JP2001506993A

JP2001506993A - 転移性腫瘍の同定および治療用組成物

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Publication number: JP2001506993A
Application number: JP52733098A
Authority: JP
Inventors: スレーマンジョナサン; ポンタヘルムート; ヘルリッヒペーター; アンテーキム
Original assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Karlsruhe GmbH
Priority date: 1996-12-18
Filing date: 1997-12-18
Publication date: 2001-05-29
Also published as: EP0948356A1; ATE320818T1; EP0948356B1; DE19652815C2; US6391301B1; DE19652815A1; WO1998026801A1; DE59712604D1

Abstract

(57)【要約】本発明はＮ−グリコシド結合サッカライドを有するタンパク質と反応する抗体を含有する、腫瘍細胞の増殖を同定および抑制するための新規組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】転移性腫瘍の同定および治療用組成物本発明は腫瘍細胞の増殖を同定および抑制するための組成物に関する。西欧世界において最も多い病因の１つは悪性腫瘍の出現である。問題は今日でも、従来同様、腫瘍の早期発見と引き続く治療である。近年、腫瘍の増殖の確認および転移の形成の確認のためのいくつかのマーカーが記載されている（Potter -Jordan,K.およびLippman,M.,1994,Hematol.Oncol.Clin.North Am.8,73〜100(19 94)参照）。これらのマーカーのいくつか、例えばｅｒｂＥ−２、カテプシン(Ca thepsin)Ｄは多数の研究において良好に使用可能なものであることが証明された。最近ではタンパク質ＣＤ４４の変種が重要性を増してきている(Kaufmann et a l.Lancet 345,615〜619(1995),EP 0531300,DE‐OS 4134982)。更に、ＥＰ−３５１３１３、ＣＡ１２１：２９４４８、ＣＡ１１５：６９４１７、Ｍｅｄｌｉｎｅ９５０８５２９３、ＣＡ１１１：２０９８９６からは抗原抗体−システムが公知であり、このシステムにおいてはＮ−グリコシド結合サッカライドを含有するタンパク質が使用される。これらの文献から、腫瘍マーカータンパク質上の特定のエピトープを特異的に認識し、これと反応し、かつラジオアイソトープにより標識され、かつ／または細胞破壊作用または細胞毒作用物質と結合可能である、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を転移性の腫瘍の診断および治療に適用可能であるということは公知である。抗体は特異的なエピトープに反応する。一般に、異なる腫瘍は異なるマーカーを発現し、かつ他方では１つのマーカーは常に１つのサブセットのみに対応する。従って、多要素治療の領域においては腫瘍治療のために複数の異なるマーカーが望ましい。従って、本願の課題は、できるだけ種々異なる腫瘍のために一様に使用可能である、腫瘍の増殖を同定するためのまたは抑制するための組成物を開発することである。この課題は、Ｎ−グリコシド結合サッカライドを有するタンパク質と反応する抗体を含有し、このサッカライドがＢ２、３、４型またはＡ２型の血液型特異的抗原に属することを特徴とする、腫瘍の増殖を同定しかつ抑制する組成物により達成される。本発明の目的のためには特異的なサッカライドで修飾されている、動物またはヒト由来のタンパク質の全ての任意の変種を挙げることができる。