EA003318B1 - ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК МЫШИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО 14F7 ПРОТИВ ГАНГЛИОЗИДОВ NGcGM3, МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО 14F7, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И РЕАКТИВ, СОДЕРЖАЩИЕ УКАЗАННОЕ АНТИТЕЛО - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к области иммунологии и медицине человека, особенно в отношении получения и отбора моноклонального антитела (MAT), которое распознает олигосахаридную последовательность N-гликолилированная галактоза-глюкоза-сиаловая кислота, присутствующую в злокачественных опухолях. Одной из целей данного изобретения является получение MAT типа IgG1, которое обладает способностью распознавать с высокой степенью специфичности олигосахаридную последовательность N-гликолилированная галактоза-глюкоза-сиаловая кислота, присутствующую в злокачественных тканях молочной железы, меланомах и опухолях печени, желудка, толстой кишки, прямой кишки и почек. Оно также обладает способностью вызывать прямой цитолиз опухолевых клеток, несущих олигосахаридную последовательность N-гликолилированная галактоза-глюкоза-сиаловая кислота, поэтому его можно применять для диагноза и лечения некоторых опухолевых заболеваний. Еще одна цель данного изобретения состоит в получении гибридомы, образующей указанное MAT так же, как фармацевтической композиции, содержащей его для лечения опухолевых заболеваний.

Description

Область техники

Данное изобретение относится к области иммунологии и медицины человека, особенно в отношении получения и отбора моноклонального антитела (МАТ) против олигосахаридной последовательности Ν-гликолилированная галактоза - глюкоза - сиаловая кислота, которое можно применять для диагностики и лечения определенных опухолевых заболеваний.

Уровень техники

Олигосахаридные структуры участвуют в образовании гликопротеинов и гликолипидов. Как те, так и другие присутствуют в нормальных и патологических тканях.

Приблизительно в 100% случаев злокачественных новообразований описывают аберрантное гликолилирование. Обычные изменения при аберрантном гликолилировании представляют собой, помимо прочего, экспрессию неоантигенов, изменения в составе олигосахаридных последовательностей, увеличение или уменьшение количества молекул сиаловой кислоты в олигосахаридах и увеличение плотности молекул на поверхности клетки (Накотоп 8.Н. е! а1.: Сигг. Ορίη. ίη 1ттипо1. 1991, (3)646653). В дополнение к изменениям, которые можно найти в механизме сиалил-трансфераз, существуют изменения гидроксилаз, зависимые от активированной Ν-ацетилированной формы сиаловой кислоты.

Ганглиозиды являются гликосфинголипидами, которые содержат сиаловую кислоту в своей структуре и характеризуются тем, что присутствуют в большинстве клеток позвоночных. Эти молекулы обнаружены в нормальной ткани и они могут сильнее экспрессироваться в опухолях с отличной организацией и конформацией на поверхности злокачественных клеток (Накотоп 8.Н., 1985, Сапсег Век. 45: 2405-2414; М1га1й1, Р., 1989, 8етшагк ίη М.1с1еаг Мейюше, XIX, 282-294).

За гуморальный иммунный ответ против углеводных антигенов, как правило, отвечают иммуноглобулины, относящиеся к изотипу 1дМ. Олигосахаридные последовательности, связанные с липидами в большинстве случаев менее иммуногенны, чем гликопротеины. Поэтому применение гликолипидов в качестве иммуногена требует его связывания с белкамипереносчиками или включения в липосомы или в бактерии, такие как МюоЬас!етшт !иЬегси1ок1к или 8а1топе11а тшпекоЮ В595.

Ответ, индуцируемый против ганглиозидов, является тимуснезависимым. Об этом неоднократно сообщали ЬМпдкЫп е! а1., (ЬМпдк!оп, Ρ.Ο. е! а1., 1982, Ргос. №11, Асай. 8с1. И8А 84: 2911-2915; Ь1утдк!оп, Ρ.Ο. е! а1., 1989, Сапсег Век. 49: 7045-7050). Главными особенностями антител, вырабатываемых против ганглиозидов, при исследовании сыворотки различных видов, являются их низкая афинность, значительная перекрестная реактивность и короткий период жизни (Ь1утдк!оп, Ρ.Ο. 1991, 1ттипо1оду апй А11егду Сйшск о! №П11 Атенса, 11: 401423, РойоикаЛап, 1. е! а1., 1991, 1п!. 1. Сапсег, 49: 893-899).

Экспрессия Ν-гликолилированной формы олигосахаридов имеет место в нормальных и патологических тканях всех видов позвоночных, за исключением курицы и человека, у которых она обнаружена только в эмбриональной и опухолевой тканях. Нормальные ткани этих двух последних видов содержат только Νацетилированный вариант (ШкЫтакй е! а1., 1979, 1. 1ттипо1оду 122: 2314; ШдакЫ Н. е! а1., 1985, Сапсег Век., 45: 3796).

Изучение олигосахаридного состава в некоторых опухолях человека показывает присутствие Ν-гликолилированной формы и в гликолипидах, и в гликопротеинах опухолевых клеток меланомы (ШтаЬауакЫ, Υ. е! а1., 1987, 1. Сапсег Век., 78, 614-620; 8а1йа Т. е! а1., 1991 Атсй. Эегта!о1. Век. 282(3): 179-182; Ка^акЫта I. е! а1., 1993, 1. Вюсйет (Токю) (2) 186-193; Ка^асЫ 8. е! а1., 1992, 1. Эегта1о1 (11): 827-830), также как в опухолях толстой кишки, особенно в гликолипидах (М1уокЫ, I., е! а1., 1986, Мо1. 1ттипо1. 23(6): 631; ШдакЫ Н., е! а1., 1985, Сапсег Векеагсй, 45: 3796-3802).

Кроме того, проводили исследования, свидетельствующие о наличии Ν-гликолилированной формы ганглиозидов в образцах опухоли печени, тератомы, лимфомы и т.д. (Ка^а1 Т. е! а1., 1991, Сапсег Век. (51) 1242-1246).

