CN107037201A - 一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法 - Google Patents

一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法，属于中药开发应用技术领域。本发明依赖于建立基于制备KMnF4纳米探针用于筛选抑制厌氧菌的中药配方的方法。采用抗体包被制备的顺磁KMnF4纳米探针能对目标菌进行特异性结合的特点，利用KMnF4的顺磁特性对核磁共振弛豫时间的影响，检测出样品中是否含有目标菌。顺磁KMnF4纳米探针，在一定范围内核磁共振弛豫时间显示出线性关系，即纳米KMnF4含量大，样品的核磁共振自旋‑晶格弛豫时间和自旋‑自旋弛豫时间值越小，在一定范围能够定量检测目标菌，从而间接评估中药配方的抑菌效果。该方法可以用于对厌氧菌有抑制作用的中药的配方筛选，加快中药产品的开发速度。

Description

一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法
技术领域
本发明涉及一种中药配方的筛选方法。
背景技术
抗生素在杀菌同时，也会造成人体损害，影响肝、肾脏功能、胃肠道反应等。滥用抗生素可能引起某些细菌耐药现象的发生，对感染的治疗会变得十分困难。目前，几乎没有一种抗菌药物不存在耐药现象。开发具有抗菌作用的中药及配方具有积极意义。
许多中药及配方药具有抗菌消炎作用，一些中草药的有效成分和分子结构等也已经全部或部分地研究清楚。例如黄连和黄柏止痢的主要成分小蘖碱（黄连素）、黄芩抗菌的主要成分黄芩素等等。大量事实证明，中国古代劳动人民通过长期实践所积累起来的医药遗产是极为丰富、极为宝贵的。我们应当珍视这个祖国医药学的伟大宝库，努力发掘，加以提高，从中可以开发具有抗菌消炎作用的中药，可以取代或部分取代抗生素。
厌氧菌是一类在无氧条件下比在有氧环境中生长好的细菌，而不能在有空气存在情况下生长的细菌。这类细菌缺乏完整的代谢酶体系，其能量代谢以无氧发酵的方式进行。它能引起人体不同部位的感染，包括阑尾炎、胆囊炎、中耳炎、口腔感染、心内膜炎、骨髓炎、腹膜炎等多种疾病。在传统的开发针对某种厌氧菌的中药新配方过程中，一般是在灭菌的培养基中接种厌氧菌后加入中药组分，在特殊的厌氧培养箱中培养。一段时间后再取样进行划线培养，计算菌落数，从而确定某中药组成配方是否有抑菌作用。划线培养也需要在厌氧培养箱中培养，且培养周期至少要几天，因此整个周期长，效率低。本方法是针对上述问题发明的一种中药配方的快速筛选方法。
本方法的基本原理：单克隆抗体或抗原分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。而KMnF4材料其Mn元素外层具有多个未成对电子，具有高饱和磁化强度，在粒径小到一定程度时，会出现超顺磁特性，KMnF4纳米材料会对周围水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫时间的影响非常大，具有放大核磁共振驰豫信号的作用。非常微量的KMnF4纳米材料就会造成水的核磁共振弛豫时间大幅下降。因此可以通过构建KMnF4纳米探针，从磁共振的角度来做检测是否存在目标菌，从而间接评估中药成分的抑菌作用。
主要步骤：
1）. KMnF4纳米探针制备。从市场上购买顺磁KMnF4纳米材料，也可以通过其他方法制备纳米级的KMnF4。使用硅烷偶联剂，其通式为:Y(CH2)nSiX3。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)3)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。通过硅烷偶联剂反应可以得到表面修饰的氨基化或羧基化的KMnF4纳米材料。进一步通过偶联抗体，可实现表面功能化，形成特异性免疫探针，封闭多余的活性位点，离心分离后可以将过量的抗体分离，即可以得到抗性修饰的KMnF4纳米探针。