抗体とは１価または多価の抗体およびポリまたはモノクローナル抗体を意味するが、これらのフラグメントおよび誘導体（Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’およびＦａｂフラグメントを包含する）をも意味し、更に少なくとも２つの抗原結合位もしくはエピトープ結合位を有する、キメラ抗体またはハイブリッド抗体、または２個の特異的組換え抗体（例えば、Quadrome、Triome）、種間−ハイブリッド抗体、抗イディオタイプ抗体およびこれらから化学的に修飾されたものおよびこれらの抗体の誘導体として理解されるべきもの、および公知の抗体獲得のための慣用法を介してまたはＤＮＡ組換えを介して、ハイブリドーマ技術または抗体工学により、または公知の方法により合成または半合成可能であるものか、および前記の定義した糖鎖に関して中和特性または結合特性を有するものである。多用の文献の内から単に例として次の文献を示す： 75;Biocca,S.et al.,Embo,J.9,101〜108,1990;Bird,R.E.et al.，Science 242,4 23〜426,1988;Boss,M.A.et al.,Nucl.Acids Res.12,3791〜3806,1984;Boulianne ,G.L.et al.,Nature 312,643〜646,1984;Bukovsky,J.& Kennett,R.H.,Hybridoma fi,219〜228,1987;Diano,M.et al.,Anal.Biochem.166,223〜229,1987;Huston,J .S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879〜5883,1988;Jones,P.T.et al.,Nat ure 321,522〜525,1986;Langone,J.J．& Vunakis,H.V．(Hrsg.),Methods Enzymo l,121,Academic Press,London,1987;Morrison;Morrison,S.et al.,Proc.Natl.Ac ad.Sci.USA 81,6851〜6855 ,1984;Oi,V.T.& Morrison S.L.,Bio Techniques 4,214〜221,1986;Riechmann,L. et al.，Nature 332,323〜327,1988;Tramontano,A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USE 83,736〜6740,1986;Wood,C.R.et al.，Nature 314,446〜449,1985。エピトープに対するポリクローナル抗体の製造に関しては、多くの方法が提供されている。例えばこの目的のためには、公知法で種々の動物を本発明によるグリコペプチド、またはそのフラグメントで注射することにより免疫化し、かつこれにより得られた血清から所望のポリクローナル抗体を公知法により獲得し、かつ精製することができる。同様に、タンパク質投与に対する免疫応答を上昇させるためには種々のアジュバントを、免疫化に選択した動物に依存して、使用することができ、例えばフロインドアジュバント、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ヘモシアニン、ジニトロフェノールまたはリゾレシチンを使用することができる。本発明においてはモノクローナル抗体が有利である。特に有利であるのは抗体Ｍ−Ｎ＃１であり、これはＤＳＭＺ（Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig）に寄託した細胞培養体ＤＳＭＡＣＣ２３３３から得られる。本発明による使用に有利なモノクローナル抗体は、セルラインの培養を介して抗体を製造するために提供される全ての適当な方法により得ることができる。この種の公知方法には、例えばケーラーおよびミルスタイン（Koehler,G & Milstein,C.,1975前記）またはタツガートおよびサムロフ（ Taggart & Samloff,Science 219,1228-1230,1983）により記載された、ハイブリドーマ細胞を用いる方法、またはヒトＢ細胞ハイブリドーマを用いる方法（Kozb or et al.,Immunology Today4,72-79,1983）を挙げることができる。Ｂ−リンパ球からのジーンライブラリー（Ward et al.,1989;Nature 341，544-546）およびファージベクター上の“コンビナトリアル（combonatorial）”ライブラリー（M c Cafferty et al.,1990,Nature 348,552-554;Krang et al.;1991,PNAS88,4363- 4366）の使用もこの方法に挙げることができる。