PT95856B - Processo para a preparacao de novos anticorpos monoclonais anti-idiotipicos - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Rsãumo

O invento está relacionado com o prcessso para a preparação de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos que são a imagem interna de determinantes reconhecidos por um anticorpo monaclonal no antigénio de alto peso molecular associado a melanoma ÍHMW—KAft), de derivados dos anticorpos e de linhas celulares de hibridoma que segregam tais anticorpos monoclonais anti-idiotípicos. Os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos são úteis na determinação de anticorpos dirigidos contra o antigénio de alto peso molecular associado a melanoma, para a modulação da resposta imune contra HMW-MAA e para o tratamento de meIanoma» referido processo de multiplicarem, in vitro ou in vivo, de hibridoma que segregam os reter anti-idiotípicos e, quando riecessári monoclonais- anti-idiotípicos e/ou se preparação consista em se células de uma. linha celular idos anticorpos monoclonais o, se isolarem os anticorpos converterem nos seus derivados.

fe

invento diz respeito a novos anticorpos eiurinos anti-idiotípicos que são a imagem interna de determinantes reconhecidos por um anticorpo monoclonal em antigénio de alto peso molecular associado a melanoma ÍHMW-MAA), derivados ds anticorpos, linhas celulares ds hibritíomas secretoras de tais anticorpos monoclonais anti-idiotípicos e processos para a preparação de tais anticorpos monoclonais anti-idiotípicos, dos seus derivados e de linhas celulares de hibridomas. Os anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos são úteis na determinação de anticorpos dirigidos contrra antigénio ds alto peso molecular associado a melanoma, para a modulação da resposta imune contra HMW-MAA s para o tratamento de melanoma»

Fundamen to do Invento

Os melanomas são tumores da pele, menos frequentemente das membranas mucosas, alguns dos quais são benignos» Os melanomas malignos são carcinomas de origem neuroectodèrmica geralmente derivados de melanócitos (células produtoras de pigmentos), algumas vezes de membranas mucosas, do revestimento corióide ou das meninges. Existem vários tipos de melanoma maligno que diferem na localização, modo ds alastramento e produção de metástases» tratamento convencional de melanoma inclui cirúrgia, radioterapia ou quimioterapia e a aplicação de modificadores da resposta biológica» No entanto, estes métodos provaram ser insuficientes para combater a doença, e=g» para evitar a recur— rência de tumores e são complicados por um grande número de efeitos secundários» Portanto, é desejável desenvolver abordagens terapêuticas que ultrapassem estas desvantagens e possam substituir ou ser usados era combinação com tratamento convencionai«

Uma vez que o sistema imune parece estar altamente envolvido na patogenese desta doença, o tratamento mais adequado seria um método de imunoterapia activa, por exemplo baseado na aplicação de anticorpos anti-idiotípicos específicos» Ds anticorpos anti—idiotípicos são dirigidos contra idiotipos de anticorpos particulares» Os anticorpos anti-idiotípicos são dirigidos contra idiotopos de anticorpos particulares (série completa de determinantes da região variável do anticorpo), e são produzidos usando anticorpos como imunogénios. Os anticorpos anti-idiotípicos são portanto muitas vezes designados como Ab 2 (anticorpo 2) enquanto que o anticorpo imunizante é referido como Ab 1 (anticorpo 1), Nos últimos anos» mostrou-se que os anticorpos anti-idiotípicos .induzidos contra anticorpos contra uma variedade de antigénios são reagentes úteis para manipular a resposta imune contra os correspondentes antigénios, presumivelmente através do equilíbrio dos sinais de amplificação e supressores entre as subsériss de células imunes» São de especial interesse para aplicação terapêutica os anticorpos anti-idiotípicos do tipo imagem interna que simulam o antigénio inicial e poem substitui—lo» Para a terapia de tumores, são anticorpos anti-idiotípicos adequados os que são induzidas contra anticorpos específicos de antigénios associados a tumores» Em melanoma, alvos adequados para a produção de anticorpos anti-idiotípicos e para o desenvolvimento de abordaÍMAA), alguns dos quais foram identificatícs e caracterizados pelo seu peso molecular, por exemplo antigénio de alto peso molecular associado a melanoma (HMW—MAA) com um peso molecular de

Qb j ect ivo do invenLa

Constitui usii objectivo deste invento proporcionar anticorpos monoclonais (MAbs) murinos anti-idiotípicos que são a

imagem interna de determinantes reconhecidos por anticorpos monoclonais de antigénio ds alto peso molecular associado a melanoma (HMW-MAA). Tais MAbs anti-idiotípicos podem ser produzidos usando antcorpos monoclonais, e.g. anticorpos monoclonais singeneicos, dirigidos contra. HMW-MAA para imunização, do anticorpo imunizante determina quais os epítopos são simulados pelos anticorpos anti-idiotipicos.

ds escolha

HMW-MAA

Os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos do invento têm funções imuno-reguladoras tais como a estimulação de imunidade humoral e celular. Consequentemente, os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos do invento podem ser usados para muitos fins de diagnóstico e terapêuticos, e.g. para o controle, prevenção, tratamento e seguimento de melanoma.

Descrição do invento

O invento diz respeito a anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos que são a imagem interna reconhecidos por um anticorpo monoclonal no peso molecular assocxatío a melanoma ÍHMW—MAA) que retenham a especificitíade do anticorpo dos quais derivam.

oe ue cermman ues antxgénio de alto e seus derivados

Us âiitxuo. pGíxs sni-i ifliutipims íko 2) báo dif xgidos contra a região variável de uma outra molécula de anticorpo (Ab 1), i.e. contra idiotipos ds anticorpos particulares (série completa de determinantes da região variável do anticorpo)= Ds anticorpos anti-idiotípicos tipo imagem interna são reactivos com estruturas de ligação a antigénio no anticorpo imunizante que são campiementares do antigénio, i.e.tais anticorpos representam a imagem conformacional no espelho do antigénio e podem ser usados como seus substitutos. Os anticorpos tipo imagem interna in vitro inibem a ligação do anticorpo imunizante a células alvo e induzem y

anticorpos anti-idiotipicos in vivo, também designados como Ab 3 (anticorpo 3>, osquais são dirigidos contra o antigénio e te'm o mesmo padrão de reactivida.de de Ab 1»

No presente invento, os anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos, os quais são produzidos contra anticorpos monoconais anti-HMW-MAA como aqui descrito detalnadamente abaixo, simulam determinantes de HMN-MAA reconhecidos pelos anticorpos imunizantes» Eles reconhecem idiotopos com o sítio de combinação ao antigénio do anticorpo monoclonal imunizante anti-HMW-MAA Ab í e portanto inibem a ligação de Ab 1 a células de melanoma expressando HMW-MAA e induzem anticorpos anti-anti-idiotípicos (Ab 3) reactivos com HMW-MAA. A especificidade dos anticorpos monoclenais anti-idiotípicos de acordo com o invento para o anticorpo monoclonal imunizante anti-HMW-MAA é testada num imunoenssio, por exemplo um ensaio ds ligação em que veículos são revestidos com Ab i, incubados com os anticorpos monoclonais do invento anti—idiotípicos marcados radioactivamente ou com enzimas e a marca ligada é detectada, Para investigar ss os anticorpos monoclonais murinos anti—idiotípicos reconhecem idiotopos dentro do sítio de combinação com o antigénio do anticorpo monoclonal usado para imunização, testou-se a sua capacidade para inibir a ligação de Ab í a células de melanoma expressando HMN-MAA, por exemplo num isiunoensaio. Tal imunoensaio pode ser um radio-imunoensaio ou ensaio com enzimas competitivo em que o anticorpo monoclonal imunizante anti-HMW—MAA marcado, e,q, rsdioactivamente ou com enzima, é incubado com um -correspondente anticorpo monoclonal anti-idiotípico do invento, a mistura é adicionada a células d© melanoma portadoras de HMW—MAA, e»g» células de melanoma em cultura Colo 38 e a marca ligada é medida após subsequente incubação» Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos do inventosão do tipo imagem interna, analisa—se ss eles são capazes de induzir anticorpos anti-idiotípicos que sejani

reactivos com HMW-MAA ε apresentam o mesmo padrão ds reactividade de Ab 1» A indução de anticorpos anti-itíiotipicos pode ser efectuada num modelo animal, por exemplo em murganho. Os anticorpos anti-anti-idiotxpicos gerados são testados por exemplo quanto à sua especificidade para HMW-MAA, e.g. num imunoensaio que analisa a sua ligação a células de melanoma portadoras HMW-MAA, e análise electroforética, por exemplo electroforsse em gel ds dodecilsulfato de sódio-poliscrilsmida (SBS—PABE), dos antiqénios imunoprecipitados das células. Os anticorpos anti-anti-idiotípicos podem também ser testados quanto à sua reactividsd-a com os anticorpos anti-idiotípicos usados na indução.

antigénio de alto peso molecular associado a melanoma (peso molecular > í 000 000) foi escolhido como alvo para a produção de anticorpos anti-idiotípicos uma vez que HMW-MAA preenche a maior parte, senão todos, os critérios para o desenvolvimento de abordagens imunoterapãuticas no tratamento de melanoma, como indicado pelas características mostradas na Tabela 1 abaixo,

Tabela í Características doHMW—íiAA

Distribuição na células i

Frequência em lesões de melanoma removido círúrqicamente.;

Distribuição em tec idos no rma iss

ligada á membrana elevada (pelo menos 83% das lesões testadas) restrícta (apenas células basais tía epiderme e foiíc u1os pi1osos)

Nível no soro; baixo

Susceptibilida.de à modulação baixo por anticorpos e linfoquinass

Densidade em células tumoraiss a I ta (en tre 1 χ ί e 2x i e s í t i os ant igén icos/ c é 1u1a de melanoma em cultura)

Qs anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos do invento podem ser de qualquer classe/sub-c lasse de imunoglobulina, de preferência da classe de imunoglobulina IgG, em particular da subclasse de imunoglobulina IgSl» Uma vez que diferentes isotipos de anticorpos anti—itíiotípicos podem ter diferente acção imuno— -reguladora, os MAbs anti-idiotípicos podem ser escolhidos de acordo.

