ES2317655T3

ES2317655T3 - Antigeno de staphylococcus aureus.

Info

Publication number: ES2317655T3
Application number: ES97941511T
Authority: ES
Inventors: Ali Ibrahim Fattom; Atulkumar Induprasad Patel
Original assignee: Nabi Biopharmaceuticals Inc
Current assignee: Nabi Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-09-11
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: JP4282765B2; PT925073E; WO1998010788A1; CA2265498C; DK0925073T3; AU4340597A; JP2009007355A; EP0925073B1; US6194161B1; JP2001507566A; DE69739120D1; US5770208A; EP0925073A1; NZ334828A; AU725181B2; EP0925073A4; CA2265498A1; ATE414532T1

Abstract

SE PRESENTA UN ANTIGENO DEL S. AUREUS NEGATIVAMENTE CARGADO QUE CONTIENE BE -HEXOSAMINA COMO COMPONENTE DE CARBOHIDRATO PRINCIPAL. LAS CEPAS DEL S. AUREUS QUE TRANSPORTAN EL ANTIGENO REPRESENTAN CASI TODAS LAS CEPAS CLINICAMENTE SIGNIFICATIVAS DEL S. AUREUS QUE NO SON LAS CEPAS DE TIPO 5 O DE TIPO 8. EL ANTIGENO PUEDE UTILIZARSE EN COMBINACION CON EL ANTIGENO DEL POLISACARIDO DEL S. AUREUS DE TIPO 5 Y CON EL ANTIGENO DEL POLISACARIDO DEL S. AUREUS DE TIPO 8 PARA SUMINISTRAR UNA COBERTURA DE CASI EL 100% DE LAS INFECCIONES POR S. AUREUS. EL ANTIGENO TAMBIEN ES UTIL EN EQUIPOS Y ENSAYOS PARA LA DIAGNOSIS DE LAS INFECCIONES POR S. AUREUS.

Description

Antígeno de Staphylococcus aureus.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a un antígeno novedoso de Staphylococcus aureus y a un método para obtener y usar el antígeno.

S. aureus provoca varias enfermedades mediante diversos mecanismos patógenos. La más frecuente y grave de estas enfermedades es la bacteriemia y sus complicaciones en pacientes hospitalizados. En particular, S. aureus puede provocar infecciones de heridas e infecciones asociadas con catéteres y dispositivos protésicos. Las infecciones graves asociadas con la bacteriemia por S. aureus incluyen osteomielitis, endocarditis invasiva y septicemia. El problema se agrava por la resistencia múltiple a antibióticos en cepas en hospitales, que limita gravemente la elección de la terapia.

Una vacuna contra S. aureus proporcionaría una solución para el problema de la resistencia a antibióticos. Se han identificado ocho serotipos diferentes de S. aureus usando anticuerpos policlonales y monoclonales frente a polisacárido capsular (CPS). Karakawa et al., J. Clin. Microbiol. 22:445 (1985). El contenido de este documento y todos los demás enumerados en el presente documento se incorporan en el presente documento como referencia. Estudios han demostrado que aproximadamente el 85-90% de los aislados son polisacáridos capsulares de tipo 5 o de tipo 8. Un individuo vacunado con una vacuna que contiene antígenos CPS de tipo 5 y de tipo 8 estaría protegido frente a la infección por el 85-90% de las cepas de S. aureus, pero todavía existiría un riesgo significativo de infección. Una vacuna que contiene antígenos de los otros seis serotipos podría proporcionar teóricamente una protección del 100%, pero requeriría la producción y purificación de seis componentes adicionales. Esto no sería sostenible desde un punto de vista práctico. Por otro lado, un antígeno común para los aislados que no pueden tipificarse como de tipo 5 o de tipo 8 permitiría la producción de una vacuna que contenga sólo tres antígenos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un antígeno de Staphylococcus aureus, que puede obtenerse en cantidades recuperables y de forma sustancialmente pura mediante un procedimiento que comprende:

a): hacer crecer una cepa representativa de S. aureus que porta el antígeno 336 y se ha depositado bajo el tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, y se le ha dado el número de registro 55804, sobre una placa de agar de caldo Columbia complementada con MgCl_{2}/CaCl_{2}, y transferirla a un matraz de inicio de NaCl al 2%/Columbia;

b): inocular un fermentador de 50 litros con el matraz de inicio y fermentar las células durante 16-24 horas;

c): destruir las células con una concentración final del 2% de fenol con respecto a etanol y centrifugar las células para separarlas del sobrenadante;

d): extraer el antígeno de la pasta de células resultante de la etapa c)

i): extrayendo el antígeno mediante tratamiento de la pasta de células con lisostafina, ADNasa, ARNasa y proteasa seguido de precipitación secuencial con etanol frío al 25-75%/CaCl_{2} y filtración a través de una membrana de 0,45 \mum de tamaño de poro;

ii): redisolviendo el material bruto resultante en agua y dializando el material frente a agua y liofilizando el material;

iii): disolviendo el material liofilizado en tampón de pH 7,0 y cargando el material disuelto en una columna de separación Q Sepharose equilibrada con el mismo tampón;

iv): lavando la columna con tampón de carga de NaCl 0,15 M pH 7,0 y entonces eluyendo la columna con un gradiente de NaCl 0,15 - 0,4 M;

v): combinando y dializando fracciones que eluyen a NaCl 0,32 - 0,35 M/Tris HCl 0,05 M que contienen antígeno bruto, y

vi): tratando el antígeno bruto con lisozima y purificándolo en tamaño en una columna de filtración en gel Sepharyl S-300 en NaCl 0,2 M/PBS;

no conteniendo dicho antígeno azúcares neutros.