抗体は公知法により精製される、例えば免疫吸着または免疫親和性クロマトグラフィーを介して、ＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）またはこれらの組合せを介して精製される。分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは同様にして公知法により製造することができる。例えばＦ(ａｂ’)₂ フラグメントは完全ポリ−またはモノクローナル抗体のペプシン消化により得ることができる。Ｆａｂ’フラグメントは、例えば該当するＦ（ａｂ’）₂フラグメントのジスルフィド架橋結合を還元することにより得ることができ、Ｆａｂフラグメントは例えば、パパインおよび還元剤での抗体分子の処理により得ることができる。抗体、そのフラグメントまたは誘導体の同定および選択のためには全ての公知法を使用することができる。例えば、もしこれが単離または精製した抗原に結合している場合にはこれを相応する標識付けにより、または例えばポリアクリルアミドゲルを介して精製された抗原の免疫沈降を介して、検出可能であることによるか、または抗体を血液型抗原に対して他の血液型特異的抗体と、糖側鎖への結合に関して競合させることによる。しかし本発明の課題は、抗体の製造のためのハイブリドーマセルラインの使用もしくは本発明による使用のための製剤、および本発明による使用のための製剤の製法でもある。この種の抗体を含有する組成物を動物およびヒトにおける腫瘍疾患において使用することが本発明により見いだされた。この使用とはこの腫瘍疾患の予防、制御、診断または治療を包含する。該抗体の本発明による使用は、Ｂ２、３、４型またはＡ２型の血液型特異的抗原に属する、Ｎ−グリコシド結合サッカライドを有するタンパク質が種々異なる腫瘍を同定および治療することを可能にする、という意外な観察を基にする。実験は、全ての糖タンパク質を抗体の製造に使用することができるわけではないことを示した。こうしてＯ− グリコシド結合サッカライドを有するタンパク質は不適であることが示された。こうして、特に本発明による抗体を多数の障害、疾患および状態のために臨床的に使用することが特に有利である。動物またはヒトの身体における治療すべき疾患または障害または影響を与えるべき状態の種類および原因に依存して、この抗体製剤を全身的に、局部的にまたは局所的に該当する組織または器官に投与することが望ましい。全身的な作用の仕方は例えば種々の器官または器官系が要治療である場合に所望である。これに対して、腫瘍の局所的発現にのみ影響を与えるべき場合には局所的な作用を考慮すべきである。該当する抗体は、専門家に公知な全ての経腸または非経腸投与ルートで投与することができる。全身的投与のためには、例えば静脈内、血管内、筋肉内、動脈内、腹膜内、経口または胸腔内が提供される。むしろ、局所適用は、例えば、皮下、皮内、心臓内、葉内、髄内、肺内または治療すべき組織（結合組織、骨組織、筋肉組織、神経組織、上皮組織または骨組織）上または中に行なわれる。達成すべき免疫抑制作用の期間及び強度に依存して、抗体製剤を１日当たり、１回または複数回で、断続的に、数日、数週間または数ヶ月にわたって、種々異なる投与量で、投与することができる。前記投与のために好適な抗体製剤の製造のためには専門家に公知の注入可能な、生理学的に認容性の溶剤を、無菌の形で使用することができる。腸管外注射または注入のためのそのまま使用可能な溶液の製造のためには、公知の等張水溶液、例えば生理食塩水、またはγ−グロブリンを含有しない相当する血漿タンパク質溶液を提供することができる。しかしながら、この製剤は凍結乾燥製品もしくは乾燥製剤の形であってもよく、例えばキット・オブ・パートとしてこれを使用の直前に公知注入可能な溶剤１種と滅菌条件下に再構成することができる。注射、注入または灌流のための、本発明おいて使用すべき抗体製剤の最終的製造は、前記定義により精製した抗体を前記生理学的に認容性の溶剤の１種と混合することより行なわれ、この溶剤は場合により、公知担体または助剤で補足されていてもよい（例えば、血清アルブミン、デキストロース、ナトリウムビスルフェート、ＥＤＴＡ）。投与すべき抗体の量は、治療すべき疾患または障害または影響を与えるべき状態および該当する患者（動物またはヒト）の種類および重さに依存する。しかしながら、投与量単位当たり該当する動物の体重ｋｇ当たり、使用すべき投与量０ .