CN105372427A - 一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法 - Google Patents

一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，属于食品安全致病菌快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品样本中致病菌的核磁共振检测方法，利用KMnF4纳米探针的顺磁特性对核磁共振弛豫时间的影响，检测出样本中是否含有目标菌。不同的具体的对应关系为：KMnF4纳米探针，在一定条件下显示出线性关系，即KMnF4纳米探针含量大，样品的自旋-晶格弛豫时间值越小，在一定范围能够定量检测目标菌。本发明可以用于食品样本中有害致病菌的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。

Description

一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种致病菌的快速检测方，是一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法。
背景技术
基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。KMnF4纳米探针为抗体修饰改性的KMnF4纳米粒子，KMnF4由于具有元素Mn, 其最外层有未成对电子，因而具有持久的电子自旋。非成对电子自旋的总磁矩是质子自旋的657倍。由于弛豫效率随着磁矩的平方变化，所以电子弛豫效率是质子弛豫效率的50万倍，因此，其粒子对周围水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫时间的影响非常大。这也就是这类物质作为核磁共振造影剂的机理。非常微量的纳米KMnF4就会造成水的核磁共振自旋-晶格弛豫时间大幅下降，通过空白对照就能明确，是由于存在这种物质引起的。因此可以构建KMnF4纳米探针生物传感器，从磁共振的角度来做检测特定物质，本发明就是通过构建抗体修饰的生物传感器来对特异性的病菌进行检测。
其主要的步骤原理：1）检测目标菌的特异性KMnF4纳米探针的制备。从市场上购买KMnF4纳米材料，也可以通过其他化学合成方法制备纳米级的KMnF4。使用硅烷偶联剂或PEG（聚乙二醇），修饰提高生物相容性，其通式为：Y(CH2)nSiX3。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)3)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。再通过修饰特异性抗体可实现表面功能化，形成特异性探针，再封闭多余的活性位点。2）采用常规方法将待检目标菌的特异性单抗固定在酶标板表面，并将多余活性位点封闭，备用。将单抗在酶标板上固定，这已经是业界的成熟技术。3）将待检样品加到第2）步制得的固定了目标菌单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在目标菌，则目标菌会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。４）将第1）步所制的抗体修饰的KMnF4纳米探针加入第3）步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标菌，通过探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合目标菌的探针。若酶标板上没有目标菌，则所以探针都被洗去。５）加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了目标菌的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样本中有目标菌，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明目标菌越多，通过加标验证定量检测样本中目标菌的数目。
该方法利用了酶标板固定技术，双抗夹心技术，核磁共振技术，其步骤设计主要是针对操作过量时的传感器的有效分离，使检测结果准确。
该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。相对于致病菌的微生物培养2-3天甚至几天的时间。此方法主要取决于样品的预处理时间，核磁共振检测只需几分钟。所有的食品标准，致病菌都不得检出。因此，用该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价。该方法是一种客观有效的检出食品中有害致病菌的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品有害致病菌的筛选时间。
一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与KMnF4纳米探针含量的相关性指标。
该方法依赖于建立的可用于食品样品中有害致病菌特异性 KMnF4纳米探针的分离，从核磁共振弛豫时间变化的角度，检测出样品中的有害致病菌。由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对KMnF4纳米探针非常敏感，即在去离子水中，存在微量的KMnF4纳米探针，则水的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫就会显著下降。通过定量检测出样品中的免疫探针含量，从而可以间接定量出食品样品中的有害致病菌含量。检测出的致病菌含量与探针含量线性相关，拟合度较好。最终以免疫探针与致病菌间的对应关系为纽带，确定食品样本中的致病菌菌落数。所有的食品标准，致病菌均不得检出。因此，该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明所述的一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，步骤如下。
（1）检测目标菌的特异性KMnF4纳米探针的制备。
（2）将目标菌特异性单抗固定在酶标板表面，并将多余的活性位点用牛血清蛋白封闭。
（3）将待检样品加到步骤（2）制得的固定了目标菌单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在目标菌，则目标菌会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。
（４）将步骤（1）所制的抗体修饰的KMnF4纳米探针加入步骤（3）所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标菌，通过探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合目标菌的探针。若酶标板上没有目标菌，则所以探针都被洗去。
（５）加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了目标菌的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样本中有目标菌，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明目标菌越多，通过加标验证定量检测样本中目标菌的数目。
所述探针为具有顺磁特性的KMnF4纳米材料，纳米粒径小于500纳米。
所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振弛豫时间的变化。
所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
本发明的有益效果：本发明提供一种客观的快速检测出食品中的有害致病菌的方法，其特征是依赖于建立的可用于检测KMnF4纳米探针的核磁共振检测方法。该方法可以客观有效地对食品中有害致病菌进行检测，相比于致病菌的生物培养确认，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样本的快速筛选。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。
检验食品样本测定其是否含有有害致病菌——单增李斯特菌。
1. KMnF4纳米粒子制备：KMnF4纳米粒子可以从市场购买，也可以采用以下方法制备：称取1.6mmol MnCl2•4H2O加入到反应釜中，再加入10mL的无水乙醇，搅拌溶液至完全溶解；称取3mmol油酸钾加入上述溶液，搅拌1-2min，使其混匀；称取5-6g的氟化钾（KF）研磨10min以上，当其粒径变小变细之后，称取4.98mmol，将其加入之前的溶液中；再次加入无水乙醇，一般30mL；夹套套紧，密封好后，将反应釜放入烘箱，将温度调制160℃，反应24h；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min；将洗涤好的样品放入烘箱中，温度调至60℃，所得颗粒粒径一般是20nm；