La invención se refiere además a una composición que comprende el antígeno de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo. Además, el antígeno de Staphylococcus aureus de la invención también pretende usarse como agente inmunoestimulador. Un aspecto adicional de la invención es el uso de un antígeno de Staphylococcus aureus según la reivindicación 1 para la preparación de una composición para tratar un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, infección por S. aureus.

La invención se refiere además a un método de preparación de un agente inmunoterápico frente a infección por S. aureus, que comprende recoger plasma de sujetos inmunizados con un antígeno de S. aureus según la invención, y recuperar anticuerpos dirigidos frente a S. aureus de dicho plasma recogido.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un anticuerpo aislado dirigido frente a un antígeno según la reivindicación 1. De manera similar, la invención se refiere al anticuerpo aislado dirigido frente a un antígeno según la reivindicación 1 para su uso como agente inmunoestimulador. La invención se refiere además a una composición que contiene anticuerpos dirigidos frente a antígeno polisacarídico de tipo 5 de S. aureus, antígeno polisacarídico de tipo 8 de S. aureus, y un antígeno de la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

Todavía adicionalmente, la invención proporciona un ensayo de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpo anti-S. aureus en una muestra, que comprende las etapas de:

mezclar el antígeno de S. aureus de la invención con una muestra que se sospecha que contiene anticuerpo específico para S. aureus; y

monitorizar dicha mezcla para determinar la unión entre dicho antígeno y anticuerpo específico para S. aureus en dicha muestra.

Otros objetos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A, 1B y 1C muestran los espectros de RMN para cada uno de los antígenos 336, de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la capacidad de IgG conjugada con 336 para mediar la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que porta el antígeno 336.

Descripción de las realizaciones preferidas

Se ha descubierto que prácticamente todas las cepas de S. aureus que no pueden tipificarse como de tipo 5 o de tipo 8 tienen en común un antígeno, denominado en el presente documento "el antígeno 336". Cuando se combina con antígenos de tipo 5 y de tipo 8, el antígeno 336 representa la base para una vacuna que proporciona protección casi completa frente a la infección por aislados de S. aureus clínicamente significativos. A este respecto, un aislado "clínicamente significativo" es un aislado que es patógeno.

Más particularmente, la tipificación de aislados obtenidos a partir de diversas fuentes ha mostrado que aproximadamente el 60% de los aislados son de tipo 8, aproximadamente el 30% son de tipo 5 y que casi todo el 10% restante de aislados son de tipo 336, tal como se muestra en la tabla 1. Menos del 1% de los aislados no pueden tipificarse como uno de estos tres tipos.

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TABLA 1 Tipificación de aislados

1

De manera notable, los presentes inventores obtuvieron 27 aislados clínicos que no pudieron tipificarse como cepas de S. aureus o bien de tipo 5 o bien de tipo 8, y que se caracterizaron como que eran cepas resistentes a meticilina. Las 27 cepas reaccionaron de manera muy fuerte con sueros de anticuerpo conjugado con antígeno 336, y por tanto pudieron tipificarse como cepas que contenían el antígeno 336.

Los anticuerpos frente al antígeno 336 no reaccionan de manera cruzada con polisacáridos aislados de cualquiera de S. aureus tipo 5, tipo 8, tipo 4, K73 (una cepa variante de tipo 5) o S. epidermidis. Por tanto, el antígeno 336 es específico del tipo, es decir, produce una única banda sólo con el antisuero de tipo homólogo.

El antígeno 336 puede obtenerse en cantidad recuperable, a partir de ciertos aislados de S. aureus cultivados de acuerdo con los protocolos descritos en el presente documento, de forma sustancialmente pura. En particular, el antígeno purificado contiene menos del 1% de proteína y menos del 1% de ácidos nucleicos. A este respecto, una cantidad "recuperable" significa que la cantidad aislada del antígeno puede detectarse mediante una metodología menos sensible que el radiomarcaje, tal como inmunoanálisis, y puede someterse a manipulaciones adicionales que implican la transferencia del antígeno per se a la disolución.

Para obtener el antígeno 336, en primer lugar se hace crecer un aislado de 336 según la invención sobre una placa de agar de caldo Columbia complementada con MgCl_{2}/CaCl_{2} y entonces se transfiere a un matraz de inicio de NaCl al 2%/Columbia. Se inocula un fermentador de 50 litros que contiene el mismo medio con el matraz de inicio. Se fermentan las células durante 16-24 horas. Tras la fermentación, se destruyen las células con una concentración final del 2% de fenol con respecto a etanol (1:1) y entonces se centrifugan para separar las células del sobrenadante. Se extrae antígeno de la pasta de células. Algo de antígeno 336 está presente en el sobrenadante, pero la cantidad es insignificante en comparación con la cantidad encontrada en la pasta de células. Debido al bajo rendimiento, y al riesgo de contaminación por hexosa de los medios, no se prefiere la extracción del sobrenadante.