Em particular, o invento diz respeito a anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos que são a imagem interna de monoclonal monoclonal

reconhecidos pelo anticorpo •designado MAb 763 = 74 e seus derivados, 0 anticorpo MA.is763.74 está descrito por F'= Siacomini et al. (J A9A determinantes de HMW-MAA

Immunol. 135, é especialmente preferido o anticorpo monoclonal murino anti-idiotípico designado MAb MK2-23 e seus derivados» Este MAb anti-idiotípico é induzido contra nftb763=74 e è a imagem interna de determinantes de HMW-MAA reconhecido pelo MAb 763.74. 0 MAb MK2-23 è capaz de induzir anticorpos que simulam as características qo Mao z&O»/e=

Os derivados de um anticorpo monoclonal anti-idiotípicodo invento ret’s’m a especificidade do ancxcorpo de onde derivam, i.e. eles mantêm o padrão ds ligação característico do anticorpo parental. São exemplos de tais derivados os fragmentos de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos, conjugados dos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos com um veiculo que aumente a imunogenicidade, com uma enzima, com uma marca fluorescente, com uma marca guimioluminescsnte, com um quelato de metais, com partículas paramagnéticas.

'.om a vi o mi :om biotina ou similares, ou anticorpos monoclonais anti-idiotípicos marcados radioactivaisent <=» „ í ragmenrus de anticorpos do inventu são por exemplo us fragmen tos univs1entes Fiais’ ab^? DU f F*c&y ÍTf£h i Lu O Í Vel x 5Π uS?

Moléculas de veículos adequadas que aumentem a imunogsnicidad-s dos anticorpos monoclonais anti—idiotípicos do invento são por exemplo proteínas ricas- em lisina com grupos amina livres disponíveis para acoplagem, especialmente proteínas ds alto peso Ui ft!

Ç o:--amilase de Bacillus subtil is (PM 58 ©v©) ou hemocianina de lapa ÍLH5 PM > 1 %£& 000) que podem ser adquiridas comereialmente em grandes quantidades» Também podem ser usados como veiculas tiroglobulina porcina, toxinas tais como toxina do tétano, cólera ou difteria, albumina sérica humana (HSA), β—2 microglobulina e similares» Dutras moléculas veículo possíveis incluem polissacáridos, lipopaiissacáridos sintéticos ou naturais, polipeptídeos sintéticos tais como polilisinas, membranas activadas, partículas de látex, bactérias tais como Salmonella, e similares»

Enzimas usadas para conjugados- de anticorpos do invento são por exemplo, peroxid-as-e de rábano silvestre, fosfatase alcali na, j3-D ~g a 1 ac tos i d-ase, g 1 uc oss-o x i d ase, andrase carbónica, acetilcolinesterase, lisozima, genase ou glucose-ó-fosfato-desidroqenase, g1ucoamiIase, •i-ala to~desid ro—

Marcas invento podem ser fluoresceína, fluorocrómio, rodamina e simíla fluorescentes conjugadas com anticorpos do res»

Marc as qu irnio1uminescen ts são e»q» derivados ae

São exemplos de quelatos de metais- o ácido etileno— diaminotetracético CEDTA), ácido dietiilenotriaminopentacético CDPTA), í,4,8,íl-tetraazatetradecsno, ácido í,4,5,ií-tetraazatetradecano-1,4,8,ll-tefcracética, ácida l-oxa-4,7,12,15-tetraaza-heptadecano-4,7,12,15-tetracético ou similares»

Em tais conjugados, o anticorpo é ligado ao parceira de conjugação directamente ou através de um espaçador ou grupo 1igante»

Qz> an tiuor pos do con têm e.g» iodo rad iosc ti vo i 4 carbono i“ C>„ enxofre (^3SSÍ similares.

invento marcados radioactivamente ,123, 125, 131 \ I» i,

V0 itrio C V)

I) tecnécio C trício .. 99m

Tc)

Ή), ou

Os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos do invento e seus derivados são obtidos por processos conhecidos per se em que celuias de uma Ixnha celular de hxbridoma sscrsuors oos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos pretendidos são multiplicados in o ou in vivo e, quando necessário» os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos obtidos são isolados e/ou convertidos nos seus derivados».

fi multiplicação in vitro ê realizada em meios de cultura adequados, os quais são os meios ds cultura convencionais, por exemplo Dulhecco’s Modified Eagle Médium CDMEhl) ou meio RF‘MI 164®, f acul tativamente complementado por um soro de mamífero, e»g» soro fetal de vitela ou micronutrientes e e suplementos de suporte do crescimento, e.ç. células de suporte í”feeder^s'> tais como células de exsudato peritoneal de murganho normal.

células do baço, macrófaqos da medula

-amxnoeta.no insulina, transferrina, lipoproteína da baixa densidade, ácido oiexco ou similares,

A produção in vitro proporciona preparações de anticorpos relativamente puras e permite o aumento da escala para obtenção de grandes quantidades dos anticorpos pretendidos» As técnicas para a cultura de células de mamífero em condições ds cultura de tecidos são conhecidas e incluem cultura em suspensão homogénea, e,g. e.m fibras ocas, microcàpsulas, em microsfsras de agarose ou ds porcelana anticorpos monoc ionais cação das células in

Podem também ser obtidas grandes quantidades dos anti—idiotipicos pretendidos por muitipii— vivo. Com esta finalidade, células de hibridoma produtoras dos anticorpos pretendidos são injectadas em mamíferos histocompatíveis para provocar o crescimento de tumoresprodutores de anticorpos» Facultativamente, os animais são préviaroente injectadas com um hidrocarboneto, especialmente óleosminerais tais como prista.no Ctetrametilpentadecano), antes da injecção. Após uma a três semanas, os- anticorpos são isolados a partir de fluídos do corpo daqueles mamíferos. Por exemplo, células de hibridoma derivadas de murganhos Balb/c que produzem os anticorpos monoclonais pretendidos são injectados intraperitonealmente em murganhos Balb/c facultativamente pré-tratados com pristano, e após uma a duas semanas, o fluido ascítico é retirado dos animais.

Fragmentos dos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos, por exemplo Fab» Fab⁵ ou FCab⁵ podem ser obtidos a partir dos anticorpos anti-idiotípicos preparados como descrito atrás por métodos conhecidos per se, e«g» por digestão com enzimas tais como papaína ou pepsina e/ou clivagem das ligações dissulfureto por redução química,

Os derivados dos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos do invento com imunogemc idade melhorada são preparados por métodos conhecidos per se, quer por adsorção do anticorpo monoclonal anti—idiotípico ao veículo quer por acoplagem usando periodato, glutaraldeido, cartaodiimidas e,g» SM,N⁵-o~fenilenodimaleimida, hl— C —m—maleimidohenzoilox i) —succinimida, hl— C 3—Ϊ2 ’ — piri— di1 tio)-propionox i)-succinimida, N-eti1-N⁵ -< 3-d imeti1aminopropilícarhodiimida ou similares

Conjugados de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos com uma enzima, um-a marca fluorescente, uma marca do invento quimioluminescente, um quelato tíe metais, partículas paramagnéticas, avidina, biotina ou similares, são preparados por métodos conhecidos na área, e.g. por reacção de um anticorpo preparado como descrito atrás na presença ds um agente de acoplagem, e.g» g1utaraldeído, periodato, W,M^?-o-feni1enodima1eimida, M-Cm-maleif n i doben z oi1ox i > ~suc cin imida, M-C 3-C 2^?-p i rid i1d i ti o 3-propi onox i) — succinimida.

ití 1~N^? •dimetilaminopropil>-carbodiimida ou similares» Os conjugados com biotina são preparados e»g» por reacção de anticorpos com um éster activado de biotina como seja· éster N-hidroxi-succinimida da biotina» Os conjugados com marcas fluorescsntes ou quimioluminescentes são preparados na presença de um agente de acoplagem, e.g. os referidos atrás ou por reacção com isotiocianato. ds preferencia fluoresceína—isotiocianato.

Us anticorpos monoclonais anti-idiotípicos marcados radioactivamente com iodo C i3i

1) são obtidos a partir se, por dos anticorpos do invento por iodinação conhecida per exemplo com sódio radioactivo ou potássio radioactivo e um agente ds oxidação química, como seja com hipoclorito ds sódio, cloramina T ou similares, ou um agente de oxidação enzimático, como seja lactoperoxidass ou glucose oxidase e glucose» Anticorpos de <?ζ'5 acordo com o invento são marcados com ítrio C'''¥) por exemplo por quelação com ácido dietilenotriaminapentacético (DPTA)» Os anticorpos marcados com tecnécio-Wm são preparados por processos de permuta de ligandos, por exemplo por redução de pertecnato (TcO^ ) com solução de ião estanhoso, fazendo a quelação do tecnêcio reduzido numa coluna de Sephadex e aplicando os anticorpos a esta coluna, ou por técnicas de marcação directa, e.g. por incubação de pertecnato, um agente redutor tal como SnCl_o, uma solução tampão tal como sedução de ffalato de potássio e sódio e os anticorpos»

inveno diz ainda respeito a linhas celulares ds hibridomas que secretam os anticorpos monoclonais antí-idiotxpicos murinos do invento»

Em particular, o invento diz respeito a linhas celulares de hibrídoma que são híbridos de células de mieloma e de linfócitos B de um ratinho imunizado com um anticorpo monoclonal, preferencialmente um anticorpo monoclonal singeneica, dirigido contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma» Preferencialmente, estas linhas celulares são híbridos de células de mieloma de murganho e de linfócitos B de um murganho, por exemplo luts murganho Balb/c, imunizado com MAb7ó3»74» έ especialmente preferida a linha celular de hibrídoma MK2-23 que foi depositada na American Type Culturs Collection ÍATCC), 12301 Parklawn Drive, Pockville, MD 20852, USA, em 31 de Outubro, ÍP89, com o número HB 10288=

As linhas celular camente estáveis, secretam cos murinos do invento com mantidos na. forma, de cultur gexaçao e faculcacivamence ss de hibrídoma do invento são genéti— anticorpos monoclonais anti-idiotipiespecificidade constante e podem ser a. congelaoa e reac eivadas por descon— r ec1onagem» □ invento também diz respeita a um processo para apreparação de linhas celulares- de hibrídoma secretoras de anticorpos monoclonais anti-idiotípieos murinos do invento em que um murganho é imunizado com um anticorpo monoclonal, de preferência um anticorpo monoclonal singeneica, dirigido contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma. ou um seu conjugado.

as célula?