KMnF4纳米粒子羧基修饰：将得到的KMnF4与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90℃，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min；将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的KMnF4纳米粒子。
抗体修饰：称取一定量的羧基修饰的KMnF4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。）将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量的单增李斯特菌抗体，在混匀仪上偶联1h。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的KMnF4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 ℃待用。
2. 单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入单增李斯特菌单克隆单抗，即将100 µL 100 µg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3. 将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了特异性单抗的酶标板上孵育20mins,若样品中存在目标菌，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。
4. 将第1步所制的抗体修饰的KMnF4纳米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标李斯特菌，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合单增李斯特菌的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了单增李斯特菌的探针。
5. 加入定量的洗脱液（30%甲醇）将第４步的酶标板上的结合了单增李斯特菌的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样本中有单增李斯特菌，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明单增李斯特菌越多，通过加标验证定量检测样本中目标菌的数目。
实施例2。
测定食品样品是否含有有害致病菌——大肠杆菌O157：H7。
1. KMnF4纳米粒子制备：KMnF4纳米粒子可以从市场购买，也可以采用以下方法制备：称取1.6mmol MnCl2•4H2O加入到反应釜中，再加入10mL的无水乙醇，搅拌溶液至完全溶解；称取3mmol油酸钾加入上述溶液，搅拌1-2min，使其混匀；称取5-6g的氟化钾（KF）研磨10min以上，当其粒径变小变细之后，称取4.98mmol，将其加入之前的溶液中；再次加入无水乙醇，一般30mL；夹套套紧，密封好后，将反应釜放入烘箱，将温度调制160℃，反应24h；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min；将洗涤好的样品放入烘箱中，温度调至60℃，所得颗粒粒径一般是20nm。
KMnF4纳米粒子羧基修饰：将得到的KMnF4与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90℃，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min；将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的KMnF4纳米粒子。
抗体修饰：称取一定量的羧基修饰的KMnF4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。）将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量的大肠杆菌O157：H7抗体，在混匀仪上偶联1h。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的KMnF4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 ℃待用。
2. 单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol 二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入大肠杆菌O157：H7单克隆单抗，即将100 µL 100 µg/mL大肠杆菌O157：H7单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3. 将食品样本进行预处理，必要时采用FDA增菌法，对样品进行过滤、增菌活化等预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了大肠杆菌O157：H7特异性单抗的酶标板上孵育20mins,若样品中存在目标菌，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则目标菌被固定在酶标板上。
4. 将第1步所制的抗体修饰的KMnF4纳米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标大肠杆菌O157：H7，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的目标菌发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合大肠杆菌O157：H7的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了大肠杆菌O157：H7的探针。
加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了大肠杆菌O157：H7的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样本中有大肠杆菌O157：H7，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明大肠杆菌O157：H7越多，通过加标验证可以定量检测样本中目标菌的数目。

Claims (3)

1.一种基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其步骤如下：
（1）检测目标菌的KMnF4纳米探针的制备；
（2）将目标菌特异性单抗在酶标板上的固定备用，并将多余的活性位点用牛血清蛋白封闭；
（3）将待检样品加到步骤（2）所制得的酶标板上，孵育一段时间，若待检样品中含有目标菌，则会与酶标板上的单抗结合，用无菌的去离子水清洗后，目标菌被固定在酶标板上；
（4）将步骤（1）制得的KMnF4纳米探针悬浊液加到步骤（3）固定了目标菌的酶标板上，若存在目标菌则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有结合的探针就被洗掉；若不存在目标菌，则所有探针都被洗掉；
（5）用洗脱剂将酶标板上的双抗夹心的探针洗下来，如果还存在探针就是抓到目标菌的探针；
（6）步骤（5）所得的探针的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定；以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样本中有目标菌；探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标菌的量。
2.根据权利要求1所述的基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述探针为纳米级KMnF4材料，其纳米粒径小于500纳米。
3.根据权利要求1所述的基于KMnF4纳米探针的NMR食源性致病菌快速检测方法，其特征是所述核磁共振弛豫时间，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
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