DD230883B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer humanes iga - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper,die in der Lage sind, humanes IgA spezifisch zu binden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

IgA kommt beim Menschen sowohl im Serum als auch in Sekreten vor. Besonders durch die Anwesenheit in Schleimhautsekreten erfüllt das IgA eine wichtige immunologische Schutzfunktion. Die Konzentrationsbestimmungen von IgA sowie die Bestimmung des Gehaltes an IgA-Antikörpern erfordern spezifische Anti-lgA-Antiseren. Konventionelle Antiseren gegen Human-lgA sind bekannt, weisen jedoch eine Reihe von Mängeln auf. Am schwerwiegendsten ist die Unmöglichkeit, ein Antiserum genau zu reproduzieren. Dies ist durch die äußerst heterogene humorale Immunantwort der Serumspendertiere bedingt. Die Zusammensetzung der Antiseren, z. B. hinsichtlich der Häufigkeit einzelner Anti körpertypen, die durch ihre Affinität definiert sind, variiert von Versuchstier zu Versuchstier, ja selbst von einer Blutabnahme zur anderen bei einem Serumspender. Die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion eines Antiserums, bei einer endlichen gewinnbaren Antiserummenge, limitiert eine Standardisierung solcher Antiseren, wie sie jedoch für quantitative Bestimmungsverfahren zu fordern wäre. Monokionale Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zeliinie sezerniert werden, überwinden diese Mängel konventioneller Antiseren.

Es ist bereits bekannt, monokionale Antikörper herzustellen. So haben Köhlerund Mi Istein (Nature 256, (1975), 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytornlinie eine Hybridzeliinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, da β verschiedene Hy bridomiinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monokionale Antikörper für humanes IgA sezernieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-IgA anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für humanes IgA gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest für humanes IgA eignen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

DerErfindung liegt die Aufgabe zug run de, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper abzuwickeln, die für humanes IgA spezifisch sind. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus dem Serum gesunder Spender isoliert wird, z.B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch lonenaustauschchromatographie an DEAE-Zellulose reines IgA isoliert, mit dem erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Myelomzellen dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3 - X - 63Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, (1979),1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefieid, Science 145, (1964), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone salektioniert, die Antikörper, die spezifisch mit Human-lgA reagieren, sezernieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-дІ-КиИигеп aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgA reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgA verwendet, das aus Serum oder Colostrum präpariert wurde. Weitergezüchtet werden aber nur solche Hybridome, die sowohl mit Serum- als auch mit Colostrum-lgA, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgD, IgE oder isolierten λ- und κ-Ketten reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an alpha-kettenspezifische Determinanten des IgA. — Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen selektioniert, die die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgA reagieren. Jedes Hybridom wird kloniert und rekloniert, wodurch jeweils Subklone erhalten werden, die stabil und mit guter Ausbeute den entsprechenden monoklonalen Antikörper sezernieren. Die so klonierten und selektionierten Hybridome erhalten die Bezeichnungen H-BL-IgA, speziell H-BL-lgA/1 bis 5. Die Hybridome können nach an sich bekannten Verfahren eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden.Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Satzes BL-lgA/1-5 wird das jeweilige Hybridom aus der Serie H-BL-lgA/1-5 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄)₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte jeweilige monokionale Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 kann lyophilisiert werden. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Antc-il am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37^CC zu arbeiten.

Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis,4 Tagen. Anschließend ist ein teilweiser Kulturmediumwechsel notwendig. Dabei ist erneut eine optimale Zelldichte einzustellen.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Satzes BL-lgA/1-5 die jeweiligen Hybridome H-BL-lgA/1-5 in histokompatible A χ BALB/c-F-pMäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms H-BL-lgA/1-5. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder einer weiteren Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschgromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp des jeweiligen BL-lgA/1-5 spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die die Antikörper BL-lgA/1-5 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg des jeweiligen monoklonalen Antikörpers der Serie 8L-lgA/1-5 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobuiinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCC>3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophüisiert bei t4³C haltbar ist. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 weisen das in Tabelle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immungiobuiinen auf.

