物に抗ガングリオシドｍＡｂ
の３〜６用量を、各用量間に１５〜３０日の間隔を置い
て投与する。可能な免疫経路は腹腔内、皮下、静脈内お
よびこれらの組合わせである。
オタイプ（Ａｂ２）および抗−抗−イディオタイプ（Ａ
ｂ１’）抗体応答を得るための免疫操作マウスおよび他
の哺乳動物種を、２５〜２００μｇ用量の精製抗−ガン
グリオシドｍＡｂにより、アジュバントの存在下または
非存在下に、また所望により輸送蛋白質とカップリング
させて、免疫処置する。動物に抗ガングリオシドｍＡｂ
の３〜６用量を、各用量間に１５〜３０日の間隔を置い
て投与する。可能な免疫経路は腹腔内、皮下、静脈内お
よびこれらの組合わせである。
【００２９】免疫処置期間前および期間中、動物の血清
サンプルを採取して、既知の任意のイムノアッセイ法で
Ａｂ２およびＡｂ１’抗体レベルを測定する。動物血清
希釈液を、免疫原として用いた抗−ガングリオシドｍＡ
ｂまたは免疫処置プロトコールに用いなかった他の抗ガ
ングリオシドｍＡｂもしくはガングリオシドとともにイ
ンキュベートする。免疫処置した動物の血清が免疫原と
して用いた抗−ガングリオシドｍＡｂのその抗原への結
合を遮断する能力を決定する実験も行った。すなわち、
抗−イディオタイプ応答（Ａｂ２）を発生するイディオ
タイプネットワークに連結し、抗原の不存在下に抗−抗
−イディオタイプ応答（Ａｂ１’）を産生できるそれら
の特異的抗−ガングリオシドｍＡｂを選択した。換言す
れば、抗−ガングリオシド免疫応答を刺激できるイディ
オタイプ（リカレントなイディオタイプ）をもつ抗−ガ
ングリオシドｍＡｂを選択した。
サンプルを採取して、既知の任意のイムノアッセイ法で
Ａｂ２およびＡｂ１’抗体レベルを測定する。動物血清
希釈液を、免疫原として用いた抗−ガングリオシドｍＡ
ｂまたは免疫処置プロトコールに用いなかった他の抗ガ
ングリオシドｍＡｂもしくはガングリオシドとともにイ
ンキュベートする。免疫処置した動物の血清が免疫原と
して用いた抗−ガングリオシドｍＡｂのその抗原への結
合を遮断する能力を決定する実験も行った。すなわち、
抗−イディオタイプ応答（Ａｂ２）を発生するイディオ
タイプネットワークに連結し、抗原の不存在下に抗−抗
−イディオタイプ応答（Ａｂ１’）を産生できるそれら
の特異的抗−ガングリオシドｍＡｂを選択した。換言す
れば、抗−ガングリオシド免疫応答を刺激できるイディ
オタイプ（リカレントなイディオタイプ）をもつ抗−ガ
ングリオシドｍＡｂを選択した。
【００３０】リカレントなイディオタイプをもつ抗−ガ
ングリオシドｍＡｂに対する抗−イディオタイプｍＡｂ
の産生 抗ガングリオシドＡｂ２抗体の高力価を有するマウス
を、免疫原として用いたｍＡｂにより再免疫処置し、３
日後に抗体産生細胞を得て、前述のようにしてミエロー
マ細胞と融合させる。融合によって得られたハイブリド
ーマ上清について、既知の任意のイムノアッセイ法によ
り試験する。上清を、免疫原として用いたｍＡｂおよび
免疫処置に用いなかった他の抗−ガングリオシドｍＡｂ
とインキュベートする。ハイブリドーマ上清が、免疫原
として用いた抗−ガングリオシドｍＡｂのその抗原への
結合を遮断する能力を、上清を適当な希釈度の抗−ガン
グリオシドｍＡｂとインキュベートし、ついで上記抗体
をその抗原とインキュベートすることによって測定す
る。選択されたハイブリドーマを少なくとも２回クロー
ン化し、得られたｍＡｂをインビトロおよびインビボで
産生させる。得られた抗−イディオタイプｍＡｂは抗−
ガングリオシドｍＡｂを認識し、所望により抗−ガング
リオシドｍＡｂのその抗原への結合を遮断する能力をも
たせることが可能である（β型）。
ングリオシドｍＡｂに対する抗−イディオタイプｍＡｂ
の産生 抗ガングリオシドＡｂ２抗体の高力価を有するマウス
を、免疫原として用いたｍＡｂにより再免疫処置し、３
日後に抗体産生細胞を得て、前述のようにしてミエロー
マ細胞と融合させる。融合によって得られたハイブリド
ーマ上清について、既知の任意のイムノアッセイ法によ
り試験する。上清を、免疫原として用いたｍＡｂおよび
免疫処置に用いなかった他の抗−ガングリオシドｍＡｂ
とインキュベートする。ハイブリドーマ上清が、免疫原
として用いた抗−ガングリオシドｍＡｂのその抗原への
結合を遮断する能力を、上清を適当な希釈度の抗−ガン
グリオシドｍＡｂとインキュベートし、ついで上記抗体
をその抗原とインキュベートすることによって測定す
る。選択されたハイブリドーマを少なくとも２回クロー
ン化し、得られたｍＡｂをインビトロおよびインビボで
産生させる。得られた抗−イディオタイプｍＡｂは抗−
ガングリオシドｍＡｂを認識し、所望により抗−ガング
リオシドｍＡｂのその抗原への結合を遮断する能力をも
たせることが可能である（β型）。
【００３１】α型抗−イディオタイプｍＡｂを用いガン
グリオシドに対する抗体応答を得るための免疫操作 マウスおよび他の哺乳動物を、α抗−イディオタイプｍ
Ａｂを用いて免疫処置する。これらのｍＡｂは免疫原と
して使用する前に輸送蛋白質とカップリングさせること
ができる。各動物にα抗−イディオタイプｍＡｂ２５〜
２００μｇの３〜５用量を、各用量間に１５〜３０日の
間隔を置いて投与する。免疫経路は腹腔内、皮下、静脈
内またはこれらの組合わせである。
グリオシドに対する抗体応答を得るための免疫操作 マウスおよび他の哺乳動物を、α抗−イディオタイプｍ
Ａｂを用いて免疫処置する。これらのｍＡｂは免疫原と
して使用する前に輸送蛋白質とカップリングさせること
ができる。各動物にα抗−イディオタイプｍＡｂ２５〜
２００μｇの３〜５用量を、各用量間に１５〜３０日の
間隔を置いて投与する。免疫経路は腹腔内、皮下、静脈
内またはこれらの組合わせである。
【００３２】免疫処置プロトコール期間前および期間
中、動物の血清サンプルを採取して、既知の任意のイム
ノアッセイ法を用いて異なるガングリオシドに対する血
清抗体力価をモニタリングする。イディオタイプネット
ワークに高度に連結した抗−ガングリオシドｍＡｂで免
疫処置して産生させたα抗−イディオタイプｍＡｂの動
物への投与は、ガングリオシドに対する抗体応答（Ａｂ
１’）を発生するワクチン効果を誘導できる。
中、動物の血清サンプルを採取して、既知の任意のイム
ノアッセイ法を用いて異なるガングリオシドに対する血
清抗体力価をモニタリングする。イディオタイプネット
ワークに高度に連結した抗−ガングリオシドｍＡｂで免
疫処置して産生させたα抗−イディオタイプｍＡｂの動
物への投与は、ガングリオシドに対する抗体応答（Ａｂ
１’）を発生するワクチン効果を誘導できる。
【００３３】例１ 非定型免疫プロトコール：短時間イ
ンターバルおよび累積高用量によるＮｅｕＡｃＧＭ２に
応答する抗体（Ａｂ１）の産生 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス、６−８週令にリン酸バッファー
生理食塩溶液（ＰＢＳ）中のシクロホスホアミド（１５
ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｐ．Ｏ．他（１９８３）、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３１，２６０１；Ｈｏｏ，Ｄ．Ｓ．Ｂ．他（１９
９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，５３５８）。３日
後、このマウスに０．２ｍＬ ＰＢＳ中に５０μｇのＮ
ｅｕＡｃＧＭ２を含有するリポソーム調整液を皮下投与
して免疫感作した。
ンターバルおよび累積高用量によるＮｅｕＡｃＧＭ２に