Los tratamientos enzimáticos de la pasta de células con lisostafina, ADNasa, ARNasa y proteasa, seguido de precipitación secuencial con etanol frío al 25-75%/CaCl_{2}, dan como resultado una extracción de antígeno bruto. Se redisuelve el material bruto en agua, se dializa y se liofiliza. Se disuelve el material liofilizado en tampón y se carga en una columna de separación equilibrada con el mismo tampón. Se lava la columna con tampón de carga de NaCl 0,15 M y entonces se eluye con un gradiente de NaCl 0,15-0,4 M. La mayor parte del antígeno según la invención eluye a NaCl de 0,32 a 0,35 M. Se combinan las fracciones que contienen el antígeno, se dializan, se concentran y se liofilizan. Puede repetirse la separación para obtener mejor purificación. Se trata el antígeno bruto con lisozima y se purifica en tamaño en una columna adecuada y entonces se combinan las fracciones positivas para 336, se concentran, se dializan y se liofilizan.

El análisis del antígeno 336 purificado mediante cromatografía gas-líquido (CGL) muestra la presencia de glucosamina como componente glicosílico principal. Esto se confirma mediante el análisis de azúcares en un sistema Dionex. La espectroscopia de 1H-RMN del antígeno 336 indica la presencia de hexosamina con enlaces \beta como componente de hidrato de carbono principal. El antígeno comprende adicionalmente un componente que es responsable de una carga negativa observada presentada por el antígeno 336.

Una comparación de los espectros de RMN para cada uno de los antígenos 336, de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus, tal como se muestra en la figura 1, confirma que el antígeno 336 se distingue químicamente de los antígenos tanto de tipo 5 como de tipo 8 de S. aureus. Las estructuras de los antígenos polisacarídicos de tipos 5 y 8 se han dilucidado por Moreau et al., Carbohydr. Res. 201:285(1990); y Fournier et al., Infect. Imm. 45:87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición así como ManNAcA que puede usarse para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras son las siguientes:

Tipo 5:

2

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Tipo 8:

100

Por lo contrario, el componente de hidrato de carbono principal del antígeno 336 es hexosamina con enlaces \beta.

La inducción de bacteriemia en mamíferos requiere un número extremadamente alto de microorganismos o alguna maniobra previa para disminuir la resistencia del huésped. Sin embargo, la fagocitosis in vitro puede estudiarse como correlación de la inmunidad protectora in vivo. En este modelo, la capacidad de anticuerpos monoclonales y policlonales específicos para el antígeno 336 de opsonizar S. aureus in vitro se mide mediante fagocitosis, según el método descrito en Kojima et al., Infect. Dis. Immun. 58: 2367-2374 (1990).

Los anticuerpos inducidos mediante una vacuna de antígeno 336 facilitan la fagocitosis específica del tipo. Los ensayos de fagocitosis in vitro indican por tanto que los anticuerpos frente al antígeno 336 son protectores frente a la infección por cepas de S. aureus que portan el antígeno 336. Se ha demostrado anteriormente que las vacunas a base de antígenos de tipo 5 y de tipo 8 son protectoras frente a la infección por cepas de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus, respectivamente. Fattom et al. Inf. and Imm. 58: 2367-2374 (1990) y Fattom et al., Inf. and Imm. 64: 1659-1665 (1996). Puede usarse una vacuna a base de una combinación de antígeno de tipo 5, de tipo 8 y 336, para proteger frente a la infección de la mayor parte de las cepas de S. aureus clínicas.

Una composición del antígeno 336 según la presente invención "consiste esencialmente en" el antígeno 336, lo que significa que la composición no contiene ningún material que interfiere con la obtención de una respuesta inmunitaria frente al antígeno 336 (y frente a otros antígenos, si están presentes) cuando la composición se administra a un sujeto como una vacuna, o con el acoplamiento antígeno-anticuerpo característico de un ensayo de diagnóstico cuando el antígeno se usa en el diagnóstico. En una realización preferida, la composición contiene antígenos de tipo 336, de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus.

Los antígenos según la invención son útiles en la producción de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de antígeno de S. aureus y/o anticuerpo anti-S. aureus en una muestra. El antígeno 336 de S. aureus, o el anticuerpo específico frente al antígeno de S. aureus, sólo o en combinación con antígeno de, o anticuerpo frente a, uno o a ambos de los antígenos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus, se mezcla con una muestra que se sospecha que contiene anticuerpo frente a, o antígeno de, S. aureus y se monitoriza para determinar la unión de antígeno-anticuerpo. Se marca el antígeno o anticuerpo con marcador radioactivo o enzimático. En una realización preferida, se inmoviliza el antígeno o anticuerpo sobre una matriz sólida de modo que el antígeno o anticuerpo es accesible al anticuerpo o antígeno complementario que entra en contacto con una superficie de la matriz. Entonces se pone en contacto la muestra con la superficie de la matriz, y se monitoriza la superficie para determinar la unión de antígeno-anti-
cuerpo.