Хотя в первых случаях концентрация Νгликолилированного варианта гликолипидов составляла менее 0,05% от общего содержания сиаловой кислоты, Магс.|шпа с сотр. обнаружили в опухолях молочной кислоты приблизительно 10% такой сиаловой кислоты, связанной с липидами (Магцшпа, О. Е! а1., 1996, Сапсег Век. 56: 5165).

Образование моноклональных антител против Ν-гликолилированного варианта ганглиозидов до сих пор позволяло получать антитела изотипа 1дМ, которые обычно распознают более одной молекулы ганглиозидов, например, антитела человека 2-39М и 32-27М (Ритика^а К., е! а1., 1988, 1. Вю1одка1 Сйет1к!ту, 263: 18507) и антитела мыши ОМВ8 и ОМВ3 (Ο/а^а Н. е! а1., 1992, Вюсйет. Вюрйук., 2(294) :427). Другие авторы сообщали о получении специфичных антител к Ν-гликолилированным ганглиозидам, всегда изотипа 1дМ, среди которых моноклональные антитела Υ-2-ΒΩ1 против N6с6М₂ (8ата1 Υ. е! а1., 1988, Вюсй Вюрйук. Ас!., 958, 368) и МК2-34 против той же молекулы (М1уаке, М. е! а1., 1990, Сапсег Век. 48, 6154).

Однако, \Уа1ага1 (\Уа1агат 8. е! а1., 1995, 1.

Вюсйет. 117, 1062) получил моноклональное антитело 8Н8-1 против ί-активных Νгликолилированных ганлиозидов, а №1китага получил моноклональное антитело ΥΧ-3 против (ΝΟο-ΝΟο) ОЭ1с (№1китага е! а1., 1995, 1. о!

Βίο1ο§. СЬеткк, 8 (270):3876). Недавно νάζιιικζ, е1 а1.,(Vаζ^иеζ, А. М. е1 а1., 1995, НиЬпбота, 14, 6, 551) сообщили о получении моноклонального антитела Р3, которое распознает большинство молекул ганглиозида, содержащих Ν-гликолилированную форму сиаловой кислоты, также как сульфатированные гликолипиды.

№щ;н е1 а1. получили моноклональное антитело НМА1 против ганглиозидов (Ν;·ι§;·ιί Υ. е1 а1., патент США № 4965198). Они получили специфическое моноклональное антитело против ганглиозида ΝΟεΟΜ2 мыши, страдающей аутоиммунным заболеванием. Хотя они сообщили о нескольких данных антителах, которые дополнительно распознают Ν-гликолилированные ганглиозиды, обозначенные как РуК, ΥΗ02, ΥΗ03, ΥΗ04, ΥΗ05, ΥΗ06 и ΥΗ07.

Кроме того, Хатакакт М. и др. в патенте США № 4942131 сообщают о получении МАТ ΥΗ08, ΥΗ09, ΥΗ10 и ΥΗ11 против ганглиозида 4-О-Аее1у1ЛСеСМ3 также у мышей, страдающих аутоиммунным заболеванием.

Моноклональные антитела против ганглиозидов получают, используя данные молекулы как лактоны или используя клеточные линии, содержащие ганглиозиды (патенты США № 5308614, 5240833, 5389530 и 5500215).

Тем же способом различные моноклональные антитела, мышиные и человеческие, были получены против ганглиозидов ΟΌ3, ΟΌ2 и ОМ2 в Ν-ацетилированной форме, большинство из которых относятся к подклассам 1дМ и 1дО3 (Рике1, С.8. е1 а1., 1982, 1. Ехр. Меб., 115: 11331147; ШтаЬауакЫ, Υ. е1 а1., 1985, 1. Βίο1. СЬет., 260: 13328-13333; Ра1еп1 аррйсайоп ГСО 86/00909; М1уаке, М. е1 а1. 1988, Сапсег Век., 48: 6154-6160; КатакЫта, I. е1 а1., 1992, Мо1еси1аг 1ттипо1оду, 29, 625-632; Ко1ат, М. е1 а1. 1992, ВюсЫтюа е1 ВюрЬукюа Ас1а, 1117: 97-103).

Пассивную иммунотерапию с применением моноклональных антител против ганглиозидов применяют в клинической практике для лечения некоторых опухолей, таких как меланомы и нейробластомы. В случае меланом введение проводят внутри пораженной области, либо применяют системное лечение всего организма и хотя результаты кажутся обнадеживающими, только у небольшого числа пациентов происходит полная или частичная ремиссия (ΗοидЬΐοη, Α.Ν. е1 а1., 1985, Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 82: 1242; I НррокТ ГС.О. е1 а1., 1988, 1. Сапсег Сйп. Опсо1; 24: 865; VабЬап-Ва^, 8. е1 а1., 1988, 1. СЬп. Опсо1., 6: 1636; 8а1еЬ М/Ν. е1 а1., 1992, Сапсег Век., 52: 4332-4347).

Данные антитела показывают эффект при изучении цитотоксичности, опосредованной комплементом или клетками (Ваутбтата1Ь МН е1 а1., 1991, 1п1ет. Веу. 1ттипо1., 7, 303).

Все моноклональные антитела, полученные до сих пор против Ν-гликолилированных ганглиозидов, относятся к изотипу 1дМ, а ток сичность, которую они вызывают, опосредована комплементом.

1дМ, как правило, имеют низкую афинность и антиген, и их трудно применять для диагностики или лечения в виде радиоактивно меченых моноклональных антител. Хотя они хорошо фиксируют комплемент и гарантируют адекватную цитотоксичность, широкомасштабное выделение намного сложнее по сравнению с таковым иммуноглобулинов изотипа 1дС.

Кроме того, в литературе мало данных о моноклональных антителах против Ν-гликолилированных гликопротеинов, а большинство из них сообщают о диагностических целях.

Эеуте и др. описали моноклональное антитело 3Е1.2, которое распознает Νгликолилированный муцин (гликопротеин), экспрессирующийся в 90% опухолей молочной железы, изучаемой иммуногистохимически (Оеуте, Р.Ь., е1 а1., 1991, Сапсег Век. 51 (21): 5826-36).

Существует публикация о моноклональном антителе, обозначенном 1АМ3, которое распознает Ν-ацетилированную и Νгликолилированную формы белка с молекулярной массой 250 кДа, который присутствует на поверхности цист, образующихся при инфекции Еп1атоеЬа (Аутоп, В., е1 а1., 1987, Мо1. ВюсЬет. РатакЬо1. (3): 257-266).