応答する抗体（Ａｂ１）の産生 雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス、６−８週令にリン酸バッファー
生理食塩溶液（ＰＢＳ）中のシクロホスホアミド（１５
ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏ
ｎ，Ｐ．Ｏ．他（１９８３）、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３１，２６０１；Ｈｏｏ，Ｄ．Ｓ．Ｂ．他（１９
９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０，５３５８）。３日
後、このマウスに０．２ｍＬ ＰＢＳ中に５０μｇのＮ
ｅｕＡｃＧＭ２を含有するリポソーム調整液を皮下投与
して免疫感作した。
【００３４】３−４日間隔で５用量、次いで週単位でさ
らに４用量、合計累積用量４５０μｇをマウスに投与し
た。マウス血清サンプルは免疫感作開始前と５回目と９
回目の投与後１週間に採取した。マウス血清中の抗体濃
度は以下の方法を用い、固定化ＮｅｕＡｃＧＭ２を有す
るポリビニルクロリド活性化プレート（ＩＣＮ−ＦＬＯ
Ｗ）で行う間接免疫酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により
測定した。
らに４用量、合計累積用量４５０μｇをマウスに投与し
た。マウス血清サンプルは免疫感作開始前と５回目と９
回目の投与後１週間に採取した。マウス血清中の抗体濃
度は以下の方法を用い、固定化ＮｅｕＡｃＧＭ２を有す
るポリビニルクロリド活性化プレート（ＩＣＮ−ＦＬＯ
Ｗ）で行う間接免疫酵素アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により
測定した。
【００３５】メタノール中のＮｅｕＡｃＧＭ２（４μｇ
／ｍＬ）、５０μｌを各ウエルにとり、プレートを３７
℃で１時間放置してメタノールを蒸発させた。次いで、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＲＩＳ
−ＨＣｌバッファー０．０５Ｍ ｐＨ７．８、５０μＬ
／ウエルを加え、プレートを３７℃で３０分インキュベ
ートした。次にＰＢＳ中の希釈血清５０μｌ／ウエルを
加え、プレートを３７℃で９０分間インキュベートし
た。
／ｍＬ）、５０μｌを各ウエルにとり、プレートを３７
℃で１時間放置してメタノールを蒸発させた。次いで、
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＲＩＳ
−ＨＣｌバッファー０．０５Ｍ ｐＨ７．８、５０μＬ
／ウエルを加え、プレートを３７℃で３０分インキュベ
ートした。次にＰＢＳ中の希釈血清５０μｌ／ウエルを
加え、プレートを３７℃で９０分間インキュベートし
た。
【００３６】ウエルをＰＢＳ ２００ｍＬで４回洗浄
し、１５０μＬのアルカリフォスファターゼ、抗マウス
イミュノグロブリンコンジュゲート抗血清を適当に希釈
し、添加した。ＰＢＳで洗浄後ウエルを１００μＬのサ
ブストレートバッファー（ジエタノールアミン希釈ｐ−
ニトロフェニルホスフェートバッファー１ｍｇ／ｍＬｐ
Ｈ９．８）にインキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡ
を用いて４０５ｎｍで測定した。最初の５回の免疫感作
用量を与えた後ではＮｅｕＡｃＧＭ２に応答する抗体は
マウスにみられなかった。免疫感作処理したマウスの５
０％に検出しうる抗体をうるには９回の累積免疫感作用
量が必要であった（図１）。
し、１５０μＬのアルカリフォスファターゼ、抗マウス
イミュノグロブリンコンジュゲート抗血清を適当に希釈
し、添加した。ＰＢＳで洗浄後ウエルを１００μＬのサ
ブストレートバッファー（ジエタノールアミン希釈ｐ−
ニトロフェニルホスフェートバッファー１ｍｇ／ｍＬｐ
Ｈ９．８）にインキュベートした。吸光度をＥＬＩＳＡ
を用いて４０５ｎｍで測定した。最初の５回の免疫感作
用量を与えた後ではＮｅｕＡｃＧＭ２に応答する抗体は
マウスにみられなかった。免疫感作処理したマウスの５
０％に検出しうる抗体をうるには９回の累積免疫感作用
量が必要であった（図１）。
【００３７】例２ ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する抗体応答
（Ａｂ１）の産生 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、シクロホスホア
ミド（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した。３日後
に、０．２ｍＬ中にＮｅｕＧｃＧＭ３ ５０μｇおよび
破傷風トキソイド５μｇ／用量を含有するリポソーム調
整液により第１回免疫感作を行なった。
（Ａｂ１）の産生 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、シクロホスホア
ミド（１５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した。３日後
に、０．２ｍＬ中にＮｅｕＧｃＧＭ３ ５０μｇおよび
破傷風トキソイド５μｇ／用量を含有するリポソーム調
整液により第１回免疫感作を行なった。
【００３８】動物には、３−４日間隔で５用量、次いで
さらに毎週２用量で免疫原性調製液を投与した。この免
疫感作プロトコールの開始前と開始後に、動物血清試料
を採取した。マウス血清中の抗体濃度を例１と同様にし
て測定した。ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する自然の応答を持
たないマウスは、３５０μｇの累積用量までの免疫原の
各種用量を与えられた後に、ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する
抗体を産生した（図２）。
さらに毎週２用量で免疫原性調製液を投与した。この免
疫感作プロトコールの開始前と開始後に、動物血清試料
を採取した。マウス血清中の抗体濃度を例１と同様にし
て測定した。ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する自然の応答を持
たないマウスは、３５０μｇの累積用量までの免疫原の
各種用量を与えられた後に、ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する
抗体を産生した（図２）。
【００３９】例３ ＮｅｕＡｃ−およびＮｅｕＧｃ−含
有モノシアロガングリオシドに対するｍＡｂの産生 例１および２に記載の方法によって、ＮｅｕＡｃＧＭ
１、ＮｅｕＡｃＧＭ２、ＮｅｕＡｃＧＭ３およびＮｅｕ
ＧｃＧＭガングリオシドを含有するリポソーム調製液を
使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫感作することによ
って、モノクローナル抗体を産生させた。
有モノシアロガングリオシドに対するｍＡｂの産生 例１および２に記載の方法によって、ＮｅｕＡｃＧＭ
１、ＮｅｕＡｃＧＭ２、ＮｅｕＡｃＧＭ３およびＮｅｕ
ＧｃＧＭガングリオシドを含有するリポソーム調製液を
使用して、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫感作することによ
って、モノクローナル抗体を産生させた。
【００４０】動物を、各リポソーム調製液により再免疫
感作し、３日後に融合を行なった。その後に、マウス脾
