ES2207768T3 - Anticuerpo anti-idiotipo que inducen a una respuesta inmune contra un glicoesfingolipido y su uso. - Google Patents

Anticuerpo anti-idiotipo que inducen a una respuesta inmune contra un glicoesfingolipido y su uso.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN ANTICUERPO MONOCLONAL ANTIIDIOTIPICO QUE INDUCE ESPECIFICAMENTE UNA RESPUESTA INMUNITARIA FRENTE A UN GLICOESFINGOLIPIDO. ASIMISMO, LA INVENCION PROPORCIONA UNA COMPOSICION DE INTERES, QUE INCLUYE UNA CANTIDAD EFECTIVA DE UNA CITOQUINA Y UN ANTICUERPO ESPECIFICO PARA UN GANGLIOSIDO DE MELANOMA, UNIDO A UN TRANSPORTADOR.

Description

Anticuerpos anti-idiotipo que inducen una respuesta inmune contra un glicoesfingolípido y su uso.
R24, un anticuerpo monoclonal de ratón IgG3 (mAb) inducido contra un melanoma humano, reconoce el gangliósido GD_{3}. El gangliósido GD_{3} se expresa abundante en la mayoría de los melanomas, sin embargo, la expresión del gangliósido GD_{3} en tejidos normales es selectiva y tiene lugar a bajas concentraciones (1). Los gangliósidos son una subserie de glicoesfingolípidos que, a su vez, son una subserie de glicolípidos. Los glicolípidos, como su nombre indica, son lípidos que contienen azúcar.
R24 comprende una mezcla conocida de tres especies variantes de anticuerpos (figura 11) designadas V1-R24, V2-R4 y R24. Las variantes V1-R24 y V2-R24, comprenden una y dos cadenas ligeras de anticuerpo irrelevantes, respectivamente; por el contrario, R24 comprende cadenas ligeras relevantes. Generalmente, las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo en combinación realizan una unión anticuerpo-antígeno específica. Sin embargo, los anticuerpos que comprenden cadenas ligeras de anticuerpo irrelevantes, a diferencia de los anticuerpos que comprenden cadenas ligeras de anticuerpo relevantes, no se unen específicamente a un antígeno.
Para evitar la confusión, la variante R24 se denominará en lo sucesivo "R24" y R24 que comprende las tres especies variantes se denominará "composición de R24". Cada variante muestra diferencias que implican que la región de unión a GD_{3} (también denominada "parátopo") de V1-R24, V2-R24 y R24 está alterada.
Se han desarrollado anticuerpos monoclonales anti-idiotipo que imitan y poseen la imagen interna de un epítopo de sacárido (2). El epítopo de sacárido es un globósido asociado a tumores, es decir, un glicolípido. Sin embargo, estos anticuerpos monoclonales anti-idiotipo no imitan específicamente a un glicoesfingolípido, un gangliósido o, más particularmente, al gangliósido GD_{3}. Adicionalmente, estos anticuerpos monoclonales anti-idiotipo no están dirigidos contra R24 ni son anticuerpos que se unen específicamente a un glicoesfingolípido o un gangliósido, ni por supuesto al gangliósido GD_{3}.
Se han inducido ratones contra antígenos capsulares de bacterias patógenas por medio de la administración de anticuerpos monoclonales anti-idiotipo que imitan la cápsula de polisacáridos de E. coli (una bacteria gram negativa) (3). Generalmente se sabe que los lipopolisacáridos (LPS) son un componente principal de la membrana externa de bacterias gram negativas y que se libera cuando se lisan las bacterias. El LPS consta de una cadena de heteropolisacárido unida covalentemente a un glicolípido. Es importante indicar que aunque estos anticuerpos monoclonales anti-idiotipo se usaron como medio para inducir en un sujeto una respuesta contra un LPS, no ha habido ninguna sugerencia de la generación de anticuerpos monoclonales anti-idiotipo contra R24 ni de anticuerpos que se unan específicamente a glicoesfingolípidos o gangliósidos, en particular al gangliósido GD_{3}.
El documento EP-A-0 306 995 describe un anticuerpo anti-idiotipo específico para un idiotipo que reconoce un antígeno del gangliósido GD3 asociado a seres humanos y que se induce tras el reconocimiento del antígeno GD3 por el anticuerpo monoclonal MG-21. Los anticuerpos anti-idiotipo del documento EP-A-0 306 995 se pretenden usar para inducir una respuesta inmune contra tumores que llevan un antígeno específico.