Описание изобретения

Новизна данного изобретения состоит в получении моноклонального антитела, высокоспецифичного к олигосахаридной последовательности Ν-гликолилированная галактоза глюкоза - сиаловая кислота, присутствующей как в ганглиозиде, так и в гликопротеинах. Кроме того, характеристики получаемого иммуноглобулина изотипа 1дС делают его более специфичным и поэтому обладающим большим сродством к молекулам, которые он распознает, улучшая, таким образом, его биологическую активность. Неожиданно данное антитело обнаружило способность вызывать гибель клеток, непосредственно производящих указанную олигосахаридную последовательность.

Подробное описание изобретения

Получение ганглиозида ХСсСМ3

Для получения ганглиозида ХСсСМ3 применяли модификацию методики Ηакοтο^^ (Ηηкотогк 8. е1 а1., 1974, Ме1Ьобк ш Еηζутο1οду, 32:, Рай В, 350) с использованием такого природного источника, как эритроциты лошади. Выход ганглиозида N6с6Μ3 составлял 180-300 мг/л эритроцитов лошади со степенью очистки выше 90%, подтвержденной высоко эффективной жидкостной хроматографией по методике 6аζζοΐй (6аζζοй^, О. е1 а1., 1985, 1. о£ СЬтота1одгарЬу 348: 371-378).

Получение иммуногена

Чтобы получить иммуноген, ганглиозид

ХСсСМ3 гидрофобно связывали с человеческими липопротеинами очень низкой плотности (УБИТ), полученными согласно Эитоп1е1 и др. (ЦитоШе!, С. е! а1., 1994, Сапсег 1ттипо1 1ттипойег. 38: 311-318).

Схема иммунизации

Чтобы получить антиганглиозидные моноклональные антитела типа 1дС применяли следующий способ иммунизации. Мышей или других млекопитающих иммунизировали вакцинными препаратами, содержащими 0,03 и 0,5 мг ганглиозида Ы6с6М3, связанного с УБЭБ, в расчете на дозу, а также адъювант, отобранный из ниже следующих: альбумин, полный или неполный адъювант Фройнда или Моп1ашбе Ι8Ά 51.

Перед и после периода иммунизации брали образцы крови у животных, чтобы получить сыворотку и вести контроль за антителами, появляющимися у животных против ганглиозида, примененного в качестве антигена. С этой целью использовали все известные способы иммуноанализа для определения реакции антигенантитело (Аг - Ат).

Животных иммунизировали различными дозами от 2 до 8 с временными интервалами, варьирующимися от 7 до 14 дней. Инъекции осуществляли подкожно или внутримышечно объемами в 0,1 и 0,2 мл.

Другими возможными способами иммунизации являются внутривенный и внутрибрюшинный. Животные, получившие этот диапазон доз, показывают специфический ответ на ганглиозид, примененный в качестве иммуногена. Специфический иммунный ответ типа 1дС на ганглиозид И6с6М3 имели от 70 до 100% иммунизированных животных.

Получение моноклональных антител

Для получение специфических МАТ против ганглиозида ИСсСМ3 мышей с антителами против данного ганглиозида снова иммунизировали вакцинным препаратом за 3 дня до того, как получали клетки, продуцирующие антитело. Предпочтительно использовать клетки селезенки, хотя можно использовать и другие клетки.

Данные клетки сливают с клетками миеломы, в результате образуются гибридные клетки или гибридомы со способностью неограниченно размножаться ίη νί\Ό и ίη У11то. Для этой цели можно использовать любой из известных способов слияния клеток. Для определения антител, образуемых гибридомой, предпочтительно использовать иммуноферментный анализ. Другие методы иммуноанализа также можно использовать. Процедура данного анализа представляет собой распознавание гибридомой ганглиозидов в супернатанте, а реакцию антиген антитело можно выявить, используя вторичное антитело, меченое ферментом, который связывается с антителом, образованным гибридомой в адекватных условиях, определения проводят одновременно.

Гибридому, однажды отобранную, клонируют, по крайней мере, два раза, например, ли митирующим разбавлением. Синтезируемое клетками МАТ можно продуцировать ίη уйто в соответствующей культуральной среде, любой, известной существующему уровню техники, и затем выделять из указанного культурального супернатанта. В данном случае от 1 до 8% секретирующих клеток были иммуноспецифичны к Ν-гликолилированному ганглиозиду СМ3.

Другой способ производства антител состоит в инъекции гибридом в животные, (например в сингенные животные). Гибридома вызывает образование несолидной опухоли, которая обеспечивает высокую концентрацию нужного антитела в крови и перитонеальном эксудате животного-хозяина.

Очистка моноклонального антитела

Очистку моноклональных антител осуществляют, используя асцитную жидкость, полученную после инокуляции 0,2 Х 10⁶ клеток МАТ-продуцирующей гибридомы, в брюшную полость мышей линии Ва1Ь/С, предварительно обработанных неполным адъювантом Фройнда в качестве асцитогенного вещества.

Асцитную жидкость разбавляют вдвое глициновым буфером 1,5 М, №С1, 3М; рН 8,9 и подвергают афинной хроматографии, где матриксом служит белок А - сефароза, со скоростью элюции 60 мл/ч. Элюцию МАТ проводят, используя цитратный буфер 0,14 М; рН 6.

Концентрацию очищенных МАТ определяют методом Лоури (Бо^ту, С. Н., 1951, 1. Вю1. Сйет., 193: 256) и используя коэф. поглощения мышиного 1дС1 при 280 нм. Специфичность подтверждают с помощью теста ИФА.

Получали от 2 до 5 мг антител на мл асцитной жидкости с процентом чистоты выше 95%. Это подтверждали жидкостной хроматографией низкого давления.

Исследования специфичности

Чтобы определить специфичность полученных моноклональных антител, проводят иммуно-ферментное исследование МАТ на планшетах ИФА и применяя тонкослойную хроматографию с использованием Ν-ацетилированных (СМ1, СМ2, СМ3, СМ1, 6И1а, СО1Ь, ΟΌ3, СТ1Ь) и Ν-гликолилированных (СМ3, СМ2, СМ1а, СМ1Ь, СИ1с, СЭ3) ганглиозидов.