•=s Esroautoras ue •pos oo murganno serem fundida?

com células de uma linha contínua, as células híbridas obtidas na fusão serem danadas e seleeeionados os- clones de células sscretando os anticorpos monoclonais pretendidos»

□ imursogénio usada para induzir anticorpos monoclonais anti-idiotípicos é ele mesmo um anticorpo monoclonal» Anticorpos imunizantes adequados para a produção dos MAbs murinos anti-idiotípicos do invento são anticorpos monoclonais, em particular anticorpos monoclonais singeneicos íhomogéneos}, que reconhecem idiotopos em antigénio de alto peso molecular associado a melanoma» Os anticorpos monoclonais adequados podem ser ds isotipo ds imunoglobulina» Conforme explicado atrás, a cidade do anticorpo monoclonal usado na imunização determina quais os determinantes do antigénio ds alt associado a melanoma que são simulados pelo MAbs anti-idiotípicos e podem portanto ser escolhidos individualmente dependendo do tipo de reacção imune que se pretende influenciar pela aplicação anti-idiotípicos qualquer especifiin<

peso molecular as i x z c or pus moi ?oc 1 ona z preferido ê o MAb 763=74 (P um zmunogénzo

Giacomini et al», loc» cit») antigénio, i=e= o anticorpo monoclonal imunizante, pode ser acoplado a um veiculo para aumentar a imunogenicidade do anticorpo monoclonal» As moléculas de veiculo adequadas são por exemplo proteínas ricas em lisina com grupos amina livres disponíveis para acoplagem, especialmente proteínas de alto peso molecular tais como a albumina sérica bovina (BSA; PM 66,20®}, «-amilase de Bac i 11 us subtil is CPM 58 ®®®> ou bemocianina de lapas ÍKHL; PM > 1 &&Φ ®®®> que podem ser adquiridas comercialmente em grandes quantidades» Podem também ser usadas como veiculo tiro™ globulina porcina, toxinas tais como toxinas do tétano, cólera ou difreria, aloumina sérica humana (HóA), β—2 microglo-bulzna e similares» Outras moléculas veículo possíveis incluem polissacá— ridos, lipopolissacáridos naturais ou sintéticos, polipeptídeos sintéticos tais como polilisinas, membranas a-ctivadas, partículas de látex» bactérias tais como Salmonella e similares»

Os conjugados imunogénicos do invento são preparados por métodos conhecidos per se quer por adsorção do anticorpo monoclonai imunizante ao veículo quer por acoplagem usando periodato, glutaraldeído, carbodiimidas e.g. N,N’-α-fenilenodxmaleimida, N-C-m-maleimidobenzoiloxi)-succinimida, N-<3-C2’-piri~ diIdi tio 3-propionoxi)-succ in imida , N-e til-N ’ -í3~d ime ti1 aminopropil)-carbodiimida ou similares.

έ preferido um conjugado do anticorpo monoclonai imunizante em que o MAb imunizante é acoplado a hemocianina de lapa UiLH) com glutaraldeído.

□ imunogénio pode ser misturado com adjuvantes, i.e. agentes que aumentarão a resposta imune, para o processo de imunização. Os adjuvantes possíveis são adjuvante completo de Freund (emulsão ds óleo mineral. água e extractos de micobactério), adjuvante incompleto de Freund (emulsão de água e óleo apenas), géis minerais, e.g, géis de hidróxido de alumínio.substâncias tenso-activas tais como lísolecitina, polianiSes, peptí— deos, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), etc..

As vias de imunização incluem, entre outras, injecções in tradermxcas, subcuxaneas, xn orarousculares, in traperitoneais, intravasculares e intracraniais. Uma vez que se pretende títulos de anticorpos elevados, normalmente dá—se várias injecções» A imunização ê por exemplo efectuada através da injecção de antigénio duas, três, quatro ou mais vezes parenteralmente, e.g. intraperitonealmente e/ou su-hcutãneamente, em intervalos regulares ou irregulares de alguns dias, e.g. três a sete dias, até vários meses, por exemplo quatro semanas.

As células produtoras de anticorpos dos murganhos imunizados, de oreferência células linfóides. retiradas por

exemplo um -a cinco dias após a última injecção, são fundidas- oom as células- de uma linha celular continua, i.e, um cxone ds células que ss replicam continuamente que confere esta capacidade ae replicação exemplo de tal

CSiLíl at híbridas resultantes da fusão. Um linha celular ê uma linha de células de tumor

Cmieiorna) que não produz pu?

imunoglobulinas ou seus para produzir e secreta?fragmentos mas que tem o potencial grndes quantidades de anticorpo e que ê portadora de uma marca genética de tal forma que as células híbridas podem ser seleccionadas contra células parentais não fundidas ío conhecidas várias linhas celulares de mieloma adequadas» São preferidas as linhas celulares de mieloma que não possuem a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase CHGPRT5 ou a enzima timidina-cinase CTK), as quais não sobrevivem pois num meio sem HAT e não secretam imunoglobulinas ou seus- fragmentos, como sejam as linhas celulares F‘3xó3Ag8»ó53 ou Sp2/0-Agi4«

A fusão é efectuada na presença de um promotor de fusão, por exemplo vírus Sendai ou outro paramixovírus, faculta— tivamente na forma inactivada com UV, ou. fusogénios químicos tais como iões cálcio, lípides tenso-activos, s.g» 1isolecitina ou rtrodusão» De preferência, as ι um excesso de crês a vinis animais imunizados numa solução de polietilenoglicol de um

tilenoglicol	CPfcG) ou por e
as de mieiorna	são fundidas
de células	do baço de aí
ndo cerca de	3@% a cerca de
molecular ent	re 1000 e 40®O.

Após a fusão, as células foram ressuspensas e cultivadas num meio selectivo escolhido dependendo da marca genética de selecção, por exemplo meio HAT» Neste meio,apenas as células de hibridoma sobreviverão, pois elas combinam a capacidade para crescer e replicar in vitro herdadas das células ds mieloma parentais e -a ausência ds genes KQPRT ou TK essenciais para a

sobrevivência em meio HAi herdado das células de baço produtoras de anticorpos dos mamíferos imunizados»

Os meios ds cultura adequados para a expansãodss células ds hibridoma são os meios de culturas convencionais, tais como Dulbecco’s Modifisd Eagle Médium CDMEM), meio mínimo essencial, RPMI 164€? e similares, facultativamente suplementado cosi um soro de mamífero, e»q« a 15% de soro fetal ds vitela. De preferência, células ds suporte, e.g»células do sxudato peritoneal ds murganho normal» células do baço, macrófagos da medula óssea ou similares, são adicionadas no começo do crescimento celular imediatamente após o passo de fusão para alimentar as células de hibridoma e suportar o seu crescimento, especialmente sempre que as densidades celulares forem baixas, através do fornecimento da factores de crescimento e similares» Se se usar células fagocíticas tais como macrófagos ou monócitos, eles podem desempenhar um serviço útil n-a limpeza dos detritos das células de misloma mortas sempre encontrados após tratamento com aminopterina» Os meios de cultura são suplementados com meio selectivo para evitar que as células de misloma cresçam mais que as células de hibridoma»

Os sobrenadantss das culturas de células de hibridomas são despistados quanto aos anticorpos monoclonais murinos ariti-idiotípicos pretendidos com um imunoensaio, de preferência cosn um radioimunoensaio ou ensaio ligado a enzima» Tal imunoensaio é por exemplo um ensaio de ligação indirecta em que um veículo è revestido com o anticorpo .monoclonal imunizante ou um seu fragmento, os sobrenadantss de hibridoma são adicionados e os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos encontrados ligados ao veículo são detectados pela adição de anticorpos marcados que reconhecem os anticorpos anti—idiotípicos»

XCÍ

As células ds hibridoma positivas são clonadas, e.g. por diluição limits ou sm agar mole, ds preferência duas ou mais vezes» Facultafcivamente, as células ds hibridoma são passadas através ds animais, e.g» murganhos, por iniecção intraperitoneal® colheita das ascites, α que sstatailizaos hibridoma® e melhora as características de crescimento. As linhas celulares clonadas podem ser congeladas ds forma convencional» □s anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos s seus derivados de acordo com o invento são úteis para uma série de fins de diagnóstico e terapêuticos» As vantagens da utilização de anticorpos monoclonais anti-idiotipo tipo imagem interna em vez do próprio HHM—MAA são por exemplos maior imunogsnicidade dos MAbs anti-idiotípicos, estimulação dos clones ds células B normalmente não responsivos a HMW—MAA pelos MAbs anti-idiotípicos, possível geração de células T citotóxicas anti-HMW-MAA, as quais não estão restringidas a HLA classe I, pelos MAbs an ti-i diotípi cos,, eliminação de efeitos secundários que possam estar associados com a aplicação ds HMW-MAA, facilidade de produção ds grandes quantidades ds MAbs anti-idiotipicos.

Qs anticor seus derivados de a usados para modular mo1scu1ar assoe iado 1adoras dentro da modul-ação έ específ anticorpo monoc1onal pos monoclonais murinos anti-idiotípicos e .cordo com o invento podem por exemplo ser a resposta imune a antigénio de alto peso a mieloma devido ãs suas funções imuno-regurede ds reacções idiotipo-anti-idiotipo. A ica s pode ser dirigida pela escolha do usado para a produção dos MAbs anti-idiotípicos,

dos MAbs anti-idiotípicos , uma vez que diferentes isotipos dos anticorpos anti-idiotípicos pode ter diferentes seções imuno-reguladoras.

Consequentemente» os MAbs anti-idiotípicos murinos e seus derivados de acordo com o invento são agentes úteis no controle e tratamento de melanoma, ou seja podem ser empregues com êxito e»g« para prcsvocar a regressão de tumores e/ou evitar a recorrência de tumores» Ds MAbs anti-idiotipicos do invento podem ser feitos de encomenda para simularem determinantes específicos de HMW-MAAatravés da escolha adequada do anticorpo imunizan— te.