Por ejemplo, el antígeno o anticuerpo puede usarse en un ensayo de inmunoabsorción unido a enzima (ELISA), en el que se unen el antígeno o el anticuerpo a una fase sólida y se usa un conjugado enzima-anticuerpo o enzima-antígeno para detectar y/o cuantificar el anticuerpo o el antígeno presente en una muestra. Alternativamente, puede usarse un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western en el que el/los antígeno(s) solubilizado(s) y separado(s) se une(n) a papel de nitrocelulosa. Entonces se detecta el anticuerpo mediante un anticuerpo anti-inmunoglobulina (Ig) conjugado a marcador o enzima, tal como el conjugado de peroxidasa de rábano-Ig, incubando el papel de filtro en presencia de sustrato que puede precipitar o detectarse. Los ensayos de inmunotransferencia de tipo Western tienen la ventaja de no requerir una pureza mayor del 50% para el/los antígeno(s) deseado(s). Las descripciones de las técnicas de ELISA e inmunotransferencia de tipo Western se encuentran en los capítulos 10 y 11 de Ausubel, et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (1988).

Para su uso en una vacuna, es preferible conjugar el antígeno 336 con un inmunoportador, normalmente un polipéptido o una proteína, para mejorar la interacción entre las células T y B para la inducción de una respuesta inmunitaria frente al antígeno. Esto es particularmente importante para vacunas que se pretenden usar en pacientes con resistencia reducida. Un inmunoportador potencia la inmunogenicidad tanto para la inmunización activa como para preparar antisueros de titulo alto en voluntarios para la inmunización pasiva. Los inmunoportadores adecuados según la presente invención incluyen toxoide tetánico, toxoide diftérico, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa o sus derivados, cepas mutantes no tóxicas producidas de manera recombinante de exotoxina A, tal como se describen, por ejemplo, en Fattom et al., Inf. and Imm. 61: 1023-1032 (1993), así como otras proteínas usadas comúnmente como inmunoportadores.

Preferiblemente, el antígeno o conjugado de antígeno se administra sin un adyuvante con el fin de evitar la toxicidad inducida por el adyuvante. Si se usa un adyuvante, se prefiere usar uno que potencie los anticuerpos del subtipo 2 de IgG protectores. Los adyuvantes típicos incluyen adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freund incompleto (IFA). Se ha demostrado que el sulfato de dextrano es un potente estimulador de anticuerpo IgG_{2} frente a antígenos de superficie celular de estafilococos, y también es adecuado como adyuvante.

La presente invención también se refiere al uso del antígeno 336 para producir anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales (de ratón o de seres humanos) que se unen a, o neutralizan, cepas de S. aureus que portan el antígeno 336. Los protocolos para la producción de estos anticuerpos se describen en Ausubel, et al. (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), capítulo 11; en METHODS OF HYBRIDOMA FORMATION 257-271, Bartal & Hirshaut (eds.), Humana Press, Clifton, NJ (1988); en Vitetta et al., Immunol. Rev. 62:159-83 (1982); y en Raso, Immunol. Rev. 62:93-117 (1982).

El inóculo para la producción de anticuerpos policlonales se prepara normalmente dispersando el antígeno-inmunoportador en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como solución salina, para formar una composición acuosa. Se administra una cantidad inmunoestimuladora de inóculo, con o sin adyuvante, a un mamífero y entonces se mantiene el animal inoculado durante un perdido de tiempo suficiente para que el antígeno induzca los anticuerpos anti-antígeno 336 protectores. Pueden usarse dosis de refuerzo de antígeno-inmunoportador en individuos que non están todavía sensibilizados para responder frente al antígeno.

Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de anticuerpos a partir de una variedad de animales usados comúnmente, por ejemplo, cabras, primates, burros, cerdos, conejos, caballos, gallinas, cobayas, ratas y ratones, e incluso anticuerpos humanos tras una selección, fraccionamiento y purificación apropiados. También pueden producirse antisueros animales inoculando los animales con cepas de 336 de S. aureus destruidas con formalina, mediante métodos convencionales, extrayendo sangre de los animales y recuperando el suero o plasma para el tratamiento adicional.

Los anticuerpos inducidos de esta manera pueden recuperarse y aislarse hasta el grado deseado mediante técnicas bien conocidas, tal como mediante fraccionamiento en alcohol y cromatografía en columna, o mediante cromatografía por inmunoafinidad; es decir, mediante la unión de antígeno a un relleno de columna cromatográfica como tal Sephadex^{TM}, haciendo pasar el antisuero a través de la columna, reteniendo de ese modo anticuerpos específicos y eliminando mediante separación otras inmunoglobulinas (IgG) y contaminantes, y entonces recuperando anticuerpos purificados mediante elución con un agente caotrópico, opcionalmente seguido de purificación adicional, por ejemplo, mediante el paso a través de una columna de antígenos de grupo sanguíneo unidos u otras especies no patógenas. Puede preferirse este procedimiento cuando se aíslan los anticuerpos deseados de los sueros o plasma de seres humanos que han desarrollado un título de anticuerpos frente al patógeno en cuestión, garantizando de ese modo la retención de anticuerpos que pueden unirse al antígeno. Pueden usarse entonces en preparaciones para la inmunización pasiva frente a cepas de 336 de S. aureus.

Una composición de anticuerpo monoclonal contiene, dentro de los límites detectables, sólo una especie de sitio de combinación de anticuerpo que puede unirse de manera eficaz al antígeno 336. Pueden prepararse anticuerpos adecuados de forma monoclonal usando tecnología de hibridoma convencional.

