DD230884A1

DD230884A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMAN IGG

Info

Publication number: DD230884A1
Application number: DD25465383A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Cornelia Metschurin; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer IgG. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer humanes IgG gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst ein Hybridom zu selektionieren, das den entsprechenden monoklonalen Antikoerper produzieren kann. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll der entsprechende Antikoerper in technisch einfacher Weise herstellbar sein. Die Aufgabe wird geloest durch die Selektionierung, Klonierung, Reklonierung und Subklongewinnung des Hybridoms H-BL-IgG/1 und dessen Kultivierung in vitro oder in vivo.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies for IgG. It is the object to provide a method of producing monoclonal antibodies which allows, in an easily controllable manner, the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies to human IgG. The object is seen, first to select a hybridoma that can produce the corresponding monoclonal antibody. Using this hybridoma, the corresponding antibody should be producible in a technically simple manner. The object is achieved by the selection, cloning, recloning and subclone production of the hybridoma H-BL-IgG / 1 and its cultivation in vitro or in vivo.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, spezifisch mit humanem IgG zu reagieren.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of specifically reacting with human IgG.

Characteristic of the known technical solutions

IgG ist das dominierende humorale Immunglobulin des Menschen. Die Konzentrationsbestimmung von IgG ist mittels konventionell hergestellter Antiseren bei Anwendunc/einfacher analytischer Methoden möglich. Die verwendeten konventioneilen Antiseren weisen jedoch eine Reihe von Nachteilen auf, die ihre Einsatzmöglichkeit einschränken. Zuerst ist die Unmöglichkeit festzustellen, Antiseren gleicher Qualität zu reproduzieren. Die Ursache dafür liegt in der heterogenen humoralen Immunantwort der Serumspendertiere begründet. Die Zusammensetzung der Antiseren, z. B. hinsichtlich der Frequenz unterschiedlich affiner Antikörpertypen, variiert von Versuchstier zu Versuchstier, ja selbst von einer Blutentnahme zur anderen bei demselben Serumspender. Die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion eines Antiserums bei einer endlichen gewinnbaren Antiserummenge limitiert eine Standardisierung solcher Antiseren. Monoklonale Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zellinie sezerniert werden, überwinden die Mängel der konventionellen Antiseren. Monoklonale Antikörper herzustellen ist bereits bekannt. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, [1975] 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper vom Typ BL-IgG sezemieren, d.h. Antikörper, die in der Lage sind zur Bestimmung von humoralem IgG zu dienen.IgG is the dominant human humoral immunoglobulin. The determination of the concentration of IgG is possible by means of conventionally prepared antisera using simple analytical methods. However, the conventional antisera used have a number of disadvantages that limit their use. First, it is impossible to reproduce antisera of equal quality. The reason for this lies in the heterogeneous humoral immune response of the serum donor animals. The composition of the antisera, z. As regards the frequency of different affine antibody types, varies from animal to laboratory animal, yes even from one blood sample to another at the same serum donor. The inability to accurately reproduce an antiserum with a finite amount of antiserum that can be recovered limits the standardization of such antisera. Monoclonal antibodies secreted by a permanently growing cell line overcome the shortcomings of conventional antisera. It is already known to produce monoclonal antibodies. Thus Köhler and Milstein (Nature 256, [1975] 495) have generated a hybrid cell line by fusion of antibody-forming cells with a permanently growing Plasmozytomlinie, which grows permanently and stable antibody secreted. This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. However, no hybridoma lines are known which secrete monoclonal antibodies of the BL-IgG type in high yield, i. Antibodies capable of detecting humoral IgG.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-IgG anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für humanes IgG gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einfachen und exakten Nachweistests für humorales IgG eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen humanen Immunglobulinen nicht vorkommen sollen.The invention aims to provide a method for producing a monoclonal antibody of the BL-IgG type, which in an easily controllable manner allows the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody for human IgG. It should be ensured consistent quality, the antibody should be stable and storable and are suitable for use in simple and exact detection tests for humoral IgG, cross-reactions with other human immunoglobulins should not occur.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper abzuwickeln, die für humanes IgG spezifisch sind. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daiS zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus dem Serum gesunder Spender isoliert wird, z. B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch lonenaustauschchromatographie an DEAE-ZeIIulose in an sich bekannter Weise reines IgG isoliert, mit dem erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3 —X —63Ag 8653 (KEARNEY et. al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper, die spezifisch mit Human-IgG reagieren, sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgG reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgG verwendet, das aus Serum gesunder Blutspender präpariert wird. Weitergezüchtet werden nur die Hybridome, die mit humanem IgG, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgM, IgA, IgD und IgE reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an eine gamma-kettenspezifische Determinante des IgG. Auf die geschilderte Weise wird ein Hybridom selektioniert, das die wertvolle Eigenschaft hat, Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgG reagieren. Das Hybridom wird kloniert und rekloniert, wodurch ein Subklon erhalten wird, der stabil und mit guter Ausbeute den entsprechenden monokionalen Antikörper sezerniert. Die so klonierten und stabilisierten Hybridome erhalten die BezeichnungThe invention has for its object to provide a method for producing monoclonal antibodies that are specific for human IgG. The method is intended to reproducibly produce antibodies of high affinity and specificity. The object is achieved according to the invention by first isolating an immunoglobulin fraction from the serum of healthy donors by methods known per se, eg. B. by salting out. Purified IgG is isolated from this immunoglobulin fraction by ion exchange chromatography on DEAE cellulose in a manner known per se, with which mice according to the invention are immunized. Preferably 6 to 8 week old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The necessary mouse B myeloma cells P3-X-63Ag 8653 (KEARNEY et al., J. Immunol., 123, [1979], 1548) are cultured in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, a cell clone is selected, the antibody specific for human IgG react, secreted. The selection of the hybridoma is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200-pl cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react with human IgG. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. The antigen used is human IgG, which is prepared from serum of healthy blood donors. Only the hybridomas that react with human IgG but not with human immunoglobulins of the isotypes IgM, IgA, IgD and IgE are further bred. The binding of the antibody is carried out on a gamma-chain-specific determinant of IgG. In the manner described, a hybridoma is selected that has the valuable property of producing antibodies that specifically react with human IgG. The hybridoma is cloned and recloned to give a subclone which stably and with good yield secretes the corresponding monoclonal antibody. The thus cloned and stabilized hybridomas receive the name

H-BL-IgG, speziell H-BL-lgG/1. ,.H-BL IgG, especially H-BL IgG / 1. .

Das Hybridom H-BL-IgGA kann nach an sich bekannten Verfahren eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden. Zur Herstellung des Antikörpers BL-IgGA wird das Hybridom H-BL-IgGZ₁ in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CCVhaltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ versetzt und eine Gammagiobulinfraktion erhalten.The hybridoma H-BL-IgGA can be frozen according to methods known per se and stored on liquid nitrogen. For the production of the antibody BL-IgGA, the hybridoma H-BL-IgGZ _{1 is} cultivated in a culture medium supplemented with serum in mass culture. After appropriate cultivation in a CCV-containing atmosphere, the now antibody-containing culture medium is mixed with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄ and a gamma-biobuline fraction.

Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographieFurther purification of the antibody is known per se methods such as gel filtration, ion exchange chromatography

o. dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonale Antikörper BL-IgGZ₁ gehört der IgG-Klasse an und kann lyophilisiert werden.o. The like. Possible. The monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ thus produced belongs to the IgG class and can be lyophilized.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI ο. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10~⁵M Mercaptoethanol, lOOmgZI Centamycin versetzt ist.It is expedient, as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI o. to apply. Particularly favorable is the use of RPMI-1640, which is added in a preferred embodiment of the invention with 1OmM HEPES, 5 · 10 ~ ⁵ M mercaptoethanol, lOOmgZI centamycin.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%.As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20%.

Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰C und 38°C.It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 ⁰ C and 38 ° C.

Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu arbeiten.It is advantageous to work at 37 ⁰ C.

Der CCVGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.The CCV content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10%, in particular 5%. It is advantageous to have a high level of humidity, which should extend to the saturation of the atmosphere.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend ist ein teilweiser Kulturmedium-wechsel notwendig. Dabei ist erneut die optimale Zelldichte einzustellen.The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is advisable to cultivate for 3 to 4 days. Subsequently, a partial culture medium change is necessary. Here, the optimal cell density is again set.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-IgGZ₁ in histokompatible A χ Balb/C-FrMäuse i.p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZ₁. Es wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-lonenaustauschromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-IgGZi (IgG) spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-IgGZ₁ antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg BL-IgGZi pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.In a second embodiment of the invention, the hybridoma H-BL-IgGZ _{1 is} injected ip into histocompatible A Balb / C mice. It is advantageous if the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. have been pretreated. After ascites formation, which becomes visible as a result of swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ is removed, e.g. B. by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-IgGZ ₁ . It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like. in question, which specifically accumulate the isotype of the BL-IgGZi (IgG), or immunoadsorption methods that antigen-specific isolate the antibody BL-IgGZ ₁ . The ascitic fluid contains 5 to 10 mg BL-IgGZi per ml of liquid in the process according to the invention. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Assitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCC>3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4X haltbar ist. Der so hergestellte monoklonale Antikörper weist das in Tabelle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immunglobulinen aufTo produce a stable storage form, which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free liquid Assites is precipitated, for example, with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution and taken up in buffered saline. Dialyzing against NH ₄ HCC> 3 solution results in a lyophilizable product that is lyophilized at + 4X. The monoclonal antibody produced in this way has the binding pattern with human immunoglobulins documented in Table 1

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail below with reference to two exemplary embodiments.

