DD243184A3 - Process for the preparation of monoclonal antibodies for L chains - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer L-Ketten der humanen Immunglobuline. Es ist das Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper ermoeglicht, die in der Lage sind, mit Determinanten von L-Ketten aller humanen Immunglobulinklassen sowohl im isolierten als auch im H-kettengebundenen Zustand sowie mit membrangebundenem Immunglobulin der B-Lymphozyten zu reagieren. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst Hybridome zu erzeugen, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. In folgenden Verfahrensschritten sollen dann monoklonale Antikoerper der gewuenschten Art hergestellt werden. Die Aufgabe wird geloest durch die Herstellung der Hybridome H-BL-Ig-L/1 und H-BL-Ig-L/2 und deren Kultivierung in vitro und in vivo.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies for L chains of human immunoglobulins. It is the object of the invention to provide a process for the production of monoclonal antibodies which in an easily controllable manner enables the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies capable of having determinants of L chains of all human immunoglobulin classes in both the isolated and the human immunoglobulin classes H-linked state and to react with membrane bound immunoglobulin of B lymphocytes. The object is seen in the first to produce hybridomas that are easy and inexpensive to handle and their cultivation is technically and economically advantageous manner possible. In the following process steps then monoclonal antibodies of the desired type are to be produced. The object is achieved by the production of the hybridomas H-BL-Ig-L / 1 and H-BL-Ig-L / 2 and their cultivation in vitro and in vivo.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, mit den leichten Ketten humaner Immunglobuline zu reagieren.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of reacting with the light chains of human immunoglobulins.
Es ist bereits bekannt, spezifische Antiseren für die L-Ketten humaner Immunglobuline herzustellen und diese für die qualitative und quantitative Bestimmung von Immunglobulin in Seren oder anderen biologischen Flüssigkeiten sowie für den Nachweis und die Quantifizierung von immunglobulinpositiven B-Lymphozyten zu verwenden. Die konventionellen Methoden der Herstellung von Anti-L-Ketten-Antikörpem haben die Nachteile, daß die Antikörper von Tier zu Tier, ja sogar von Blutentnahme zu Blutentnahme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, daß sie dadurch nicht reproduziert und standardisiert werden können, daß eine Absorption mit Lebertrockenpulver und verschiedenen Zellarten notwendig ist, um unspezifische Begleitantikörper zu entfernen und daß trotzdem bei ihrem Einsatz zum Nachweis von Membranimmunglobulin noch unspezifische Bindungen an die Fc-Rezeptoren von Lymphozyten und Monozyten vorkommen. Der letzte Nachteil kann durch die aufwendige und kostspielige Präparation von (Fab)2-Fragmenten zwar elimiert werden, jedoch ist für eine Routineanwendung dieses Verfahren insgesamt zu teuer. jIt is already known to prepare specific antisera for the L chains of human immunoglobulins and to use these for the qualitative and quantitative determination of immunoglobulin in sera or other biological fluids as well as for the detection and quantitation of immunoglobulin-positive B lymphocytes. The conventional methods of producing anti-L chain antibodies have the disadvantages that the antibodies have different properties from animal to animal, even from blood collection to blood collection, that they can not be reproduced and standardized by absorption with liver dry powder and different types of cells is necessary in order to remove unspecific accompanying antibody and that nevertheless still occur non-specific binding to the F c receptors of lymphocytes and monocytes when they are used for the detection of membrane immunoglobulin. Although the last disadvantage can be eliminated by the costly and costly preparation of (Fab) 2 fragments, this procedure is generally too expensive for routine use. j
Es sind aber monoklonale Antikörper bekannt geworden, die mit verschiedenen Differenzierungsantigenen von humanen Lymphozyten reagieren. Zur Bestimmung der immunglobulinpositiven B-Lymphozyten werden jedoch weiterhin konventionelle Antiseren genutzt. Das hat seine Ursache mit hoher Wahrscheinlichkeit darin, daß keine hinreichend produktiven Hybridome bekannt sind, die monoklonale Antikörper mit Spezifität für die L-Ketten der humanen Immunglobuline sezemieren.However, monoclonal antibodies have become known which react with different differentiation antigens of human lymphocytes. For the determination of immunoglobulin-positive B-lymphocytes, however, conventional antisera are still used. This is most likely due to the lack of sufficiently productive hybridomas that secrete monoclonal antibodies specific for human immunoglobulin L chains.