臓を摘出し、この組織をステンレススチール篩に通す
か、または脾臓を灌流させることによって、細胞懸濁液
を調製した。融合は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎにより開示された方法（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄ）２５６、４９５−４９７）を若干変更して
行なった。
感作し、３日後に融合を行なった。その後に、マウス脾
臓を摘出し、この組織をステンレススチール篩に通す
か、または脾臓を灌流させることによって、細胞懸濁液
を調製した。融合は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ
ｉｎにより開示された方法（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄ）２５６、４９５−４９７）を若干変更して
行なった。
【００４１】ＲＰＭＩ−１６４０メジウム中の４２％ポ
リエチレングリコール含有融合メジウム０．５ｍＬ中
で、マウス脾臓細胞と無分泌性マウスミエローマＰ３１
×６３Ａｇ８ ６．５．３とを融合させた。この融合後
に、この細胞を、５％ＣＯ２含水雰囲気で、３７℃にお
いて、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）選択メジウム中で培養した。
リエチレングリコール含有融合メジウム０．５ｍＬ中
で、マウス脾臓細胞と無分泌性マウスミエローマＰ３１
×６３Ａｇ８ ６．５．３とを融合させた。この融合後
に、この細胞を、５％ＣＯ２含水雰囲気で、３７℃にお
いて、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）選択メジウム中で培養した。
【００４２】この融合の１０〜１５日後に、ハイブリド
ーマ上澄液中の抗体の存在を例１に前記したＥＬＩＳＡ
法を用いて評価した。目標のガングリオシドを認識す
る、選ばれたハイブリドーマを、コンディショニング細
胞の存在下に、制限稀釈法により、２回クローン形成し
た。
ーマ上澄液中の抗体の存在を例１に前記したＥＬＩＳＡ
法を用いて評価した。目標のガングリオシドを認識す
る、選ばれたハイブリドーマを、コンディショニング細
胞の存在下に、制限稀釈法により、２回クローン形成し
た。
【００４３】この選ばれたハイブリドーマにより産生さ
れた抗体の特異性を、間接ＥＬＩＳＡ法により、および
またＭａｇｎａｎｉ等により開示された薄層免疫染色
（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）クロマトグラフィ技
法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９．３９９−４０
２、１９８０）の変法により、糖脂質のバッテリィを用
いて測定した。
れた抗体の特異性を、間接ＥＬＩＳＡ法により、および
またＭａｇｎａｎｉ等により開示された薄層免疫染色
（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）クロマトグラフィ技
法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０９．３９９−４０
２、１９８０）の変法により、糖脂質のバッテリィを用
いて測定した。
【００４４】この糖脂質は、高圧薄層クロマトグラフィ
により、クロマトグラフィ溶剤として、クロロホルム／
メタノール／塩化カリウム０．２５％（５０／４０／１
０ｖ／ｖ／ｖ）を用いて分離した。プレートを通気乾燥
させ、次いでヘキサン中の０．５％ポリイソブチルメタ
アクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、英国）により
プラスティック処理した。このプレートは一度乾燥させ
た後に、室温において３０分間、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ
０．０５Ｍ（ｐＨ７．８−８．０）緩衝液中の１％ＢＳ
Ａによりブロックした。
により、クロマトグラフィ溶剤として、クロロホルム／
メタノール／塩化カリウム０．２５％（５０／４０／１
０ｖ／ｖ／ｖ）を用いて分離した。プレートを通気乾燥
させ、次いでヘキサン中の０．５％ポリイソブチルメタ
アクリレート（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｌｔｄ．，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、英国）により
プラスティック処理した。このプレートは一度乾燥させ
た後に、室温において３０分間、ＴＲＩＳ／ＨＣｌ
０．０５Ｍ（ｐＨ７．８−８．０）緩衝液中の１％ＢＳ
Ａによりブロックした。
【００４５】このプレートを次いで、室温で一夜にわた
り、抗ガングリオシドｍＡｂｓ（組織培養上澄液）とと
もにインキュベートした。その後、このプレートをＰＢ
Ｓにより４回洗浄し、次いで１％ＢＳＡ含有ＴＲＩＳ−
ＨＣｌ緩衝液で１：５０００に稀釈したアルカリホスフ
ァターゼ接合抗マウス免疫グロブリン抗血清（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともに、室温で３時間インキ
ュベートした。
り、抗ガングリオシドｍＡｂｓ（組織培養上澄液）とと
もにインキュベートした。その後、このプレートをＰＢ
Ｓにより４回洗浄し、次いで１％ＢＳＡ含有ＴＲＩＳ−
ＨＣｌ緩衝液で１：５０００に稀釈したアルカリホスフ
ァターゼ接合抗マウス免疫グロブリン抗血清（Ｊａｃｋ
ｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）とともに、室温で３時間インキ
ュベートした。
【００４６】このプレートを同様の条件下に洗浄し、次
いで３７℃において１時間、グリシン緩衝液０．１Ｍ、
ｐＨ１０．４、ＺｎＣｌ２ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍ
Ｍに溶解した０．１％ ５′−ブロモ−４′−クロロ−
３′−インドリルホスフェートを含有する基質溶液とと
もにインキュベートした。
いで３７℃において１時間、グリシン緩衝液０．１Ｍ、
ｐＨ１０．４、ＺｎＣｌ２ １ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍ
Ｍに溶解した０．１％ ５′−ブロモ−４′−クロロ−
３′−インドリルホスフェートを含有する基質溶液とと
もにインキュベートした。
【００４７】２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン（ただし、別のアスサイトゲン性（ａｓｃｉｔｏ
ｇｅｎｉｃ）薬物も使用できる）を予め接種したＢａｌ
ｂ／ｃマウスに、腹腔内注射した（０．５−１×１０６
細胞／０．２ｍＬ）。相違するモノシアロガングリオシ
ドを認識する四種のＩｇＭ ｍＡｂｓを得た。この結果
を表１に示す。この表１には、ＥＬＩＳＡおよびＨＰＴ
ＬＣ免疫染色法により予想されたとおりに、相違する糖
脂質に対するＡ３、Ｅ１、Ｐ６およびＰ３の各ｍＡｂｓ
の反応活性が示されている。
デカン（ただし、別のアスサイトゲン性（ａｓｃｉｔｏ
ｇｅｎｉｃ）薬物も使用できる）を予め接種したＢａｌ
ｂ／ｃマウスに、腹腔内注射した（０．５−１×１０６
細胞／０．２ｍＬ）。相違するモノシアロガングリオシ
ドを認識する四種のＩｇＭ ｍＡｂｓを得た。この結果
を表１に示す。この表１には、ＥＬＩＳＡおよびＨＰＴ
