CN105372278A - 一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，属于食品安全过敏原快速检测技术领域。本发明依赖于建立的可以用于食品样品中过敏原的核磁共振检测方法，利用CoFe2O4纳米探针的顺磁特性对核磁共振弛豫时间的影响，检测出样品中是否含有过敏原。不同的具体的对应关系为：纳米CoFe2O4纳米探针，在一定条件下显示出线性关系，即CoFe2O4纳米探针含量大，样品的自旋-晶格弛豫时间值越小，在一定范围能够定量检测过敏原。该方法可以用于食品样品中特定过敏原的快速检测，从而可以作为大批待检样品的快速筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种过敏原的快速检测方法，尤其涉及一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法。
背景技术
食物过敏原能引起婴儿或幼龄动物产生过敏反应，从而造成肠道损伤。食源性过敏原分为很多种，如大豆过敏原蛋白、花生过敏原蛋白、虾过敏原成分等，均会对特定人群产生过敏反应。目前，国内外对一些过敏性疾病尚无根治的方法。为此，对某些过敏原过敏的患者避免食用含有特定过敏原的食物是目前有效预防方法之一。近年来美国及欧盟食品标签法中规定必须将食物过敏原成分加以标示并开始对部分进口食品进行过敏原检测。检查过敏原的方法是很多的，有生物免疫方法，皮肤点刺法，抽血免疫检测法等，对于食源性的过敏原也有酶联免疫法等，各有优缺点。本方法是一种全新的基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法。
基本原理：单克隆抗体或抗原分子与酶分子通过共价键结合，这种结合不会改变单克隆抗体、抗原和酶的免疫学特性及生物活性，特异性的单克隆抗体只会与特异性的抗原结合。CoFe2O4纳米探针为抗体修饰改性的CoFe2O4纳米粒子，CoFe2O4由于具有元素Co, 具有高饱和磁化强度，在粒径小到一定程度时，会出现超顺磁特性。因此，其粒子对周围水分子的核磁共振自旋-晶格弛豫时间的影响非常大。这也就是这类物质作为造影剂的机理。非常微量的纳米CoFe2O4就会造成水的核磁共振自旋-晶格弛豫时间大幅下降，通过空白对照就能明确，是由于存在这种物质引起的。因此可以构建CoFe2O4纳米探针生物传感器，从磁共振的角度来做检测。
其主要的原理步骤：（1）目标过敏原的特异性CoFe2O4纳米探针的制备。从市场上购买CoFe2O4纳米材料，也可以通过其他化学合成方法制备纳米级的CoFe2O4。使用硅烷偶联剂或PEG（聚乙二醇），修饰提高生物相容性，其通式为:Y(CH2)nSiX3。此处，n为0-3；X为可水解的基团；Y为有机官能团。X通常是氯基、甲氧基、乙氧基、乙酰氧基等，这些基团水解时即生成硅醇(Si(OH)3)，而与无机物质结合，形成硅氧烷。Y是乙烯基、氨基、环氧基、甲基丙烯酰氧基、巯基。这些反应基团可与有机物质反应而结合。因此，通过使用硅烷偶联剂，可在无机物质和有机物质的界面之间架起“分子桥”，把两种性质悬殊的材料连接在一起提高复合材料的性能和增加粘接强度的作用。再通过修饰特异性抗体可实现表面功能化，形成特异性探针，再封闭多余的活性位点。（2）采用常规方法将目标过敏原的特异性单抗固定在酶标板表面，并将多余活性位点封闭，备用。3）将待检样品加到第（2）步制得的固定了过敏原单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在过敏原，则过敏原会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则过敏原被固定在酶标板上。（４）将第1）步所制的抗体修饰的CoFe2O4纳米探针加入第3）步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有过敏原，通过探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的过敏原发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合过敏原的探针。若酶标板上没有过敏原，则所以探针都被洗去。（５）加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了过敏原的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有过敏原，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明过敏原越多，通过加标验证定量检测样品中过敏原的数目。
该方法的主要优点就是快速、灵敏度高。因此，用该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。该方法对于花生过敏原、大豆过敏原、虾活性蛋白过敏原等一类蛋白过敏原有效。
发明内容
一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，用于对各种不同的食品样品进行评价。该方法是一种客观有效的检出食品中特定过敏原的方法，从而在某种程度上大大缩减了食品样品特定过敏原的检测时间。
一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，核磁共振仪对顺磁物质的响应敏感性，提出核磁共振弛豫参数变化与CoFe2O4纳米探针含量的相关性指标。