Ainda, os MAbs anti-idiotípicos do invento são úteis na prevenção de melanoma -pela indução de imunidade contra os determinantes do antígênio de alto peso molecular associado a melanoma reconhecido pelo anticorpo monoclonal ímunizante» invento também diz respeito a composições farmacêuticas compreendendo um anticorpo monoclonal murino anti-idiotípico e/ou um seu derivado ds acordo com o invento» As composições farflíacêuticas compreendem por exemplo, os anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos e/ou seus derivados numa quantidade terapêufcicamente eficaz juntamente ou misturado com veículos inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos» São preferidas composições farmacêuticas compreendendo um derivado de um anticorpo monoclonal murino anti-idiotípico do invento que é um conjugado de uma anticorpo monoclonal anti-idiotípico com um veículo que aumenta a imunogenicidade, em particular com hemocianina de lapa (K.LH) . As composições farmacêuticas do invento podem também compreender adjuvantes» i.e» agentes que aumentam mais a resposta imune, Possíveis adjuvantes são adjuvante completo de Freund (emulsão de óleo mineral, água extractos de

micobactério), adjuvante incompleto de Freund (emulsão de água e óleo apenas), géis minerais, e.g» géis substâncias tenso-activas tais como peptídeos, BCG (Bacillus Calmette-Guerin), etc== São particularmente preferidas as composições farmacêuticas compreendendo um conjugado de um anticorpo monoclonal anti-idiotípico com um veículo que aumenta a imunogemcidade e um adjuvante, de preferência um anticorpo -monoclonal anti-idiotípico acoplado a hemo— cianina de lapa CKHL) e .Bacillus Calmstte-Suerin (BCG).

de hidróxido de alumínio. 1iso1ec i tina, ρο i i an iSes«

São preferidas as composições farmacêuticas para administração parenteral» As composições para aplicação intramuscular, subcutânea ou intravenosa, são e.g. soluções aquosas isotónicas ou suspensões, facul t-ati vamente preparadas imediatamente antes de usar a partir de preparações liofilizadas ou concentradas» As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e conter adjuvantes e.g» para conservação, estabilização, humedecimento, emulsionação ou solubilização dos ingredientes, sais para -a regulação da pressão osmótica, tampão e/ou compostos reguladores da viscosidade, e»g= carboxicelulose sódica, dextrano, polívinilpirrolidina ou gelatina. Elas são preparadas por métodos conhecidos, e.g» por mistura, dissolução ou liofílização convencional, e contêm entre aproximadamente 0,01% e aproximadamente 50% dos ingredientes activos. As composições para injecções são processadas,introduzidas em ampolas e seladas em condições assépticas de alordo com métodos conhecidos» modo de administr seleccionados de acordo com a ração as características do do melanoma tratado e similares, entre aproximadamente 30 μο dependendo do estado do doente ação e dosagem específicos serão prescrição médica tendo em consids— ente, o estado da doença, o tipo de A dose terapêutica para mamíferos é e 100p,g por Kg de peso de s do iiiOQQ de aplicação» corpo

Per exemplo num estuda com dez melanoma avançado = pacientes sofrendo de a aplicação do anticorpo monoclonal murino anti-idiotípico Mftb MK2-23 de acordo com o invento resulta na remissão completa num doente e na remissão parcial noutro doente.

Os MAbs murinos anti-idiotípicos e seus derivados de acordo com o invento podem também ser usados para a determinação qualitativa e quantitativa ds anticorpos dirigidos contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma. Isto é especificamente útil para o controle do tratamento de melanoma com os MAbs murinos anti—idiotípicos & seus derivados.

Poe exemplo, os anticorpos monoclonais murinos anti-idiota.picos ou seus derivados de acordo com o invento podem ser usados em qualquer um dos imunoensaios conhecidos que se baseiam na interseção de lipacão entre os idiotopos dos anticorpos dirigidos contra HMW-MAA e os anticorpos monoclonais anti-idito— típicos. SSo exemplos de tais ensaios os radioimunoensaios, imunoensaios ligados a enzimas, marcas fluorescentes, químiolumi— nescentes, imunoprecipitação, aglutinação com látex e hemaglutiΠ-SÇ-âQ »

Os anticorpos monoclonais murinos anti-idíotípicos de acordo com o invento podem ser usadas como tal ou na forma de derivados marcados radioactivamente num radioimunoensaio CRIA). (Que ser usada qualquer uma d.as modxfxcações oe Hih, por exemplo RIA em fase solúvel (homogénea), RIA em fase sólida Cheterogénea), RIA simples ou RIA dupla (sanduíche), RIA com determinação directa ou. indirecta (competitiva) dos anticorpos dirigidos contra antigénio- de alto pesai molecular associado a melanoma.

Um exemplo de tal radioimunoensaio é uma RIA tipo sanduíche na qual um veicula adequado, por exemplo a superfície pos ε-snti-MAA e que

125 ....

I. A quautiaade

de plástico de uma placa ds microtitulação ou d© um tubo de ensaio, e,g. de polistireno, polipropileno ou polivínilcioreto, esferas de vidro ou de plástico, papel de filtro, dextrano, etc» folhas de acetato ds celulose ou ds nitrocslulose, partículas magnéticas ou similares, é revestida com um anticorpo monoclonal murino anti-idiotípico do invento por simples absorção ou facul— tativamente após activação do veículo, por exemplo com glutaraldeído ou brometo de cisnogenio» Em sequida as soluções -a testar contendo anticorpos dirigidos contra HMW-MAA e finalmente adicionados os anticorpos policlonsis que também reagem com os anticorforam marcados radioactivamente, e»g» com de anticorpos dirigidos contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma na solução a testar é directamente proporcional èi quantidade de anticorpos policionais ligados e é determinada medindo a. rs.dioactivida.de da fase sólida.

Os anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos de acordo com o invento podem ssr usados como tal ou na forma de derivados conjugados com enzima num imunoensaio com enzima» Como descrita trás para radioiraunosnsaíos, poda ssr usada qualquer uma das modificações conhecidas de um imunoensaio com enzima»

Os testes são realizados de modo análoga aos radio-imurioensaios descritos atrás usando como marca uma enzima em vez ds uma marca radioactiva» A quantidade de complexo imune formada que corresponde à quantidade de anticorpos dirigidos contra HMW-MAA presentes; nas soluções a testar é detreminada pela adição de uma solução de substrato da enzima» A reacção enzima-substrato resulta, por exemplo, numa mudança ds côr que pode ser observada a olho nu ou com sistemas de medição da densidade óptica»

Lis anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos acordo com o invento podem ser usados como tal ou na forma de de

derivados conjugados com marcas quimialuminescentes num imunaen-ssio quimioluminescente» Como descrito atrás para os radio-imunoensaios podem ser usadas quaisquer modificações conhecidas de um ifrtunoensaio quimioluminescente«

Os testes são realizados de forma análoga aos radio-imunoensaios descritos atrás usando uma marca quimioluminescente em vez de uma marca radioactiva. A quantidade ds complexo imune formado que corresponde a quantidade de anticorpos dirigidos contra rinW—nAA presentes nas soluções a testar e determinaoa pela adição de um composto que capte luminescência, e.g. K_0_<s e NaOH e medindo a emissão ds luz com dispositivos para medições ópticas.

A utilização de acordo com o invento de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos e seus derivados como aaui descrito atrás para a determinação de anticorpos dirigidos contra an ei geou t ros nio da alto peso molecular imunoensaios conhecidos per associado a melanoma inclui ____ se , por exemplo ensaios de imunofluorescência, aglutinação de latsx, hemaglutinação, ensaios com luz evanesoents usando uma fibra óptica revestida com um MAb anti-idiotípico e outro imuno-ssnsores de actuação directa que convertem ofacto da ligação num sinal similares.

eléctrico ou óptíco.

u iuven co tamOem qí^i γ a kx*cs oe tes* lss para a determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos dirigidos contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma compreendendo anticorpos monoclonais murinos anti-idiotípicos do invento e/ou seus derivados e, facultativamente outros anticorpos policlonais ou monoclonais e/ou adjuvantes.

Os fcits de testes de acordo com o invento para um radio—imunoensaio contem, por exemplo, um veículo.

ι

facu.1 tativamente soluções liofilizadas de um ou mais anticorpos monocionaxs e/ou policxonaxs, soxuçoes ds um anticorpo marcado radioactivamente, soluções padrão de anticorpos dirigidos contra HMW~MAA, soluções tampão e, facultativamente, polipeptideos ou detergentes para prevenção da adsorçao inespec.itica e formação de agregados,; pipetas, vasos de reacção, curvas de calibração, manuais de instruções e similares. Um dos anticorpos do kit de teste é um anticorpo monoclonal anti-idiotípico do invento»

Os kits ds testes do invento para um imunoensaio com enzimas contêm, por exemplo, um veiculo adequado, facultativamente soluções liofilizadas ou concentradas de um conjugado com enzima ou com biotina, soluções de um conjugado com ensima-biotina, soluções de um conjugado com enzima—avidina se se usar anticorpo marcado com biotina, substrato da enzima na forma sólida ou dissolvida, soluções padrão de anticorpos dirigidos contrai HMW-MAA, soluções tampão e, facuitativamente, deos ou detergentes que evitem a formação de agregados, pipetas, calibração» manuais de instruções e similares» Um dos anticorpos polipeptíatísorção inespacífica e a vasos de reacção, curvas de do kit de invento.

um anticorpo monoclonal anti-idiotípico do

Os exemplos que se seguem ilustram o invento mas não o limitam de alguma forma.»

Abreviaturas

ece	Bac i 11 us Ca 1 me11e-Gui
CFA	adjuvante completo ci
BEAE	dietilaminoetilo
FCS	soro fetal de vitela
FPLC	cromatograf ia líquid.
HAT	hi poxan t ina/aminop te;
HLA	antigénios ds linfóc
HT	hipoxantina/timidina
ICAM-1	moIéc u1a an ti-adesão
IFA	adj uvante i ncomp1e to

i »ρ« intra peri tonea1(mente >

KLH hemocianina de lapa («keyhole limpet»)

PBS tampão de fosfatos salino

PSS-T20 tampão de fosfatos salino suplementada com 0,05% Twsen 2t#

TA temperatura ambiente

SDS-PAGE electroforese em gel de dodecilsulfato de sód io-po1iac r i1amida

Breve descrição das Fiquras

Figura í -MAft marcado com inibição da ligação do MAb /63=/4 anti—HMWI a células de melanoma em cultura Colo- 3B por MAbs anti-idiotípicos

símbolos:
L. X Γ*’— LiI L*L> “	MAb	an ti	-idiotípico
quadrados:	MAb	anti	-idiotípico
triângulos:		anti	—idiotípico

ι** iuura_z; ReactivxQsde do soru anti—MAb anti xoxotxpico

MK2-23 (de um ratinho Balb/c) com células de melanoma em cultura.