ＬＣ免疫染色法により予想されたとおりに、相違する糖
脂質に対するＡ３、Ｅ１、Ｐ６およびＰ３の各ｍＡｂｓ
の反応活性が示されている。
【００４８】
【表１】
【００４９】Ａ３ ｍＡｂはＮｅｕＡｃＧＭ２およびＮ
ｅｕＡｃＧＭ１を優先的に認識し、かつまたＮｅｕＡｃ
ＧＭ３と中程度に反応する。これらのＮｅｕＡｃＧＭ１
−３はいずれも、Ｎ−アセチルシアル酸残基を有する。
（Ａ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインはＥＣ
ＡＣＣ Ｎｏ． として寄託されている）。
ｅｕＡｃＧＭ１を優先的に認識し、かつまたＮｅｕＡｃ
ＧＭ３と中程度に反応する。これらのＮｅｕＡｃＧＭ１
−３はいずれも、Ｎ−アセチルシアル酸残基を有する。
（Ａ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインはＥＣ
ＡＣＣ Ｎｏ． として寄託されている）。
【００５０】Ｎ−アセチルシアル酸残基が付加されてい
る（ＧＤ１ｂまたはＧＤ１ａ）、あるいは欠失している
（Ｇｇ４Ｃｅｒ）糖脂質はＡ３ｍＡｂとは反応しない。
ＮｅｕＡｃＧＭ３ガングリオシドのように、末端ガラク
トサミンが欠けていると、この抗体の反応性は減少され
る。これらの結果を、末端ガラクトースの欠失がＮｅｕ
ＡｃＧＭ２の認識に影響しないという事実に加えると、
Ａ３ｍＡｂにより認識されるエピトープはトリサッカラ
イド配列Ｇａ１ＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−３）
Ｇａ１でありうることが示唆される。
る（ＧＤ１ｂまたはＧＤ１ａ）、あるいは欠失している
（Ｇｇ４Ｃｅｒ）糖脂質はＡ３ｍＡｂとは反応しない。
ＮｅｕＡｃＧＭ３ガングリオシドのように、末端ガラク
トサミンが欠けていると、この抗体の反応性は減少され
る。これらの結果を、末端ガラクトースの欠失がＮｅｕ
ＡｃＧＭ２の認識に影響しないという事実に加えると、
Ａ３ｍＡｂにより認識されるエピトープはトリサッカラ
イド配列Ｇａ１ＮＡｃβ１−４（ＮｅｕＡｃα２−３）
Ｇａ１でありうることが示唆される。
【００５１】Ｅ１ｍＡｂは、ＮｅｕＡｃＧＭ２のみを検
知する高度に制限された結合特異性を示した（このＥ１
抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインはＥＣＡＣＣ
Ｎｏ． として寄託されている）。１個の末
端ガラクトサミンが欠失している糖脂質、すなわちＮｅ
ｕＡｃＧＭ３、あるいは末端ガラクトースが付加されて
いる糖脂質、すなわちＮｅｕＡｃＧＭ１は、このｍＡｂ
により認識されなかった。
知する高度に制限された結合特異性を示した（このＥ１
抗体を産生するハイブリドーマ細胞ラインはＥＣＡＣＣ
Ｎｏ． として寄託されている）。１個の末
端ガラクトサミンが欠失している糖脂質、すなわちＮｅ
ｕＡｃＧＭ３、あるいは末端ガラクトースが付加されて
いる糖脂質、すなわちＮｅｕＡｃＧＭ１は、このｍＡｂ
により認識されなかった。
【００５２】Ｅ１ ｍＡｂはＮ−アセチル基とＮ−グリ
コリル基との間で区別できる。従って、内部ガラクトー
スに結合したＮ−アセチルノイラミン酸および末端ガラ
クトサミンが抗体認識に包含される。Ｆ６ｍＡｂは主と
して、ＮｅｕＡｃＧＭ１と反応し、ＧＤ１ｂを中程度に
認識し、かつまたＧｇ４Ｃｅｒ糖脂質と低反応性を有す
る（このＦ６抗体を産生するハイブリドーマ細胞ライン
はＥＣＡＣＣにＮｏ． として寄託されてい
る）。
コリル基との間で区別できる。従って、内部ガラクトー
スに結合したＮ−アセチルノイラミン酸および末端ガラ
クトサミンが抗体認識に包含される。Ｆ６ｍＡｂは主と
して、ＮｅｕＡｃＧＭ１と反応し、ＧＤ１ｂを中程度に
認識し、かつまたＧｇ４Ｃｅｒ糖脂質と低反応性を有す
る（このＦ６抗体を産生するハイブリドーマ細胞ライン
はＥＣＡＣＣにＮｏ． として寄託されてい
る）。
【００５３】末端ガラクトースが存在していないガング
リオシド（ＧＭ２およびＧＤ２）も、あるいは末端ガラ
クトースに結合したＮ−アセチルノイラミン酸を有する
ＧＤ１ａも、認識しないという事実は、この末端モノサ
ッカライドが抗体への結合に係り重要であることを示唆
している。
リオシド（ＧＭ２およびＧＤ２）も、あるいは末端ガラ
クトースに結合したＮ−アセチルノイラミン酸を有する
ＧＤ１ａも、認識しないという事実は、この末端モノサ
ッカライドが抗体への結合に係り重要であることを示唆
している。
【００５４】さらにまた、内部ガラクトースに結合した
Ｎ−アセチルノイラミン酸を欠失している糖脂質（Ｇｇ
４Ｃｅｒ）は、Ｆ６ｍＡｂと弱い反応性を示すが、この
位置にＮ−アセチルシアル酸残基が付加されると（ＧＭ
１に対してＧＤ１ｂ）、中程度の抗体反応性に変化され
る。
Ｎ−アセチルノイラミン酸を欠失している糖脂質（Ｇｇ
４Ｃｅｒ）は、Ｆ６ｍＡｂと弱い反応性を示すが、この
位置にＮ−アセチルシアル酸残基が付加されると（ＧＭ
１に対してＧＤ１ｂ）、中程度の抗体反応性に変化され
る。
【００５５】これらの事実いづれも、テトラサッカライ
ド構造、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ
Ａｃα２−３）Ｇａｌが抗原認識に包含されることを示
唆している。Ｐ３ｍＡｂは、このガングリオシドの内部
ガラクトースに結合したＮ−グリコリルノイラミン酸に
特異的に結合する。（このＰ３抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞ラインはＥＡＣＣに、No.９４１１３０２６
として寄託されている）。
ド構造、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃβ１−４（Ｎｅｕ
Ａｃα２−３）Ｇａｌが抗原認識に包含されることを示
唆している。Ｐ３ｍＡｂは、このガングリオシドの内部
ガラクトースに結合したＮ−グリコリルノイラミン酸に
特異的に結合する。（このＰ３抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞ラインはＥＡＣＣに、No.９４１１３０２６
として寄託されている）。
【００５６】例４ Ｐ３ ｍＡｂ腫瘍認識 組織を１０％ホルマリン緩衝液中に固定させ、脱水し、
洗浄し、次いでパラフィンに埋め込んだ。ＨｅＥ染色し
た組織切片において、組織病理学的に評価した。以前に
開示された（Ｈｓｕ，Ｓ．Ｍ．およびＲａｉｎｅ，Ｌ，
（１９８１），Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈ
ｅｍ，２９：１３４９−１３５３）、ビオチン ストレ
プタビジン パーオキシダーゼ複合法による免疫染色
に、組織病理学的に評価されている塊からの一連の切片
を使用した。
洗浄し、次いでパラフィンに埋め込んだ。ＨｅＥ染色し
た組織切片において、組織病理学的に評価した。以前に
開示された（Ｈｓｕ，Ｓ．Ｍ．およびＲａｉｎｅ，Ｌ，
（１９８１），Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈ
ｅｍ，２９：１３４９−１３５３）、ビオチン ストレ
プタビジン パーオキシダーゼ複合法による免疫染色
に、組織病理学的に評価されている塊からの一連の切片
を使用した。
【００５７】脱パライン化し、再水和した組織切片を、
３％Ｈ２Ｏ２（メタノール溶液）により３０分間処理し
て、外因性パーオキシダーゼ活性を排除した。これらの
切片を室温で１時間、Ｐ３ ｍＡｂ（組織培養上澄液）
とともにインキュベートした。次いで、ビオチン処理し