该方法依赖于建立的可用于食品样品中特定过敏原特异性 CoFe2O4纳米探针的分离，从核磁共振弛豫时间变化的角度，检测出样品中的特定过敏原。由于核磁共振仪自旋-晶格弛豫效率和自旋-自旋弛豫效率对CoFe2O4纳米探针非常敏感，即在去离子水中，存在微量的CoFe2O4纳米探针，则水的自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫就会显著下降。通过定量检测出样品中的免疫探针含量，从而可以间接定量出食品样品中的特定过敏原含量。检测出的过敏原含量与探针含量线性相关，拟合度较好。最终以免疫探针与过敏原间的对应关系为纽带，确定食品样品中的过敏原。因此，该方法可做大规模待检样品的阳性筛选，一定程度上可以定量检测。
本发明是这样实现的，步骤如下。
（1）检测过敏原的特异性CoFe2O4纳米探针的制备。
（2）将过敏原特异性单抗固定在酶标板表面，并封闭多余活性位点。
（3）将待检样品加到第（2）步制得的固定了过敏原单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在过敏原，则过敏原会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则过敏原被固定在酶标板上。
（４）将第（1）步所制的抗体修饰的CoFe2O4纳米探针加入第（3）步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有过敏原，通过探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的过敏原发生特异性结合，形成双抗夹心结构，此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了过敏原的探针。若酶标板上没有过敏原，则所有探针都被洗去。
（５）加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了过敏原的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有过敏原，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明过敏原越多，通过加标验证定量检测样品中过敏原的数目。
所述探针为具有顺磁特性的CoFe2O4纳米材料，纳米粒径小于500纳米。
所述的过敏原的最终检出评价方法基于核磁共振弛豫时间的变化。
所述弛豫时间特性，是指自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
本发明的有益效果：本发明提供一种客观的快速检测出食品中的特定过敏原的方法，其特征是依赖于建立的可用于检测CoFe2O4纳米探针的核磁共振检测方法。该方法可以客观有效地对食品中特定过敏原进行检测，该方法具有快速检测的优势，可以用于大规模样品的快速检测。该方法对于花生过敏原、大豆过敏原、虾活性蛋白过敏原等一类蛋白过敏原有效。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。
检验食品样品测定其是否含有特定过敏原——大豆过敏原蛋白检测。
1、CoFe2O4纳米粒子制备：CoFe2O4纳米粒子可以从市场购买，也可以参考文献用化学方法合成。将得到的CoFe2O4与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90℃，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min；将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的CoFe2O4纳米粒子。
抗体修饰：称取一定量的羧基修饰的CoFe2O4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。）将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入适量的抗大豆总蛋白抗体，在混匀仪上偶联1h。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的CoFe2O4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 ℃待用。
2、单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol
二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入抗大豆蛋白单抗，即将100 µL 100 µg/mL单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3、将食品样品进行预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了特异性单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在过敏原，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则过敏原被固定在酶标板上。
4、将第1步所制的抗体修饰的CoFe2O4纳米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标过敏原，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的过敏原发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合过敏原的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了过敏原的探针。
5、加入定量的洗脱液（30%甲醇）将第４步的酶标板上的结合了过敏原的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有过敏原，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明过敏原越多，通过加标验证定量检测样品中过敏原的数目。