Die Hybridome H-BL-lgA/1-5 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig zugänglich. Die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 sind im Zent^ralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR wie folgt registriert: BL-lgA/1 = DDR 0054; BL-lgA/2= DDR 0055; BL-igA/3= DDR 0036; BL-lgA/4 = DDR 0097; BL-lgA/5 = DDR 0098.

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen der Serie H-BL-lgA/1-5 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 10° Zellen pro mi Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 10~⁵M) Gentamycin ilOOmg/l) und N^-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden/

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelidichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den jeweiligen топокіопаіеп Antikörper der Serie BL-lgA/1-5. Die Konzentration des jeweiligen Antikörpers BL-lgA/1—5 ist ausreichend für diagnostische Nachweisverfahren von Human-lgA (wie z. B.

enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z.B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstä'nde mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglo'oulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonal Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer ЯН2.8) von diesem Immunadsorbes wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1-5, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert.

Als histokompatible Mäuse werden F,-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum, i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1-5. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobuiinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 sind lyophüisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.

Tabelle 1

Reaktion der monokionaien Antikörper BL-lgA/1—5 mit humanen Immunglobulinen bzw. deren Poiypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.

Antigen I¹¹

BL-lgA/1 BL-lgA/2 BL-lgA/3 BL-lgA/4 BL-lgA/5

Serum-lgA Colostr.-lgA

lgA(K)_Hep2) lgA(\)_Te IgG³¹ lgM(K)_Loh

IgD(K)₁ IgD(X)₁

lgE(X)_ND SC⁴ⁱ

K-Kette⁵¹ λ-Kette⁵'

1) Zur Testung der monokionaien Antikörper auf deren Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in Mikrotiterplatten aus PVC, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monokionaien Antikörper wurden dann durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmungloouiin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des jeweiligen gebundenen Antikörpers der Serie BL-igA/1-5 zu der des monokionaien Antikörpers BL-DNP/il, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern.

2) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.

3 HGG-Präparation der Firma SERVA, Heidelberg.

4 Sekretorische Komponente des IgA.

5 Standard-K-bzw. -lambda-Präparation der Behringwerke AG, Marburg.

Mischungen von mehreren Bence-Jonss-Proteinen.

Claims (24)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung monoklonal er Antikörper für humanes IgA, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit humanem IgA immunisiert werden, die Milzlyrhphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen der Art H-BL-lgA/1-5 selektioniert werden, die selektionierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die Aszitesflüssigkeit gewonnen und die jeweiligen Antikörper isoliert werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3 - X - 63 Ag 8.653 eingesetzt werden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit dem humanen IgA erfolgt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, 2, 4, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisie rung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten,diezur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1, 3, 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ BALBZc-F₁-Hybridmäusen enthält.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf die Anwesenheit von Antikörpern, die mit der α-Kette reagieren, und damit die Auswahl geeigneter Hybridome H-BL-IgA bestimmt, durch indirekte Radiobindungstechnik oder monoklonale PAP-Technik bei Verwendung von IgA, welches aus dem Serum und aus dem Colostrum präpariert wird, erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinen der Isotypen IgGJgM.lgDundlgE geführt wird.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen der Hybridomzellen der HybridomserieH-BL-lgA/1 bis 5 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CCVhaltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
10. 10. Verfahren nach Punkt 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. eingesetzt wird.
11. 11. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPM1-1640 verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5 10"⁵M Mercaptoethanol, 100 mg/l Gentamycin zugesetzt werden.
13. 13. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
14. 14. Verfahren nach Punkt 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.
15. 15. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kuitivierungstemperatur 35 bis 38°C beträgt.
16. 16. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37⁰C kultiviert wird.
17. 17. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der COvGehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.
18. 18. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.
19. 19. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4 Tage kultiviert wird.
20. 20. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridome der Se^rie H-BL-lgA/1 bis 5 jeweils einzeln in histokompatibleA χ BALB/c-F,-Mäuse injiziert werden, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1 bis 5 enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO₃-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
21. 21. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des eingesetzten Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1 bis 5 bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können.
22. 22. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt werden.
23. 23. Verfahren nach Punkt 1 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein enfsprechender Tumorstimulator 3 Tage bis 6 Wochen vor der Hybridominjektion gegeben wird.
24. 24. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-IgA bei +4⁰C aufbewahrt wird.,