Para formar hibridomas a partir de los cuales se produce una composición de anticuerpo monoclonal de la presente invención, se fusiona un mieloma u otra línea celular en autoperpetuación con linfocitos obtenidos de sangre periférica, ganglios linfáticos o el bazo de un mamífero hiperinmunizado con el antígeno 336. Se prefiere que la línea celular de mieloma sea de la misma especie que los linfocitos. Normalmente se fusionan esplenocitos con células de mieloma usando polietilenglicol 1500. Se seleccionan híbridos fusionados por su sensibilidad a HAT. Pueden identificarse hibridomas que segregan las moléculas de anticuerpo de esta invención usando un ELISA.

Un bazo de ratón Balb/C, sangre periférica humana, ganglios linfáticos o esplenocitos humanos son los materiales preferidos para usar en la preparación de hibridomas murinos y humanos. Los mielomas de ratón adecuados para su uso en la presente invención incluyen las líneas de células sensibles a hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), siendo un mieloma preferido P3X63-Ag8.653. La pareja de fusión preferida para la producción de anticuerpos monoclonales humanos es SHM-D33, un heteromieloma disponible de ATCC, Rockville, Md. con la designación CRL 1668.

Una composición de anticuerpo monoclonal de la presente invención puede producirse iniciando un cultivo de hibridoma monoclonal que comprende un medio de nutrientes que contiene un hibridoma que segrega moléculas de anticuerpo de la especificidad apropiada. El cultivo se mantiene en condiciones y durante un periodo de tiempo suficiente para que el hibridoma segregue las moléculas de anticuerpo en el medio. Entonces se recoge el medio que contiene anticuerpos. Entonces pueden aislarse adicionalmente las moléculas de anticuerpo mediante técnicas bien conocidas.

Los medios útiles para la preparación de estas composiciones se conocen bien en la técnica y están comercialmente disponibles, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones consanguíneos y similares. Un medio sintético a modo de ejemplo es el medio esencial mínimo de Dulbecco complementado con de suero de ternero fetal al 20%. Una cepa de ratón consanguíneo a modo de ejemplo es la Balb/c.

También se contemplan otros métodos de preparación de composiciones de anticuerpo monoclonal, tales como fusiones interespecies, puesto que es principalmente la especificidad por el antígeno de los anticuerpos la que afecta a su utilidad en la presente invención. Pueden fusionarse linfocitos humanos obtenidos a partir de individuos infectados con una línea de células de mieloma humana para producir hibridomas que pueden seleccionarse para determinar la producción de anticuerpos que reconocen al antígeno 336. Sin embargo, a este respecto es más preferible un procedimiento que no implique el uso de una muestra biológica de un sujeto humano infectado. Por ejemplo, un sujeto inmunizado con una vacuna tal como se describe en el presente documento puede servir como fuente de anticuerpos utilizados de manera adecuada en una composición de anticuerpo dentro de la presente invención.

En una realización particularmente preferida, se producen anticuerpos monoclonales frente al antígeno 336 usando métodos similares a los descritos para los anticuerpos específicos del tipo frente al tipo 5 y al tipo 8 de S. aureus. Los anticuerpos monoclonales purificados se caracterizan mediante ensayos de aglutinación bacteriana usando una colección de aislados clínicos.

Las composiciones de anticuerpo monoclonal y policlonal producidas según la presente descripción pueden usarse mediante inmunización pasiva para inducir una respuesta inmunitaria para la prevención o el tratamiento de la infección por cepas de S. aureus que portan el antígeno 336. A este respecto, la preparación de anticuerpo puede ser una composición policlonal. Tal composición policlonal incluye anticuerpos que se unen al antígeno 336, y adicionalmente puede incluir anticuerpos que se unen a los antígenos que caracterizan a las cepas de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus. El componente de anticuerpo policlonal puede ser un antisuero policlonal, preferiblemente purificado por afinidad, de un animal que se ha expuesto al antígeno 336, y preferiblemente también a los antígenos de tipo 5 y de tipo 8. Alternativamente, puede usarse una mezcla "oligoclonal diseñada mediante ingeniería", que es una mezcla de anticuerpos monoclonales frente al antígeno 336, y anticuerpos monoclonales frente a antígenos de tipo 5 y/o de tipo 8.

En ambos tipos de mezclas, puede ser ventajoso unir químicamente anticuerpos entre sí para formar una única molécula poliespecífica que puede unirse al antígeno 336 y uno o ambos de los antígenos de tipo 5 y de tipo 8. Un modo de realizar una unión de este tipo es preparar fragmentos híbridos bivalentes F(ab')_{2} mezclando dos fragmentos F(ab')_{2} diferentes producidos, por ejemplo, mediante digestión con pepsina de dos anticuerpos diferentes, escisión reductora para formar una mezcla de fragmentos Fab', seguido de nueva formación oxidativa de los enlaces disulfuro para producir una mezcla de fragmentos F(ab')2 incluyendo fragmentos híbridos que contienen una parte Fab' específica frente a cada uno de los antígenos originales. Métodos de preparación de tales fragmentos de anticuerpo híbridos se dan a conocer en Feteanu, LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE 321-23, McGraw-Hill Int'l Book Co. (1978); Nisonoff, et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961); y Hammerling, et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968); y en la patente estadounidense número 4.331.647.