При анализе гликолипидов с помощью тонкослойной хроматографии высокого давления система растворителя включает хлороформ: метанол :КС1 0,25% и 2,5 М Ν^ (5:4:1) (объем: объем). Для проявления полос используют орсин.

Планшеты покрывают раствором полиизобутилметакрилата и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Блокировку осуществляют примерно в течение 30 мин 1% раствором бычьего сывороточного альбумина, растворенного в солевом фосфатном буфере (ФСБ), рН 7,4. Затем моноклональные антитела инкубируют в блокирующем растворе.

После чего планшеты промывают раствором ФСБ и добавляют пероксидазу, конъюгированную с мышиным антииммуноглобулином на 1 ч. Планшеты снова промывают и добавляют раствор субстрата фермента, до тех пор пока не появятся полосы. В заключение сравнивают полученные химические и иммунохимические данные. В результате 1дС распознавал только ганглиозид ЫСсСМЗ.

Определение цитотоксичности

Чтобы определить, вызывают ли полученные антитела смерть клеток непосредственно или каким-то другим цитотоксическим способом 10⁷ клеток/мл мышиной миеломы Р3Х63, содержащей ЫОсОМЗ, инкубируют при 4 и 37°С соответственно с моноклональным антителом в концентрации 0,01-1 мг/мл в течение 30 мин. Затем применяют окрашивание Трипаном синим для определения жизнеспособности. Количество мертвых клеток как следствие действия антитела можно определить, используя пропидиум иод или любой другой маркер жизнеспособности.

Для изучения цитотоксичности, опосредованной комплементом, использовали суспензию, содержащую 10⁷ клеток /мл; моноклональные антитела добавляют в концентрации от 0,01 до 0,5 мг/мл. Сыворотку кролика, которая содержит высокую концентрацию белков комплемента, добавляют в разбавлениях от 1/20 до 1/2 и инкубацию проводят в течение 1 ч при 37°С. Цитотоксичность, обусловленную комплементом, определяли, подсчитывая живые клетки, как описано выше, или используя метод выделения хрома Сг⁵¹, при котором радиоактивномеченые клетки миеломы Р3Х63, когда умирают, выделяют в культуральный супернатант изотоп.

Прямую цитотоксичность измеряли, используя различные способы, которые обнаружили величины от 50 до 85% мертвых клеток по отношению к общему числу изученных клеток.

Определение биораспределения моноклонального тела

Полученные МАТ можно использовать как для диагноза, так и для лечения, вводя метку радиоактивного изотопа такого, как 99тТс, Ве186 и Вс 188. 8с11\\'агх апб 81с1п51га55сг (8с11\\'агх А., апб 81е1п51га55ег, А. 1987, 1. Иис1. Меб. 28: 721) описали способ получения меченых радиоизотопами моноклональных антител, который был модифицирован МаШег у ЕШкоп (МаШег 8.1. апб ЕШкоп Ό., 1990, 1. Иис1. Меб. 31: 692-697). Контроль за качеством метки осуществляют, используя хроматографию на Ватмане 3ММ. Процент включения метки составлял 98 и 100%.

Чтобы определить возможное применение МАТ, 10 мышей инокулировали опухолью Р3Х63, а других 10 мышей использовали в качестве обычного контроля (никакую опухоль не инокулировали). Ожидали в течение отрезка времени, необходимого для роста опухоли, и затем 20 мышам внутривенно инъецировали МАТ 14Е7, меченое 99тТс.

Через 4 и 24 ч после инъекции проводили контроль за биораспределением МАТ против олигосахаридной последовательности в группах из 5 мышей (5 здоровых и 5 с опухолью). Животных забивали, взвешивали главные органы и опухоль, и гамма излучение количественно определяли в конце опыта.

У здоровых животных моноклональные антитела распределялись в основном в крови, печени и почках, а у животных с опухолью МАТ обнаружили в первых органах и, предпочтительно, в опухоли через 24 ч.

Распознавание моноклональными антителами нормальных и эмбриональных тканей Радиоактивные МАТ, как описано в разделе, посвященном уровню техники в данной области, можно использовать, чтобы определить опухоль, в которой наблюдается экспрессия олигосахаридной последовательности.

Радиоактивность всего тела можно изучать с помощью Гамма Камеры. Картины в развитии получают через 5 мин и через 1, 3, 5, 24 и 48 ч после инъекции МАТ. МАТ обнаружили только в опухоли и органах выделения.

МАТ можно также связывать прямо и опосредованно с другими терапевтическими веществами, такими как лекарства, радиоизотопы, иммуномодуляторы, лектины и токсины. Среди иммуномодуляторов биологического ответа, которые каким-либо образом могут усилить разрушение опухоли с помощью МАТ данного изобретения, можно назвать лимфокины, такие как фактор некроза опухоли, фактор активатор макрофага, фактор стимуляции колоний, интерфероны и т.д.

Иммуногистохимические исследования проводили с диагностическими целями. Срезы тканей фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, затем их обезвоживали, осветляли и заключали в парафин. Для исследования гистопатологии срезы тканей окрашивали гематоксилин-эозином.

Серийные срезы из парафиновых блоков, используемые для гистопатологических целей, подвергали иммуноокрашиванию методом биотин стрептавидин пероксидазного комплекса, предварительно описанного (Нки, 8. М. у Ваше, Ь., 1981,. 1. НЩосйет СуФсйет. 29: 1349-1353).

Депарафинированные и обезвоженные срезы обрабатывали раствором 3% метанола с перекисью водорода в течение 30 мин для удаления эндогенной пероксидазной активности. Срезы ткани инкубировали с очищенными МАТ. Затем следовали антимышиные антитела и стрептавидин пероксидазный комплекс (ИакораШ); реакцию проводили при комнатной температуре.

Между инкубациями срезы промывали солевым раствором трис-НС1 буфера. Пероксидаз9 ную реакцию проводили с 30% Н₂О₂ и 3-3 диаминобензидином.