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper ermöglicht, die in der Lage sind, mit Determinanten von L-Ketten humaner Immunglobulinklassen im isolierten und im H-kettengebundenen Zustand zu reagieren.The object of the invention is to provide a process for the production of monoclonal antibodies which allows, in an easily controllable manner, the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies capable of reacting with determinants of L chains of human immunoglobulin classes in the isolated and in the H-linked Condition to respond.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafterweise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms sollen im folgenden Verfahrensschritt monoklonale Antikörper hergestellt werden, die spezifisch für die L-Ketten aller humaner Immunglobulinklassen sind. Dabei soll gleichbleibende Qualität der Antikörper gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein.The invention has for its object to provide a traceable process available, in the course of which a hybridoma is first generated, which is easy and inexpensive to handle and its cultivation is technically and economically advantageously possible. Using this hybridoma, monoclonal antibodies specific for the L chains of all human immunoglobulin classes are to be prepared in the following process step. The aim is to ensure constant quality of the antibodies, the antibody should be stable and storable.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst eine Immunglobulinfraktion nach den an sictr bekannten Verfahren der Aussalzung und der Ionenaustauscher!romatographie aus dem Serum gesunder Blutspender präpariert wird. Mit derart gereinigtem humanen IgG werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens, wobei die erste Immunisierung als Emulsion des Antigens mit komplettem Freundschen Adjuvans vorgenommen wird. 4 Tage vor der Entnahme der Milzlymphozyten für die Ausführung der Zellfusion erhalten die Mäuse eine i. v. Injektion von jeweils 200 μg humanem IgG.The object is achieved according to the invention by first preparing an immunoglobulin fraction from the serum of healthy blood donors according to the methods of salting out and ion exchange chromatography which are known from sictr. With such purified human IgG, mice are immunized according to the invention. Preferably 6 to 8 week old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen, wherein the first immunization is carried out as an emulsion of the antigen with Freund's complete adjuvant. 4 days before the removal of the spleen lymphocytes to perform the cell fusion, the mice receive an i.v. v. Injection of 200 μg each human IgG.
Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-BN-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63Ag 8.-653 (KEARNEY et al., J. Immunol, 123 [1979], 1548) werden im RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin undThymidin enthält (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgG reagieren. Anschließend werden die Hybridzellkulturen ausgewählt, die äußer mit IgG auch mit IgM, IgA, IgE, IgD sowie isolierten kappa- und lambda-Ketten reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik, wobei die einzelnen Antigene an Plastoberflächen adsorbiert werden und die gebundenen Hybridomantikörper durch 125J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper nachgewiesen werden.From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse BN myeloma cells. The necessary mouse B myeloma cells P3-X-63Ag 8.-653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123 [1979], 1548) are grown in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, a cell clone is selected which secretes antibodies of the desired kind. The selection of the hybridoma is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200-pl cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react with human IgG. Subsequently, the hybrid cell cultures are selected which react externally with IgG also with IgM, IgA, IgE, IgD and isolated kappa and lambda chains. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique, wherein the individual antigens are adsorbed on plastic surfaces and the bound hybridoma antibodies are detected by 125 I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies.
Nur Hybridome, deren Antikörper mit allen genannten Immunoglobulinen reagieren, werden mittels indirekter Immunfluoreszenz geprüft, ob sie auch mit den L-Kettendeterminanten von membrangebundenem Immunglobulin der B-Lymphozyten reagieren.Only hybridomas whose antibodies react with all of the above-mentioned immunoglobulins are tested by indirect immunofluorescence whether they also react with the L-chain determinants of membrane bound immunoglobulin of B lymphocytes.