El documento WO-A-88/08429 describe composiciones farmacéuticas y vacunas para el tratamiento de infecciones oportunistas en pacientes inmunodeficientes. Esas composiciones y vacunas se basan en antígenos dependientes de células T específicos para una infección diana acoplados con un soporte independiente de células T. Söderström et al. (1984), The New England, J. of Medicine 310, 726-727; describe que la interleuquina 1 mejora las respuestas de anticuerpos secundarios en ratones in vivo contra un antígeno proteico, y que esta proteína puede ser un mediador importante de las respuestas defensivas del hospedador y de los efectos estimuladores de algunos adyuvantes.
Staruch et al. (1983) J. of Immunology 130, 2191-2194 se refiere a la adyuvanticidad de la interleuquina 1 in vivo. Específicamente, se demostró que la interleuquina 1 mejora las respuestas de anticuerpos secundarios de ratones in vivo contra un antígeno proteico. Se descubrió que la actividad dependía del tiempo y de la dosis. El efecto de mejora máximo se obtuvo con 2000 unidades LAF de IL1 proporcionadas dos horas después de la dosis de inducción del antígeno. La observación sugiere que está proteína puede ser un mediador importante de la respuesta defensiva del hospedador, así como de los efectos estimuladores de algunos adyuvantes.
El gangliósido GD_{3} es poco inmunogénico (1). Por consiguiente, el gangliósido GD_{3} es una diana atractiva para la inmunoterapia del cáncer debido a la utilidad comercial de moléculas de diseño que imiten estructuralmente al GD_{3} y que posean propiedades inmunogénicas espectacularmente significativas.
La presente invención proporciona el anticuerpo anti-idiotipo denominado BEC2 y producido por el hibridoma denominado hibridoma BEC2 (Nº de acceso de la ATCC HB 10153). La presente invención también proporciona el hibridoma denominado hibridoma BEC2 (Nº de acceso de la ATCC HB 10153). Adicionalmente, esta invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-idiotipo de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) el anticuerpo anti-GD_{3} R24 (Nº de acceso de la ATCC HB 8445) marcado con un agente citotóxico; y (b) el anticuerpo anti-idiotipo de la invención; donde (a) y (b) son para administración secuencial. Finalmente, esta invención proporciona una composición inmunogénica de materia que comprende una citoquina y un anticuerpo R24 (Nº de acceso de la ATCC HB 8445) unidos a un soporte, donde la citoquina está en una cantidad eficaz para estimular la generación de anticuerpos en un sujeto.
La presente invención también describe un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo que induce específicamente una respuesta inmune contra un glicoesfingolípido y, más específicamente, contra un gangliósido. Adicionalmente, esta invención describe una composición de materia que comprende una cantidad eficaz de una citoquina y de un anticuerpo específico para gangliósidos de melanoma unidos a un soporte. Finalmente, esta invención describe un método para generar el anticuerpo anti-idiotipo identificado previamente que comprende: (a) preparar un anticuerpo; (b) purificar el anticuerpo; (c) unir el anticuerpo a un soporte para producir un inmunógeno; (d) combinar el inmunógeno con una citoquina para producir una nueva combinación de inmunógeno-citoquina; y (e) inyectar la nueva combinación de inmunógeno-itoquina en un mamífero produciendo de esta manera el anticuerpo anti-idiotipo.
Breve descripción de la figuras
Figura 1: Inhibición de la unión de R24 a GD_{3} por BEC2. Se incubaron diluciones de BEC2 con 5 \mug/ml de R24 biotinilado durante 1 hora. Después, la mezcla se cultivó en pocillos recubiertos con gangliósidos de melanoma que contenían GD_{3}. La unión de R24 se detectó añadiendo avidina conjugada con fosfatasa alcalina durante 15 minutos. Después del lavado, se añadió substrato (p-nitrofenilfosfato) y se midió la absorbancia a 410 nm.
Figura 2: Reactividad anti-GD_{3} inducida en conejos por inmunización con BEC2. A los conejos se les inocularon por vía subcutánea 100 \mul de BEC2 en adyuvante completo de Freund. Se administraron inmunizaciones de refuerzo posteriores por vía subcutánea en adyuvante incompleto de Freund (días 17 y 31) o por vía intramuscular sin adyuvante (días 57 y 85). Para detectar anticuerpos de conejo anti-GD_{3} por ELISA, se recubrieron placas de 96 pocillos con GD_{3} de melanoma purificado y se bloquearon con leche desnatada al 5%. Se añadieron diluciones de suero de conejo durante una hora. Después del lavado, se añadió IgG anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina. La unión se visualizó añadiendo substrato (p-nitrofenil-fosfato) y midiendo la absorbancia a 410 nm.