Símfaolus;

linha rectas 1in ha pon teada triãnguloss círculos;

células de melanoma Colo 3b células linfóides B LS-Ξ (testemunha) soro imune soro pré-imune (testemunha)

Exemplos

Exemplo í Preparação de linhas celular anticorpos monoclonais anti-idiotípicos contra antxí.l Protocolo de imunização

Murganhos Balb/c com oito a doze semanas (Charles River Breeding Laboratory, Ulilmington, MA, USA) receberam individualmente uma Injecção intraperitoneal Ci.p„> de 20® pg do MAb 763.74 anti-HMW—MAA purificado CP. Siacomini et al., J. Immunol» 135, 696, 1985) que foi acoplado a hemocianina de lapa CKLH), polimerizado com 4 μΐ de uma solução de glutaraldeído a 2,57 em PBS pH 7,2 e misturado oom um volume igual ds adjuvante completo de Freund (CFA) (Gibco). 0 processo de acoplamento e poiimerxzação fo a 1 izadc

bz i .	Os mu	tr ganhos
com		yg do
eund	\ It A)	no dia

injecção de retorço x.p. com 2®%? p.g do mesmo xmunogênio em adjuvante incompleto de Freund (1FA) no dia 7« A segunda injecção de reforço oom uma injecção intraperitoneal ds 2® pg do mesmo imunogénio em PBS pH 7,3, foi dada no dia 3®. Tr@s dias após a segunda injecção de reforço, os murganhos foram sacrificados, os

baças foram removidos e os esplenócitos foram fundidos com as células de mieloma murino P3-X63-Ag8.653 como descrito no exemplo 1.2.

Í.2 Fusão celular

A fusão celular é conseguida usando 1Ô células de baço dos murganhos imunizados em 3 x 10 células da linha celular de mieloma ds murganho P3-X63-Ag8»653 na presença de íml de polietilenoglicol a 50% CPES 4000, Merck) de acordo com métodos convencionais anteriormente descritos CKonlsr e Milstein, Mature 256,_f

495, 1975). Após lavagem, as células foram ressusperisas em 300 ml de Dulbecco’s Minimum Essenctial Médium convencional (Seromed).

Adicionou-se 15% ds soro fetal de vitela e 3x10° céluli exsudato peritoneal normal de murganho por fusão como células suporte. As células foram distribuídas por seis placas Costar 4Sxl ml» As culturas foram alimentadas duas vezes por semana

HT durante de □s de

ClíiO meios selectiva HAT, mais tarde com meio semanas» Os hibridomas foram despistados com o ensaio descrito no Exemplo Í.3»

1«3 Despiste dos sobrenadantes ds hibridomas

MAbs anti-idiot£p1cos luanco a presença de

Qs sobrenadantes de hibridoma foram testados quanto á presença de MAbs anti—idiotípicos num ensaio de ligação com fragmentos F(ab^s).-_S dos anticorpos monoclonais e um imunoens-aio em

4m* sanduíche.

Para ensaio de ligação indirecta, prepararam-se fragmentos Fíab’)^ do MAb 763.74 como descrito por Kusama et al» (Câncer Fies» 47, 4312, 1987). Placas de microtitulação de 96 cavidades em polivinilcloreto (Dynatech) foram revestidas com os

fragmentos Fíab’) do MAb 763.74 pela adição a cada cavidade de 50 μΐ da solução dss fragmento de anticorpo (5|.ig/ffll) em tampão bicarbonato ®,ÍM pH 9,5» Após 16 horas de incubação a 4*C, as placas foram lavadas duas vezes com pBS pH 7,4 suplementado com 0,05% de Tween 20. Adicionou-se 50 μϊ/cavidade dos sobrenadantes de hibridoma. Após 6 horas de incubação a 4°C, as placas foram lavadas quatro vezes com prheadicionado xenoanticorpos anti-íqb de murganho marcados com ^rI (Jackson Immunoressarch

Lab? Íxl0'“ cpm). Após 4 horas de incubação a 4*C, as placas foram lavadas quatro vezes com PBS-T20, e a radioactivida.de ligada foi medida num contador qama.

Para o imunoensaio em sanduíche, placas de micro-titulação ds 96 cavidades (Dynatech) foram revestidas com o MAb 763.74 por incubação de 10® μϊ da solução de anticorpo monoclonal (1®®

V.O durante 16 horas a 4'-'t gg/ml) em tampão bicarbonato ®,ÍM pH 9

Após três lavagens com PBS pH 7,4 suplementado com ®,®5% Tween 2®, adicionou-se 1®®μ1 dos sobrenadantes de hibridoma e a incubação continuou, durante 4 horas a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T2® e incubadas a 4°C com MAb 763.74 marcado com 1 s

Clxl®’ cpm). Após cinco lavagens com PBS-T2®, a radioactividade liqada foi contada num contador qama»

Os hibridomas produtores ds anticorpos anti-idiotípicos foram detectados numa frequência de 4,9%.

Os sobrenadantss de hibridoma foram também testados com células de melanoma humano portadoras de HMW-MAA Colo 38 (Quinn et al =, 0. Natl.Câncer Inst. 59, 3®i, 1977) num ensaio de ligação semelhante ao ensaio de ligação descrito atrás usando as células como alvo em vez dos fragmentos de anticorpo p-j ·>-—= Encontrou— -se 1,2% dos sobrenadantes de hibridoma como sendo positivos neste teste» Todos estes- hibridomas são diferentes dos que

SiCíbfS* infóides hibridonaturais secretam nadantes humanas :

MAbs anti-idiotípicos. Testagem adicional destes mostra que eles também reagem oom células 1 .8-2 ÍR.A» Satti & W» Leibod, Tíssue ftntigens

1979)» Estes anticorpos são provávelmsnte mas gerados com esplenócitos produtores contra células nucleadas humanas» ssc r e tados po r d-3 -3Π ÍÍCCirOt3£j

Dos hibridomas que secretam anticorpos monoclonais anti-idiotípicos três foram designados MK2-23, MK2-72 e MK2-123, respectivamente» Eles secretam os anticorpos monoclonais anti-idiotipicos com a designação MAb MK2-23, MAb MK2-72 e MK2-Í23, respectivamente»

Exemplo 5 Produção, isolamento e purificação do MAb MK2-23

2.Í Expansão de hibridomas in vivo s purificação dos monocionax s

Para a produção ds ascistes, murganhos fêmea Balb/c (20-25 g) foram pré-tratados com 0,3 ml de óleo de pristano íAldrich) i.p». Uma a três- semanas mais tarde, os murganhos receberam uma segunda injecção de pristano <<3,2 ml i»p») e foram simultaneamente znocuxados i«p= com 2x1%)— células de hibndoma em «3,2 ml de pBS» Após oito a des dias, o fluido de ascites- resultante foi colhido, centrifugado a 833 g e guardado a —23*8 ou a —80*C.

Os anticorpo* fluido ascítico por um com ácido caprxlico ou foram purificados por ε monoclonais foram purificados a partir do processo de dois passos» Após precipitação com sulfato de amónio a 40%, os anticorpos ramatografia de permuta iónica em DEAE.

A pureza foi testada por electroforess em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PASE)« = 2 Expansão dos híbridomas in vitro

Pré-culturas das células de hibridoma foram obtidas por cultura das células de hibridoma à temperatura fisiológica (cerca de 37°C> em meio RPMI 164© (Seromed) contendo 107 FCS para uma densidade celular final de 5xl©‘~ a i©’~ células» Toda a pré-cultura foi distribuída por frascos de cultura BeiIco e ajustado a um volume total de 15©© ml com meio RPMI ló4© fresco/í07 FCS e agitada durante mais sete a dez dias, Decorrido este tempo 957 das células estavam mortas» Q caldo ds cultura foi centrifugado a 1©0© g durante 2© min a 4°C» 0 sobrenadante foi filtrado através de um filtro com um poro de ©,2 pm sm condiçSes de esterilidade» A imunoglobulina bruta foi precipitada pela adição gota a gota de 0,9 volumes de sulfato de amónio saturado a 0®C« Este precipitado foi purificado como descrito no Exemplo 2=1» em ρ 1 o 3 Caracterização do MAb anti-idiotípico MK2-2-

Q MAb MK2-23 foi ainda caracterizado como se segue.

3»1 Especificidade *“sC7 — — i- ui. τ—⁵ ψ

UOlH 1 □ MAb MK2-23 foi marcado radioactivamente utilizando o método da cloramina T e testado num ligação com um painel de referência de Mfibs dirigidos contra HMW-MAA, antigénios HLA Classe I e antigénios HLA Classe II» As especificidades dos anticorpos de referência estão descritas abaixo na Tabela 2=

teste foi efectuado como tu1ação (Dynatech) revestidas com referência foram incubadas durante 4 -idiotípicos marcados com <2 x as placas foram lavadas PBS-T2® e ss segue» os antic horas a 4 θ’’ cpm/cav radioacti medida num contador gama» Como se mostra pelos sentados na Tabela 2 abaixo, MK2-23 apenas imunizante 763»74»

Placas orpos °C com idade} vzdade reage de microtimonoclonais MAbs anti— » Em seguida ligada foi tados aprscom o MAb

Tabela 2 Especificidade do MAb MK2-2ó

MAb ref e r 's n c i a	C1asse de Ig	Especific idade	Fon te	MAb MK2-23S
149,,53	Bi	HMW-MAA	1	0 , ô
£>UÍ·.-: a 2Í'J	Sí	HMW-MAA	·“?	€>,8
“7 A”? “?Λ / Q'-J c .· ~f	Bi	HMW-MAA	1	·“» Tf 5* *»—· jt »—J
,£^*7	5,	HMW-MAA		’-· 3 *
902.51	SI		•7t	©?6
kí‘25 a 28		HMW-MAA	1	0,5
CRI1-351	G‘í	HLA—A2,A28	4	0,8
KS1	Bl	HLA-A2,A2S	5	0,7
KS3	S2b	HLA-B7 , g ru po de reacção cruzada.	o	0 , Ó
Gtó/64	CA	HLA-B	7	0,7
CR10-215	si	HLA—Classe I		0,7
QÍ/28	Sí	HLA-Classe I	9
CRI1-115	82 b	HLA—Classe I	8	0,8
NAMB-1	Sí	$2—microg lohui irsa	10	A L
AC1.59	M	HLA—DR1,4,
		wô 5 w8, w'9	í 1	& ~Z
B7/21	S2a	hla-dp	12	0,3
Q2/7Ô	SI	HLA-DR	13	0,4

CRI1-462	Bl	HLA~DP,DR	4	0,5
(35/13	B2a	HLA-DP,DQ,DR	13	0,7

Lã3.ãDs.â.l

A MAb MK2-23 marcado com (cpm x 10 ’*)

P» Biacomini et al», 3, ímmunol« 135, 696 (1985)

K. Imai et al., Cell. Ímmunol» 72, 239 (1982)

M.R. Ziai et al», Câncer Res» 47, 2474 (1987)