Срезы промывали водопроводной водой, окрашивали гематоксилином Майера, заключали в бальзам и покрывали покровным стеклом. Реакция с ферментом давала коричневокрасную окраску.

Опухолевые ткани молочной железы, легкого, кожи и нервной системы изучали также как ткани эмбриональные и ткани взрослого организма.

Свежую биопсию патологических тканей брали в течение первого часа после операции. Кусочки биопсии замораживали, затем делали срезы, и срезы оставались замороженными до начала исследования.

Использование эмбриональных тканей обусловлено тем фактом, что неоднократно сообщали о связи ганглиозидов с онкоэмбриональными антигенами, также как о сходстве этих молекул у эмбриональной и опухолевой ткани человека (Сайап, Ь. с1 а1., 1982, Ргос. N311. Асаб. 8с1. ИЗА., 79: 7629-7633).

Срезы эмбриональной ткани получали из эмбриона в возрасте от 12 до 18 недель.

Кусочки ткани взрослого человека получали от людей, погибших при несчастных случаях и/или в результате смерти мозга в течение первого часа после смерти.

Среди изученных опухолей опухоли легкого и центральной нервной системы различной этиологии давали отрицательный ответ, также как срезы нормальных тканей человека. Тогда как срезы ткани меланомы и молочной железы все обнаружили положительную реакцию, также как срезы эмбриональной ткани, полученные из органов пищеварительной системы (печени, желудка, тонкой и толстой кишки и почечной системы).

Противоопухолевое действие

Чтобы показать антиопухолевое действие моноклональных антител против NСсСΜ3, животных, инокулированных опухолью, несущей ганглиозидную мишень (миелома Р3Х63), обрабатывали полученными антителами. Доза может варьировать от 0,01 мг/кг веса до 200 мг/кг веса при одной или более обработках в течение одного или нескольких дней. Антитела можно применять в виде парентеральной инъекции (внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной, внутриполостной или трансдермальной).

В типичном эксперименте процент выживания мышей, обработанных антителом, составлял 30-80% по сравнению с мышами контрольной группы, что подтверждено тестом Ьод Каш (Сох апб Оакс5 (1984) Лпа1уЙ5 о£ 8игу1уа1 Эа1а ебйк. Сйартап На11). Обнаружили статистически значимые различия (<0,05%) между группой, обработанной МАТ, и контрольной группой.

Примеры

Пример 1. Специфический 1дС ответ на NСсСМ3 у мышей, иммунизированных препаратом вакцины NСсСМ3/V^^^/адъювант Фройнда, измеренный иммуноферментной методикой.

Женским особям мышей линии Ва1Ь/С в возрасте 6-8 недель инъецировали внутримышечно 0,2 мг препарата человеческой вакцины NСсСМ3/V^^^ с полным адъювантом Фройнда в первой дозе и неполным адъювантом Фройнда в последующих дозах (произведено фирмой Сигма), смешанными в равных объемах. Каждое животное получало 6 доз. Первые 4 дозы еженедельно и 2 остальные каждые 14 дней. Взятие крови осуществляли перед первой дозой и затем каждые 2 недели.

Уровни антитела измеряли в сыворотке животных, используя косвенный тест ИФА на планшетах Полисорп марки (Шпс 1габе тагк), на которых ганглиозиды иммобилизовали следующим описанным ниже способом.

Ганглиозиды NАсСМ3 и NСсСМ3 растворяли отдельно в метаноле (4 мкл/мл) и в каждую лунку вносили 50 мкл. Планшет помещали при 37°С на полтора часа, чтобы выпарить метанол. Затем добавляли 100 мкл/лунку буфер трис-НС1 0,05М, рН 7,8, содержащий 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА), и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем 50 мкл сыворотки разбавляли тем же буфером и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре.

Лунки промывали 4 раза 200 мкл фосфатного солевого буфера (ФСБ) и добавляли 50 мкл антисыворотки мышиных антииммуноглобулинов, конъюгированной с биотином в соответствующем разбавлении, на 1,5 ч при 37°С.

После дополнительного промывания с ФСБ добавляли 50 мкл соответственно разбавленной щелочной фосфатазы, конъюгированной со стрептавидином. В конце лунки промывали последний раз и 100 мкл р-нитрофенилфосфатасубстрата растворяли в диэтаноламиновом буфере, рН 9,8 (1 мг /мл). Поглощение измеряли при 405 нм на счетчике ИФА.

Фиг. 1 показывает данные оптической плотности Ο.Ό. при 405 нм в сыворотке каждого животного, разбавленной 1/80 на 56-й день эксперимента. Ответ на NСсСМ3 и СМ3 определяли с помощью теста ИФА, используя мышиный анти 1дС, конъюгированный с биотином и стрептавидин со щелочной фосфатазой от Джексона.

Более 70% животных, иммунизированных препаратом вакцины, имели величины Ο.Ό. при

405 нм, превышающие 0,5 в ответ на NСсСМ3.

Все иммунизированные животные показывали

1дС ответ против NСсСМ3 и никакого ответа не наблюдали к NАсСМ3, несмотря на минимальные различия между этими двумя молекулами.

Фиг. 2 показывает длительный специфический ответ антител (изотип 1дС против ганглиозида ЫбсСМЗ, три месяца спустя после последней дозы иммунизации, при этом никакого ответа не было против ЫЛсСМЗ.

Пример 2. Получение моноклональных антител против ЫСсСМЗ.

Антитела получали иммунизацией мышей линии Ва1Ь/С с использованием процедуры, описанной в примере 1.

За три дня до слияния животных реиммунизировали иммуногеном ЫбсбМЗ/УЪПЬ, используя полный адъювант Фройнда. После чего получали селезенку мышиную и готовили клеточную суспензию, пропуская ткань через стальное сито, либо путем перфузии. Слияние клеток проводили как описано у КбЫег М11к!еш (ЫаШге, 1975, Νο. 256, 495-497) с некоторыми модификациями.

Клетки несекретирующей миеломы мыши Р3/Х63 Ад8 6.5.3 сливали с клетками селезенки мыши в соотношении 1:10, в 0,5 мл среды для слияния, содержащей 42% полиэтиленгликоля (3000-3600, Сигма) в среде ВРМ1 1640.