Figura 3: Actividad anti-GD_{3} inducida en conejos mediante inmunización con BEC2. A los conejos se les inocularon por vía subcutánea 100 \mul de BEC2 en adyuvante completo de Freund. Se administraron inmunizaciones de refuerzo posteriores por vía subcutánea en adyuvante incompleto de Freund (días 17 y 31) o por vía intramuscular sin adyuvante (días 57 y 85). Para detectar anticuerpos anti-GD_{3} de conejo por ELISA, se recubrieron placas de 96 pocillos con GD_{3} de melanoma purificado y se bloquearon con leche desnatada al 5%. Se añadieron diluciones de suero de conejo durante 1 hora. Después del lavado, se añadió IgM anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina. La unión se visualizó añadiendo substrato (p-nitrofenil-fosfato) y midiendo la absorbancia a 410 nm.
Figura 4: Inhibición por BEC2 de la unión de R24 a GD_{3}. Los datos muestran una inhibición significativa de la unión de R24 a GD_{3} por BEC2, esto es coherente con que BEC2 sea un mAb anti-idiotipo Ab 2b.
Figura 5: IgG anti-GD_{3} de conejo 521 por RIA. El conejo 521 desarrolló IgG contra GD_{3} después de inmunizarse con BEC2 mezclado con adyuvante completo de Freund. La respuesta se midió por RIA.
Figura 6: IgM anti-GD_{3} del conejo 543 por ELISA. El conejo 543 desarrolló IgM después de inmunizarse con BEC2 mezclado con adyuvante completo de Freund. La respuesta se midió por ELISA.
Figura 7: IgM anti-GD_{3} del conejo 545 por ELISA. El conejo 545 desarrolló IgM después de inmunizarse con BEC2 mezclado con adyuvante completo de Freund. La respuesta se midió por ELISA.
Figura 8: Los anti-cuerpos anti-GD_{3} inducidos por BEC2 no presentan reacciones cruzadas con otros gangliósidos. Se aplicó 1 \mug de diversos gangliósidos purificados a tiras de filtros de nitrocelulosa y se dejaron secar. Las tiras se bloquearon en leche desnatada al 5% y se lavaron. Las tiras se incubaron en suero de conejo (diluido 1:10) durante una noche. Después del lavado, se añadió IgM anti-conejo conjugada con peroxidasa durante 2 horas. Las tiras se volvieron a lavar y la unión se visualizó añadiendo substrato de 4-cloro-1-naftol con H_{2}O_{2}.
Figura 9: Cromatograma que demuestra que la mayoría de las proteínas eluyeron a un peso molecular de aproximadamente 120 kD, que es coherente con la IgG (145-150 kD) pero no es coherente con la IgM (900 kD).
Figura 10: Reactividad anti-GD_{3} del precipitado por NH_{4}SO_{4} del conejo 543. El gráfico muestra la reactividad anti-GD_{3} de cada fracción. Está claro que sólo la fracción de 120 kD está unida a GD_{3}.
La presente invención describe un anticuerpo anti-idiotipo, tal como un anticuerpo policlonal pero preferiblemente monoclonal, que induce una respuesta inmune contra un glicoesfingolípido. Como se usa en este documento, los glicoesfingolípidos y los gangliósidos son moléculas naturales o sintéticas.
En un ejemplo, el glicoesfingolípido es un gangliósido, por ejemplo, GD_{3}, GD2, GM2 y GM3. Se prefiere el GD_{3}.
Generalmente, un anticuerpo comprende dos moléculas, teniendo cada molécula dos polipéptidos diferentes, de los que el más corto funciona como las cadenas ligeras del anticuerpo y el más largo de los polipéptidos funciona como las cadenas pesadas del anticuerpo. Sin embargo, como se usa en este documento, al anticuerpo se le proporciona una definición funcional, es decir, cualquier molécula, ya se natural, inducida artificialmente o recombinante, que tenga actividad inmunorreactiva específica. Normalmente, como se usa en este documento, un anticuerpo incluirá al menos una región variable de una cadena ligera o pesada. Adicionalmente, el anticuerpo puede comprender combinaciones de regiones variables. La combinación puede incluir más de una región variable de una cadena ligera o de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir regiones variables de una o más cadenas ligeras en combinación con regiones variables de una o más cadenas pesadas.
Por consiguiente, dentro del alcance de esta invención se incluye un fragmento de una molécula de anticuerpo natural o recombinante. Como se usa en este documento, una proteína Fab o una proteína F(ab')2 que muestra actividad inmunorreactiva es un anticuerpo. Como se usa en este documento, También es un anticuerpo un complejo inmunológicamente reactivo que comprende dos polipéptidos diferentes, de los que el más corto funciona como una cadena ligera y el más largo funciona como una cadena pesada. Además, como se usa en este documento, también es un anticuerpo un fragmento de región variable (región Fv).