た（ｂｉｏｔｉｎｉｌａｔｅｄ）羊抗マウス免疫グロブ
リンとビオチンストレプタビジン パーオキシダーゼ複
合体（ＤＡＫＯＡ／Ｓ）とをそれぞれ室温で３０分間に
わたって添加した。
３％Ｈ２Ｏ２（メタノール溶液）により３０分間処理し
て、外因性パーオキシダーゼ活性を排除した。これらの
切片を室温で１時間、Ｐ３ ｍＡｂ（組織培養上澄液）
とともにインキュベートした。次いで、ビオチン処理し
た（ｂｉｏｔｉｎｉｌａｔｅｄ）羊抗マウス免疫グロブ
リンとビオチンストレプタビジン パーオキシダーゼ複
合体（ＤＡＫＯＡ／Ｓ）とをそれぞれ室温で３０分間に
わたって添加した。
【００５８】インキュベーションの合間に、これらの切
片をＴＲＩＳ塩類緩衝溶液により洗浄した。パーオキシ
ダーゼ反応は、ＴＲＩＳ塩類緩衝液５ｍＬ、３０％Ｈ２
Ｏ２５μＬおよび３，３−ジアミノベンジジン３ｍｇを
含有する溶液を用いて発現させた。スライドを水道水で
洗浄し、メイヤーのヘマトキシハン（Ｍａｙｅｒ’ｓ
Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎｅ）により交差染色し、バルサ
ム含有定着液を加え、次いでカバースリップをかぶせ
た。
片をＴＲＩＳ塩類緩衝溶液により洗浄した。パーオキシ
ダーゼ反応は、ＴＲＩＳ塩類緩衝液５ｍＬ、３０％Ｈ２
Ｏ２５μＬおよび３，３−ジアミノベンジジン３ｍｇを
含有する溶液を用いて発現させた。スライドを水道水で
洗浄し、メイヤーのヘマトキシハン（Ｍａｙｅｒ’ｓ
Ｈｅｍａｔｏｘｉｌｉｎｅ）により交差染色し、バルサ
ム含有定着液を加え、次いでカバースリップをかぶせ
た。
【００５９】この酵素反応は、褐色着色を生じ、この呈
色度を下記のとおりに級分けした：無反応（−）、弱い
反応（＋）、中程度の反応（＋＋）および強い反応（＋
＋＋）。管浸潤性乳癌、乳癌転移リンパ節、および乳房
腺病巣組織切片に対する陽性反応はＰ３ ｍＡｂを用い
て得られた。この抗体は微小顆粒状細胞形質および細胞
膜反応を示す。残りの被験悪性腫瘍および良性腫瘍組織
との反応は見られなかった。この結果を表２に示す。表
２には、Ｐ３ ｍＡｂを使用する、各種悪性腫瘍および
良性腫瘍ヒト組織の免疫組織病理学的試験の結果が示さ
れている。
色度を下記のとおりに級分けした：無反応（−）、弱い
反応（＋）、中程度の反応（＋＋）および強い反応（＋
＋＋）。管浸潤性乳癌、乳癌転移リンパ節、および乳房
腺病巣組織切片に対する陽性反応はＰ３ ｍＡｂを用い
て得られた。この抗体は微小顆粒状細胞形質および細胞
膜反応を示す。残りの被験悪性腫瘍および良性腫瘍組織
との反応は見られなかった。この結果を表２に示す。表
２には、Ｐ３ ｍＡｂを使用する、各種悪性腫瘍および
良性腫瘍ヒト組織の免疫組織病理学的試験の結果が示さ
れている。
【００６０】
【表２】
【００６１】例５ 同系モデルにおけるＩｇＭ抗ガング
リオシド抗体に対する抗イデオタイプ（Ａｂ２）応答 １５日間の毎日に、２５μｇ ｍＡｂの４〜６回の腹腔
内投与を受けたＢａｌｂ／ｃマウスを用いて、２種の相
違する免疫感作プロトコールを行なった。Ａ３、Ｐ３お
よびＥ１ ｍＡｂは単独で、または移送タンパク質とし
てＫＬＨに結合させて、第１回目投与ではフロイント完
全アジュバントの存在下に、そして引き続く投与ではフ
ロイント不完全アジュバントの存在下に、注射した。
リオシド抗体に対する抗イデオタイプ（Ａｂ２）応答 １５日間の毎日に、２５μｇ ｍＡｂの４〜６回の腹腔
内投与を受けたＢａｌｂ／ｃマウスを用いて、２種の相
違する免疫感作プロトコールを行なった。Ａ３、Ｐ３お
よびＥ１ ｍＡｂは単独で、または移送タンパク質とし
てＫＬＨに結合させて、第１回目投与ではフロイント完
全アジュバントの存在下に、そして引き続く投与ではフ
ロイント不完全アジュバントの存在下に、注射した。
【００６２】免疫感作の前および感作後の７日目に、マ
ウス血清試料を採取した。このマウス血清におけるＡｂ
２応答の存在を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳ
Ａプレート（高結合性ＣＯＳＴＡＲ）を４℃において一
夜にわたり、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）中
で、免疫原として使用した各種抗ガングリオシド ｍＡ
ｂ １０μｇ／ｍＬとともにインキュベートした。
ウス血清試料を採取した。このマウス血清におけるＡｂ
２応答の存在を、ＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳ
Ａプレート（高結合性ＣＯＳＴＡＲ）を４℃において一
夜にわたり、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．８）中
で、免疫原として使用した各種抗ガングリオシド ｍＡ
ｂ １０μｇ／ｍＬとともにインキュベートした。
【００６３】プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０含
有ＰＢＳにより洗浄した後に、３７℃において１時間に
わたり、１％ＢＳＡ含有同一緩衝液によりブロックし
た。洗浄工程を反復し、次いで種々の稀釈度の血清５０
μＬ／ウエルを加えた。２時間のインキュベーションの
後に、再び洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ領域抗血清
に結合させたアルカリホスファターゼを添加した。洗浄
後に、前記ＥＬＩＳＡと同様に、基質溶液を添加した。
有ＰＢＳにより洗浄した後に、３７℃において１時間に
わたり、１％ＢＳＡ含有同一緩衝液によりブロックし
た。洗浄工程を反復し、次いで種々の稀釈度の血清５０
μＬ／ウエルを加えた。２時間のインキュベーションの
後に、再び洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ領域抗血清
に結合させたアルカリホスファターゼを添加した。洗浄
後に、前記ＥＬＩＳＡと同様に、基質溶液を添加した。
【００６４】マウスをＡ３およびＥ１ Ｍａｂｓ単独で
免疫感作すると、マウス血清におけるＡｂ２応答は見ら
れなかった。これに対して、これらの同一抗体をＫＬＨ
と結合させて、かつまたアジュバントの存在下に投与す
ると、免疫原として使用されたｍＡｂに対して特異な強
力なＩｇＧ型抗イディオタイプ反応（Ａｂ２）が生じ
た。
免疫感作すると、マウス血清におけるＡｂ２応答は見ら
れなかった。これに対して、これらの同一抗体をＫＬＨ
と結合させて、かつまたアジュバントの存在下に投与す
ると、免疫原として使用されたｍＡｂに対して特異な強
力なＩｇＧ型抗イディオタイプ反応（Ａｂ２）が生じ
た。
【００６５】他方、Ｐ３ ｍＡｂ（抗ＮｅｕＧｃＧＭ２
／ＮｅｕＧｃＧＭ３）が単独（抗体力価１：１０００）
で使用された場合に示すＩｇＧ型Ａｂ２応答は、ＫＬＨ
と結合させ、かつまたアジュバントを存在させると
（１：５００００）、増加した（表３）。表３は、抗ガ
ングリオシドｍＡｂ（Ａ３、Ｅ１およびＰ３）２５μｇ
を３回、単独でまたはＫＬＨと結合させて、１５日間の
間隔で注射することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免
疫感作した場合の、同系モデルにおいて得られた抗イデ
ィオタイプ（Ａｂ２）応答を示すものである。
／ＮｅｕＧｃＧＭ３）が単独（抗体力価１：１０００）
で使用された場合に示すＩｇＧ型Ａｂ２応答は、ＫＬＨ
と結合させ、かつまたアジュバントを存在させると
（１：５００００）、増加した（表３）。表３は、抗ガ
ングリオシドｍＡｂ（Ａ３、Ｅ１およびＰ３）２５μｇ