C. Russo et al., Immunogenetics 18, 23 (1983)

5« M. Tsujisaki et al», Transplantation 445, 632 (1988)

6» K.Sakaguchi et al». Hum» Ímmunol» 21, Í93 (1988)

7» V. Quaranta et al», Immunoqenetics 14, 403 (1981)

8» M.C. Turco et al,, 3. ímmunol» í55 , 2268 (1985)

9. V» Quaranta et al», Immunogenetics 13, 285 (1981)

10» M„A» Pellegrino et al., Transplantation 34, 18 (1982)

11» T» Crepaldi et al», Tissue Antigens 26, 25 (1985)

12» A»3. Wafcson et al», Mol ímmunol» 19, 755 (1982)

13» V» Quaranta et al», 3. ímmunol» 126, 548 (Í98Í)

3»2 Inibiçãg_da.......ligação., do ...MAb 763,74 anti-HMN-MAA imunizante às

Oél^Iag^^melanoma

Para investigar a relação entre os idiotopos definidos pelo anticorpo monoclonal anti-idiotípico MK2-23 e o sitio de combinação do antiqénio do MAb 763,74 anti-HMW-MAA imunizante, MAb MK2--23 foi testado quanto à sua capacidade para inibir a ligação do MAb 763,74 a células de melanoma em cultura Colo 38»

G -anticorpo monoclonai MAb 763.74 anti-HMW-MAA marcada

125.

com I (2xíô cpm/SOp!) foi misturado com 50 μΐ ds uma solução de MAb anti-idiotípico MAb MK2-23, MAb MK2-72 e MAb MK2-120 não marcados» Após uma uma incubação ds 4 horas a 4°C, cada uma das misturas foi adicionada s células ds melanoma sm cultura Colo 38 (2x10^). A oncubação células foram lavadas :ontinuou durante mais 2 horas cinco vezes com liqada foi contada num contador qama»

		resultados
ção	é especí	fica uma ve
um	an ticorpo	monoclonai
de	HMW-MAA a	células de
po	monoclona	1 anti-HMW-i
a f ec t sd o do r	um anticor

g ií. --‘i .

Hí *ad i oac t i v i d ade

3»3 Mapeamento dos idiotopos

Realizaram-se experiências de bloqueio cruzado com um número seleccionado de MAbs anti-idiotipicos para mapear os idiotopos reconhecidos pelo MAb MK2-23 no MAb imunizante» ^{r :}J·-' = ~r eni

Com esta finalidade, placas de microfcitulsção foram revestidas com o anticorpo monoclonai MAb /63./4 como descrito anteriormente» Após incubação durante 4 horas a 4*C com diluições de duas vezes dos anticorpos anti-idiotipicos não marcados MAb MK2-23, MAb MK2-72 e MAb2-í20, respectivamente (concentração final variando entre 100 e 0,0001 p.g/ml), as placas foram incuba— anti-idiotidas durante 4 horas a 4°C com cada um dos três MAbs picos marcados com (2x1*0 cpm) em PBS pH 7,4» Em sequida as placas foram lavadas com PBS suplementado com Tween 20 radioactividade liqada foi medida num contador qama»

Os resultados estão apresentados na Tabela 3 abaixo»

Tabela____3 Idiotopos reconhecidos pelos MAbs anti-idiotípicos dirigidos contra o MAb_763»74

MAfa não marcado

MAbs anti-idiotípicos marcados com * (X de inibição)

MK2-23 92 88 MK2-72 84 96 MK2-Í2© 2 1

Ds entre os três MAbs anti— o MAb 763»74_? o MAb MK2-23 e ο MK2não são inibidos nem inibem o MAfa MK2 MK2-72 reconhecem o mesmo epítopo ou os quais são espacialmente distintos idiotípicos dirigidos contra 72 inibem-se mutuamente mas -120» Portanto, MAb MK2-23 e epítopos espacialmente perto do itíiotopo reconhecido pelo

MAb

Exemplo 4 Características de anticorpos anti—idiotípicos inriuzi— dos com o MAb MK2-23

MAb MK’2-23 pode in.du imunidade humoral e mediada por células contra HMW-MAA como se mostra pel cias que se segue (ver também exemplo 5)» As e seguem também mostram que o MAb MK2-23 é uma linha de evidênperiências que se imagem interna de

HMW—MAA»

i Preparação de -anti-soros anti idiotíoicos

Quatro murg injecção subcutânea acoplado a KLH, poli CFA (ver exemplo 1= reforço com 5® pg do no dia '28. 0 soro foi anhos Balb/c foram sensibilizados com uma de 5® pg do MAfa anti-idiotípico MK.2-23 msrizado com glutaraldeído s misturado com 1). Os murganhos receberam injecçSes de mesmo imunogênio em IFA no dia Í4 ε em PBS . colhido no dia 42 . Um grupo testemunha de murganhos foi t típico ÍÍK2-12® combinação com o antigénio atado com da mesma forma com com o MAB anti-idiodirigido contra idiotopos fora dos sítios de rlrs anticorpo monaclonal imunizanu

M&h I tiítP

4.2 Ligação dc melanoma anticorpos anti-idiotípicos contr cewias soro de cada um dc murganhos

T 03 testado quanto em cultura Colo 38 e com imune s pré-imune foram e linfóides- respectiva4 ’'C, as c é 1 u 1 as f o ram -Ig ds murganho marcados prolongada durante mais lavadas cinco vezes com num contador gama.

sua reactividade com células ds melanoma células linfóides B LB-2. 5® pl de soro adicionados a 2xl®‘~ células ds melanoma mente» Após incubação durante 2 horas a lavadas- e adicionados xenoanticorpos anti com (ixi0^u cpm). A incubação foi duas horas» Em seguida as células foram PBS e a radioactividade ligada foi medida

Apenas os soros mon o c 1 on a 1 an t i - i d i ot i p i c o melanoma Colo 38, como se fica uma vez que o soro linfóides B em cultura LSds murganhos imunizados com o anticorpo MAh MK2-23 reagem com as células de mostra na Figura 2» A ligação é especíimune não reage com com as células (ver também a Figura 2).

4,3 Especificidade dos anticorpos anti-anti-idiotísicos induzidos com MAb MK2-23

Para provar que os anticorpos induzidos com o MAb MK2-23 reage com HMW-MAA, i=e, são anticorpos anti-HMW-MAA» realizou-se a análise por SDS-PABE dos antigénios imunoprecipitados das células de melanoma em tura Colu 38 pelo -=oro de murganhos Balb/c imunizados com MAb MK2-23»

Com esta finalidade, as células de melanoma em cultura 105

Colo 33 foram marcadas com -I usando o método da lactoperoxidase e solubilizadas com NP-40» Após imunoprecipitação indirecta com soro anti-MAb MK2-23, os antigénios foram eluidos do imunoadsorvente e analisados por SDS-PASE em géis de 5% na presença de 2% de β-mercaptoetanol« A solubilização com NP40, imunoprecipita™ ção e SDS-PABE foram efectuadas como descrito por Wilson et al» (Int. 3, Câncer 28, 293, 1981)= 0 MAb 763=74 e soro normal de murganho foram usados como testemunhas» Os géis· foram processados por auto-radiografia usando um filme Kodak XAR-5 (Eastman Kodak Co =) =

A análise por SDS-PABE mostrta que o soro anti-MK2-23 contem anticorpos que reagem coíh HMW-MAA, uma vez que o MAb anti-MK2-23 imuno+precipita componentes com o perfil electroforético característica de HMW-MAA a partir das células ds melanoma em cultura Colo 38=

4»4 Reactividade dos anticorpos anti-idiotípicos com MAb MK2—25 e seus fraqmentos

Primeiro, foi testada a capacidade ds ligação dos anticorpos anti—anti-idiotípicos aos fragmentos F(ab’ ao MAb sinqeneico anti-idiotípico MK2-23»

ntos	F Cab’>„	do	Mftb
‘1 uD	por Par'	ham	C J
j MAb	MK2-23	pur	if i

o processo descrito por Parham CJ. Immunol. Í31, 2895, iva-ó? Resumidamente, o ríAh ΜΚΞ-23 purificado foi incubado com pepsina

U40.

a pH 3.5. A reacção foi parada realizada a 3/^,:‘U durante 8 horas aumentando o pH para 7,0 ccm uma solução Tris IM» Em seguida a mistura foi dialisada contra PBS pH 7,4 e concentrada. Os fragmentos Fc e as imunoglobulinas não digeridas foram removidas por cromatografia da afinidade em Proteína A-Sephsrose,

Os testes para a reactividade dos soros anti-anti-idiotípicos com os fragmentos FCab’)^ do Mftb MK2-23 foi realizado em analogia com o ensaio de ligação do exemplo 4.2. 0 soro de cada um dos murganhos reage com a preparação de fragmentos. 0 titulo dos anticorpos reactivos com os fragmentos F(ab^?)_ , ^r * 2 do Mftb MK2-23 é amrcadamente superior ao dos anticorpos reactivos com as células de melanoma em cultura.

Ainda, examinou—se se os soros anti—anti—idiotípicos _ ι o-s xnibem a Ixgaçâo do Mftb MK2-2O marcado com * ~*I ao Mftb imunxzante anti-HMW-MAA 763.74= Como testemunha, testou—se também se os soros anti-anti-idiotípicos inibem a ligação de outros anticorpos monoclonais anti-idiotípicos aos correspondentes MAbs ímunizantes anti—HMW-MAA que reconhecem determinantes distintos do definido pelo Mftb 763.74. 0 ensaio de inibição foi realizado por incubação de 100μ1 do soro anti-idiotípico a ser testado com o Mftb anti-idiotípico marcado com *^1 C2xl.0'^-i cpm) durante 4 horas a 4°C. Em seguida a mistura foi adicionada às cavidades das placas de microtitulação revestidas com o anticorpo monoclonal imunxzante CIpg/cavidade)» Após incubação durante 2 horas á temperatura ambiente, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS—T2©« A radioactividade ligada foi medida num contador gama. Os resultados estão expresses como percentagem de inibição da ligação do _·Ν>

Q i

Í25

Mftb anti-idiotípico marcado com I na nressnca do soro anti-ananti ti-idiotipico comparado com soro pré-imune.

a ligação realizada na presença de

Os soros dos murganhos imunizados com o MAfa anti—idio— 125 tioico MK2-23 inibe a ligação do Mftb MK.2—23 marcado com I ao Mftb 763,74« A diluição do soro qua dá 50% de inibição é muito mais alta do que o que dá 50% da ligação máxima, a células de melanoma em cultura, mas inferior do que dá 50% da ligação máxima aos fragmentos FCab’)_o do Mftb MK2-23, A actividade inibidora dos sorc altamente restictiva, uma vez que eli nao inibem a _ _ * '~^s5 ligação do MAb anti-idiotípico Mt 11-õO marcado marcado com .....I ao seu MAb imunizante 225,28, do MAb anti-idiotípico TK6—74 marcado com ^iJ 1 ao seu MAb imunizante iP41,2 imunizante e do MAb anti-idiotípico TK7-ÍÍ0 ao seu MAb imunizante TP 61,5.

