DD230883B1 - PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANES IGA - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper,die in der Lage sind, humanes IgA spezifisch zu binden.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of specifically binding human IgA.
IgA kommt beim Menschen sowohl im Serum als auch in Sekreten vor. Besonders durch die Anwesenheit in Schleimhautsekreten erfüllt das IgA eine wichtige immunologische Schutzfunktion. Die Konzentrationsbestimmungen von IgA sowie die Bestimmung des Gehaltes an IgA-Antikörpern erfordern spezifische Anti-lgA-Antiseren. Konventionelle Antiseren gegen Human-lgA sind bekannt, weisen jedoch eine Reihe von Mängeln auf. Am schwerwiegendsten ist die Unmöglichkeit, ein Antiserum genau zu reproduzieren. Dies ist durch die äußerst heterogene humorale Immunantwort der Serumspendertiere bedingt. Die Zusammensetzung der Antiseren, z. B. hinsichtlich der Häufigkeit einzelner Anti körpertypen, die durch ihre Affinität definiert sind, variiert von Versuchstier zu Versuchstier, ja selbst von einer Blutabnahme zur anderen bei einem Serumspender. Die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion eines Antiserums, bei einer endlichen gewinnbaren Antiserummenge, limitiert eine Standardisierung solcher Antiseren, wie sie jedoch für quantitative Bestimmungsverfahren zu fordern wäre. Monokionale Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zeliinie sezerniert werden, überwinden diese Mängel konventioneller Antiseren.IgA occurs in humans in both serum and secretions. Especially due to its presence in mucosal secretions, IgA fulfills an important immunological protective function. Concentrations of IgA and determination of IgA antibody levels require specific anti-IgA antisera. Conventional antisera to human IgA are known, but have a number of deficiencies. The most serious is the impossibility of accurately reproducing an antiserum. This is due to the extremely heterogeneous humoral immune response of the serum donor animals. The composition of the antisera, z. For example, in terms of the frequency of individual antibody types, which are defined by their affinity, varies from test animal to test animal, even from one blood sample to another in a serum donor. The impossibility of accurate reproduction of an antiserum, with a finite amount of antiserum obtainable, limits the standardization of such antisera, as would be required for quantitative determination. Monoclonal antibodies secreted by a permanently growing cell line overcome these shortcomings of conventional antisera.
Es ist bereits bekannt, monokionale Antikörper herzustellen. So haben Köhlerund Mi Istein (Nature 256, (1975), 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytornlinie eine Hybridzeliinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, da β verschiedene Hy bridomiinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monokionale Antikörper für humanes IgA sezernieren.It is already known to produce monoclonal antibodies. For example, Köhler and Mi Istein (Nature 256, (1975), 495) have generated a hybrid cell line by fusing antibody-forming cells with a permanently growing plasmacytoma line, which grows permanently and stably emits antibodies. This principle solution has led to the production of different hybridomas which produce antibodies of different specificity. However, no hybridoma lines are known which secrete monoclonal antibodies to human IgA in high yield.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-IgA anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für humanes IgA gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest für humanes IgA eignen.The invention aims to provide a method for producing a monoclonal antibody of the type BL-IgA, which allows in an easily controllable way the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody for human IgA. It should ensure consistent quality, the antibody should be stable and storable and suitable for use in a simple and accurate detection test for human IgA.