５〜２、有利に０.７〜１.５ｍｇである。次に、本発明を実施例につき詳細に説明する：材料および方法セルライン：ＮＭ−０８１（Goshetal,1983,InVitro 19,919-928）、ＭＴ−４５０（Kim1986,J.Surg.Opa 133,151-165）ならびにＭＴＬＮ２、ＭＴＬＮ３、ＭＴＬｙ、ＭＴＰａ、ＭＴＣ（Nevietal,1982,J.Natl.Cancer Inst.68,507-517;Li chtmer et al.,1987,エnvasion Matastaxis 7,73-82）セルラインをＦＣＳ（ウシ胎児性血清）１０％を補足したＤＭＥＭ中で培養した。ラインＲＢＡおよびＭＴＡＢをＡＴＣＣ（American Type Culture Collection;番号ＣＲＬ１７４７およびＣＲＬ１６６６）から入手した。サブトラクティブ（substractive）免疫化：組織培養細胞をＰＢＳ／５ｍＭＥＤＴＡで収穫し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄した。それぞれのサブトラクションのためには予めプレ血清を採取した雌のＢａｌｂＣ／Ｂ１６Ｆ１ハイブリッドマウス１０匹に、所望の抗原を有しない腫瘍−または組織培養細胞２×１０⁶を皮内注射した（寛容原性抗原として、興味のない抗体がこの抗原に対して生産される抗原）。２４時間後および４８時間後、それぞれのマウスにシクロホスファミド２００ｍｇ／ｋｇを腹膜内に注射した。３週間後に、相応して寛容原性抗原およびシクロホスファミドを再度注射した。これから１０日後に、テスト血液を採血した。寛容原性抗原の最後の注射の３週間後に、抗体を製造すべき、腫瘍− または組織培養細胞２×１０⁶ 個を皮内に注射した（免疫原として）。この免疫原をそれぞれ３週間後に更に２回注射した。最後の免疫の１０日後にテスト血液を採血した。寛容原性抗原免疫により、および免疫原免疫により得られたテスト血液をそれぞれのプレ血清と比較した、この際寛容原性抗原および免疫原での細胞−ＥＬＩＳＡをターゲットとして使用した。これにより、寛容原性抗原への免疫応答が最大に妨害されるマウス、かつ免疫原への免疫応答が最大に強化されているマウスを同定することは可能であった。これらのマウスはハイブリドーマセルを製造するために選択された。最後のテスト血液採血の４週間後、これらのマウスから脾臓を取りだし、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合した。モノクローナル抗体：ハイブリドーマ細胞をハルロウおよびラーネの方法（Ha rlow & Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual;Cold spring Harbor Labor atory press）により製造した。ハイブリドーマを抗体の生産に関して細胞−ＥＬＩＳＡ中でテストし、この際免疫原をターゲットとして使用した。抗体をＥＬＩＳＡテストでプラスであったハイブリドーマ細胞の調節した培地から製造した、この際タンパク質Ｇ−アガロース（Dianova）を親和性カラムとして使用した。細胞−ＥＬＩＳＡ：ターゲット細胞をＰＢＳ／５ｍＭＥＤＴＡを用いて収穫し、かつＤＭＥＭ(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)／１０％ＦＣＳ中に再懸濁した（２×１０６／ｍｌ）。抗体テスト溶液５０μｌを担持板のＵ字型凹部中（担持板当たり凹部９６個）にそれぞれピペットで添加し、次いで細胞のアリコート５０μｌを添加した。細胞および抗体からなる混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次いでＰＢＳのアリコート２００μｌで３回洗浄した。最初に結合した抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した家兎−抗マウス抗体と共にインキュベートし、かつ引き続きＡＢＴＳ（２,２’−アジノ−ジ−（３ −エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート））で検出した。免疫沈降：細胞を（³⁵Ｓ）Ｌ−メチオニン（５００ｍＣｉ／ｍｌ）と、透析したＦＣＳを補足したメチオニン不含ＲＰＭＩ−培地中で４時間インキュベートして、標識付けした。