После слияния клетки культивировали в селективной среде НАТ (гипоксантин/аминоптерин/тимидин) при 37°С во влажной атмосфере 5% СО₂.

Между 10 и 15 днями после того, как провели клеточное слияние, начинали опыт по определению наличия антител в супернатанте культуры клеток гибридомы, используя технику ИФА, описанную в примере 1.

Отбирали клетки культуры гибридомы, которые реагировали на интересующий ганглиозид, и клонировали их дважды способом лимитирующего разбавления в присутствии кондиционирующих клеток.

Специфичность антител, образованных отобранными гибридомами, определяли, применяя косвенный тест ИФА с набором гликолипидов.

Количество специфических клонов против ганглиозида NСсСМ3 составляло 5,5%. Один из полученных клонов был обозначен как клон 14Р7.

Пример 3. Определение субкласса моноклонального антитела 14Р7.

Чтобы определить, к какому субклассу иммуноглобулинов относится моноклональное антитело данного изобретения, использовали косвенный тест ИФА с планшетами, покрытыми NСсСМ3, как описано в примере 1, но при этом заменяли сыворотку разбавлениями супернатанта от гибридомы или очищенным МАТ.

Мышиные Апб 1дС1, 1дС2а. 1дС2Ь и 1дС3, конъюгированные с биотином и полученные в крысах (Фарминген), разбавляли буфером для инкубации и вносили в лунки. После 1 ч инкубации при 37°С планшеты промывали и добавляли разбавленную в инкубационном буфере щелочную фосфатазу, конъюгированную стреп тавидином. В качестве контроля каждого субкласса использовали мышиные МАТ, предварительно охарактеризованные.

В конце добавляли раствор субстрата. Определение поглощения проводили, как описали раньше. Фиг. 3 показывает, что МАТ 14Р7 принадлежит к субклассу 1дС1.

Пример 4. Изучение специфичности моноклонального антитела 14Р7 с применением иммуноокрашивания в сочетании с тонкослойной хроматографией высокого разрешения.

Высокого разрешения тонкослойную хроматографию применяли для разделения гликолипидов. Система использованного растворителя представляла собой хлороформ:метанол:КС1 0,25% и 2,5 М ΝΗ₃ (5:4:1) объем:объем. Полосы проявляли с помощью орсина (8уеппегбо1ш Ь. 1964, 1. Ыр1б. Век., 5, 145), в то время как для иммуноокрашивания применяли способ КагакЫша Υ. с сотр. 1993 (1. Вюсбеш, 114, 186).

Пластины, на которых проводили тонкослойную хроматографию, покрывали пластиком, погружая на 75 с в раствор 0,1% полиизобутилметакрилата (ПИБМ) в Ν-гексане. Пластины затем высушивали при комнатной температуре в течение 30 мин. 1% раствором ПИБМ обрабатывали края пластины, оставляя их на ночь при комнатной температуре.

Блокирование неспецифических взаимодействий осуществляли, применяя в течение 30 мин раствор 1% бычьего сывороточного альбумина, растворенного в ФСБ, рН между 7,2 и 7,4. Немедленно после этого пластины инкубировали с МАТ 14Р7 с концентрацией от 0,01 до 0,02 мг/мл в растворе для блокирования.

Пластины промывали ФСБ и инкубировали с пероксидазой из хрена, конъюгированной с антисывороткой кролика против иммуноглобулинов мыши, разбавленной раствором для блокирования.

После одного часа инкубации с перемешиванием при комнатной температуре пластины снова промывали и добавляли раствор субстрата, состоящий из 0,4 мг/мл ортофенилдиамина (ί.’6Η8Ν2) Сигма в цитрат-фосфатном буфере 80 мМ, рН 5 с 0,12% перекисью водорода Н₂О₂ (В1ебе1 бе Наеп). Реакцию останавливали повторными промываниями фосфатным буфером.

Реакция выявила специфичность только в отношении ганглиозида NСсСМ3 и никакой реакции не наблюдали в отношении других Νгликолилированных ганглиозидов, обозначенных как СМ 1а, СМ1Ь, СМ2, и Ν-ацетилированных (фиг. 4 и 5).

Пример 5. Распознавание моноклональным антителом 14Р7 опухолевых и эмбриональных тканей.

Срезы тканей фиксировали в 10% забуференном растворе формалина, затем обезвоживали, осветляли и заключали в парафин. Гистопатологию исследовали на срезах тканей, окрашенных гематоксилин-эозином.

Серийные срезы, полученные из парафиновых блоков, использованные в гистопатологических исследованиях, подвергали иммуноокрашиванию способом биотин стрептавидин пероксидазного комплекса, предварительно описанного (Нки, 3. М. у Ваше, Ь., 1981, 1. Ηίκ1осйет Су1осйет. 29: 1349-1353).

Депарафинизированные и обезвоженные срезы обрабатывали 3% раствором метанола с перекисью водорода в течение 30 мин для удаления эндогенной пероксидазной активности. Срезы тканей инкубировали с очищенным МАТ 14Р7 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем следовали конъюгированные с биотином антимышиные антитела и стрептавидин пероксидазный комплекс (ЭакораОк) при комнатной температуре.

Между инкубациями срезы промывали солевым раствором буфера трис-НС1. Пероксидазную реакцию проводили с 5 мл раствора, забуференного трис-буфером. Добавляли также 0,005 мл 30% Н₂О₂ и 3 мг 3-3 диаминобензидина.

Срезы промывали водопроводной водой, окрашивали гематоксилином Майера, заключали в бальзам и покрывали покровным стеклом. Реакция с ферментом давала коричневокрасную окраску.

Кусочки ткани взрослого человека получали от людей, погибших при несчастных случаях и/или в результате смерти мозга, в течение первого часа после смерти. Свежую биопсию патологических тканей брали в течение первого часа после операции. Срезы эмбриональной ткани получали от эмбриона в возрасте от 12 до 18 недель в течение первого часа после аборта. Все кусочки биопсии промывали в солевом растворе и немедленно замораживали в жидком азоте и хранили в замороженном состоянии при -80°С.