En la técnica se conocen otros métodos para preparar fragmentos bivalentes que son completamente heteroespecíficos, por ejemplo, el uso de ligadores bifuncionales para unir fragmentos escindidos. Se conocen moléculas recombinantes que incorporan las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo, por ejemplo, según el método de Boss et al., patente estadounidense número 4.816.397. Métodos análogos de producción de moléculas de unión recombinantes o sintéticas que tienen las características de anticuerpos se incluyen en la presente invención. Pueden unirse más de dos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos monoespecíficos diferentes usando diversos ligadores conocidos en la técnica.

Un componente de anticuerpo producido según la presente invención puede incluir anticuerpos completos, fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulina completa de cualquier clase, por ejemplo, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidades por el antígeno o epítopo dobles o múltiples, o fragmentos, por ejemplo, F(ab')_{2}, Fab', Fab y similares, incluyendo fragmentos híbridos, e incluyen adicionalmente cualquier inmunoglobulina o cualquier proteína natural, sintética o diseñada genéticamente que actúa como un anticuerpo uniéndose a un antígeno específico para formar un complejo. En particular, las moléculas de Fab puede expresarse y ensamblarse en un huésped genéticamente transformado tal como E. coli. Por tanto, un sistema de vector lambda está disponible para expresar una población de Fab' con una diversidad potencial igual a, o que
supera, la de un sujeto que genera el anticuerpo predecesor. Véase Huse, W.D., et al., Science 246: 1275-81 (1989).

El antígeno 336 según la presente invención puede ser el principio activo en una composición, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable para el principio activo, que puede usarse como vacuna para inducir una respuesta inmunitaria celular y/o la producción in vivo de anticuerpos que combaten la infección por S. aureus. A este respecto, un vehículo farmacéuticamente aceptable es un material que puede usarse como vehículo para administrar un medicamento ya que el material es inerte o de otro modo médicamente aceptable, así como compatible con el principio activo, en el contexto de la administración de vacunas. Además de un excipiente adecuado, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede contener aditivos de vacuna convencionales tales como diluyentes, adyuvantes, antioxidantes, conservantes y agentes de solubilización.

De acuerdo con la presente invención, una vacuna de este tipo puede administrarse a un sujeto todavía no infectado por S. aureus, para inducir de ese modo una respuesta inmunitaria (humoral o celular) protectora frente a S. aureus en ese sujeto. Alternativamente, una vacuna dentro de la presente invención puede administrarse a un sujeto en el que ya se ha producido infección por S. aureus pero está en una fase suficientemente temprana que la respuesta inmunitaria producida frente a la vacuna inhibe eficazmente la propagación adicional de la infección.

En otro enfoque, una vacuna de la presente invención puede administrarse a un sujeto que entonces actúa como fuente de globulina, producida en respuesta a la exposición de la vacuna específica ("globulina hiperinmunitaria"), que contiene anticuerpos dirigidos frente a S. aureus. Un sujeto tratado de ese modo donaría plasma del cual se obtendría entonces la globulina hiperinmunitaria, por medio de la metodología de fraccionamiento de plasma convencional, y se administraría a otro sujeto con el fin de conferir resistencia frente a, o tratar, la infección por S. aureus. Las globulinas hiperinmunitarias según la invención son particularmente útiles para individuos inmunocomprometidos, para individuos que se someten a procedimientos invasivos o cuando el tiempo no permite al individuo producir sus propios anticuerpos en respuesta a la vacunación.

De manera similar, los anticuerpos monoclonales o policlonales anti-S. aureus producidos según la presente invención pueden conjugarse con una inmunotoxina, y administrarse a un sujeto en el que ya se ha producido la infección por S. aureus pero no se ha propagado ampliamente. Para este fin, el material de anticuerpo producido de acuerdo con la presente descripción se administraría en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se define en el presente documento.

La presente invención se describe además mediante referencia a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Ejemplo 1

Fermentación de S. aureus

Se cultivó una cepa de S. aureus que porta el antígeno 336 en un caldo Columbia complementado con NaCl al 2% en un fermentador de 80 litros que contiene 60 litros de medio de caldo a 37º. Se inició la fermentación con un litro de cultivo de simiente de 16 horas de antigüedad. Se hicieron crecer las células con agitación a 200 rpm durante 24 horas, hasta una A_{650nm} de 20,0.

Se fijaron con formalina durante la noche a temperatura ambiente las células que iban a usarse como vacuna para preparar antisuero de células completas. Se destruyeron las células para la purificación de antígeno añadiendo fenol-etanol (1:1, vol/vol) al fermentador hasta una concentración final del 2% y mezclando lentamente durante 2 horas a 15-20ºC. No se detectaron células viables tras este tratamiento. Entonces se recuperaron las células mediante centrifugación a 14.500 x g y se almacenaron a -70ºC hasta su uso. Se obtuvieron aproximadamente 800-900 gramos de pasta de células (peso neto) a partir de una fermentación de 60 litros.