1. Ausführungsbeispiel1st embodiment

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-IgGZ₁ werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2gZI), Mercaptoethanol (5 χ 10"⁵M), Gentamycin (lOOmgZI) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansuifonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mitHybridoma cells H-BL-IgGZ ₁ stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 χ 10 ⁵ cells per ml of culture medium and cultured in appropriate tissue culture flasks. The culture medium consists of RPMI-1640 supplemented with sodium bicarbonate (2gZI), mercaptoethanol (5 χ 10 ^"5 M), gentamycin (lOOmgZI) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethansuifonsäure (1OmM) is added. This medium is supplemented with

a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or

b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells at +37 ⁰ C in a water-saturated 5% CO ₂ atmosphere are incubated strength.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zu Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used to sow in new culture vessels.

Die zellfreien Kulturbestände enthalten die monoklonalen'Antikörper BL-IgGZ₁. Die Konzentration des Antikörpers BL-IgGZi ist ausreichend für diagnostische Nachweisverfahren von Human-IgG (wie z. B. enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).The cell-free culture stocks contain the monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ . The concentration of the antibody BL-IgGZi is sufficient for diagnostic detection of human IgG (such as enzyme immunological detection, radio linkage techniques).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z.B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturiiberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer may be determined by a suitable technique (e.g., indirect radio-link technique). High titer culture stocks allow dilution to the desired working concentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobuiinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The Gammaglobuiinfraktion thus obtained can be further purified by other known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmungiobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3M KSCN oder GlycinZHCL-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or horse serum-derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immuno-biulin antibodies and isolated again from this immunoadsorbent by gently acting desorbents (3M KSCN or glycineZHCL buffer pH 2.8).

2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZi, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperiteneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A und BaIbZc eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of the hybridoma H-BL-IgGZi, which are optionally pre-cultured in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 10 ⁵ to 5 x 10 ⁷ live cells are intraperitoneally injected into histocompatible mice. As histocompatible mice are used F _r hybrids of strains A and BaIbZc which have been treated with a Tumorstimulator, here with 0.5 ml paraffin oil ip 2 weeks before Hybridominjektion.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-IgGZ₁ enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascitic fluids containing the monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ are separated by centrifugation into cellular components and ascites fluid.

Der zellul&re Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-IgGZv Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p.The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-IgGZv. These hybridoma cells are washed with physiological saline solution and used as described above, by injecting histocompatible mice i.p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.be injected. Such passages are possible repeatedly.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-IgGZ₁ ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄ and taken up in buffered saline solution.) This solution is dialyzed against 0.5% NH ₄ HCO ₃ solution, followed by lyophilization IgGZ ₁ is lyophilized at +4 ⁰ C without loss of binding properties.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.The antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-link technique.

Table 1

Reaktion des monoklonalen Antikörpers BL-IgGZ₁ mit humanem Immunglobulin bzw. deren Polypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.Reaction of the monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ with human immunoglobulin or its polypeptide chains by means of indirect radio-linkage technology.

Numerical values

Antigenantigen

IgG²' IgGWIgG ² 'IgGW

igG2_Bu lgG2waiigG2 _Bu lgG2wai

lgM(K)_Loh lgM(\)_Pra lgM (K) _Loh lgM (\) _Pra

IgD(K)₁ IgD(X)₁, lgE(K)_y4 IgE(X)ND K-Kette⁴¹ ' X-Kette⁴¹ IgD (K) ₁ IgD (X) ₁ , IgE (K) _y4 IgE (X) ND K chain ⁴¹ 'X chain ⁴¹

1) Zur Testung des monoklonalen Antikörpers auf seine Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in Mikrotiterplatten aus PVC, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden dann durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen Antikörpers BL-IgGA zu der des monoklonalen Antikörpers BL-DNP/II, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern.1) To test the monoclonal antibody for its reaction with the corresponding antigens, the antibodies were incubated in PVC microtiter plates coated with the appropriate antigens. The bound monoclonal antibodies were then detected by ¹²⁵ I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies. The binding index I corresponds to the ratio of the count rate of the bound antibody BL-IgGA to that of the monoclonal antibody BL-DNP / II, which serves as a control for nonspecific binding after development with ¹²⁵ I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies.

l> 10: +++, 10 > l>4: ++,4 > I > 2:+, K 2:-.l> 10: +++, 10> l> 4: ++, 4> I> 2: +, K 2: -.

2) Humangammaglobulin der Firma SERVA, Heidelberg.2) human mammalian globulin from SERVA, Heidelberg.

3) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.3) The indices indicate the origin of the myeloma proteins from corresponding patients.