实施例2。
测定食品样品是否含有特定过敏原——啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原检测。
1、CoFe2O4纳米粒子制备：CoFe2O4纳米粒子可以从市场购买，也可以参考文献用化学方法合成。CoFe2O4纳米粒子羧基修饰：将得到的CoFe2O4与PEG-1500按质量比1:10在无水乙醇的溶解下，加入反应釜中，密封完毕后放入烘箱中，将温度调至90℃，反应12小时；当反应釜降至室温时，一般是在关闭烘箱后的3-4h即可。打开反应釜，将上清液倒去，用无水乙醇洗涤并搅拌；洗涤完一次就进行一次离心，直到上清液澄清为止。转速8000r/min，时间3min；将洗涤好的最终产品放在烘箱中自然晾干，得到PEG修饰的CoFe2O4纳米粒子。
抗体修饰：称取一定量的羧基修饰的CoFe2O4纳米粒子，加入2倍质量的EDC和NHS，加入0.01M的PBS各1mL。放在混匀仪上，转速15转，反应45min。）将活化时间到的样品进行10000r/min离心，时间5min，然后再加入0.01M的PBS进行洗涤离心，重复3次。将离心完的样品各加入过量啤酒泡沫活性蛋白Z4抗体，在混匀仪上偶联1h。偶联完成后加入的10%BSA封闭液45min。封闭结束后，转速8000r/min离心分离5min，用0.01M的PBS清洗离心，重复3次，则将多余的抗体、BSA洗去，最后加入PBS进行重悬。制备的抗性修饰的CoFe2O4纳米粒子即为免疫探针，保存在4 ℃待用。
2、单克隆抗体固定：可以采用常规的酶标板固定方法，也可以采用以下方法。用干净的盖玻片5×5mm2正方形，镀膜机先喷一层Cr (2–4 nm)用以帮助固定金。再用在表面溅射喷上一层纳米金，再采用200微升 2 mmol
二硫基-琥珀酰亚胺-丙酸酯（DSP）对纳米金进行修饰（DMSO，二甲基亚砜稀释DSP）。加入啤酒泡沫活性蛋白Z4单克隆单抗，即将100 µL 100 µg/mL啤酒泡沫活性蛋白Z4单克隆抗体通过共价偶联法固定在玻璃板上并37 ˚C孵育45 min。加入1%牛血清蛋白（BSA），22˚C，1小时，将板上剩余的活性位点进行封闭并干燥。
3、将食品样品进行预处理，得到待检样品。待检样品加到第2步制得的固定了啤酒泡沫活性蛋白Z4特异性单抗的酶标板上孵育20mins，若样品中存在过敏原，则会与酶标板上的单抗结合，通过洗涤，则过敏原被固定在酶标板上。
4、将第1步所制的抗体修饰的CoFe2O4纳米探针加入第3步所得到的酶标板上，此时，如果酶标板上有目标啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原，通过免疫探针的特异性反应，则探针会与酶标板上的过敏原发生特异性结合，形成双抗夹心结构。此时用无菌的去离子水清洗，就可以将没有结合啤酒泡沫活性蛋白Z4的探针洗去。在酶标板上剩下的就只有结合了啤酒泡沫活性蛋白Z4的探针。
加入定量的洗脱液（30%甲醇）将酶标板上的结合了啤酒泡沫活性蛋白Z4的探针洗脱下来。得到的溶液，用核磁共振仪(NMR20，纽迈公司)测定溶液的自旋-晶格弛豫时间。以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，溶液测得的自旋-晶格弛豫时间与空白相比较，有显著差异，说明溶液中有探针存在，从而说明样品中有啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原，探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降值呈正比。下降的越多说明探针越多，从而间接说明啤酒泡沫活性蛋白Z4过敏原越多，通过加标验证可以定量检测样品中过敏原的量。
Claims (3)
1.一种基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，其特征是步骤如下：
（1）检测过敏原的CoFe2O4纳米探针的制备；
（2）将过敏原特异性单抗在酶标板上的固定备用，并将多余的活性位点用牛血清蛋白封闭；
（3）将待检样品加到第（2）步所制得的酶标板上，孵育一段时间，若待检样品中含有过敏原，则会与酶标板上的单抗结合，用无菌的去离子水清洗后，过敏原被固定在酶标板上；
（4）将第（1）步制得的CoFe2O4纳米探针悬浊液加到第（3）步固定了过敏原的酶标板上，若存在过敏原则形成双抗夹心，用无菌的去离子水清洗，则没有结合的探针就被洗掉，若不存在过敏原，则所有探针都被洗掉；
（5）用洗脱剂将酶标板上的双抗夹心的探针洗下来，如果还存在探针就是抓到过敏原的探针；
（6）第（5）步所得的探针的悬浊液，进行核磁共振的弛豫时间测定；以无菌的去离子水重复上述步骤作为空白，测得的悬浊液的弛豫时间自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间相比无菌的去离子水有显著降低，则说明含有探针，从而间接证明样品中有过敏原；探针的量与自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间的下降呈正比，通过加标定量探针而间接定量出过敏原的量。
2.根据权利要求1所述的基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，其特征是所述探针为纳米级CoFe2O4材料，其纳米粒径小于500纳米。
3.根据权利要求1所述的基于CoFe2O4纳米探针的NMR食源性过敏原快速检测方法，其特征是所述核磁共振弛豫时间是自旋-晶格弛豫时间和自旋-自旋弛豫时间。
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