4.

Classe de imunoqlobulina dos anficorpos anti-anti—idiotípicos

A classe de imunoglobulina dos anticorpos anti-anti—idiotipicos que que reagem com células de melanoma Colo 38 Cver Exemplo 4,2) e dos anticorpos anti-anti-idiotípicos que reagem com os fragmentos FCab’)^ do MAb MK2-23 Cver exemplo 4,4) foi determinado numa modificação do ensaio de ligação do exempla 4.2, r~.gr usando xenoaticorpos marcados com ^liUI específicos de Igrí aiurina e de IgB rourina. No grupo de anticorpos reactivos com os fragmentos Fíab’> do MAb MK2—23, a grande maioria da população de anticorpos é da classe IgS, enquanto o componente IgM no grupo de anticorpos reactivos com células Colo 38 ê apenas ligeiramente inferior ao componente IgG,

4.6 Inibição da ligação dos anticorpos anti-anti-idiotípicos a.

células de melanoma pelo MAb MK.2-23

Realizaram-se experiências de inibição para determinar s-e os anticorpos anti-anti-idictípicos induzidos com o MAb MK2-23 expressam o correspondente idiotopo no seu sitio de com o antigénio»

C OiT; b 1 í i âÇão □ ensaio de inibição é realizado por incubação do soro anti-anti-idiotípico (í©0 μΐ) com o MAb MK2-23 durante 2 horas & temperatura ambiente·» Em seguida a mistura é adicionada a células de melanoma humano em cultura Colo 38 ε a incubação continua durante mais 2 horas a 4°C» Em seguida as células são lavadas três vezes com PBS-BSA e incubadas com xenoanticorpos anti-Ig humana marcados com ‘‘'l. Após mais cinco lavagens, & radioactividade ligada foi medida num contador gama» Os resultados são expressos como percentagem ds inibição comparado com a ligação na presença de um anticorpo monoclonal anti-idiotípico não relacionado .

□ soro anti-MAh MK2-23 apresenta menos reactividade com células de melanoma em cultura Colo 38 após incubação com o MAb MK2-23» A inibição ê dependente da dose» Ainda, a inibição é específica, uma vez que o MAb anti-idiotípico TK6-74 induzido com o MAb anti-HMW-MAA TP41»2 não afecta a reactividade do soro anti-MAb MK2—23 com as céllas de melanoma em cultura Colo 38» Os resultados mostram claramente, que tal como o MAb 763»74 os anticorpos anti—anti-idiotípicos expressam no seu sítio de ligação ao antigénio o idiotopo reconhecido pelo MAb MK2-23»

X

4ί

4«7 Inibição da ligação do MAb anti-HMW-MAA 765.-./4 a células de melanoma pelos anticorpos anti-anti-idiotípicos

Realisaram-se experiências ds inibição cruzada para comparar a especificidade fina dos anticorpos anti-anti-idiotípicqs induzidos pelo MAb MK2-23 com a ensaio foi realizado por incubação cultura Colo 38 durante 4 horas a 4*C do MAb anti—HMW-MAA 763=74. 0 das células de melanoma em de soro anti-anti-idiotípico

Em sequida removeu-se o sobrenadante e

2x 1 Θ'* ) com i00μ 1 adicionou—se às células o MAb anti—HMW-MAA 763.74 marcado com 1 -ns s 1 ns '“''I (2x10' cpm) ou MAb anti-ICAM-i CL207.Í4 marcado com . Após incubação durante duas horas a 4°C_S as células foram lavadas cinco vezes com PBS-SSA e a reaetividade ligada foi medio’a num contador gama» Os resultados estão expressos como percentagem de inibição da ligação dos anticorpos monoclonais marcados radioactivamente a células pré-incubadas com o soro anti-anti-idiotípico comparado com a ligação dos anticorpos monoclonais marcados radioactivamente a células pré-incubadas com soros pré-imunes»

A incubação das células de melanoma em cultura Colo 38 com diluições crescentes do soro anti-MAb MK2-23 inibe a ligação Λ . 12’ã do MAb 763 = 74 marcado com ” a células Colo 38 de forma dependente da dose» A inibição máxima obtida com a diluição mais baixa anti-soro anti-anti-idiotípico é cerca de 60« A inibição ê específica uma vez que a incubação das células de melanoma em cultura Colo 38 com soro anti-anti-idiotípico não afecta a capacidade de se ligar ao MAb anti—ICAM—í CL207.Í4 marcado com 1 os i i e ao MAb anti-HMW-MAA 220.28 marcado com 1, que reconhece um determinante distinto e espacialmente distante do HMW-MAA daquele que é reconhecido pelo MAb 763.74» Por outro lado, o soro anti-anti-idiotípico inibe a ligação a células Colo 38 do MAb VT8S marcado com I que reconhece o mesmo determinante do

HWM--MAA ou um determinante espacialmente perto do MAb 763.74 e inibe de forma cruzada, melanoma Colo 38= Ainda, não afecta a capacidade 763,74 marcado com I»

a ligação do MAb 763,74 a células de a incubação com soro normal de murganho das células Colo 33 para ligarem o MAb

Exemplo 5 Indução de hipersensibilidade ~,~S orí;-.

an t i - i d iotx pico MK2 —2-5

Para determinar se a imunização com o MAb anti-idiotípico MK2-23 induz hipersensibilidade tipo retardado ÍDTH5 contra células de melanoma em cultura, murganhos com o MAb MK2-23 (ver exemplo injectadas com 5xl@^u células ds melanoma irradiadas (20 &<&& Rad) nas pats no dia

Baib/c foram imunizados 4=1) no dia ©,14 e 28 e depois em cultura Colo 38 5@= A espessura do inchaço de cada pata foi medido no dia @ e após 24, 48 e 72 horas com um Digit Outsids Micrometer CMitutoyo Corp»), Como testemunhas deram-se injecçSes de células linfóides B em cultura L8-2 na pa t ci contraidueral □bservou-se um aumento marcado na espessura do inchaço z.4 horas apôs a xnjecção e persis.ee z2 noras -apos nova injeeção» 0 aumento foi significativamente maior do que o observado nas patas injectadas com células L8-2=

Exemplo 6 Factorss que influenciam a imunoqeniciade do MAb anti-idiotípico MK2-23 =1 Efeito da dose do MAb MK2-23

Para -estudar o efeito da dose dos anticorpos anti-anti-idiotípicos, murganhos cada foram injectadas com 5 (grupo B) e com 500 yg (grupo C) do MAb do MAb MK2-23 na indução três grupos de quatro yg (grupo A), com 50 yg

MK2-23 (conjugado com

KLH e misturado com Q-A no dia. 0, com IhA no dia 14 e PBS no dia

28) soro foi colhido no dia 42 e testado com células de frsqsien tos FCab⁵¹)^ do MAb melanoma sm cultura Colo 38 e com

MK2-23 ©m ensaios ds ligação com 125 murganho marcados com I. Gs processos do teste sao realizadas em analogia com os ensaios descritos- nos Exemplos- 4.2 e 4.3. Osanticorpos que reagem com células Colo 38 são detectados nos soros de um murganho do grupo A, em todos os murganhos do grupo B e em dois murganhos do grupo C. Menhum dos soros apresenta reactivida.de com células linfóides B em cultura LG~2 = Todos os murganhos desenvolveram anticorpos anti-anti-idiotípicos que reagem com os fragmentos Fíab’)^ do MAb MK2-23. Independentemente da dose do MAb MK'2-23 usada para imunização, o nível dos anticorpos que reagem com as células de melanoma em cultura Colo 38 é inferior aos que reagem com os fragmentos F(ab⁵>_o do MAb MK2-23. •Ainda, o nível destes últimos anticorpos é relativamen te inferior nos murganhos injectados com 5pg do MAb MK2-23 do que nos injectados com 50 e 500 pg, mas é semelhante nos dois últimos grupos.

xsuOãnticurpub antx i-T ds é„2 Efeito do número de imunizaçSes com MAb MK2-23

Parai estudar indução dos anticorpos quatro murganhos cada o efeito do número de imunizaçSes anti-antx-idiotípico grupos foram sensibilizados com 5® μα do na de

MAb

MK2comjugado com KLH e misturado com CFA no dia & e depois tratados- ds acordo com os seguintes protocolos:

grupo As sem roais imunização grupo Bs imunização tíe reforço com MAb MK2—23 conjuoado com KLH e misturado com IFA no dia 14§ grupo Cs imunizaçSes tíe reforço no dia 14 e 28 com MAb MK2-23 conjugado com KLH e misturado com IFA no dia 14 e com PBS no dia 28=

Os soros foram foram colhidos no dia 42 e testados quanto à reactividade em células ds melanoma em cultura Colo 38 e cooí fragmentos FCab’).-, do MAb MK2--23 em ensaios de ligação com xenoanticorpos anti-Ig tíe murganho marcados com ‘‘'‘“I. Anticorpos que reagem com células de melanoma em cultura Colm f oram detectados num murganho do grupo A, em todos os murganhos do grupo B e em três murganhos do grupo C„ Nenhum dos soros apresenta reactividade com células linfóides B em cultura LG-2» Todos os murganhos induziram anticorpos anti-anti-idiotipicos que reagem com os fragmentos Fíab’)^ do MAb MK2-23» 0 nível destes últimos anticorpos é inferior nos murganhos injectados apenas uma vez do nos outros dois grupos de murganhos entre os quais não se encontraram diferenças» índependentemente do número de imunizações, os anticorpos que reagem com os fragmento FCab³)^ do MAb MK.2-23 apresentam um nível relativamente superior ou estão mesmo presentes em murganhos sem anticorpos detectáveis que reajam com células Colo 38»

6.3 Efeito do veículo e adjuvante

Para estudar o efeito da adjuvantes na imunogenicidade do murganhos cada foram imunizados conjugação com um veículo e/ou MAb MK2-23, qrupos de quatro no dia ® e 14 com 5Θ p.q do anticorpo apresentado do seguinte modos