4) Standard κ- bzw. λ-Präparationen der Behringwerke AG, Marburg. Mischungen von mehreren Bance-Jones-Proteinen.4) Standard κ and λ preparations of Behringwerke AG, Marburg. Mixtures of several Bance Jones proteins.

Claims

Invention claim:

A process for producing monoclonal antibodies to human IgG, which comprises immunizing mice with human IgG, hybridizing the hyperglycemic spleen lymphocytes of the hyperimmune mice, selecting hybridoma cells H-BL-IgGA, culturing the selected hybridoma cells or injecting them into mice containing Obtained ascitic fluid and the antibody BL-IgGZ _{1 is} isolated.

2. The method according to item 1, characterized in that 6 to 8 weeks old female Α mice are used for immunization.

3. Method according to item 1, characterized in that those of the line P3 - X - 63Ag 8653 were used as myeloma cells.

4. The method according to item 1 and 2, characterized in that the immunization of the mice is carried out by a series of injections with the human IgG.

5. The method according to item 1,2,4, characterized in that the last immunization 4 days before the isolation of the determined for the hybridization B-lymphocytes is made.

6. Method according to items 1 to 3, characterized in that the ratio of myeloma cells and B lymphoblasts intended for fusion is about 1: 1.

7. The method according to item 1,3,6, characterized in that in the step of separating the unhybridized myeloma cells from the hybrid cells, the culture medium used contains spleen cells of non-immunized A χ BaIbZc-F ₁ hybrid mice.

8. The method according to item 1, characterized in that the examination of the supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells on the presence of antibodies which react with the γ-chain, and thus the selection of suitable hybridomas H-BL-IgG determined by indirect Radio-linkage technique or monoclonal PAP technique using IgG prepared from the serum of normal donors, and the detection of non-reacting with a series of human immunoglobulins of the isotypes IgM, IgA, IgD and IgE is performed.

9. The method according to item 1, characterized in that the hybridoma H-BL-IgGA is selected, cloned, recloned and that a subclone is selected which stably produces antibody BL-IgGZ ₁ .

10. The method according to item 1, characterized in that antibody-producing hybridoma cells of the hybridoma H-BL-IgGA are grown in a culture medium in mass culture, wherein the culture medium, a serum is added, after appropriate cultivation in CO ₂ -containing atmosphere, the now antibody-containing culture medium 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO _{4 is} added and a gamma globulin fraction is obtained from which the monoclonal antibody is isolated after further workup in a conventional manner.

11. The method according to item 1 and 10, characterized in that as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMIo. Like. Is used.

12. The method according to item 1 and 10 to 11, characterized in that is used as the culture medium RPMI-1640.

13. The method according to item 1 and 10 to 12, characterized in that the culture medium 1OmM HEPES, 5 x 10 " ⁵ M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin be added.

14. The method according to item 1 and 10 to 13, characterized in that are used as serum fetal calf serum or normal horse serum.

15. The method according to item 14, characterized in that the proportion of fetal calf serum in the culture medium is about 10%, that of the horse normal serum is also about 10%.

16. The method according to item 1 and 10 to 15, characterized in that the cultivation temperature is 25 to 40 ° C.

17. The method according to item 1 and 10 to 16, characterized in that cultured at 37 ⁰ C.

18. The method according to item 1 and 10 to 17, characterized in that the CO ₂ content of the atmosphere over the culture medium is 2 to 10%.

19. The method according to item 1 and 10 to 18, characterized in that the CO ₂ content above the culture medium is 5%.

20. The method according to item 1 and 10 to 19, characterized in that above the culture medium high humidity prevails, which may extend to saturation of the atmosphere with water vapor.

21. The method according to item 1 and 10 to 20, characterized in that is cultivated for 3 to 4 days.

22. The method according to item 1, characterized in that the hybridoma BL-IgGZ _{1 is} injected ip in histocompatible A χ BALBZc-F ₁ mice, after ascites the ascites is removed, the cellular components are separated, the clear supernatant, the monoclonal antibody BL-IgGZ ₁ , either directly used further or subjected to purification and enrichment operations or even precipitation of the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid z. B. with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SGv solution, receiving the precipitate in buffered saline, dialyzed against dilute NH ₄ HCO ₃ solution and subsequent lyophilization in a permanent storage form is transferred.

23. The method according to item 1 and 22, characterized in that the separated cellular components, which consist mainly of cells of the hybridoma H-BL-IgGZ ₁ , washed with saline and can be injected again histocompatible mice.

24. The method according to item 1 and 22 to 23, characterized in that the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subiiquidum, Pristan o. The like. Be pretreated.

25. The method according to item 1 and 22 to 24, characterized in that a corresponding tumor stimulator is given 3 days to 6 weeks before the hybridoma injection.

26. The method according to item 1, characterized in that the lyophilized antibody BL-IgG is stored at +4 ⁰ C.