パルス追跡分析のために、細胞を（³⁵Ｓ）Ｌ−メチオニン（５００ｍＣｉ／ｍｌ）と、透析したＦＣＳを補足したメチオニン不含ＲＰＭＩ− 培地中で１５分間インキュベートし、次いで洗浄し、メチオニン含有培地で更にインキュベートした。免疫沈降のために細胞をＲＩＰＡ（radioimmunoprecipita tion）緩衝剤中で溶解し、かつアリコートを抗体５μｇで免疫沈降した。ウレクス・エウロパエウスレシチンに結合するタンパク質の精製のために、この細胞をＰＢＳ／１％ＮＰ４０／１ｍＭＰＭＳＦで溶解し、遠心分離し、かつこの溶解物をウレクス・エウロパエウスレシチンビーズと４℃で１時間インキュベートした。次いでこのビーズをＰＢＳで３回洗浄し、かつ過剰の緩衝液を除去した。このビーズを１％ＳＤＳ／２０ｍＭリン酸塩中ｐＨ７で煮沸した。次いでＲＩＰＡ−緩衝液の２０倍過剰を添加し、かつ上澄みを、ウレクス・エウロパエウスレシチンビーズを分離した後、免疫沈降のために使用した。免疫沈降したタンパク質を０.５ＵＮ−グリコシダーゼＦ、２.５ｍＵＯ−グリコシダーゼまたは５ｍＵノイラミニダーゼで処理した実験において、抗原／抗体−マトリックスビーズコンプレックスを最初に１００ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７.０で中で洗浄した。緩衝液を除去し、次いでマトリックスビーズを１％ＳＤＳ／２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７.０、５μｌ中で５分間沸騰させた。次いでこの酵素を２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７.０）／１ｍＭＣａＳＯ₄４５μｌ中に添加した。酵素反応の能力を、前記酵素の全てのものにより消化される、免疫沈降ＣＤ４４ｖ４−ｖ７タンパク質での類似の消化法との比較により確認した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動）により分離した。ゲルをＰＰＯ（２,５−ジフェニルオキサゾール）で処理し、かつＸ線感光性フィルム材料に晒す。転移テスト：雌のｗ／ＦｕラットにＰＢＳ中のＭＴ−４５０細胞５×１０⁵個を皮下注射した。この動物を、その腫瘍の大きさが法定の限界に達するまで、またはラットが死亡寸前になるまで規則的に観察した。次いで、この動物を殺し、解剖を実施した。抗体での治療実験においては、ラットに腫瘍細胞を抗体（２００μｇ／ラット）と共に注射した。その後、この動物に、抗体２００μｇを腫瘍細胞を注射した部位に週２回、４週間にわたって皮下投与した。窪んだ室８個を有する担持板（Nunc）上で増殖させた。細胞懸濁液からの細胞をシトスピン（cytospin）遠心分離器を用いてシラン被覆担持板上に固定した。両方の場合に、担持板上に固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、次いでＰＢＳ／１０％ＦＣＳ（ＦＰＢＳ）中で３０分間インキュベートした。これに抗体溶液（ＦＰＢＳ中）を添加し、かつインキュベーションを更に２時間続行した。引き続き、細胞を３回ＰＢＳで洗浄し、かつＦＰＢＳで希釈したテキサスレッド複合家兎抗マウスＩｇと共に１時間インキュベートした。ＰＢＳでの洗浄工程を２回行なった後、染色した細胞を室スライド上に乗せた。合成オリゴサッカライドへの結合固体マトリックスに固定した血液型特異的オリゴサッカライド（SYNSORB^(R)）をＣｈｅｍｂｉｏｍｅｄ杜（カナダ、エドモントン在）から購入した。オリゴサッカライドの化学的構造を第４表中に記載する。ｍＡｂＭ−Ｎ＃１（２００μｌＰＢＳ／ｌ＆ＢＳＡ中の０.２μｇ）を負荷した（または対照として未負荷の）ＳＹＮＳＯＲＢ^(R)−ビーズ１０ｍｇと共にインキュベートした。インキュベーションの後、上澄みを集め、血液型Ｂの唾液ムチンに対する反応性を次のように試験した。血液型Ｂまたは血液型Ｏの個体の唾液を採取後すぐに１５分間沸騰する水浴中で加熱し、引き続き１３０００ｇで５分間遠心分離した。透明な上澄液を０.１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９で１：８０に希釈した。この希釈溶液を用いて、ＥＬＩＳＡプレート（NUNC免疫板）を室温で１時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳで洗浄した後、これをＰＢＳ、３ＢＳＡとインキュベートした。