Además, en un ejemplo, el complejo inmunológicamente reactivo puede producirse por métodos de ingeniería genética conocidos o de otra forma (4, 8, 9, 5, 10).
En otro ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-idiotipo descrito anteriormente, que induce específicamente una respuesta inmune contra el gangliósido GD_{3}, también se une específicamente al sitio de unión del anticuerpo R24.
El anticuerpo anti-idiotipo creado por ingeniería genética descrito en este documento puede proceder de cualquier mamífero. El anticuerpo anti-idiotipo creado por ingeniería genética también puede ser un anticuerpo quimérico derivado de una combinación de diferentes mamíferos. El mamífero puede ser, por ejemplo, un conejo, un ratón, una rata, una cabra o un ser humano. La combinación de diferentes mamíferos incluye fragmentos de origen humano y de ratón.
La clase y subclase del anticuerpo es crítica. Puede usarse cualquier subclase para preparar los anticuerpos anti-idiotipo. Los anticuerpos también pueden contener fragmentos de anticuerpos de diferentes clases y subclases, formando por lo tanto un compuesto. En un aspecto, el anticuerpo anti-idiotipo descrito anteriormente es un anticuerpo anti-idiotipo de clase IgG.
El anticuerpo monoclonal anti-idiotipo descrito anteriormente se denomina BEC2. La presente invención también proporciona un hibridoma que produce el anticuerpo anti-idiotipo descrito anteriormente. El hibridoma que produce BEC2 se denomina hibridoma BEC2. El hibridoma BEC2 se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en the International Recognition Of The Deposit of Microorganisms For The Purposes of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos, con el Nº de acceso de la ATCC HB 10153. La presente invención además proporciona un anticuerpo anti-idiotipo producido por el hibridoma BEC2.
En una realización de esta invención, el anticuerpo anti-idiotipo se marca con un marcador detectable. El marcador detectable puede crearse mediante una reacción enzimática, por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
Debería ser evidente para los especialistas en la técnica que un método para unir el anticuerpo anti-idiotipo de la presente invención a una enzima, podría ser mediante una modificación del método de peryodato (6). Como alternativa, debería ser evidente para los especialistas en la técnica cómo unir un ligando a los anticuerpos anti-idiotipo de la presente invención y un receptor del ligando a la enzima. Una combinación de ligando-receptor adecuada es biotina-avidina de acuerdo con el método de Bayer et al. (7).
Además, esta invención describe un método para generar el anticuerpo anti-idiotipo reivindicado descrito anteriormente, BEC2, que comprende: (a) preparar un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal, contra un glicoesfingolípido, más específicamente contra un gangliósido, y más específicamente contra GD_{3}; (b) purificar el anticuerpo; (c) unir el anticuerpo, tal como R24, a un soporte para producir un inmunógeno; (d) combinar el inmunógeno con una citoquina para producir una nueva combinación de inmunógeno-citoquina; y (e) inyectar la nueva combinación de inmunógeno-citoquina en un mamífero produciendo de esta manera el anticuerpo anti-idiotipo.
De acuerdo con la práctica de la invención, el soporte puede ser cualquier material que cuando se combina con el anticuerpo es inmunogénico. El soporte puede ser un microbio, un liposoma o un proteosoma. En un ejemplo, el microbio es S. aureus.
Adicionalmente, de acuerdo con la práctica de la invención, la citoquina puede ser una interleuquina, preferiblemente la interleuquina 1. En un ejemplo, la interleuquina 1 es la interleuquina 1 humana recombinante.
GD_{3} es poco inmunogénico en el ser humano. Por el contrario, los anticuerpos anti-idiotipo del sujeto son muy inmunogénicos.
La presente invención proporciona vacunas que comprenden el anticuerpo anti-idiotipo BEC2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas vacunas son agentes terapéuticos muy potentes y útiles desde el punto de vista comercial.
En la técnica se conocen bien ejemplos de vehículos adecuados y pueden incluir, pero sin limitación en ningún caso, cualquiera de los vehículos farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua, y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos, comprimidos recubiertos y cápsulas.
Típicamente, tales vehículos contienen excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico o sales del mismo, magnesio o estearato cálcico, talco, grasas o aceites vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Tales vehículos también pueden incluir aditivos aromatizantes y colorantes u otros ingredientes. Las composiciones que comprenden tales vehículos se formulan por métodos convencionales bien conocidos. Soluciones salinas tamponadas, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Otros vehículos también pueden incluir soluciones estériles, comprimidos, comprimidos recubiertos y cápsulas.
Esta invención además proporciona una vacuna para inmunizar a un sujeto humano contra gangliósidos GD_{3}, donde al sujeto se le administrará una dosis adecuada de la vacuna descrita anteriormente. La administración de cualquiera de las vacunas puede realizarse de diversas formas. Los medios adecuados de administración incluyen la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular, tópica o intradérmica.