Ejemplo 2

Preparación de antisuero de células completas

Se ajustaron a DO_{540nm}=1 las células fijadas con formalina del ejemplo 1 y se inyectaron por vía intravenosa a conejos. No se usó adyuvante. Se extrajo sangre de los conejos semanalmente y se recogió y se combinó el suero de células completas positivo. Se purificó IgG a partir del suero de células completas mediante una columna de afinidad por la proteína G. El material purificado contenía 23 mg/ml de IgG total (barrido de UV a 280) y sustancialmente menos IgG específica de antígeno 336.

Ejemplo 3

Purificación de antígeno

Se suspendió la pasta de células a 0,5 g (peso húmedo) por ml en Tris 0,05 M-MgSO_{4} 2 mM, pH 7,5. Se añadió lisostafina (de 100 a 150 \mug/ml) y se incubó a 37ºC durante 3 horas con mezclado. Después, se añadieron ADNasa y ARNasa hasta concentraciones finales de 50 \mug/ml cada una y se continuó la incubación durante 4 horas adicionales. Se precipitó la mezcla de reacción secuencialmente con etanol al 25 y al 75% en presencia de CaCl_{2} 10 mM.

Se sedimentó el precipitado de etanol al 75% mediante centrifugación a 12.000 x g durante 30 minutos, o a menos rpm durante más tiempo. Se transfirió el sobrenadante a tubos de diálisis. Se filtró la mezcla de reacción a través de una membrana de 0,45 \mum de tamaño de poro y se precipitó secuencialmente con etanol al 25 y al 75% en presencia de CaCl_{2} 10 mM. Se dializó el precipitado de etanol al 75% de manera extensa frente a agua a de 3 a 8ºC y se liofilizó. Se disolvió el polvo en NaCl 0,2 M/Tris HCl 0,05 M, pH 7,0. Se cargó el material bruto resultante en una columna Q Sepharose en NaCl 0,2 M/Tris HCl 0,05 M, pH 7,0, y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0,2-0,4 M. Se combinaron las fracciones que contenían antígeno, tal como se detectó mediante precipitación capilar con antisuero del ejemplo 2, se dializaron y se liofilizaron. La mayor parte del antígeno eluía a NaCl 0,32-0,35 M/Tris HCl 0,05 M.

Se trató el antígeno bruto obtenido de ese modo con 1 mg de lisozima por 10 mg de antígeno bruto en CaCl_{2}
10 mM para digerir la contaminación por peptidoglicano residual. Entonces se purificó adicionalmente el antígeno bruto tratado con lisozima en una columna de filtración en gel Sephacryl S-300 en NaCl 0,2 M/PBS 1x para obtener antígeno sustancialmente puro. Se examinó todo el material reactivo usando antisuero completo.

Ejemplo 4

Caracterización de antígeno

El análisis de antígeno 336 purificado mediante cromatografía gas-líquido (CGL) muestra la presencia de glucosalina como componente glicosílico principal. Esto se confirmó mediante análisis de azúcares en el sistema Dionex. La espectroscopia de 1H-RMN del antígeno 336 muestra un protón anomérico a 4,751 ppm, correspondiente a la hexosamina con enlaces \beta. Además, el espectro de RMN muestra señales bien separadas a 4,229 ppm (2H), 3,649 (1H), 3,571 ppm (2H), 2,19 ppm (3H). No se encuentran señales correspondientes a grupos O-acetilo. Esto indica la ausencia de O-acetilación y se distingue claramente del 20-80% de O-acetilación encontrada en otros aislados de tipo de S. aureus, tales como de tipo 5 y de tipo 8. El espectro de 13C-RMN muestra una señal en la región anomérica a 102,396 ppm. Esto confirma la presencia de monosacárido como componente principal. Otras señales del espectro de 13C-RMN aparecen a 81,865, 76,641, 74,950, 71,841, 71,051, 70,775, 67,665.67,142, 61,716, 56,552, 50,355, 43,408 y 23,246 ppm, respectivamente.

La movilidad del antígeno purificado en inmunoelectroforesis (IEF) indica la presencia de grupos cargados negativamente. El antígeno purificado no contiene azúcares neutros tal como se detecta mediante el ensayo de fenol-sulfúrico. La K_{d} del antígeno purificado era de 0,3 en una columna Superose 12 HR, que es un material de tamaño molecular más pequeño en comparación con el tipo 5 (K_{d} de 0,017), tipo 8 (K_{d} de 0,061) y ácido teicoico (K_{d} de 0,18).

Ejemplo 5

Conjugados de antígeno-inmunoportador

Se derivatizó el antígeno purificado con dihidrazida del ácido adípico (ADH) 0,5 M usando 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC) 100 mM a pH 5,6. Se logró un porcentaje de derivatización en el intervalo del 2 al 7% (p/p). Se conjugó el antígeno purificado derivatizado con una cepa mutante, no tóxica producida de manera recombinante, de exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa usando EDAC 50 mM a 1:1 (antígeno:proteína), tal como se describe en Fattom et al., Inf. and Imm. 60: 584-589 (1992). El rendimiento de conjugación fue del 50-70%, determinado mediante medición de proteína. La Kd del conjugado era de 0,2 en la columna Superose 12 HR.