を３回、単独でまたはＫＬＨと結合させて、１５日間の
間隔で注射することによって、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免
疫感作した場合の、同系モデルにおいて得られた抗イデ
ィオタイプ（Ａｂ２）応答を示すものである。
【００６６】
【表３】
【００６７】これらのｍＡｂに対するＩｇＧ型抗イディ
オタイプ（Ａｂ２）応答は、この抗体応答におけるヘル
パーＴ細胞の関連を示している。生理学的に投与され
た、これらのＩｇＭ型抗イディオタイプ（Ａｂ２）は、
同系モデルにおいてＡｂ２応答を生じさせる相違する能
力を示す。すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＴ細
胞イディオタイプネットワークに連結する、相違する能
力を示す。しかしながら、ＫＬＨと結合させ、かつまた
アジュバントを存在させると、全部がＴおよびＢ細胞イ
ディオタイプネットワークと連結でき、強力なＡｂ２応
答を誘発する。
オタイプ（Ａｂ２）応答は、この抗体応答におけるヘル
パーＴ細胞の関連を示している。生理学的に投与され
た、これらのＩｇＭ型抗イディオタイプ（Ａｂ２）は、
同系モデルにおいてＡｂ２応答を生じさせる相違する能
力を示す。すなわち、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＴ細
胞イディオタイプネットワークに連結する、相違する能
力を示す。しかしながら、ＫＬＨと結合させ、かつまた
アジュバントを存在させると、全部がＴおよびＢ細胞イ
ディオタイプネットワークと連結でき、強力なＡｂ２応
答を誘発する。
【００６８】例６ 同系モデルにおけるＩｇＧ型抗ガン
グリオシドｍＡｂに対する抗−イディオタイプ（Ａｂ
１′）応答の誘発：特異抗原非依存性抗体応答 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫感作に、ＫＬ
Ｈに結合させたＰ３（抗ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＮｅｕＧｃ
ＧＭ２）ｍＡｂおよびＥ１（抗ＮｅｕＡｃＧＭ２）ｍＡ
ｂを使用した。動物には、１５日間の間隔で、ＫＬＨに
結合させたｍＡｂ２５μｇ用量を、第１回投与ではフロ
イント完全アジュバントの存在下に、そして残りの投与
ではフロイント不完全アジュバントの存在下に、投与し
た。
グリオシドｍＡｂに対する抗−イディオタイプ（Ａｂ
１′）応答の誘発：特異抗原非依存性抗体応答 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの免疫感作に、ＫＬ
Ｈに結合させたＰ３（抗ＮｅｕＧｃＧＭ３／ＮｅｕＧｃ
ＧＭ２）ｍＡｂおよびＥ１（抗ＮｅｕＡｃＧＭ２）ｍＡ
ｂを使用した。動物には、１５日間の間隔で、ＫＬＨに
結合させたｍＡｂ２５μｇ用量を、第１回投与ではフロ
イント完全アジュバントの存在下に、そして残りの投与
ではフロイント不完全アジュバントの存在下に、投与し
た。
【００６９】この免疫感作の前と感作期間中に、動物血
清試料を採取した。Ａｂ１′抗体濃度は、例１に記載の
間接的ＥＬＩＳＡ法により測定した。リポソームによる
免疫感作には、ＮｅｕＡｃＧＭ２に対する抗体応答を得
るために、少なくとも９回の投与が必要であった。これ
に対して、免疫感作をＫＬＨに結合したＥ１ ｍＡｂを
用いて行なうと、抗ガングリオシド抗体応答を得るため
に、３回の投与が必要であるのみであった（図３）。
清試料を採取した。Ａｂ１′抗体濃度は、例１に記載の
間接的ＥＬＩＳＡ法により測定した。リポソームによる
免疫感作には、ＮｅｕＡｃＧＭ２に対する抗体応答を得
るために、少なくとも９回の投与が必要であった。これ
に対して、免疫感作をＫＬＨに結合したＥ１ ｍＡｂを
用いて行なうと、抗ガングリオシド抗体応答を得るため
に、３回の投与が必要であるのみであった（図３）。
【００７０】同様に、ＫＬＨと結合させたＰ３ ｍＡｂ
による免疫感作は、免疫感作された８匹の動物のうちの
６匹において、ＮｅｕＧｃＧＭ２（Ａｂ１′）に対する
抗体応答をもたらした（図４および５）。これらの結果
は、ＫＬＨと結合させた、または生理学的に、これらの
抗体がＡｂ２型応答を誘発でき、また同系モデルにおけ
るＡｂ１′応答を誘発させる能力を有することを示して
いる。これらはまた、リカレントなイディオトープ、す
なわち特異抗原非依存性抗体応答を誘発することができ
るイディオトープを有することが示されている。
による免疫感作は、免疫感作された８匹の動物のうちの
６匹において、ＮｅｕＧｃＧＭ２（Ａｂ１′）に対する
抗体応答をもたらした（図４および５）。これらの結果
は、ＫＬＨと結合させた、または生理学的に、これらの
抗体がＡｂ２型応答を誘発でき、また同系モデルにおけ
るＡｂ１′応答を誘発させる能力を有することを示して
いる。これらはまた、リカレントなイディオトープ、す
なわち特異抗原非依存性抗体応答を誘発することができ
るイディオトープを有することが示されている。
【００７１】例７ Ｂａｌｂ／ｃマウスのＰ３ ｍＡｂ
による免疫感作により、抗ガングリオシドｍＡｂを産生
するハイブリドーマの産生 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、例６に記載の免
疫感作プロトコールを用いて、ＫＬＨと結合させたＰ３
ｍＡｂにより免疫感作した。ＮｅｕＧｃＧＭ３に対す
る血清Ａｂ１′型抗体力価を有する１匹のマウスを使用
して、例３に記載の融合技法を用い、ミエローマ細胞ラ
インＰ３／×６３Ａｇ８ ６．５．３とこのマウスの脾
臓細胞とを融合させた。
による免疫感作により、抗ガングリオシドｍＡｂを産生
するハイブリドーマの産生 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、例６に記載の免
疫感作プロトコールを用いて、ＫＬＨと結合させたＰ３
ｍＡｂにより免疫感作した。ＮｅｕＧｃＧＭ３に対す
る血清Ａｂ１′型抗体力価を有する１匹のマウスを使用
して、例３に記載の融合技法を用い、ミエローマ細胞ラ
インＰ３／×６３Ａｇ８ ６．５．３とこのマウスの脾
臓細胞とを融合させた。
【００７２】モノシアロガングリオシドを優先的に認識
する抗体産生性ハイブリッドセルクローン（図６）が、
この融合から得られた。これに対して、ＮｅｕＧｃＧＭ
３および破傷風トキソイドを含有するリポソームにより
免疫感作すると、被験対象のガングリオシドの全部を認
識する抗体を産生するクローンが主として産生された
（図７）。従って、Ｐ３ Ｍａｂによる免疫感作は、リ
ポソーム中に内包されているガングリオシドにより免疫
感作した場合に得られる結果に比較して、類似の、ある
いは質的に優れた、ガングリオシドに対する抗体を産生
するクローンの活性化を生じさせることができる。
する抗体産生性ハイブリッドセルクローン（図６）が、
この融合から得られた。これに対して、ＮｅｕＧｃＧＭ
３および破傷風トキソイドを含有するリポソームにより
免疫感作すると、被験対象のガングリオシドの全部を認
識する抗体を産生するクローンが主として産生された
（図７）。従って、Ｐ３ Ｍａｂによる免疫感作は、リ
ポソーム中に内包されているガングリオシドにより免疫
感作した場合に得られる結果に比較して、類似の、ある
いは質的に優れた、ガングリオシドに対する抗体を産生
するクローンの活性化を生じさせることができる。
【００７３】例８ 同系モデルにおけるＥ１ ｍＡｂに
対する抗イディオタイプ抗体の発現 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、例４に記載の免