Adicionalmente, esta invención proporciona una vacuna para tratar a un sujeto humano con una afección neoplásica o preneoplásica asociada con la expresión de glicoesfingolípidos, por ejemplo gangliósidos tales como GD3, donde al sujeto se le administrará una cantidad eficaz del anticuerpo anti-idiotipo descrito anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de afecciones neoplásicas y preneoplásicas asociadas con la expresión de gangliósidos GD_{3} incluyen una afección seleccionada entre un grupo compuesto por un melanoma, carcinoma de células escamosas, glioblastoma, sarcoma, leucemia de células T y linfoma, enfermedad de Hodgkin, carcinoma microcítico de pulmón, o tumor cerebral.
En un ejemplo, la administración del anticuerpo anti-idiotipo descrito anteriormente se realiza por medio de administración intravenosa. En otro ejemplo de la invención, la administración del anticuerpo anti-idiotipo descrito previamente se realiza por administración intraperitoneal. En otro ejemplo, la administración del anticuerpo anti-idiotipo descrito previamente se realiza por administración subcutánea. En otro ejemplo de la invención, la administración del anticuerpo anti-idiotipo descrito previamente se realiza por administración intramuscular. Además, en otro ejemplo de la invención, la administración del anticuerpo anti-idiotipo descrito previamente, se realiza por administración tópica. Adicionalmente, en otro ejemplo, la administración del anticuerpo anti-idiotipo descrito previamente se realiza por administración intradérmica.
Esta invención también proporciona una vacuna para inhibir una infección microbiana, tal como una infección relacionada con endotoxinas, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la vacuna descrita anteriormente para inducir la generación de un anticuerpo que se una específicamente a un glicoesfingolípido presente en la membrana de un microbio, formando el anticuerpo y el glicoesfingolípido una combinación e inhibiendo de esta manera la infección microbiana.
Adicionalmente, esta invención proporciona una vacuna para inhibir una malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3} en un sujeto, tal como un ser humano, donde al sujeto se le va a administrar una cantidad eficaz de la vacuna descrita anteriormente para inducir la generación de un anticuerpo que se una específicamente a un gangliósido GD_{3}, formando el anticuerpo y el gangliósido GD_{3} una combinación e inhibiendo de esta manera una malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3}. Los ejemplos de malignidades asociadas con la expresión de gangliósidos GD_{3} incluyen una malignidad seleccionada entre el grupo compuesto por un melanoma, carcinoma de células escamosas, glioblastoma, sarcoma, leucemia de células T y linfoma, enfermedad de Hodgkin, carcinoma microcítico de pulmón o tumor cerebral.
En un ejemplo, el método para medir niveles de expresión de gangliósidos GD_{3} en un tejido de un sujeto se realiza determinando la cantidad y distribución de GD_{3} en secciones tisulares del tejido neoplásico a ensayar. El método comprende poner en contacto el tejido a ensayar con el anticuerpo R24 y detectar de esta manera el nivel de expresión y distribución de GD_{3}.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar a un sujeto que padece una malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3} en células malignas, donde al sujeto se le administrará una cantidad para destruir células de un anticuerpo anti-GD_{3} marcado con un agente citotóxico, tal como un radioisótopo, un fármaco o un metal pesado. El anticuerpo marcado se une al gangliósidos GD3, después de lo cual el agente citotóxico destruye las células malignas a las que está unido el gangliósido GD3. Es importante eliminar rápidamente el anticuerpo no unido marcado con un agente citotóxico. La eliminación puede facilitarse poniendo en contacto el anticuerpo marcado no unido con cualquiera de los anticuerpos anti-idiotipo descritos anteriormente. Los anticuerpos anti-idiotipo se unen al anticuerpo marcado previamente no unido para formar un complejo que puede eliminarse del sujeto por excreción. De esta forma, se trata la malignidad del sujeto sin producir daños indebidos por el agente citotóxico.
Los especialistas en la técnica deberían saber que la "eliminación" de compuestos indeseables, en particular el complejo marcado, implicaría el transporte del complejo al bazo, al pulmón o al hígado, donde una región Fc del anticuerpo dentro del compuesto se uniría al receptor Fc de los tejidos del bazo, pulmón o hígado o de las células procedentes de estos tejidos. Después de unirse a estos tejidos o a las células procedentes de los mismos, el complejo se excreta del cuerpo por medios fisiológicos o bioquímicos.
Los ejemplos de una malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3} incluyen cualquier malignidad seleccionada entre un grupo compuesto por melanoma, carcinoma de células escamosas, glioblastoma, sarcoma, leucemia de células T y linfoma, enfermedad de Hodgkin, carcinoma microcítico de pulmón o tumor cerebral.