ＳＹＮＳＯＲＢ^(R)−ビーズにＭ−Ｎ＃１を吸着させた後に、上澄み１００μｌを被覆されたＥＬＩＳＡプレート上に二重に重複してそれぞれピペットで加えた。０℃で一夜インキュベーションした後、このプレートをＰＢＳで洗浄し、引き続きアルカリ性ホスファターゼに結合した山羊抗マウスＩｇＧ（Sigma,St.Louis,MO,USA）１００μｌと１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、結合した抗体をｐ−ニトロフェニルホスフェート（Sigma）で検出した。結果および討議サブトラクティブ免疫化により、ラットの乳癌セルラインの転移性腫瘍上のエピトープと特異的に反応する、モノクローナル抗体を製造することが達せられた。まず、マウスを非転移性ラット−乳癌セルラインＮＭ−０８１（寛容原性抗原として）で免疫化した。１日もしくは２日後に、活性化した免疫細胞を殺すために、マウスをシクロホスファミドで処理した。３週間後、寛容原性抗原およびシクロホスファミドの注射を繰り返した。更に３週間後このマウスを転移性ラット−乳癌セルラインＭＴ−４５０（免疫原として）を投与した。免疫化およびシクロホスファミド処理の効力は、それぞれ寛容原性抗原、シクロホスファミドもしくは免疫原での処理の前または処理後に採取した血清を用いて細胞−ＥＬＩＳＡによりテストした、この際ＮＭ−０８１細胞またはＭＴ−４５０細胞をターゲットとして使用した。血清は第２の免疫化及びシクロホスファミド処理の１０日後寛容原性抗原に対して全く免疫反応を示さず、シクロホスフアミド処理の効力を証明した。しかしながら、これらの全ての血清は免疫原に対して強化された反応性を示した。免疫化マウスの脾臓細胞をハイブリドーマの生成のために使用した。ハイブリドーマのいずれもが、寛容原性抗原のみをサブトラクティブ免疫化の有効性で認識する抗体を全く生産しなかった。ハイブリドーマの１つは細胞ＥＬＩＳＡ中で特異的に転移性ＭＴ−４５０細胞とのみ反応する抗体（Ｍ−Ｎ＃１）を生産した。この抗体はＭＴ−４５０細胞で免疫蛍光染色をも示し（図１）かつ免疫沈降に使用することができる。但し、ウェスタンブロット法においては全く反応性を示さない。抗体が転移特異的に発現するエピトープのみを認識するだけでなく、腫瘍転移を抑制するかどうかを調べるために、ＭＴ−４５０細胞をラットの胸腺組織中に注射し、引き続きＭ−Ｎ＃１−抗体で、または対照抗体で同じアイソタイプを処理した。Ｍ−Ｎ＃１−抗体は腫瘍の増殖を抑制し、このことは一方では、対照動物中でよりもより少ない動物において腫瘍が形成され、かつ他方では増殖した腫瘍が対照動物中でより明らかに小さいという結果に導いた。更に、抗体は腫瘍を有する動物のリンパ節中の転移増殖を抑制する作用をも有した。Ｍ−Ｎ＃１−抗体で処理した動物の生存期間も明らかに対照動物より長い（図２）。Ｍ−Ｎ＃１−抗体の特異性を調べるために組織切片で免疫組織学的なＭ−Ｎ＃１−抗体での染色を、転移能力の異なるラインを包含する組織培養物中の種々異なる乳房腫瘍セルラインおよびＭＴ−Ｗ９乳房腫瘍系の腫瘍に実施した（図３）。ＭＴ−Ｗ９系の腫瘍の内で、抗体は転移性ＭＴ−４５０およびＭＴ−４４９と反応したが、非転移性ＭＴ−Ｗ９ＡおよびＭＴ−Ｗ９Ｂとは反応しなかった。培養物中の細胞の内、低い転移能力を有するラインのいずれとも反応しなかった（第１表）。転移性の乳癌セルラインの内のいくつかはこの抗体と反応したが、いくつかは反応しなかった。このことは、Ｍ−Ｎ＃１エピトープの発現は全ての腫瘍のための転移工程に必須なものではないことを意味する。Ｍ−Ｎ＃１−抗原が動物中の生理学的条件下に同様に発現されるかどうかを確定するために、一連のラット組織をＭ−Ｎ＃１−抗体との反応性に関して調査した。腺特性を有する上皮細胞はプラスに反応した（第２表）。脾臓、胸腺からのまたはリンパ節からの白血球および腹膜からのマクロファージはマイナスであった。パラフィン切片においては、胃の内体領域および洞領域の上皮、膵臓の胞状細胞および腸管の洞の基底細胞は染色された。強い反応性は骨髄にも見られた。なぜＭ−Ｎ＃１−エピトープが転移性乳腺腫に発現するかという原因は正常な生理学的条件下にもこの抗原が乳腺組織に存在するということでもあるかもしれない。正常な乳腺組織はＭ−Ｎ＃１−抗体と全く反応を示さず、妊娠および授乳期にも全く反応を示さない。