Серийные срезы толщиной в 5 мкм получали из кусочков замороженной ткани в криостате Лейса при -25°С. Срезы высушивали на воздухе и использовали немедленно или хранили при -20°С завернутыми в алюминиевую фольгу. Во всех случаях срезы фиксировали в момент использования в 4% параформальдегиде в течение 20 мин.

Фиг. 6 показывает результаты иммуногистохимического исследования МАТ 14Р7 в тканях здорового человека. Реакционную способность МАТ в мембране и в цитоплазматической области не наблюдали.

Фиг. 7 показывает результаты того же исследования на патологических тканях. Все изученные ткани молочной железы (33/33) и меланомы (20/20) дали положительную реакцию, в то время как 70 опухолей легкого различной этиологии дали отрицательную реакцию также, как 33 различные опухоли центральной нервной системы.

Фиг. 8 демонстрирует распознавание МАТ 14Р7 в случае пищеварительной системы и эмбриональных почечных тканей.

Пример 6. Распознавание с помощью МАТ 14Р7 ганглиозида ЫСеСМ3 в клетках, изучаемых поточной цитометрией.

Изучаемые клеточные линии включали мышиную миелому Р3Х63, экспрессирующую СМ3 и ЫСсСМ3, описанную 1. Ми1Ыид и др. (МиШшд, 1. е! а1., 1994, 1. Вюсйеш 116: 64-73) и миелому В16, которая экспрессирует СМ3. Клетки культивировали в среде ВРМ1 с 8% бычьей эмбриональной сывороткой. Концентрацию клеток доводили до 10⁷ клеток/мл солевого фосфатного буфера рН 7,4, содержащего 0,02% азида натрия и 1% бычьего сывороточного альбумина. В каждую пробирку, содержащую 0,1 мл клеточной суспензии, добавляли 0,05 мл раствора МАТ 14Р7, растворенного в солевом фосфатном буфере до окончательной концентрации 0,1 мг/мл, и затем инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Клетки затем промывали раствором, в котором их суспендировали.

Затем клеточные культуры центрифугировали в течение 5 мин при низкой скорости, чтобы осадить. Добавляли антимышиный (1дС+1дМ) конъюгат биотина (Джексон) и промывали после 30 минутной инкубации при 4°С. В конце добавляли 0,002 мг флуоресцеин стрептавидина Р1ТС (Джексон) и инкубировали в тех же условиях, описанных ранее. Последнее промывание проводили солевым фосфатным буфером.

Супернатант после последнего центрифугирования выливали и клетки ресуспендировали в 0,6 мл раствора для последнего промывания.

80% клеток миеломы Р3Х68 давали положительную окраску с моноклональным антителом 14Р7 (фиг. 9).

Пример 7. Изучение прямой цитотоксичности у моноклонального антитела 14Р7.

Клеточную линию мышиной миеломы Р3Х63 инкубировали с МАТ 14Р7, как описано в примере 6. После промывания добавляли к клеткам 0,01 мл раствора пропидий йода в солевом фосфатном буфере для определения клеточной жизнеспособности с помощью поточной цитометрии.

Результаты показали, что 78% клеток мертвые (фиг. 10).

Пример 8. Изучение биораспределения 99тТс - меченого моноклонального антитела 14Р7 у мышей линии Ва1Ь/С, здоровых и несущих опухоль миеломы Р3Х63.

Двадцать женских особей мышей линии

Ва1Ь/С весом от 20 до 22 г (10 здоровых и 10, инокулированных опухолью миеломы Р3Х63 перитонеальным путем) получали внутривенную инъекцию МАТ 14Р7, меченого 99тТс.

Концентрация метки составляла 0,03 мг МАТ

14Р7/60 мкКи 99тТс.

Результаты определения радиоактивности в различных органах получали на 5 животных в каждой группе, через 4 и 24 ч после инъекции. Животных забивали и вес каждого органа определяли на весах Сарториус. Радиоактивность всех пробирок определяли одновременно, приблизительно через 25 ч после начала эксперимента на гамма счетчике ГС АББАС (модель ГСЕАЯЭ 1470).

Способ мечения был предварительно описан у 8с11\\'агх 81еш51га58ег (1987) и модифицирован у МиШет и ЕШкои в 1990.

Меченое МАТ 14Р7 удалялось из организма здоровой мыши с помощью почек и печени (фиг. 11).

У мышей с миеломой Р3Х63 связывание МАТ 14Р7 обнаружили через 4 ч (12% общей инъецированной радиоактивности на грамм ткани) и через 24 ч (35% общей инъецированной радиоактивности на грамм ткани). Удаление из организма МАТ происходило в основном через почки (фиг. 12).

Пример 9. Антиопухолевый эффект моноклонального антитела 14Р7 у мышей линии Ва1Ь/С, несущих асцитную миелому Р3Х63.

Самки мышей линии Ва1Ь/С весом 20-22 г инъецировались внутривенно 6 дозами моноклонального антитела 14Р7 (одну группу 0,1 мг и другую 0,2 мг) каждые 2 дня, моноклональное антитело растворяли в солевом фосфатном буфере. За три дня до эксперимента в брюшинной полости вызывали воспаление с помощью неполного адъюванта Фройнда, чтобы стимулировать момент, когда опухоль можно измерить. 10000 клеток мышиной миеломы Р3Х63 инокулировали внутрибрюшинно в 0 день эксперимента, в то же самое время когда пассивную терапию с моноклональным антителом 14Р7 начинали, только в случае моноклонального антитела проводили внутривенную инокуляцию. Контрольная группа с хорошим прогнозом (наилучшее лечение), используемая для сравнения, составляла третью группу, которую обрабатывали внутривенно циклофосфамидом (8йаида1 Ниа Б1аи Рйагшасеийса1 Согр.) с дозой 20 мг/кг веса тела, которая составляла еженедельную дозу в течение всего эксперимента. Внутривенная обработка раствором солевого фосфатного буфера, рН 7,4, служила контролем эксперимента.

Фиг. 13 показывает результаты по выживанию в 4 группах, предварительно описанных. В группах, обработанных 14Р7 (0,1 и 0,2 мг), а также 20 мг/кг веса циклофосфамида, не обнаружили измеримой опухоли у отдельных животных.