DerErfindung liegt die Aufgabe zug run de, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper abzuwickeln, die für humanes IgA spezifisch sind. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus dem Serum gesunder Spender isoliert wird, z.B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch lonenaustauschchromatographie an DEAE-Zellulose reines IgA isoliert, mit dem erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Myelomzellen dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3 - X - 63Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, (1979),1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefieid, Science 145, (1964), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone salektioniert, die Antikörper, die spezifisch mit Human-lgA reagieren, sezernieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-дІ-КиИигеп aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgA reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgA verwendet, das aus Serum oder Colostrum präpariert wurde. Weitergezüchtet werden aber nur solche Hybridome, die sowohl mit Serum- als auch mit Colostrum-lgA, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgD, IgE oder isolierten λ- und κ-Ketten reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an alpha-kettenspezifische Determinanten des IgA. — Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen selektioniert, die die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgA reagieren. Jedes Hybridom wird kloniert und rekloniert, wodurch jeweils Subklone erhalten werden, die stabil und mit guter Ausbeute den entsprechenden monoklonalen Antikörper sezernieren. Die so klonierten und selektionierten Hybridome erhalten die Bezeichnungen H-BL-IgA, speziell H-BL-lgA/1 bis 5. Die Hybridome können nach an sich bekannten Verfahren eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden.Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Satzes BL-lgA/1-5 wird das jeweilige Hybridom aus der Serie H-BL-lgA/1-5 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH4)2SO4 versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte jeweilige monokionale Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 kann lyophilisiert werden. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 10"5M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.The object of the invention is to provide a method of producing monoclonal antibodies specific for human IgA. The method is intended to reproducibly produce antibodies of high affinity and specificity. The object is achieved according to the invention by first isolating an immunoglobulin fraction from the serum of healthy donors by methods known per se, for example by salting out. From this immunoglobulin fraction, pure IgA is isolated by ion exchange chromatography on DEAE cellulose, with which mice according to the invention are immunized. Preferably 6 to 8 week old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B-myeloma cells of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The necessary murine B myeloma cells P3-X-63Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol., 123, (1979), 1548) are grown in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (Littlefieid, Science 145, (1964), 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, are cell clones which specifically clone antibodies that react with human IgA. secrete. The selection of the hybridomas takes place in such a way that the cells are divided immediately after the fusion into a multiplicity of separate 200-дІ-KiИигеп. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react with human IgA. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. The antigen used is human IgA prepared from serum or colostrum. However, only those hybridomas that react both with serum and with colostrum IgA but not with human immunoglobulins of the isotypes IgG, IgM, IgD, IgE or isolated λ and κ chains are further bred. The binding of the antibody takes place at alpha-chain-specific determinants of IgA. - In the manner described, a series of hybridomas is selected that have the valuable property of producing antibodies that react specifically with human IgA. Each hybridoma is cloned and recloned to give subclones which stably and with good yield secrete the corresponding monoclonal antibody. The hybridomas thus cloned and selected are designated H-BL-IgA, especially H-BL-IgA / 1 to 5. The hybridomas may be frozen according to methods known in the art and stored on liquid nitrogen. For the preparation of a monoclonal antibody of the kit BL-IgA / 1-5, the respective hybridoma from the series H-BL-IgA / 1-5 is cultivated in a culture medium supplemented with serum in mass culture. After appropriate cultivation in a CO 2 -containing atmosphere, the culture medium now containing antibody is mixed with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 and a gamma globulin fraction is obtained. Further purification of the antibody is possible by processes known per se, such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like. The respective monoclonal antibody of the series BL-IgA / 1-5 thus produced can be lyophilized. It is useful as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like. apply. Particularly favorable is the use of RPMI-1640, which is added in a preferred embodiment of the invention with 1OmM HEPES, 5 10 " 5 M mercaptoethanol, 100mg / l gentamycin.
Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Antc-il am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37CC zu arbeiten.As a serum supplement fetal calf serum or normal horse serum with an antacil to the culture medium serves from 5 to 20%. It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 ° C and 38 ° C. It is advantageous to work at 37 C C.
Der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.The CO 2 content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10%, in particular 5%. It is advantageous to have a high level of humidity, which should extend to the saturation of the atmosphere.
Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis,4 Tagen. Anschließend ist ein teilweiser Kulturmediumwechsel notwendig. Dabei ist erneut eine optimale Zelldichte einzustellen.The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is expedient to cultivate from 3 to 4 days. Subsequently, a partial culture medium change is necessary. Here, an optimal cell density is set again.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Satzes BL-lgA/1-5 die jeweiligen Hybridome H-BL-lgA/1-5 in histokompatible A χ BALB/c-F-pMäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms H-BL-lgA/1-5. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder einer weiteren Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschgromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp des jeweiligen BL-lgA/1-5 spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die die Antikörper BL-lgA/1-5 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg des jeweiligen monoklonalen Antikörpers der Serie 8L-lgA/1-5 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20mg/ml.In a second embodiment of the invention, for the production of a monoclonal antibody of the set BL-IgA / 1-5, the respective hybridomas H-BL-IgA / 1-5 in histocompatible A χ BALB / c-F-p mice i. p. injected. It is advantageous if the mice used have been pretreated with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the respective monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 is removed, e.g. B. by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the respective hybridoma H-BL-IgA / 1-5. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the corresponding monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like. in question, which specifically enrich the isotype of the respective BL-IgA / 1-5, or immunoadsorption methods which antigen-specifically isolate the antibodies BL-IgA / 1-5. The ascitic fluid contains 5 to 10 mg of the respective monoclonal antibody of the series 8L-IgA / 1-5 per ml of liquid in the process according to the invention. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.
Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobuiinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH4)2SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH4HCC>3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophüisiert bei t43C haltbar ist. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 weisen das in Tabelle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immungiobuiinen auf.To produce a stable storage form, which is also suitable as a commercial preparation, the Immununglobuiinfraktion the cell-free ascites is precipitated, z. B. with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 solution and taken up in buffered saline. Dialysing against NH 4 HCC> 3 solution results in a lyophilizable product that is lyophilized at t 3 C. The BL-IgA / 1-5 series monoclonal antibodies have the binding pattern with human immunoglobins documented in Table 1.
Die Hybridome H-BL-lgA/1-5 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig zugänglich. Die von ihnen produzierten monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 sind im Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR wie folgt registriert: BL-lgA/1 = DDR 0054; BL-lgA/2= DDR 0055; BL-igA/3= DDR 0036; BL-lgA/4 = DDR 0097; BL-lgA/5 = DDR 0098.The hybridomas H-BL-IgA / 1-5 are available at the Life Sciences Section of Karl Marx University Leipzig. The monoclonal antibody produced by them BL-IgA / 1-5 are Zent r alinstitut of Molecular Biology of the Academy of Sciences of the GDR registered as follows: BL-IgA / 1 = GDR 0054; BL-IgA / 2 = DDR 0055; BL-igA / 3 = DDR 0036; BL-IgA / 4 = DDR 0097; BL-IgA / 5 = DDR 0098.
1. Ausführungsbeispiel1st embodiment
Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen der Serie H-BL-lgA/1-5 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 10° Zellen pro mi Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.Hybrid nitrogen cells of the H-BL-IgA / 1-5 series are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 10 ° cells per ml of culture medium and cultured in suitable tissue culture flasks.
Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 10~5M) Gentamycin ilOOmg/l) und N^-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.The culture medium consists of RPMI-1640 supplemented with sodium bicarbonate (2g / l), mercaptoethanol (5 10 -5 M) Gentamycin ilOOmg / l) and N ^ -Hydroxyethylpiperazin-N'-ethanesulfonic acid (1OmM) is added.
Dieses Medium wird mitThis medium comes with
a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or
b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum
supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.
Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +370C in einer wassergesättigten 5%igen CO2-Atmosphäre bebrütet werden/The most favorable culture conditions are achieved when the cells are incubated at +37 0 C in a water-saturated 5% CO 2 atmosphere /
Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelidichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimum cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.
Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den jeweiligen топокіопаіеп Antikörper der Serie BL-lgA/1-5. Die Konzentration des jeweiligen Antikörpers BL-lgA/1—5 ist ausreichend für diagnostische Nachweisverfahren von Human-lgA (wie z. B.The cell-free culture supernatants contain the respective топокоопаіеп antibodies of the BL-IgA / 1-5 series. The concentration of the respective antibody BL-IgA / 1-5 is sufficient for diagnostic detection of human IgA (eg.
enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).enzyme immunological detection, radio-linkage techniques).
Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z.B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer may be determined by a suitable technique (e.g., indirect radio-link technique). High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.
Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstä'nde mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglo'oulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The resulting Gammaglo'oulin fraction can be further purified by other known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).