興味深いことに、授乳期の終了の２日後から乳腺の退行開始まで、および退行相の間、Ｍ−Ｎ＃１−エピトープの強い発現が見られる（図４）。退行期の特徴はアポプトーシスによる細胞の除去（プログラムされた細胞死）である。他の器官もアポプトーシスにより退行する。これには去勢後の前立腺も属する。前立腺の組織も、正常の乳腺組織と同様に、全くＭ−Ｎ＃１−エピトープの発現を示さない。すでに去勢の２日後、前立腺の退行の開始で、Ｍ−Ｎ＃１−抗原の強い発現が見られ、この発現は退行期間の間保持される（図５）。このデータはＭ−Ｎ＃１−抗原がアポプトーシスの組織で発現されることを示唆している。Ｍ−Ｎ＃１−抗体と関連する抗原の同定のためには、細胞溶解物から反応性材料をＭ−Ｎ＃１−抗体と免疫沈降させ、引き続き沈降した材料をゲル電気泳動で分離した。沈降した材料は不連続バンドに分離せず、“べっとりとしたシミ”のように見え、この材料がポストトランスレーション変容体（post-translational modification）であろうことを示唆している。従って、免疫沈降材料を種々のグリコシダーゼで処理した。Ｎ−グリコシダーゼＦでの処理のみが効果を有し、 “べっとりとしたシミ”を見かけの分子量４９／５１ｋＤを有する２つのバンドに減少させた（図６）。コンドロイチンスルフェートおよびヘパランスルフェート変性は除いた。興味深いことには、Ｎ−グリコシダーゼＦでの処理の後、Ｍ−Ｎ＃１−抗原はもはやＭ−Ｎ＃１−抗体と免疫沈降をすることができなかった。ＭＴ−４５０溶解物の熱処理後、Ｍ−Ｎ＃１−抗原の免疫沈降性は破壊されないので、Ｍ−Ｎ＃１により認識される抗原は糖残基と思われる。このことはＭＴ−４５０細胞をツニカマイシン（tunicamycin）での処理も免疫沈降性の材料を消失させることから確認された。ＭＴ−４５０細胞の放射性フコースでの標識付けにより、Ｍ−Ｎ＃１−抗体により認識されるＮ−グリコシド結合糖がフルコース化されていることが示された：ｉ）この抗体は、³⁵Ｓ−標識細胞からのものと類似の分子量を有するタンパク質をフコース標識細胞の溶解物から沈降した（図７）。ｉｉ）Ｎ−グリコシダーゼＦでの免疫沈降したタンパク質の処理はフコースの脱離に導く（図７）。ｉｉｉ）ウレクス・エウロパエウスレシチンでのフコース化タンパク質の精製および引き続くＭ−Ｎ＃１−抗体での免疫沈降は³⁵Ｓ−標識後と類似の分子量を有するタンパク質を同定する。ｉｖ）Ｍ−Ｎ＃１−抗体へのタンパク質の結合はＤ−フコースおよびＤ−ガラクトースの量の上昇により抑制される。Ｌ−フコースは結合に全く影響を有しない（図８）。ｖ）Ｍ−Ｎ＃１−抗体とヒト赤血球および血管内皮との反応性は血液型の状態に依存する。ＢおよびＡＢ型（示さず）の個体の赤血球との反応性、およびＢ型個体の幽門および十二指腸の上皮との反応性は、これらが血液型抗原を分泌する場合、見られる。Ａ型の個体の内では、この個体が血液型抗原を分泌する場合、幽門の上皮との反応は見られるが、十二指腸の上皮、空腸または赤血球との反応は見られない（第３表）。ｉｖ）Ｍ−Ｎ＃１− 抗体はＥＬＩＳＡ−実験において、血液型Ｂの個体のヒト唾液に結合する。この結合は、合成により製造したＢ２、３、４型およびＡ２型の血液型糖により妨害されるが、Ｂ１、Ａ１、３、４型またはＨ型により妨害されない。この結合の妨害は１−２結合フコースに依存する（第５表）。第１表ラットからの乳癌細胞の免疫蛍光染色免疫蛍光染色セルラインをＣＤ４４特異性抗体５Ｇ８および１．ＬＡＳＭＬ（Sleeman et a l.,Cancer Research 56 3134-3141,1996）で、およびＭ−Ｎ＃１−抗体で実施した。染色強度は４段階（−；染色せず、＋＋＋；強く染色）で主観的に決定した。転移能力は文献（Sleeman et al.,Cancer Res．56,3134-3141,1996）に記載されているような分類で行なった。細胞の約１０％が強く染色した。第２表正常組織の免疫組織学的染色パラフィン切片をＭ−Ｎ＃１抗体で免疫組織的に染色した（材料および方法）４段階（第１表参照）で主観的に評価した。第３表血液型ＡＢＯ、分泌または非分泌に関して表現型を分類した個体の胃十二指腸のＭ−Ｎ＃１抗体での免疫ペルオキシダーゼ染色第４表結合に関する研究で使用したＡＢＨ関連オリゴサッカライドの構造第５表固体結合したオリゴサッカライドへのＭ−Ｎ＃１の結合固体マトリックスに固定したオリゴサッカライドへのＭ−Ｎ＃１−抗体の結合は「材料および方法」の項に記載されている。