Se inyectó el conjugado en conejos con adyuvante (CFA seguido de IFA) a una razón de 1:1. Se combinaron extracciones de sangre positivas y se purificaron las IgG en una columna de proteína G. La IgG preparada frente a conjugado mostró identidad con los anticuerpos inducidos mediante IgG de células completas frente al antígeno en un ensayo de inmunodifusión. Se mostró que la IgG de sueros de conjugado purificada contenía 12,2 mg/ml de IgG total mediante un barrido de UV a 280 nm y 0,7 mg/ml de IgG específica de antígeno mediante ELISA. Se usaron suero de células completas, IgG frente a células completas e IgG frente a conjugado en ensayos de opsonofagocitosis y modelos animales.

Ejemplo 6

Ensayos de opsonofagocitosis in vitro

Se obtuvieron leucocitos polimorfonucleares (PMN) a partir de células HL-60 ajustadas hasta una concentración de 1,0 x 10^{7} células por ml en MEM complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). Se hizo crecer S. aureus durante la noche en caldo Columbia complementado con MgCl_{2}/CaCl_{2}. Se ajustó espectrofotométricamente la concentración de bacterias hasta una DO de 0,02 a 540 nm (4 x 10^{6} células/ml) entonces se ajustó hasta 1 x 10^{6} células/ml en MEM complementado con FBS al 10%. Se añadieron IgG purificadas específicas de antígeno o no reactivas control para facilitar la opsonización mediante PMN. Se usó complemento de conejo bebe, diluido 1:8 en MEM complementado con FBS al 10% como control negativo.

La mezcla de reacción contenía 25 \mul de S. aureus (concentración de 1 x 10^{6} células/ml), 25 \mul de PMN (concentración 1 x 10^{7} células/ml), 25 \mul de complemento, 100 \mul de sueros o anticuerpos, y suficiente MEM/FBS al 10% para llevar el volumen de reacción total hasta 250 \mul. Se diluyeron en serie 25 \mul de muestra a las 0 horas, 1 horas y 2 horas. Se cultivaron 25 \mul de las diluciones de 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5} en placas de agar TSA y se incubaron durante la noche a 37ºC.

Los resultados se muestran en la figura 2, y muestran que el anticuerpo frente al conjugado media la opsonofagocitosis de una cepa representativa de S. aureus que porta el antígeno 336. Los resultados se indican como porcentaje de destrucción en cantidades de IgG específica de antígeno 336 que oscilan desde 300 \mug hasta 128 \mug. Para la comparación, también se indica el porcentaje de destrucción en una cantidad equivalente de IgG no reactiva. Se usaron como control los PMN más el complemento.

Claims

1. Antígeno de Staphylococcus aureus, que puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende:

d): extraer el antígeno de la pasta de células resultante de la etapa c)

iv): lavando la columna con tampón de carga de NaCl 0,15 M de pH 7,0 y entonces eluyendo la columna con un gradiente de NaCl 0,15 - 0,4 M;

v): combinando y dializando las fracciones que eluyen a NaCl 0,32 - 0,35 M/Tris HCl 0,05 M que contienen antígeno bruto, y

vi): tratando el antígeno bruto con lisozima y purificándolo por tamaño en una columna de filtración en gel Sepharyl S-300 en NaCl 0,2 M/PBS;

no conteniendo dicho antígeno azúcares neutros.

2. Antígeno según la reivindicación 1, estando conjugado dicho antígeno con un inmunoportador.

3. Antígeno según la reivindicación 2, en el que dicho inmunoportador es una exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa mutante no tóxica, producida de manera recombinante.

4. Composición que comprende el antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

5. Composición según la reivindicación 4, que comprende además un antígeno polisacarídico de tipo 5 de S. aureus o un antígeno polisacarídico de tipo 8 de S. aureus.

6. Composición según la reivindicación 5, que comprende antígenos polisacarídicos tanto de tipo 5 como de tipo 8.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en la que cada uno de dichos antígenos está conjugado con un inmunoportador.

8. Composición según la reivindicación 7, en la que dicho inmunoportador es una exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa mutante no tóxica, producida de manera recombinante.

9. Antígeno de Staphylococcus aureus según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso como agente inmunoestimulador.

10. Uso de un antígeno de Staphylococcus aureus según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para la preparación de una composición para tratar un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, infección por S. aureus.

11. Método de preparación de un agente inmunoterápico frente a la infección por S. aureus, que comprende recoger plasma de sujetos inmunizados con un antígeno de S. aureus según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y recuperar anticuerpos dirigidos frente a S. aureus de dicho plasma recogido.

12. Anticuerpo aislado dirigido frente al antígeno según la reivindicación 1.

13. Anticuerpo según la reivindicación 12, siendo dicho anticuerpo un anticuerpo monoclonal.

14. Composición que contiene anticuerpos dirigidos frente a antígeno polisacarídico de tipo 5 de S. aureus, antígeno polisacarídico de tipo 8 de S. aureus, y un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo.

15. Composición según la reivindicación 14, en la que dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

16. Anticuerpo según la reivindicación 12 ó 13, para su uso en inmunoterapia.

17. Ensayo de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpo anti-S. aureus en una muestra, que comprende las etapas de:

mezclar el antígeno de S. aureus según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 con una muestra que se sospecha que contiene anticuerpo específico para S. aureus; y

18. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación 17, en el que dicho antígeno se inmoviliza sobre una matriz sólida.

19. Ensayo de diagnóstico según la reivindicación 17 ó 18, en el que dicho anticuerpo se inmoviliza sobre una matriz sólida.