Werden hochgereinigte monoklonal Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer ЯН2.8) von diesem Immunadsorbes wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, these can be separated from the calf serum or horse serum derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and by gently acting desorbents (3 M KSCN or glycine / HCl buffer ЯН2.8) from this immunoadsorber be isolated.
2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment
Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1-5, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 105 bis 5 · 107 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert.Cells of a hybridoma of the series H-BL-IgA / 1-5, which are optionally pre-cultured in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 10 5 to 5 x 10 7 live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice.
Als histokompatible Mäuse werden F,-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum, i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.As histocompatible mice F, hybrids of strains A and Balb / c are used, which with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum, i.p. 2 weeks prior to hybridoma injection.
Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the respective monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 are separated by centrifugation into cellular components and into ascites fluid.
Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1-5. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.The cellular portion consists predominantly of cells of the respective hybridoma of the series H-BL-IgA / 1-5. These hybridoma cells are washed with physiological saline and used as described above by injecting histocompatible mice i. p. be injected. Such passages are possible repeatedly.
Die Immunglobuiinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH4I2SO4 präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH4HCO3-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 sind lyophüisiert bei +40C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.The immunoglobulin fraction of cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH 4 I 2 SO 4 and taken up in buffered saline, dialyzed against 0.5% NH 4 HCO 3 solution, and lyophilized series BL-IgA / 1-5 are lyophüisiert at +4 0 C without loss of binding characteristics durable.
Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.The antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-link technique.
Reaktion der monokionaien Antikörper BL-lgA/1—5 mit humanen Immunglobulinen bzw. deren Poiypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.Reaction of the monoclonal antibodies BL-IgA / 1-5 with human immunoglobulins or their polypeptide chains by means of indirect radio-linkage technique.
Antigen I11 Antigen I 11
BL-lgA/1 BL-lgA/2 BL-lgA/3 BL-lgA/4 BL-lgA/5BL-IgA / 1 BL-IgA / 2 BL-IgA / 3 BL-IgA / 4 BL-IgA / 5
Serum-lgA Colostr.-lgASerum IgA Colostr. IgA
lgA(K)Hep2) lgA(\)Te IgG31 lgM(K)Loh IgA (K) Hep 2) IgA (\) Te IgG 31 IgM (K) Loh
IgD(K)1 IgD(X)1 IgD (K) 1 IgD (X) 1
lgE(X)ND SC4i LGE (X) ND SC 4i
K-Kette51 λ-Kette5'K-chain 51 λ-chain 5 '
1) Zur Testung der monokionaien Antikörper auf deren Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in Mikrotiterplatten aus PVC, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monokionaien Antikörper wurden dann durch 125J-markierte Anti-Mausimmungloouiin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des jeweiligen gebundenen Antikörpers der Serie BL-igA/1-5 zu der des monokionaien Antikörpers BL-DNP/il, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit 125J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern.1) To test the monoclonal antibodies for their reaction with the corresponding antigens, the antibodies were incubated in microtiter plates made of PVC, which had been coated with the corresponding antigens. The bound monoclonal antibodies were then detected by 125 I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies. The binding index I corresponds to the ratio of the count rate of the respective bound antibody of the series BL-IgA / 1-5 to that of the monoclonal antibody BL-DNP / il, which serves as a control for the non-specific binding, after development with 125 I-labeled anti-binding agent. mouse immunoglobulin antibodies.
2) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.2) The indices indicate the origin of the myeloma proteins from corresponding patients.
3 HGG-Präparation der Firma SERVA, Heidelberg.3 HGG preparation from SERVA, Heidelberg.
4 Sekretorische Komponente des IgA.4 Secretory component of IgA.
5 Standard-K-bzw. -lambda-Präparation der Behringwerke AG, Marburg.5 standard K resp. lambda preparation of Behringwerke AG, Marburg.
Mischungen von mehreren Bence-Jonss-Proteinen.Mixtures of several Bence-Jonss proteins.
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- 1983-09-08 DD DD25465283A patent/DD230883B1/en not_active IP Right Cessation
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |