DD260515B5 - Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikoerpern gegen menschliche A-Erythrozyten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die humane Erythrozyten der Blutgruppe A spezifisch agglutinieren. Das Anwendungsgebiet ist die Typisierung von Erythrozyten der Blutgruppe A in der Blutgruppenserologie von Blutspende- und Transfusionseinrichtungen, klinischen- und gerichtsmedizinischen Laboratorien.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Kenntnis der Blutgruppe eines Menschen ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Ausführung von Bluttransfusionen und Transplantationen. Im klassischen ABO-Blutgruppensystem werden die Merkmale 0, A, B und AB unterschieden. Die Merkmale sind unter anderem auf der äußeren Membran von menschlichen Erythrozyten vorhanden und können von menschlichen Serumantikörpern agglutiniert werden. Zur Vermeidung von Unverträglichkeitsreaktionen bei Bluttransfusionen und Transplantationen werden die Blutgruppenmerkmale durch Antiseren ermittelt.

Blutgruppentestseren bestehen aus besonders ausgewählten menschlichen Seren, deren Reaktionsparameter mit Erythrozyten den jeweiligen gesetzlichen Bestimmungen (z. B. Arzneibuch der DDR) gerecht werden müssen. In der Regel werden sie von freiwilligen, mit der jeweiligen Blutgruppensubstanz immunisierten Spendern gewonnen.

Jedes für diese Zwecke gewonnene Serum wird selbst bei gleichen Spendern graduelle Unterschiede in der Avidität und im Titer aufweisen. Die Eignung für einen Testserumpool muß überprüft werden. Eine exakte Reproduzierbarkeit der Herstellung derartiger Testseren ist nicht gegeben.

Im Gegensatz dazu lassen sich mit Hilfe der von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256 [1975] 495) entwickelten Hybridantechnologie spezifische, gegen menschliche Blutgruppenmerkmale gerichtete monoklonale Antikörper produzierende Hybridomzellinien etablieren. In der Literatur sind bereits monoklonale Antikörper dieser Spezifität beschrieben (VOAK et. al. Vox Sang. 39, [1980], 13, MOORE et. al. Develop, biol. standard. 57, [1984], 49, MESSETER et. al. Biotest Bulletin 1, [1983], 308). Diese permanent kultivierbaren Zellinien sezernieren die Antikörper in das Zellkulturmedium, das die Grundlage für einen diagnostischen Einsatz bildet. Die Literaturdaten lassen sich wegen NichtVerfügbarkeit der jeweiligen Ausgangsmaterialien nicht reproduzieren bzw. überprüfen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, agglutinierende monoklonale Antikörper gegen menschliche Erythrozyten mit dem Blutgruppenmerkmal A zur Verfugung zu stellen. Sie sollen durch Zellkultivierung gewonnen werden und in ihren Reaktionsparametern die gesetzlichen Forderungen des Arzneibuches der DDR erfüllen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß zunächst in an sich bekannter Weise 6-10 Wochen alte weibliche Balb/c Mäuse mit gewaschenen humanen Ai-Erythrozyten in mehreren Applikationsstufen sowohl intraperitoneal als auch intravenös immunisiert werden. Die Lymphozyten werden aus den Milzen der immunisierten Mäuse isoliert, mit P30-/1 Myelomzellen fusioniert und die Zellsuspension in Selektionsmedium (Littlefield, Science 145 [1964] 709) kultiviert. Simultan mit dem Mediumwechsel werden dieZellkulturüberstände der Mikrotestplatten auf Anwesenheit agglutinierender Antikörper gegen humane Testerythrozyten überprüft. Aus den Vertiefungen der Mikrotestplatten, die eine positive Reaktion aufweisen, werden Hybridzellklone isoliert und separat in der Zellkultur geführt. Nach bestätigter spezifischer Agglutionsreaktion, Kryokonservierung und nach Reklonierung werden die Subklone nach spezifischer Wirkung,Titer und Avidität bewertet. Unter den derart stabilisierten Hybridomen wurde auch eine Zellinie etabliert, die monoklonale Antikörper in das Zellkulturmedium sezerniert und unter der Nomenklatur 21 III 5/E 10 oder Sifin mAK-Anti A-1 im Staatlichen Institut für Immunpräparate und Nährmedien hinterlegt wurde.

Diese Zeil/nie wird erfindungsgemäß zur Produktion der mAK in der Zellkultur eingesetzt, wobei eine stabile Produktion über einen längeren Zeitraum ohne Veränderung der Antikörperbildungsraten möglich ist. Die Produktion der mAK ist gleichermaßen auch nach Transplantation in der Aszitesform in Mäuse möglich.

Die erfindungsgemäß hergestellten mAK reagieren spezifisch mit den Erythrozyten der Blutspendemerkmale A₁, A₂, A]B und A₂B, jedoch nicht mit 0 und B. Sie erfüllen bzw. übertreffen die im Arzneibuch der DDR gestellten Forderungen an ein Blutgruppentestserum „Anti A"

Die Isotypcharakterisierung ergab, daß alle Subklone dieser Linie vom IgM-Typ waren. Unter Screeningbedingungen

durchgeführte Vergleiche belegen, daß bei der Bestimmung des Titers eine Überlegenheit gegenüber einem polyklonalen menschlichen Anti-A-Testserum (Sifin) bzw. gleiche oder höhere Verdünnungen gegenüber einem monoklonalen Anti-A-Testserum (Seraclone, Fi. Biotest-Serum-Institut GmbH, Frankfurt [BRD]) ermittelt wurden (Tab. 1).