疫感作プロトコールを用いて、ＫＬＨに結合させたＥ１
Ｍａｂ（抗ＮｅｕＡｃＧＭ２）により免疫感作した。
Ｅ１ ｍＡｂに対するＡｂ２抗体の血清濃度が高いマウ
スからの脾臓細胞を、例３に記載の融合法に従い、Ｐ３
／×６３Ａｇ８ ６．５．３ミエローマ細胞ラインと融
合させた。
対する抗イディオタイプ抗体の発現 ６〜８週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、例４に記載の免
疫感作プロトコールを用いて、ＫＬＨに結合させたＥ１
Ｍａｂ（抗ＮｅｕＡｃＧＭ２）により免疫感作した。
Ｅ１ ｍＡｂに対するＡｂ２抗体の血清濃度が高いマウ
スからの脾臓細胞を、例３に記載の融合法に従い、Ｐ３
／×６３Ａｇ８ ６．５．３ミエローマ細胞ラインと融
合させた。
【００７４】ＩｇＧ ２ａサブクラスの抗イディオタイ
プｍＡｂが得られた。このｍＡｂがその抗原（ＮｅｕＡ
ｃＧＭ２）に対するＥ１ ｍＡｂの結合を阻止すること
ができないことから、このｍＡｂはアルファ抗イディオ
タイプｍＡｂであることが証明された（図８）。このＢ
７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂは、これが試験された一群のＡ
ｂ１抗ガングリオシド抗体に対する高度の結合を示し
た。このＢ７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂは、免疫原として使
用されたＥ１ ｍＡｂと、およびまたＰ３（抗ＮｅｕＧ
ｃＧＭ３／ＮｅｕＧｃＧＭ２）ｍＡｂおよびＡ３（抗Ｎ
ｅｕＡｃＧＭ２／ＮｅｕＡｃＧＭ１／ＮｅｕＡｃＧＭ
３）ｍＡｂと反応する（図９）。（この抗−ｉｄＥ１を
産生するハイブリドーマ細胞ラインはＥＣＡＣＣにＮ
ｏ． として寄託されている）。
プｍＡｂが得られた。このｍＡｂがその抗原（ＮｅｕＡ
ｃＧＭ２）に対するＥ１ ｍＡｂの結合を阻止すること
ができないことから、このｍＡｂはアルファ抗イディオ
タイプｍＡｂであることが証明された（図８）。このＢ
７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂは、これが試験された一群のＡ
ｂ１抗ガングリオシド抗体に対する高度の結合を示し
た。このＢ７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂは、免疫原として使
用されたＥ１ ｍＡｂと、およびまたＰ３（抗ＮｅｕＧ
ｃＧＭ３／ＮｅｕＧｃＧＭ２）ｍＡｂおよびＡ３（抗Ｎ
ｅｕＡｃＧＭ２／ＮｅｕＡｃＧＭ１／ＮｅｕＡｃＧＭ
３）ｍＡｂと反応する（図９）。（この抗−ｉｄＥ１を
産生するハイブリドーマ細胞ラインはＥＣＡＣＣにＮ
ｏ． として寄託されている）。
【００７５】もう一種のＩｇＧ２のサブクラスの抗イデ
ィオタイプｍＡｂをまた、得た。このｍＡｂは、その抗
原（ＮｅｕＡｃＧＭ２）に対するＥ１ ｍＡｂの結合を
阻止することが出来ることから、パラトピック（ｐａｒ
ａｔｏｐｉｃ）（ベータまたはガンマ）抗イディオタイ
プｍＡｂであった（図１０）。この抗−ｉｄＥ１（Ｆ
２）ｍＡｂは免疫原として使用されたＥ１ ｍＡｂに対
して非常に特異性であった。このｍＡｂは、Ｐ３および
Ａ３ ｍＡｂなどの他の抗ガングリオシド抗体とは反応
しない（図１１）。
ィオタイプｍＡｂをまた、得た。このｍＡｂは、その抗
原（ＮｅｕＡｃＧＭ２）に対するＥ１ ｍＡｂの結合を
阻止することが出来ることから、パラトピック（ｐａｒ
ａｔｏｐｉｃ）（ベータまたはガンマ）抗イディオタイ
プｍＡｂであった（図１０）。この抗−ｉｄＥ１（Ｆ
２）ｍＡｂは免疫原として使用されたＥ１ ｍＡｂに対
して非常に特異性であった。このｍＡｂは、Ｐ３および
Ａ３ ｍＡｂなどの他の抗ガングリオシド抗体とは反応
しない（図１１）。
【００７６】例９ 同系モデルにおけるＢ７抗−ｉｄＥ
１ ｍＡｂにより免疫感作した後のＮｅｕＡｃＧＭ２に
対する抗体応答 Ｂ７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂをＫＬＨに結合させ、６〜８
週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｍａｂ５０μｇ用量を
用いて、２１日の間隔で行なう免疫感作に使用した。動
物には、ＫＬＨと結合させた抗−ｉｄＥ１ Ｍａｂの３
回用量を与えた。第１回の投与はフロイント完全アジュ
バントの存在下に、そして他の２回の投与はフロイント
不完全アジュンバントの存在下に行った。
１ ｍＡｂにより免疫感作した後のＮｅｕＡｃＧＭ２に
対する抗体応答 Ｂ７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂをＫＬＨに結合させ、６〜８
週令の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｍａｂ５０μｇ用量を
用いて、２１日の間隔で行なう免疫感作に使用した。動
物には、ＫＬＨと結合させた抗−ｉｄＥ１ Ｍａｂの３
回用量を与えた。第１回の投与はフロイント完全アジュ
バントの存在下に、そして他の２回の投与はフロイント
不完全アジュンバントの存在下に行った。
【００７７】この免疫感作の前と後とに、血清試料を採
取した。ＮｅｕＡｃＧＭ２に対する抗体応答を例１に記
載の間接ＥＬＩＳＡ法により測定した。図１２に示され
ているように、アルファＢ７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂは、
同系モデルにおいて、ＮｅｕＡｃＧＭ２ガングリオシド
に対する抗体応答を発現することができた。
取した。ＮｅｕＡｃＧＭ２に対する抗体応答を例１に記
載の間接ＥＬＩＳＡ法により測定した。図１２に示され
ているように、アルファＢ７抗−ｉｄＥ１ ｍＡｂは、
同系モデルにおいて、ＮｅｕＡｃＧＭ２ガングリオシド
に対する抗体応答を発現することができた。
【図１】リポソーム中に導入したガングリオシドで免役
したマウスの血清中におけるＮｅｕＡｃＧＭ２に対する
血清抗体応答をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示
す。該抗体応答は、５回目及び９回目投与後に測定し
た。
したマウスの血清中におけるＮｅｕＡｃＧＭ２に対する
血清抗体応答をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示
す。該抗体応答は、５回目及び９回目投与後に測定し
た。
【図２】テタヌストキソイドを含むリポソーム中に導入
したガングリオシドで免役したマウスの血清中における
ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する血清抗体応答を示す。該血清
応答は、５回目及び７回目の免疫原投与後のマウスの１
／８０希釈血清中でＥＬＩＳＡで測定した。
したガングリオシドで免役したマウスの血清中における
ＮｅｕＧｃＧＭ３に対する血清抗体応答を示す。該血清
応答は、５回目及び７回目の免疫原投与後のマウスの１
／８０希釈血清中でＥＬＩＳＡで測定した。
【図３】ＫＬＨに結合したＥ１ ｍＡｂをＦｒｅａｎｄ
アジュバンドとともに免役したＢａｌｂ／ｃマウス中に
産生されたＮｅｕＡｃＧＭ２に対する血清抗−抗イディ
オタイプ（Ａｂ１′）応答を示す。Ａｂ１′抗体応答
は、ｍＡｂを３回投与前及び後に直接ＥＬＩＳＡにより
測定した。
アジュバンドとともに免役したＢａｌｂ／ｃマウス中に
産生されたＮｅｕＡｃＧＭ２に対する血清抗−抗イディ
オタイプ（Ａｂ１′）応答を示す。Ａｂ１′抗体応答