Результаты по выживанию были в пользу групп, обработанных МАТ 14Р7. На 30 день эксперимента, когда ни одно животное из контрольной группы не оставалось живым, 6 животных были еще живы, как из первой группы (0,1 мг МАТ) так и из группы, обработанной циклофосфамидом, а также 7 животных из второй группы (0,2 мг МАТ). На 60 день обработки 2 животных первой группы и 2 животных, обработанных циклофосфамидом, оставались живы, тогда как во второй группе 5 животных были еще живы.

Пример 10. Ингибирование опухолевого роста плотной миеломы Р3Х63 у мышей без тимуса.

В 0 день эксперимента 10 женским мышиным особям, лишенным тимуса из линии ои! Ьтеаб ИМК1, с весом от 20 до 22 г инокулировали подкожно 10⁶ клеток опухолевой мышиной линии миеломы Р3Х63. Животных разделяли на две группы по 5.

Одну группу начинали обрабатывать внутрибрюшинно очищенным МАТ 14Р7, по 0,15 мг в дозе (6 доз) каждые 2 дня. В то время как другая группа служила контролем и получала тем же способом то же число доз с той же частотой равный объем солевого фосфатного буфера.

Фиг. 14 показывает ингибирование роста опухолей у мышей, обработанных МАТ 14Р7, по сравнению с контрольной группой. Статистически значимые различия наблюдали у этих групп.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1 показывает уровни антител в сыворотке, полученных против ИСсСМ3, но не против СМ3, на 56 день эксперимента у мышей, иммунизированных препаратом вакцины, содержащим ИСсСМ3/УБПБ/полный адъювант Фройнда.

Фиг. 2 - определение с помощью теста ИФА изотипов ответа антитела на ганглиозид ИСсСМ3 в сыворотке мышей 3 месяца спустя после получения четвертой дозы 0,2 мг комплекса ИСсСМ3/УБПБ/полный адъювант Фройнда.

Фиг. 3 - определение с помощью теста ИФА субкласса иммуноглобулина, к которому относится моноклональное антитело 14Р7.

Фиг. 4 - распознавание с помощью иммуноокрашивания с тонкослойной хроматографией Ν-гликолилированных и Ν-ацетилированных ганглиозидов, которые использовали при изучении специфичности моноклонального антитела 14Р7.

Фиг. 5 - распознавание ганглиозида

NСсСМ3 моноклональным антителом 14Р7 при использовании иммуноокрашивания с тонкослойной хроматографией.

Фиг. 6 - отрицательный ответ в распознавании у нормальных тканей взрослого организма при обработке моноклональным антителом 14Р7 и последующем иммуногистохимическом исследовании.

Фиг. 7 - иммуногистохимическое распознавание некоторых злокачественных и доброкачественных опухолей человека моноклональным антителом 14Р7.

Фиг. 8 - иммуногистохимическое распознавание нормальной эмбриональной ткани человека моноклональным антителом 14Р7.

Фиг. 9 - распознавание клеточной линии миеломы Р3Х63, экспрессирующей ганглиозид ΝΟοΟΜ3, моноклональным антителом 14Р7 с использованием поточной цитометрии.

Фиг. 10. - комплемент независимое цитотоксическое действие ΜΑΤ 14Р7 при использовании клеточной линии миеломы Р3Х63 и методики пропидиум йод совместно с поточной цитометрией.

Фиг. 11 - биораспределение моноклонального антитела 14Р7, меченого 99тТс. Результаты в процентах гамма-излучения на вес в граммах в изучаемом органе у нормальных мышей линии Ва1Ь/С.

Фиг. 12 - биораспределение моноклонального антитела 14Р7, меченого 99тТс. Результаты в процентах гамма-излучения на вес в граммах изучаемого органа у мышей линии Ва1Ь/С, несущей опухоль миелому Р3Х63.

Фиг. 13 - антиопухолевый эффект пассивной терапии моноклональным антителом 14Р7 в группах мышей линии Ва1Ь/С, инокулированных мышиной асцитной опухолью миелома Р3Х63 и обработанных 0,1 и 0,2 мг указанного антитела в сравнении с контрольной группой, обработанной циклофосфамидом (20 мг/кг) и контрольной группой, обработанной солевым фосфатным буфером.

Фиг. 14 - ингибирование опухолевого роста ίη νινο на примере плотной мышиной миеломы Р3Х68 у мышей без тимуса, линия ои! Ьгеаб ΝΜΚΙ.

Claims (10)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Штамм гибридных клеток мыши 14Р7 ЕСАСС 98101901, продуцирующий моноклональное антитело 14Р7 против ганглиозидов ΝΟοΟΜ3.
2. 2. Моноклональное антитело 14Р7, продуцируемое штаммом гибридных клеток по п.1, специфично распознающее олигосахаридную последовательность Ν-гликолилированная га- лактоза - глюкоза - сиаловая кислота в ганглиозиде ΝΟοΟΜ3 и обладающее цитолитической активностью по отношению к опухолевым клеткам, содержащим указанную последовательность.
3. 3. Моноклональное антитело по п.2, отличающееся тем, что его цитолитическая активность в отношении опухолевых клеток, содержащих олигосахаридную последовательность Ν-гликолилированная галактоза - глюкозасиаловая кислота, может быть прямой или опосредованной комплементом.
4. 4. Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело, охарактеризованное в любом из пп.2, 3, и растворитель или наполнитель.
5. 5. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что антитело может быть связано с терапевтическим средством, таким как лекарственный препарат, радиоизотоп, иммуномодулятор, лектин и токсин.
6. 6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.4, 5, отличающаяся тем, что используется для лечения злокачественных новообразований.
7. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что злокачественное новообразование представляет собой злокачественную опухоль молочной железы, почки, органов пищеварительной системы или меланому человека.
8. 8. Реактив, содержащий моноклональное антитело, охарактеризованное в любом из пп.2, 3, связанное с такими маркерами, как ферменты, хромофоры, хемилюминесцентные вещества и радионуклиды.
9. 9. Применение реактива, охарактеризованного в п.8, для выявления опухолевых клеток.
10. 10. Применение по п.9, отличающееся тем, что опухолевые клетки представляют собой клетки меланомы человека, молочной железы, почки или органов пищеварительной системы, таких как печень, толстая кишка, желудок и прямая кишка.