2）. 采用聚苯乙烯材料制作的样品管进行中药筛选。聚苯乙烯材料与酶标板类似，探针表面抗体会由于吸附作用而结合在聚苯乙烯材料的表面，但是，探针表面的抗体吸附到聚苯乙烯材料表面的速度与探针表面抗体结合目标菌的速度相比，前者速度慢的多，两者是竞争关系。因此，在聚苯乙烯样品管中加入灭菌的厌氧菌的培养基，接种目标厌氧菌后加入需要筛选的中药提取液，密闭厌氧培养一段时间后，加入步骤1）所制备的KMnF4纳米探针，充分混合震荡反应一段时间，若样品管中有目标菌生长，则KMnF4纳米探针表面的抗体首先会与目标菌结合，从而使得KMnF4纳米探针留在液体中。若样品管中没有目标菌，则KMnF4纳米探针表面的抗体会逐渐吸附在聚苯乙烯样品管表面，从而使液体中没有KMnF4纳米探针。前已述及，微量的KMnF4纳米材料就会造成水的核磁共振弛豫时间大幅下降。以无菌的没有接种目标菌的培养基液体为空白，测得的悬浊液的弛豫时间相比有显著降低，则说明液体中含有探针，从而间接证明样品中有目标菌，探针的量与弛豫时间的下降值呈正比，通过加标定量探针可以间接定量出目标菌的量。有目标菌存在，则说明中药抑菌作用不明显，反之则说明有抑菌作用。
该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。在一定程度上可以对目标菌实现连续在线监控。相对于厌氧菌培养2-3天甚至几天的时间，核磁共振检测只需几分钟。此方法不需要厌氧培养箱，只需在无氧条件下接种后将样品管密封即可培养，检测时用注射器将定量的探针注入即可进行后续的核磁共振检测。因此，用该方法可做大规模中药及配方的筛选。
发明内容
一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法。该方法是一种客观有效的检出样品中目标菌的方法，可以做大规模中药及配方的快速筛选，从而在某种程度上大大缩减针对某种厌氧菌有效的中药开发时间。
一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法。利用核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与KMnF4纳米粒子顺磁免疫探针含量的相关性指标。该方法依赖于顺磁纳米KMnF4纳米探针用于样品中目标菌的检测来评估中药配方的抑菌效果。采用偶联了特异性单克隆抗体的顺磁KMnF4纳米探针，可以对样品中的特异性厌氧菌进行检测。由于核磁共振仪对KMnF4纳米粒子非常敏感，存在微量的顺磁KMnF4纳米粒子，则水的自旋-晶格弛豫时间和/自旋-自旋弛豫就会显著下降。通过空白对照及加标定量检测出样品中的免疫探针含量，从而可以间接定量出样品中的厌氧菌菌落数。检测出的厌氧菌含量与探针含量线性相关，拟合度较好。最终以顺磁KMnF4纳米探针与厌氧菌间的对应关系为纽带，确定样品中的厌氧菌菌落数。从而间接确定中药的抑菌作用是否有效。相对于厌氧菌培养2-3天甚至几天的时间，核磁共振检测只需几分钟。因此，用该方法可做大规模中药及配方的筛选。
本发明是这样实现的，步骤如下：
1）目标菌抗体包被顺磁纳米KMnF4纳米探针的制备。
2）在聚苯乙烯样品管中加入灭菌的厌氧菌的培养基，接种目标厌氧菌。加入需要筛选的中药提取液，培养一段时间后，培养一段时间后，加入步骤1）所制备的KMnF4纳米探针，充分混合震荡反应一段时间，若样品管中有目标菌，则首先会与KMnF4纳米探针表面的抗体结合，从而使得KMnF4纳米探针留在液体中。若样品管中没有有目标菌，则KMnF4纳米探针表面的抗体会逐渐吸附在聚苯乙烯样品管表面而与液体分离。此时，对样品管进行核磁共振弛豫时间的测定。以无菌的没有接种目标菌的培养基液体为空白，测得的悬浊液的弛豫时间相比有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样品中有目标菌，探针的量与弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标菌的量。
所述KMnF4纳米探针为具有顺磁特性的纳米级KMnF4材料，纳米粒径小于300纳米。