- grupo As MAb MK.2-23 não conjugado»

- grupo Bs MAb MK2-23 conjugado com KLH,

- grupo Cs MAbb MK.2-23 misturado com CFA para a primeira sensibilização e com IFA paraas injecçSes- de reforço soro foi colhido no dia 42 e testado quanto â reactividade· com células de melanoma humano em cultura Colo 3B e com ce fraamentos FCab⁵).-. do MAb MK2-23.

soro de um murganho imunizado com o MAb MK2--23 misturado com adjuvante (grupo C) apresenta uma reactivida.de baixa com células de melanoma em cultura Colo 38, enquanto nenhuns anticorpos que reagem com células Colo 38 são tíetectadas no soro dos restantes murganhos» Os soros dos murganhos injecta— dos com o MAb MK2-23 não conjugado (grupo A) não reagem com os fragmentos F(ab^?)_o do MAb MK2-23, se bem que os soros de todos os outros murganhos nos dois outros grupos apresentem uma actividade da ligação baixa semelhante e inibam a ligação do MAb MK2-23 i 25 marcado com 1 ao MAo zõò·/4 em menos de 00λ_β

Exemplo 7 Compos íção f ar mac êut ic a

0,25 mg do anticorpo monoclonal anti MK2-23 preparado de acordo com os exemplos 1 e 2 dos sm 5 ml de soro fisiológico» A solução foi pa um filtro bacteriológico e o filtrado introduzido em ampolas» A ampola é preferencialmsnte guardada

-idiotípico MAb f o r am d i sso1vissada através de assép t i c amen te no frio, e.g» a °C.

aplicação .terapêutica_dg_antiçoroo_moiusçignaj___antte zidwtísic^mb^MKazSS anticorpo monoclonal anti-idiotípico MK2-23 foi utilizado num ensaio clínico com doentes, sofrendo ds melanoma avançado (fase IV). Os doentes foram tratados anteriormente- sem sucesso com várias tipos de terapia, incluindo modificadores da resposta biológica.

Quinze doentes foram imunizados com 2 mg do MAb MK2-23 conjugada com KLH e misturado com Bacillus Calmette-Guerin (BCG) e 12 doentes foram imunizados com o MAb MK2-23 (sem conjugação e adjuvante). As imunizações foram administradas intradêrmicamente no dia ®, 7 e 28. Os soros foram obtidos semanalmente s testados quanto ao desenvolvimento de anticorpos anti-anti-idiotípicos (anticorpos que inibem a ligação do anticorpo anti-idiotípico usado como imunogénio ao correspondente anticorpo anti-HMW-MAA), reactividade com células ds melanoma portadoras nível de HMW-MAA e desenvolvimento ds anticorpos

Um ensaio de escalonamento de doses mostra que a dose de 2 mg por injecção é mais eficaz do que doses mais inferiores na indução de an tico r pos an t i-i d i otí picos» ds HMW-MAA, o anti-murganho»

Os anticorpos que reagem com células de melanoma Colo 38 foram detectados sm 73% dos doentes imunizados com MAb MK2-23 acoplada a KLH e misturado com BCG e em 16% dos doentes imunizados com MAb K2-23 não conjugado» Estes resultados mostram que, de acordo com os dados obtidos em sistemas de modelos animais (ver exsmplo 6.3), a conjugação de um anticorpo monoclonal a um veículo e mistura com um adjuvante aumenta a sua imunogenicidade»

5.

Qs soros dos doentes imunizados inibem parcialmente ligação do MAb 763=74 anti-HMW-MAA marcado com melanoma Colo 38 tíe forma especifica» i2';

I a células de

MAb MK2-23 inibe a ligação dos soros dos doentes imunizados a células de melanoma em cultura Colo 38,

Anticorpos anti-Ig murina foram removidos dos soros de doentes e os anticorpos induzidos por MK2-23 no soros foram purificados por cromatograf ia de afinidade em MAb MK2--23 irisolubi1izado» Qs anticorpos purificados reagem com HMW-MAA que foi isolado a partir de um extracto de células ds melanoma Colo 38 por cromatografia de afinidade em MAb 149.53 anti-HMW-MAA»

Cerca de 857 dos doentes imunizados com o MAb MK.2-23 conjugado com KLH e misturado com BCG e cerca de 607 dos doentes tratados com MAb MK.2—23 não acoplado desenvolveram anticorpos anti-idiotípicos que inibem a ligação do MK2-23 marcada com *'^LJÍ ao MAb 763,74 anti-HMW-MAA»

Quase todos os doentes desenvolveram níveis mais elevados de anticorpos anti-Ig de murganho, sem uma diferença marcada entre os dois grupos de doentes,

A redução no tamanho das lesões das mestástases em pelo menos seis dos doentes imunizados.

Os resultados indicam que o MAb anti-idiotípico murino MK2-23 induz anticorpos anti~HMW~MA»4 em doentes que expressam HMW-MAA nas suas lesões de melanoma mas não mostram resposta imune detectável anti-HMW-MAA, Assim, o MAb anti-idiotípico MK2-23 parece ser mais imunogénico do que o próprio correspondsnte antigénio HMW-MAA

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES iê„ - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos que são a imagem interna de determinantes reconhecidos por um anticorpo monoclonal no antigénio de alto peso molecular associado a melanoma (HMW-MAA) e seus derivados que mantêm a especificidade do anticorpo de onde derivam, caracterizado por se mui tipi içarem, in vitro ou. in vivo, células de uma linha celular de hibridoma que segregam os referidos anticorpos monoclonais anti-idiotípicos e, quando necessário, se isolarem os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos e/ou se converterem nos seus derivados»
2. 2â» - Processo de acordo com a reivindicação í₅ carscterizado por os anticorpos monoclonais anti—idiotípicos murinos serem do isotipo IqS»

   31» - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por os anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos serem a imagem interna de determinantes reconhecidos pelo anticorpo monoclonal designado MAb 763»74 no antigénio de alto peso molecular associado a melanoma (HMW—MAA)» a;

   Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se preparar o anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino designado por MAb MK2-23 e um seu derivado»

   51» - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações i a 3, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino e um seu derivado seleccionado de entre o grupo constituído pelos anticorpos monoclonais designados por MAb MK2-72 e por MAb MK2-Í20»
3. 6â = - Processo de acordo com qualquer uma das reivindi5, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino que é um fragmento de anticorpo»
4. 7S» - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçSes 1 a 5, caracterizado por se preparar um anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino que é um conjugado com um veiculo que aumenta a imursogenicidade, com uma enzima, uma marca fluorescente, uma marca quimiolumínes-cente, um quelato de metais, uma partícula paramaqnética, avidina, biotina ou similares»

   Sê» - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçSes í a 5, caracterizado por se preparar um derivado de um anticorpo monoclonal murino anti-idiotípico que é marcado radioactivamente»
5. 9ê„ — Processo para a preparação de linhas celulares de hibridoma que segregam anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos os quais são a imagem interna de determinantes reconhecidos por um anticorpo monoclonal no antigénio de alto peso molecular associado a melanoma humano (HMW-MAA), caracterizado por se imunizar um ratinho com um anticorpo monoclonal dirigido contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma (HMW-MAA), se fundirem células produtoras de anticorpos anti—idiotípicos com uma linha celular continua, se clonarem as células híbridas obtidas na fusão e sa seleccionarem os clones que segregam os luã» - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se imunizar o ratinho com um anticorpo monoclonal dirigido contra antigénio de alto peso molecular associado a melanoma (HMW-MAA) acoplado a hemocianina de lapa CKLH)»

   1 lê.

   ^racesso de acorda com a reivindicação 9 ou 13, caracterizado por o ratinho linha celular continua ssr ratinho.

   ser imunizado com MAb /6-5.74 e a uma linha celular de mieloma de

   Í2s, ··· Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado por se preparar a linha celular de hibridoma designada por MK2-23 que foi depositada na American Type Culture Collection CATCO em 31 de Outubro ds 1989 com o número HB 13288«

   Í3ã. — Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11₃ caracterizado por se preparar uma linha celular de hibridoma seleccionada de entre o grupo constituído por linhascelu.lares ds hibridoma designadas por MK.2-72 e por MK2-Í23.
6. 14ã. - Método para a modulação da resposta imune a um antígênio ds alto peso molecular associado a melanoma ÍHMW-MAA), acarcaterizado por se administrar um anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino e/ou um seu derivado preparado por um processo de acordo com a reivindicação í, sendo a dose terapêutica utilizada de 3ã pg a 133 pg por quilograma de peso corporal.

   ISâ. - Método para para controlar, prevenir e/ou tratar melanoma, caracterizado por se administrar um anticorpo monoclonal anti-idiotípico murino e/ou um seu derivado preparado por um processo ds acordo com a reivindicação 1, sendo a dose terapêutica utilizada de 3© pg a 133 pg por quilograma de peso corporal.

   16ê,

   Krocssso para a produção de composições farmacêuticas compreendendo anticorpos monoclonais anti-idiotípicos murinos preparados por um processo de acordo com a reivindicação 1 e/ou seus derivados, caracterizado por os anticorpos c a r ac ter i z ado os monoclonais anti-idiotípicos murinos serem misturados com um veí c u1o íarmacfutico.

   Í7sí= - Processo para a produção de composições Cêuticas de acordo com a reivindicação lá, caracterizado derivado do anticorpo monoclonal anti-idiotípíco murino ’ conjugado com um veículo que aumenta a imunogenicidade.

   farma— por o er um

   IBâ. - Processo para a produção de composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o veículo ser hemocianina de lapa (KLH).

   Í9ã= - Processo para a produção de composições farmacêuticas ds acordo comi a reivindicação 18, caracterizado por as composições farmacêuticas compreenderem ainda o adjuvante 8ac i11us Ca1mette-Buer in ( BCG).

   20â = — Método para a s clonal anti-idíotípico murino e/< um processo de acordo com a reiv. referido anticorpo e/ou derivado ção qualitativa ou quantitativa antigénio de alto peso molecular .itilização de um anticorpo mono3U um seu derivado preparado por Indicação 1, caracterizado por o ser empregado para a determinada anticorpos dirigidos contra associado a melanoma (HMW-MAA).

   21-i dicação — Método racter i z a anti-idiotípico murino e/ou um seu derivado um imunoensaio com enzima ou um imunoensaio para a utilização de acordo com a reivináo por o referido um anticorpo monoclonal num radioimunosnsaio,, quimioluminescente.