図に関する記載図１：Ｍ−Ｎ＃１−抗体を用いるＮＭ−０８１およびＭＴ−４５０細胞の免疫蛍光染色。ＭＴ−４５０のみが抗体により染色される（赤色免疫蛍光）。図２：腫瘍を有するラットの腫瘍増殖および生存へのＭ−Ｎ＃１−抗体の効果。ＭＴ−４５０細胞５×１０⁵個を皮下に注射し、かつその後対照抗体（ＩＢ７）またはＭ−Ｎ＃１それぞれ２００μｇで１週間当たり２回処理したＷｉｓｔａｒＦｕｒｔｈラットの、腫瘍増殖をＡに（最初の腫瘍の容量）および生存をＢに示した。図３：ＭＴ系の腫瘍のパラフイン切片のＭ−Ｎ＃１−抗体での免疫組織化学的染色。図４：授乳期終了後の雌のＢＤＸ−ラットの乳房組織のパラフィン切片のＭ− Ｎ＃１−抗体での免疫組織化学的染色。時間０でラットの子供を引き離した。図５：ラットの前立腺組織のパラフィン切片のＭ−Ｎ＃１−抗体での免疫組織化学的染色。雄のＢＤＸラットを０日目に去勢し、記載した時間に前立腺組織を採取し、Ｍ−Ｎ＃１−抗体で染色した。図６：Ｍ−Ｎ＃１−抗原はＮ−グリコシド結合糖残基の一部である。ＭＴ−４５０細胞の放射性標識付け細胞分解物をＭ−Ｎ＃１で免疫沈降し、かつ沈降したタンパク質をＳＤＳアクリロアミドゲル上で分離した。Ｍ−Ｎ＃１沈降タンパク質はべっとりとしたシミとして移動する（第１のバンド）。アルファベットはゲル電気泳動分離前の免疫沈降処理を示す：ＮＧＦ：Ｎ −グリコシダーゼＦ；ＯＧ：Ｏ−グリコシダーゼ；Ｎ：ノイラミニダーゼ。Ｒｅ −Ｉ．Ｐ．ｅｄとは、酵素処理した免疫沈降物を“再沈降”したことを意味する。図の右側部分はツニカマイシン処理の結果を示す。Ｍ−Ｎ＃１−Ｔ４５０細胞を放射性メチオニンで標識付けする前に、記載した時間の間ツニカマイシンで処理し、標識付けの後免疫沈降した。対照は抗体なしでの沈降を示す。図７：Ｍ−Ｎ＃１−抗原のフコシル化の証明ＭＴ−４５０細胞を放射性フコースで標識付けし、この細胞の溶解物中のタンパク質をＭ−Ｎ＃１で沈降させた（対照＝抗体なしでの沈降）。図はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での沈降タンパク質の分離である。ＮＧＦ（Ｎ−グリコシダーゼＦ）は分離の前に、ＮＧＦで処理された免疫沈降タンパク質を示す。実験 “Ｕ．エウロパエウス”（図の右側）のためにはＭＴ４５０細胞を¹⁴Ｃ−メチオニンで標識付けし、かつ抽出物をウレクス・エウロパエウスレシチンカラムを通して精製した。結合したタンパク質を溶離し、抗体なしで（cont）またはＭ−Ｎ＃１−抗体で沈降させた。ＮＧＦはＮ−グリコシダーゼＦ処理を示す。図８：フコースおよびガラクトースでのＭ−Ｎ＃１−結合の競合。放射性標識付けした（¹⁴Ｃ−メチオニン）ＭＴ−４５０細胞の溶解物中のタンパク質をフコースまたはガラクトースの上昇濃度または不存在で、Ｍ−Ｎ＃１−抗体で免疫沈降し、かつゲル電気泳動で分離した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ペーターヘルリッヒドイツ連邦共和国カールスルーエフォーゲルザング８ (72)発明者キムアンテーアメリカ合衆国ニューヨークスナイダーメインストリート 4720

Claims

【特許請求の範囲】 1. Ｎ−グリコシド結合サッカライドを有するタンパク質と反応する抗体を含有する腫瘍細胞の増殖を同定および抑制するための組成物において、該サッカライドがＢ２、３、４型またはＡ２型の血液型特異的抗原に属することを特徴とする腫瘍細胞の増殖の同定および抑制用組成物。 2. タンパク質として動物またはヒト由来の糖タンパク質を含有する請求項１記載の組成物。 3. 少なくとも１種のモノクローナル抗体を含有する請求項１または２記載の組成物。 4. 寄託番号ＤＳＭＡＣＣ２３３３を有する細胞培養体から得られるモノクローナルＭ−Ｎ＃１抗体を含有する請求項１から３までのいずれか１項記載の組成物。 5. 経腸、腸管外、全身的、局部的および／または局所的に投与するための投与剤形である請求項１から４までのいずれか１項記載の組成物。 6. 注射、注入または灌注に好適な投与形である請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。 7. 請求項１または２記載のタンパク質を生存細胞中に注射し、かつ形成された抗体を単離することを特徴とする、腫瘍細胞の増殖を同定および抑制するための組成物の製法。 8. 請求項１から６までのいずれか１項記載の組成物の腫瘍の増殖の診断および治療への使用。