Tabelle 1

Bestimmung des Titers von Zellkulturüberständen der Linie Sifin mAK Anti A-1 im Vergleich zu zwei kommerziellen Blutgruppentestseren „Anti A"

	A,	2	3	A2	512	Blutgruppenmerkmal'1"1 A1B	2	256	3	256	1	256	2	512	A2B	32	2	32	3	32
Testserum „Anti A" sifin	1+2	1024	2 048	1	512	1024	2 048	512	4 096	1	512	1024	1024
Charge: 1361185	2 048	1024	4 096	2 048	1024	2 048	2 048	4 096	1024	2 048	2 048
Testserum „Anti A" seraclone Biotest Charge: 121055	4 096	1024	4096
Zellkulturüberstand Sifin mAk Anti A-1	4 096

Testbedingungen: Der Test wurde für alle Antiseren simultan durchgeführt.

Die Testseren wurden in Mikrotestplatten zu gleichen Volumina verdünnt und mit identischen Volumina von 1-2%igen in physiologischer NaCI-Lösung gewaschenen Erythrozyten vermischt.

Reaktionszeit: 20min/23°C

+1 Keine Reaktion mit den Blutgruppenmerkmalen B und 0 +2 1 ... 3 unterschiedliche Spendererythrozyten

Ausführungsbeispiel

1) Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit mindestens 4 Applikationen von menschlichen Ai-Erythrozyten immunisiert worden waren, wurden nach den üblichen Techniken mit P30/1 Myelomzellen fusioniert. Die Zellsuspension wurde in HAT-Selektiomedium (RPMI 1640supp!ementiert mit 20% fetalem Kälberserum, 2mM/l Glutamin, 2g/l Natriumbicarbonat, 10mMol/l Hepes, 240JE/ml Penicillin, 150pg/mI Streptomycin, 4 x 10~⁷ Mol/l Aminopterin, 1 x 10"⁴ Hypoxanthin, 1,6 χ 10"^s Mol/l Thymikin) unter Zusatz von 1 χ 10⁵ Maus-Peritonealexsudatzellen/ml 7-10 Tage bei 37°C in einer wassergesättigten 5-6%igen C0₂-Atmosphäre inkubiert.

2) Die Selektion antikörper-produzierender Klone wurde simultan mit dem Mediumwechsel durchgeführt. Unter sterilen Bedingungen wurde die Hälfte des Zellkulturüberstandes aus den Vertiefungen der Mikrotestplatte entnommen und in getrennten Agglutinations-Mikrotestplatten, identischer Abmessung, mit gewaschenen menschlichen Testerythrozyten der Blutgruppen Ai, A₂, A₁B, A₂B, B und 0 in Kontakt gebracht. Aus den Vertiefungen der Zellkulturmikrotestplatte, deren Überstände eine spezifische Agglutination hervorriefen, wurden Hybridzellklone isoliert und separat in Kultur geführt. Nach Bestätigung der Spezifitätsreaktion wurden sowohl Kryokonserven als auch Reklonierungen nach bekannten Methoden angelegt, in deren Ergebnis nach dem Agglutinationstiter selektiert wurde.

3) Das Hybridom SIFiN mAK Anti A-1 (21 III 5/E10), dessen in den Zellkulturüberstand sezernierte monoklonale Antikörper die im Arzneibuch der DDR an ein Blutgruppentestserum „Anti A" festgelegten Forderungen für die Höhe des Titers und der Avidität mit Ai, A₂, AiB und A₂B Erythrozytensuspensionen erfüllen bzw. übertreffen, kann mit den bekannten Zellkulturtechniken vermehrt und die Kulturüberstände einschlägig gewonnen werden. Die Spezifität wurde an mehr als 50 Spendererythrozyten je Blutgruppenmerkmal A₁, A₂, A,B, A₂B, B und 0 überprüft.

4) Eine Produktion der genannten Antikörper durch Vermehrung der Hybridomzellen als Aszites-Tumor in Paraffin-stimulierten Balb/c-Mäusen wies für 15 eingesetzte Tiere eine 100%ige Aszites-Tumorangehrate aus.

Claims (1)

1. Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikörpern gegen menschliche A-Erythrozyten durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit menschlichen A-Erythrozyten, Fusion ihrer Milzzellen mit Mausmyelomzellen der Linie P30/1, Selektion der spezifischen agglutinierenden antikörperbildenden Hybride, deren Klonierung und Kultivierung bzw. Transplantation in der Aszitesform in Mäuse, dadurch gekennzeichnet, daß zur Kultivierung bzw. Transplantation der Klon SIFIN mAK „Anti-A-1 (21III5/E10)" eingesetzt wird.

   Anwendungsgebiet der Erfindung