は、ｍＡｂを３回投与前及び後に直接ＥＬＩＳＡにより
測定した。
【図４】ＫＬＨに結合したＰ３ ｍＡｂをＦｒｅｕｎｄ
アジュバントとともに免役したマウスの血清中で直接Ｅ
ＬＩＳＡにより測定したＮｅｕＧｃＧＭ３に対する抗−
抗イディオタイプ（Ａｂ１′）応答を示す。該Ａｂ１′
応答は、５回目及び６回目ｍＡｂ投与前並びに後に測定
した。
アジュバントとともに免役したマウスの血清中で直接Ｅ
ＬＩＳＡにより測定したＮｅｕＧｃＧＭ３に対する抗−
抗イディオタイプ（Ａｂ１′）応答を示す。該Ａｂ１′
応答は、５回目及び６回目ｍＡｂ投与前並びに後に測定
した。
【図５】ＫＬＨに結合したＰ３ ｍＡｂをＦｒｅｕｎｄ
アジュバントとともに免役したマウスの血清中で直接Ｅ
ＬＩＳＡにより測定したＮｅｕＧｃＧＭ３に対する抗−
抗イディオタイプ（Ａｂ１′）応答を示す。該Ａｂ１′
応答は、５回目及び６回目ｍＡｂ投与前並びに後に測定
した。
アジュバントとともに免役したマウスの血清中で直接Ｅ
ＬＩＳＡにより測定したＮｅｕＧｃＧＭ３に対する抗−
抗イディオタイプ（Ａｂ１′）応答を示す。該Ａｂ１′
応答は、５回目及び６回目ｍＡｂ投与前並びに後に測定
した。
【図６】異なるガングリオシドに対するハイブリドーマ
上清の認識パターンを示す。ハイブリドーマは、Ｐ３Ｍ
ａｂで免疫したマウスの脾臓細胞と×６３ Ａｇ８
６．５．３ムリンミエローマ細胞とを融合することによ
って得た。
上清の認識パターンを示す。ハイブリドーマは、Ｐ３Ｍ
ａｂで免疫したマウスの脾臓細胞と×６３ Ａｇ８
６．５．３ムリンミエローマ細胞とを融合することによ
って得た。
【図７】異なるガングリオシドに対するハイブリドーマ
上清の認識パターンを示す。ハイブリドーマは、テタヌ
ストキソイドを含むリポソーム中に導入したＮｅｕＧｃ
ＧＭ３で免疫したマウスの脾臓胞と×６３ Ａｇ８
６．５．３ミエローマ細胞とを融合することによって得
た。
上清の認識パターンを示す。ハイブリドーマは、テタヌ
ストキソイドを含むリポソーム中に導入したＮｅｕＧｃ
ＧＭ３で免疫したマウスの脾臓胞と×６３ Ａｇ８
６．５．３ミエローマ細胞とを融合することによって得
た。
【図８】Ｅ１ ｍＡｂを抗−ｉｄＥ１ Ｍａｂまたはマ
ウスポリクローナル抗−ｉｄＥ１抗血清希釈液でインキ
ュベートし、その後、ＮｅｕＡｃＧＭ２に対するＥ１ｍ
Ａｂの結合をＥＬＩＳＡにより測定し、結合抑制割合い
（％）を計算して実施した抑制アッセイの結果を示す。
ウスポリクローナル抗−ｉｄＥ１抗血清希釈液でインキ
ュベートし、その後、ＮｅｕＡｃＧＭ２に対するＥ１ｍ
Ａｂの結合をＥＬＩＳＡにより測定し、結合抑制割合い
（％）を計算して実施した抑制アッセイの結果を示す。
【図９】Ｅ１．Ａ３及びＰ３抗−ガングリオシドｍＡｂ
ｓに対する抗ｉｄＥ１ Ｍａｂの反応性を示す。
ｓに対する抗ｉｄＥ１ Ｍａｂの反応性を示す。
【図１０】異なるＡｂ２上清による、Ｅ１ ｍＡｂのＧ
Ｍ２に対する結合抑制を示す。
Ｍ２に対する結合抑制を示す。
【図１１】他のＩｇＭ抗−カーボハイドレートｍＡｂに
対するいくつかのＡｂ２ハイブリドーマの特異性を示
す。
対するいくつかのＡｂ２ハイブリドーマの特異性を示
す。
【図１２】Ｂ７抗−ｉｄＥｍＡｂで免役したマウス中に
産生されるＮｅｕＡｃＧＭ２に対する血清抗体応答を示
す。該抗体応答は、ＫＬＨに結合したｍＡｂの２回目及
び３回目投与前並びに後に測定した。
産生されるＮｅｕＡｃＧＭ２に対する血清抗体応答を示
す。該抗体応答は、ＫＬＨに結合したｍＡｂの２回目及
び３回目投与前並びに後に測定した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 アンゲル マウロ アルフォンゾ フェ ルナンデツ キューバ国シウダッド デ ラ ハバ ナ，プラザ，ルガレノ ナンバー 111 イー／ルアセス ワイ モントト (72)発明者 ロランド ペレツ ロドリゲツ キューバ国シウダッド デ ラ ハバ ナ，ビボラ，10 デ オクツブレ，ジュ アン デルガド ナンバー 567 (72)発明者 アムパロ イー．マシアス アブラハム キューバ国シウダッド デ ラ ハバ ナ，プラザ，ベダド カレ 10 ナンバ ー 208 イー／リネア ワイ エィチ (72)発明者 カルロス マヌエル アルバレツ バル カーセル キューバ国シウダッド デ ラ ハバ ナ，10 デ オクツブレ，ロートン，レ イェス ナンバー 334，アプト １ イー／ルツ ワイ アルターリバ (72)発明者 マリア エリアナ ラニオ ルイツ キューバ国シウダッド デ ラ ハバ ナ，ルプト シバス，グアナバコア，カ レ ８ ナンバー 37 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/02 A61K 39/395 C07K 16/30 C12N 5/10 C12P 21/08 G01N 33/53 G01N 33/577 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】 ガングリオシドに対して高い特異性を持
つIgMモノクローナル抗体であって、ガングリオシドNeu
GcGM3及びNeuGcGM2におけるガラクトースに結合したN-
グリコリルノイラミン酸と特異的に結合するIgMモノク
ローナル抗体。 - 【請求項２】 単独であるいは輸送蛋白質にカップリン
グさせて動物の免疫処理に用いた場合、Ab2及びAb1'型
抗体応答を発生する、請求項１のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 受託番号９４１１３０２６として１９９
４年１１月３０日にCenter for Applied Microbiology
and Researchにブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いるセルラインによって産生される、請求項１又は２の
モノクローナル抗体。 - 【請求項４】 請求項３のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマであって、受託番号９４１１３０２６
として１９９４年１１月３０日にCenter forApplied Mi
crobiology and Researchにブダペスト条約に基づき国
際寄託されているセルラインである、ハイブリドーマ。 - 【請求項５】 ガングリオシドを発現する腫瘍細胞の検
出のための試薬であって、マーカーに結合した請求項１
から３のいずれかのモノクローナル抗体を含む試薬。 - 【請求項６】 悪性新生物の処置のための医薬組成物で
あって、輸送分子、希釈剤又は賦形剤と共に、請求項１
から３のいずれかのモノクローナル抗体を含む医薬組成
物。 - 【請求項７】 悪性新生物が乳癌である、請求項６の医
薬組成物。 - 【請求項８】 請求項１から３のいずれかのモノクロー
ナル抗体で動物を免疫することにより、Ab2型抗体応答
として得られる抗イデオタイプモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 請求項８の抗イデオタイプモノクローナ
ル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項１０】 悪性新生物の処置のための医薬組成物
であって、輸送分子、希釈剤又は賦形剤と共に、請求項
８の抗イデオタイプモノクローナル抗体を含む医薬組成
物。 - 【請求項１１】 悪性新生物が乳癌である、請求項１０
の医薬組成物。
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