Esta invención describe adicionalmente un método para inhibir la proliferación de células asociada con niveles elevados de gangliósidos GD_{3} en un sujeto. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de la vacuna descrita anteriormente.
Además, esta invención proporciona una composición inmunogénica de materia que comprende una cantidad eficaz de una citoquina, por ejemplo interleuquina 1, preferiblemente interleuquina 1 humana recombinante, y un anticuerpo específico de gangliósidos de melanoma, tal como un anticuerpo R24, unido a un soporte. Además, el soporte puede ser un microbio, preferiblemente S. aureus.
Adicionalmente, la presente invención describe un método para generar un anticuerpo anti-idiotipo que comprende: (a) unir un antígeno, por ejemplo R24, a un microbio obteniendo de esta manera un inmunógeno; (b) purificar el inmunógeno; (c) combinar el inmunógeno con interleuquina 1 para producir una combinación de inmunógeno-interleuquina 1; y (d) inyectar la combinación de inmunógeno-interleuquina 1 en ratones, preferiblemente en ratones singénicos, generando de esta manera el anticuerpo anti-idiotipo.
Finalmente, esta invención se ilustra en la sección de detalles experimentales que se muestra a continuación. Esta sección se expone para ayudar a entender la invención pero en ningún caso pretende ser, ni debe considerarse limitante de la invención como se explica en las reivindicaciones que se presentan más adelante.
Detalles Experimentales mAb anti-idiotipo contra R24
Inmunizamos ratones hembra singénicos (C57B1/6X BALB/C)F1 con R24 purificado sin las variantes V1-R24 y V2-R24. La importancia de usar ratones singénicos es que la única porción de la molécula R24 que debe reconocerse como extraña es el parátopo. Es clásico mezclar el material de inmunización con un "adyuvante", un potenciador de una respuesta inmune, que refuerza la respuesta inmune del ratón. El nuevo adyuvante descrito en este documento se obtuvo adhiriendo el R24 a células de S. aureus e inyectando las células recubiertas con R24 junto con rh IL-1 (DuPont).
Los ratones recibieron dos refuerzos semanales. Tres días antes de la fusión, a los ratones se les inyectaron 50 \mug de R24 i.v. Los esplenocitos se fusionaron con SP2/0 usando técnicas convencionales. En los hibridomas se investigó la capacidad de unirse a fragmentos F(ab')_{2} de R24 usando un segundo anticuerpo específico de F_{c} de cabra anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina. Las colonias positivas se subclonaron dos veces por dilución limitante. Tanto S. aureus como IL-1 son fuertes estimuladores de los linfocitos B. Usando técnicas de hibridoma convencionales y la fusión de células de bazo de ratón inmune a la línea de células de mieloma de ratón SP2/0, se produjeron BEC2 y BEC3.
Demostración de que BEC2 es un mAb anti-idiotipo BEC2 reconoce determinantes característicos en R24
Si BEC2 es en realidad un anti-idiotipo para R24, sería de esperar que BEC2 se uniera únicamente a R24 y no a otros mAb. Hemos ensayado la capacidad de BEC2 para unirse a otros 23 mAb usando un ensayo de inhibición. Ningún otro mAb, a excepción de R24, puede competir con R24 por la unión de BEC2 (tabla 1). Debe destacarse que V1-R24, la variante con dos cadenas ligeras irrelevantes, no se une a BEC2. Esto es coherente con el modelo de que BEC2 reconoce el parátopo de R24.
Los resultados de la tabla 1 se obtuvieron usando el siguiente método. BEC2 (5 \mug/ml) se pre-incubó con diluciones de mAb inhibidor durante 1 hora. Después, la mezcla se cultivó en pocillos recubiertos previamente con fragmentos F(ab')_{2} de R24 y se bloqueó con leche desnatada al 5%. La unión de BEC2 se detectó por ELISA usando un segundo anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina específico para la región F_{c}.BEC2 lleva la imagen interna del antígeno GD_{3} original.