Dazu werden mononukleare Blutzellen, separierte B-Lymphozyten und T-Lymphozyten sowie adhärierende Zellen (Monozyten) eingesetzt. Hierdurch wird abgesichert, daß die Antikörper zur spezifischen Erkennung von membrangebundenes Immunglobulin tragenden B-Lymphozyten geeignet sind und keine zufällige Kreuzreaktivität mit einer Determinante von T-Lymphozyten oder Monozyten besteht.For this purpose, mononuclear blood cells, separated B lymphocytes and T lymphocytes and adherent cells (monocytes) are used. This ensures that the antibodies are suitable for the specific recognition of membrane-bound immunoglobulin-bearing B lymphocytes and that there is no random cross-reactivity with a determinant of T lymphocytes or monocytes.
Durch diese Selektionsschritte werden Hybridome H-BL-lg-L/1 und 2 erhalten, die rekloniert werden und dadurch Subklone selektioniert werden, die stabil monoklonale Antikörper produzieren, die zur Erkennung von immunglobulintragenden humanen B-Lymphozyten geeignet sind.These selection steps yield hybridomas H-BL-Ig-L / 1 and 2, which are recloned to select subclones that stably produce monoclonal antibodies suitable for detecting immunoglobulin-bearing human B lymphocytes.
Die auf die vorstehend geschilderte Weise erhaltenen Hybridome H-BL-IgL sind durch die überraschende, vorteilhafte Eigenschaft charakterisiert. Antikörper zu seziernieren, die humane immunglobulintragende B-Lymphozyten und die L-Ketten von Immunglobulin im isolierten Zustand, aber auch nach ihrer Bindung an schwere Ketten, erkennen. — Das Hybridom ist unaufwendig zu kultivieren und kann in üblicherweise, z.B. in flüssigem Stickstoff, aufbewahrt werden.The hybridomas H-BL-IgL obtained in the manner described above are characterized by the surprising advantageous property. To secrete antibodies that recognize human immunoglobulin-bearing B lymphocytes and immunoglobulin L chains in the isolated state, but also after their binding to heavy chains. The hybridoma is inexpensive to cultivate, and can be conveniently, e.g. in liquid nitrogen.
Zur Herstellung der Antikörper werden-frisch hergestellte oder aufgetaute Hybridome H-BL-Ig-L in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigem (NH4J2SO4 versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten.To prepare the antibodies, freshly prepared or thawed hybridomas H-BL-Ig-L are grown in mass culture culture medium supplemented with serum. After appropriate cultivation in a CO 2 -containing atmosphere, the culture medium now containing antibody is mixed with 50% saturated (NH 4 J 2 SO 4 and a gamma globulin fraction.
Weitere Reinigung der Antikörper ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographieFurther purification of the antibodies is by known methods such as gel filtration, ion exchange chromatography
o. dgl. möglich. Der derart erzeugte Antikörper BL-lg-L/1 gehört der IgGi Subklasse an. Der monoklonale Antikörper BL-lg-L/2 ist ein IgM und ist potentiell in der Lage, Komplement zu fixieren.o. The like. Possible. The antibody BL-Ig-L / 1 thus produced belongs to the IgGi subclass. The monoclonal antibody BL-Ig-L / 2 is an IgM and is potentially capable of fixing complement.
Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dubeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5-10"5M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.It is useful as culture medium MEM Eagle, Dubeccos MEM, RPMI or the like. apply. Particularly favorable is the use of RPMI-1640, which is mixed in a preferred embodiment of the invention with 1OmM HEPES, 5-10 " 5 M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin.
Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil an Kulturmedium von 5 bis 20%.As a serum supplement is fetal calf serum or horse normal serum with a proportion of culture medium of 5 to 20%.
Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35°C und 38°C.It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 ° C and 38 ° C.
Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten.It is advantageous to work at 37 ° C.
Der CGvGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.The CGv content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10%, especially 5%. The advantage is a high humidity, which can reach saturation of the atmosphere.
Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen.The cultivation of the hybridomas takes place over a customary period of several days. It is advisable to cultivate for 3 to 4 days.
Die monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 und BL-lg-L/2 weisen das folgende, in Tabelle 1 zusammengestellte Reaktionsmuster mit humanen Immunglobulinen auf, wie es durch indirekte Radiobindungstechnik (RBT) bestimmt wurde. Mit Blutzellen reagieren die beiden monoklonalen Antikörper in der in Tabelle 2 gezeigten Art und Weise, wie durch indirekte Immunfluoreszenz (ilF) nachgewiesen wird. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2 in histokompatible Ax Balb/c-Fi-Mäuse i.p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen,The monoclonal antibodies BL-Ig-L / 1 and BL-Ig-L / 2 have the following human immunoglobulin reaction pattern as shown in Table 1, as determined by indirect radio-linkage technique (RBT). With blood cells, the two monoclonal antibodies react in the manner shown in Table 2, as evidenced by indirect immunofluorescence (ilF). In another embodiment of the invention, the hybridoma H-BL-Ig-L / 1 or H-BL-Ig-L / 2 is grown in histocompatible Ax Balb / c-Fi mice i.p. injected. It is advantageous if the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. have been pretreated. After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-Ig-L / 1 or L / 2 is removed,
z. B. durch Funktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lg-L/1 bzw. L/2. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzz. L/2 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp das BL-lg-L/1 bzw. L/2 spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-lg-L/1 bzw. L/2 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.z. B. by function. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-Ig-L / 1 or L / 2. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-Ig-L / 1 bzz. L / 2 is used either directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like, which specifically enrich the isotype BL-Ig-L / 1 or L / 2, or methods of immunoadsorption, which include Isolate antibody BL-Ig-L / 1 or L / 2 antigen-specifically. The ascitic fluid contains 5 to 10 mg of BL-Ig-L / 1 or L / 2 per ml of liquid in the process according to the invention. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.
Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH4)2SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH4HCO3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiertTo produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for. B. with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 solution and taken up in buffered saline. Dialyzing against NH 4 HCO 3 solution results in a lyophilizable product that is lyophilized
bei +4CC haltbar ist. iat +4 C C is stable. i
Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments.
1. Ausführungsbeispiel1st embodiment
Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10Bbis5 107 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden Fi-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum i.p. 2 Wochen vorder Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of the hybridoma H-BL-Ig-L / 1 or H-BL-Ig-L / 2, which are optionally precultivated in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 10 B to 5 × 10 7 live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice. As histocompatible mice Fi hybrids of strains A and Balb / c are used, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before Hybridominjektion.
Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the monoclonal antibody BL-Ig-L / 1 and L / 2, respectively, are separated by centrifugation into cellular components and into ascites fluid.
Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lg-L/1 bzw. L/2. Diese Hybridzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p. injiziert werden. Solche Passungen sind wiederholt möglich.The cellular portion consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-Ig-L / 1 or L / 2. These hybrid cells are washed with saline and used as described above by loading i.p. into histocompatible mice. be injected. Such fits are possible again.
Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH4I2SO4 präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated with 50% saturated (NH 4 I 2 SO 4 and taken up in buffered saline.
Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH4HCO3-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper BL-lg-L/1 bzw. L/2 sind lyophilisiert bei +40C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.This solution is dialyzed against 0.5% NH 4 HCO 3 solution. Subsequently, the lyophilization takes place. The antibodies BL-Ig-L / 1 or L / 2 are lyophilized at +4 0 C preserved without loss of binding properties.
Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von PVC-Mikrotiterplatten, die mit isolierten humanen L-Ketten oder IgG beschichtet sind, ermittelt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung des monoklonalen Antikörpers angegeben, bei der 50% der radiomarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper, die bei maximaler Sättigung mit beiden Antikörpern angelagert sind, gebunden werden.The antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-link technique using PVC microtiter plates coated with isolated human L chains or IgG. The titre is the maximum dilution of the monoclonal antibody that binds to 50% of the radiolabeled anti-mouse immunoglobulin antibodies that are attached to both antibodies at maximum saturation.
2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment
Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-lg-L/1 bzw. H-BL-lg-L/2 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 · 105 Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.Hybridoma cells H-BL-Ig-L / 1 or H-BL-Ig-L / 2 stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5x10 5 cells per ml of culture medium and cultured in appropriate tissue culture flasks.
Das Kulturmedium besteht aus RPMM 640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mecaptoethanol (5 x 10"5M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.The culture medium consists of RPMM 640, which is supplemented with sodium bicarbonate (2g / l), mercaptoethanol (5 x 10 "5 M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (1OmM).
Dieses Medium wird mitThis medium comes with
a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or
b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum
supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.
Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +370C in einer wassergesättigten 5%igenCC>2-Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells are incubated at +37 0 C in a water-saturated 5% igenCC> 2 atmosphere.
Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.
Die zellfreien Kulturüberstände enthalten die monoklonalen Antikörper BL-lg-L/1 bzw. BL-lg-L/2. Die Konzentration der Antikörper BL-lg-L/1 bzw. BL-lg-L/2 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von B-Lymphozyten (wie z.B. indirekte Immunfluoreszenz, enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibodies BL-Ig-L / 1 and BL-Ig-L / 2, respectively. The concentration of the antibodies BL-Ig-L / 1 and BL-Ig-L / 2, respectively, is sufficient for the usual diagnostic detection methods of B-lymphocytes (such as indirect immunofluorescence, enzyme immunological detection, radio-binding techniques).
Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Immunfluoreszenz oder Radiobindungstechnik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer may be determined by a suitable technique (eg, indirect immunofluorescence or radio-bound technique.) High titer culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.
Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The gamma globulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).
Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Perdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCL-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or perdeserum-derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and isolated again from this immunoadsorbent by gently acting desorbents (3 M KSCN or glycine / HCl buffer pH 2.8) become.
Antigen RBT(I)11 Antigen RBT (I) 11
BL-lg-L/1 BL-lg-L/2BL-lg-L / 1 BL-lg-L / 2
Isolierte L-KettenIsolated L chains
isolierte k-Ketteisolated k-chain
isolierte λ-Ketteisolated λ chain
IgGIgG
IgMIgM
IgAIgA
IgD21 IgD 21
IgE3'IgE 3 '
isolierte y-Kette - -isolated y-chain - -
isolierte μ-Kette - -isolated μ-chain - -
1 Bindungsindex I = lpm BL-lg-L/lpm BL-DNP(IgGD I > 10: +++, <10>4: ++, <4< 1,5: +, <1,5: 1 binding index I = lpm BL-Ig-L / lpm BL-DNP (IgGD I> 10: +++, <10> 4: ++, <4 <1.5: +, <1.5:
2 Myelomprotein igOwh 2 myeloma protein igOwh
3 Myelomprotein lgEND 3 myeloma protein IgE ND
Subjektive Bewertung der Fluoreszenzintensität von +++ bis — 2 MitSchaferythrozyten rosettenbildende Lymphozyten (E+-Zellen) 3E- negative LymphozytenSubjective evaluation of the fluorescence intensity of +++ to - 2 MitSchaferythrozyten rosette forming lymphocytes (E + cells) 3 E negative lymphocytes
Die Hybridome H-BL-lg-L/1 und H-BL-lg-L/2 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig verfügbar.The hybridomas H-BL-Ig-L / 1 and H-BL-Ig-L / 2 are available from the Life Sciences Section of the Karl Marx University in Leipzig.
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