所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间的变化，弛豫时间包括自旋－晶格弛豫时间和自旋－自旋弛豫时间。
本发明的有益效果：本发明提供一种客观的快速筛选对厌氧菌有抑制作用的中药配方的方法，其特征是以顺磁KMnF4纳米探针与厌氧菌间的对应关系为纽带，确定样品中的厌氧菌菌落数。从而间接确定中药的抑菌作用是否有效。相对于厌氧菌培养2-3天甚至几天的时间，核磁共振检测只需几分钟。因此，用该方法可做大规模中药及配方的筛选。
具体实施方式
实例1
筛选对痤疮杆菌（厌氧菌）有抑制或治疗作用的中药配方。
１）纳米KMnF4免疫探针制备：
KMnF4纳米粒子可以从市场上购买，也可以参考文献用物理或化学方法合成。
二氧化硅包被纳米KMnF4：取47.5g硅酸钠，用去离子水溶解于烧杯中，用盐酸调节pH值为12-13。取5.0g纳米KMnF4加入到此烧杯中，机械搅拌(用玻璃棒)5min。将混合液超声30min，适时搅拌。升温到85˚C，逐滴加入盐酸调节pH值6-7，生成沉淀。边磁分离边用去离子水洗涤沉淀，洗涤3-4次。然后，将沉淀分散于250mL甲醇中。以上过程重复三次，保证硅依附在KMnF4上。
胺基硅烷化KMnF4纳米材料：将制得的二氧化硅包被的纳米KMnF4加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀释到150mL。然后加入150mL甘油混合。超声30min，转移到有搅拌装置的500mL三口烧瓶中。加入10mL氨基硅烷偶联剂（AEAPS），在80-90 ˚C下快速搅拌3h后，转移出产物。产物用去离子水洗涤3次，甲醇洗涤2次(用布氏漏斗抽滤)。真空干燥。需要注意的是，抽滤由于有甘油，所以比较慢，抽一段时间后可适时用吸管吸去上层液体，抽滤过程约需6-8h。最后将得到的氨基硅烷化KMnF4纳米材料真空干燥12h。
抗体修饰：称取一定量的氨基修饰的KMnF4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。）将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量痤疮杆菌抗体，在混匀仪上偶联1h。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的KMnF4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 ℃待用。
2）在一批聚苯乙烯样品管中各自加入适量灭菌的培养基，在无氧条件接种痤疮杆菌，分别加入需要筛选的中药提取液密封后，培养一段时间后，加入步骤1）所制备的KMnF4纳米探针，充分混合震荡反应，若样品管中有目标菌，则首先会与KMnF4纳米探针表面的抗体结合，从而使得KMnF4纳米探针留在液体中；若样品管中没有有目标菌，则KMnF4纳米探针表面的抗体会逐渐吸附在聚苯乙烯样品管表面。反应1小时后，对样品管进行核磁共振弛豫时间的测定（上海纽迈NMR20核磁共振仪）。以无菌的没有接种目标菌的培养基液体为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比有显著降低，则说明含有探针，说明样品管中有目标菌，从而间接说明中药的抑菌作用不明显，反之则反。探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标菌的量。有目标菌存在说明加入的中药没有抑制作用。反之则反。
具体实施方式
实例2
筛选对梭状芽孢杆菌（厌氧菌）有抑制或治疗作用的中药配方。
１）纳米KMnF4免疫探针制备：
KMnF4纳米粒子可以从市场上购买（如上海的超威纳米材料公司），也可以参考文献用物理及化学方法合成。
二氧化硅包被纳米KMnF4：取47.5g硅酸钠，用去离子水溶解于烧杯中，用盐酸调节pH值为12-13。取5.0g纳米KMnF4加入到此烧杯中，机械搅拌(用玻璃棒)5min。将混合液超声30min，适时搅拌。升温到85˚C，逐滴加入盐酸调节pH值6-7，生成沉淀。边磁分离边用去离子水洗涤沉淀，洗涤3-4次。然后，将沉淀分散于250mL甲醇中。以上过程重复三次，保证硅依附在KMnF4上。
胺基硅烷化KMnF4纳米材料：将制得的二氧化硅包被的纳米KMnF4加入到25mL甲醇中，用1mLH2O和甲醇稀释到150mL。然后加入150mL甘油混合。超声30min，转移到有搅拌装置的500mL三口烧瓶中。加入10mL氨基硅烷偶联剂（AEAPS），在80-90 ˚C下快速搅拌3h后，转移出产物。产物用去离子水洗涤3次，甲醇洗涤2次(用布氏漏斗抽滤)。真空干燥。需要注意的是，抽滤由于有甘油，所以比较慢，抽一段时间后可适时用吸管吸去上层液体，抽滤过程约需6-8h。最后将得到的氨基硅烷化KMnF4纳米材料真空干燥12h。
抗体修饰：称取一定量的氨基修饰的KMnF4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。）将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量梭状芽孢杆菌抗体，在混匀仪上偶联1h。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的KMnF4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 ℃待用。
2）在一批聚苯乙烯样品管中各自加入适量灭菌的培养基，在无氧条件接种梭状芽孢杆菌，分别加入需要筛选的中药提取液密封后，培养一段时间后，加入步骤1）所制备的KMnF4纳米探针，充分混合震荡反应，若样品管中有目标菌，则首先会与KMnF4纳米探针表面的抗体结合，从而使得KMnF4纳米探针留在液体中。若样品管中没有有目标菌，则KMnF4纳米探针表面的抗体会逐渐吸附在聚苯乙烯样品管表面。反应1小时后，对样品管进行核磁共振弛豫时间的测定（上海纽迈NMR20核磁共振仪）。以无菌的没有接种目标菌的培养基液体为空白，测得的悬浊液的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比有显著降低，则说明含有探针，说明样品管中有目标菌，从而间接说明中药的抑菌作用不明显，反之则反。探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标菌的量。有目标菌存在说明加入的中药没有抑制作用。反之则反。

Claims (3)

1.一种基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法，其特征步骤如下：
1）目标菌抗体包被顺磁KMnF4纳米探针的制备；
2）在聚苯乙烯样品管中加入灭菌的厌氧菌的培养基，接种目标厌氧菌，加入需要筛选的中药配方提取液，密闭培养一段时间后，用注射器定量加入步骤1）所制备的KMnF4纳米探针，充分混合震荡反应一段时间，若样品管中有目标菌，则KMnF4纳米探针表面的抗体首先会与目标菌结合，从而使得KMnF4纳米探针留在液体中；若样品管中没有有目标菌，则KMnF4纳米探针表面的抗体会逐渐吸附在聚苯乙烯样品管表面而离开培养液；此时，对样品管进行核磁共振弛豫时间的测定；以无菌的没有接种目标菌的培养基液体为空白，测得的悬浊液的弛豫时间相比有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样品中有目标菌，探针的量与弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出目标菌的量；样品管中没有目标菌说明加入的中药成分具有抑菌效果，反之则反。
2.根据权利要求1所述的基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法，其特征是所述纳米KMnF4纳米探针为具有顺磁特性的纳米KMnF4合金材料，纳米粒径小于300纳米。
3.根据权利要求1所述的基于KMnF4纳米探针筛选厌氧菌中药抑制剂的方法，其特征是所述的目标菌的最终检出评价方法基于核磁共振技术的弛豫时间的变化。
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