Un mAb anti-idiotipo que reconoce el parátopo del mAb de inmunización se denomina mAb anti-idiotipo Ab2b. Una implicación de esto es que el parátopo de BEC2 imitaría a GD_{3}. Si se imagina el parátopo de R24 como una plantilla para GD_{3}, y tanto GD_{3} como BEC2 se ajustan a esa plantilla, entonces BEC2 debe parecerse a GD_{3}. Usando ensayos serológicos, demostramos que BEC2 puede inhibir la unión de R24 a GD_{3}. La figura 4 muestra los resultados en un experimento en el que se preincubaron diferentes concentraciones de BEC2 con una dilución fija de R24 biotinilado. La mezcla se añadió a un pocillo recubierto con GD_{3} y la cantidad de R24 disponible para la unión se midió añadiendo avidina conjugada con fosfatasa. alcalina. Los datos muestran una inhibición significativa de la unión de R24 a GD_{3} por BEC2 que es coherente con que BEC2 sea un mAb anti-idiotipo Ab2b. Para demostrar directamente que el parátopo de BEC2 imita a GD_{3}, es necesario inmunizar animales con BEC2 y demostrar que los animales desarrollan anticuerpos contra GD_{3}.
Inmunizamos cuatros conejos blancos New Zealand con BEC2 mezclado con adyuvante completo de Freund. Los animales recibieron varias inmunizaciones de refuerzo mezcladas con adyuvante incompleto de Freund durante aproximadamente tres meses. Se extrajo sangre de los conejos de forma periódica y el suero se ensayó con respecto a la reactividad anti-GD_{3} usando dos ensayos diferentes. La respuesta de IgG anti-GD_{3} se midió mediante un radioinmunoensayo (RIA) usando [^{125}I]-proteína A. La respuesta de IgM anti-GD_{3} se midió mediante un ELISA usando segundo anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina que era específico para la cadena mu. La especificidad tanto de la respuesta de IgG como de la respuesta de IgM se analizó mediante ensayos de inmunotransferencia contra varios gangliósidos. En estos ensayos, se usó [^{125}I]-proteína A para visualizar la unión de IgG, mientras que para visualizar la unión de IgM se usó antisuero de cabra anti-conejo (específico para la cadena mu) conjugado con peroxidasa.
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1
1
Al menos tres de los cuatro conejos desarrollaron una respuesta de anticuerpo anti-GD_{3}. Según el RIA, el conejo 521 desarrolló IgG contra GD_{3} (figura 5), aunque según la inmunotransferencia, los cuatro conejos parecían crear IgG anti-GD_{3}. Según el ELISA, los conejos 543 (figura 6) y 545 (figura 7) desarrollaron IgM. La especificidad de esta respuesta de anticuerpos se analizó mediante inmunotransferencia. La figura 8 demuestra que la IgM del conejo 543 se une a GD_{3} pero no a los otros cinco gangliósidos ensayados (GM1, GM2, GM3, GD1a, GT1b). Como se ha indicado anteriormente, la inmunotransferencia de suero de los cuatro conejos mostró indicios de la unión de IgG a GD_{3} y esta unión fue específica.
Para confirmar que esta reactividad anti-GD_{3} era efectivamente de IgG, se precipitó suero del conejo 543 usando NH_{4}SO_{4} al 45% y la inmunoglobulina sometida a desplazamiento salino se fraccionó por cromatografía de exclusión molecular (columna de Superose 6, Pharmacia). La figura 9 demuestra que la mayor parte de la proteína eluyó a un peso molecular de aproximadamente 120 kD, que es coherente con la IgG (145-150 kD) pero no es coherente con la IgM (900 kD). La figura 10 muestra la reactividad anti-GD_{3} de cada fracción y está claro que sólo la fracción de 120 kD se une a GD_{3}.
Resultados
BEC2 se une a la región Fab de R24 y bloquea la unión de R24 a gangliósidos GD_{3}. Adicionalmente, BEC2 se une a dos anticuerpos monoclonales anti-GD_{3}, C5 (IgG3) y K9 (IgM). Como BEC2 contiene cadenas ligeras irrelevantes, BEC2 no se une a otros anticuerpos monoclonales de ratón, incluyendo cuatro anticuerpos monoclonales IgG3, ni tampoco se une a la variante de R24.
BEC2 es un anticuerpo monoclonal anti-idiotipo AB2 que se une a la porción de R24 que reconoce GD_{3}. Si se imagina el sitio de unión a R24 como una plantilla para GD_{3}, y tanto GD_{3} como BEC2 se ajustan a esa plantilla, entonces BEC2 debe parecerse a GD_{3}. Usando ensayos serológicos, hemos demostrado que, efectivamente, BEC2 se parece a GD_{3}. BEC2 es una forma útil de inmunizar contra GD_{3} y, de esta forma, es importante como vacuna contra el melanoma y otros tumores.
Para demostrar que BEC2 lleva una imagen interna de GD_{3}, inmunizamos conejos NZW con BEC2 y estudiamos los sueros pre-inmunes e inmunes con respecto a la existencia de indicios de reactividad anti-GD_{3}. Los conejos inmunizados desarrollaron una respuesta de anticuerpo contra GD_{3} detectable por ELISA e inmunotransferencia, contra el GD_{3} purificado, y por un ensayo de hemadsorción mixto contra una línea de células de melanoma humano GD_{3}+. Los análisis de especificidad demostraron que los sueros inmunes sólo reconocían GD_{3} y no GM_{1}, GM_{2}, GM_{3}, GD_{1a}, o GT_{1b}, el anticuerpo monoclonal BEC2 proporciona una estrategia para la inmunización activa de pacientes con melanoma contra GD_{3}.
La inmunización con BEC2 induce anticuerpos específicos IgM e IgG de alta titulación contra GD_{3} en conejos y anticuerpos IgM en ratones singénicos (BALB/c x C57B1)F1.
A partir de los experimentos, descubrimos que BEC2 es un mAb anti-idiotipo IgG2b de ratón dirigido contra R24 y que se une al sitio de unión a antígenos de R24. Además, la inmunización de conejos con BEC2 produce una respuesta IgM e IgG contra GD_{3}. Finalmente, BEC2 lleva la imagen interna del gangliósido GD_{3}, por lo tanto, es útil para la inmunización contra gangliósidos GD_{3}.
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Claims (21)

1. El anticuerpo anti-idiotipo denominado BEC2 y producido por el hibridoma denominado hibridoma BEC2 (Nº de acceso de la ATCC HB 10153).
2. El anticuerpo anti-idiotipo de la reivindicación 1, marcado con un marcador detectable.
3. El anticuerpo anti-idiotipo de la reivindicación 2, donde el marcador detectable es una enzima.
4. El anticuerpo anti-idiotipo de la reivindicación 2, donde el marcador detectable es un cromóforo, un fluoróforo, un radioisótopo o un metal pesado.
5. El hibridoma denominado hibridoma BEC2 (Nº de acceso de la ATCC HB 10153).
6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-idiotipo de la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 que es una vacuna.
8. La vacuna de la reivindicación 7 para inhibir en un sujeto humano una malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3}, donde dicha vacuna se administra por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica.
9. La vacuna de la reivindicación 8, donde la malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3} incluye cualquier malignidad seleccionada entre el grupo compuesto por un melanoma, un carcinoma de células escamosas, un glioblastoma, un sarcoma, leucemia de células T, linfoma de células T, enfermedad de Hodgkin, un carcinoma microcítico de pulmón y un tumor cerebral.
10. La vacuna de cualquiera de la reivindicaciones 7 a 9 para inhibir una infección microbiana en un sujeto, donde en el sujeto se induce con dicha vacuna una respuesta inmune contra un glicoesfingolípido existente en la membrana de un microbio, inhibiéndose de esta manera la infección microbiana.
11. Una composición farmacéutica que comprende:
(a) el anticuerpo anti-GD3 R24 (Nº de acceso de la ATCC HB 8445) marcado con un agente citotóxico; y
(b) el anticuerpo anti-idiotipo de la reivindicación 1;
donde (a) y (b) son para la administración secuencial.
12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 para al tratamiento de malignidades asociadas con la expresión de gangliósidos GD_{3}.
13. La composición farmacéutica de la reivindicación 11 ó 12, donde el agente citotóxico de (a) es un radioisótopo, un fármaco o un metal pesado.
14. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 ó 13, donde la malignidad asociada con la expresión de gangliósidos GD_{3} es una malignidad seleccionada entre el grupo compuesto por un melanoma, un carcinoma de células escamosas, un glioblastoma, un sarcoma, leucemia de células T, linfoma de células T, enfermedad de Hodgkin, un carcinoma microcítico de pulmón y un tumor cerebral.
15. Una composición inmunogénica de materia que comprende una citoquina y un anticuerpo R24 (Nº de acceso de la ATCC HB 8445) unido a un vehículo, donde la citoquina está en una cantidad eficaz para estimular la generación de anticuerpos en un sujeto.
16. La composición de la reivindicación 15, donde la citoquina es interleuquina-1.
17. La composición de la reivindicación 15, donde el vehículo es S. aureus.
18. Un proceso para la preparación del anticuerpo anti-idiotipo de una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 4, que comprende cultivar la línea de células de hibridoma y aislar el anticuerpo deseado, seguido opcionalmente del marcaje del anticuerpo.
19. Un proceso para la preparación de una composición farmacéutica de las reivindicaciones 6 ó 7 o la vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 10, que comprende combinar el anticuerpo anti-idiotipo de la reivindicación 1 con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
20. Un proceso para la preparación de la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende combinar cada uno de los anticuerpos anti-GD_{3} marcados con un agente citotóxico y el anticuerpo anti-idiotipo con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
21. Un proceso para la preparación de la composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que comprende combinar la citoquina y el anticuerpo R24 unido a un soporte.
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