DD243185A3 - Process for the preparation of monoclonal antibodies to horseradish peroxidase - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer Meerrettichperoxidase. Das Ziel besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung einer Serie von monoklonalen Antikoerpern verschiedener Isotypen anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer Meerrettichperoxidase gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, in technisch einfacher Weise eine Serie entsprechender monoklonaler Antikoerper zu erzeugen. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst Hybridome erzeugt und selektioniert werden. Diese werden entweder in Naehrmedien kultiviert oder zur in-vivo-Kultur in syngene Maeuse injiziert, um monoklonale Antikoerper der Serie BL-POD/1-12 zu produzieren.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies to horseradish peroxidase. The aim is to provide a method for the production of a series of monoclonal antibodies of different isotypes, which in an easily controllable manner allows the cost-effective production of larger quantities of specific horseradish peroxidase antibodies. The object is seen to produce a series of corresponding monoclonal antibodies in a technically simple manner. The task is solved by first generating and selecting hybridomas. These are either cultured in wet media or injected into syngeneic mice for in vivo culture to produce series BL-POD / 1-12 monoclonal antibodies.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Meerrettichperoxidase binden, ohne deren Enzymaktivität zu hemmen.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies which specifically bind horseradish peroxidase without inhibiting their enzyme activity.
Es ist bekannt, Antiseren gegen Meerrettichperoxidase herzustellen. Solche Antiseren können zur immunologischen Ankopplung von Peroxidase an Antikörper einer beliebigen Spezifität benutzt werden (Sternberger, I.A. et al. J. Histochem. Cytochem. 18[197O] 315). Diese Technik ist heute hauptsächlich durch die Präparation von Peroxidase/Anti-Peroxidase-Antikörper (PAP)-Komplex weiterentwickelt worden (Bosmann, F. T. et al. Histochemistry 67 [1980] 243). In der Regel werden solche PAP-Komplexe mit Kaninchen-anti-Peroxidase-Antikörpern hergestellt. Dies ist von praktischer Bedeutung, weil die meisten Antiseren für die nachzuweisenden Antigene im Kaninchen präpariert werden. Es ist somit leicht möglich, diese Antikörper über einen Anti-Kaninchenimmunglobulin-Antikörper mit dem Kaninchen-PAP-Komplex zu koppeln, wodurch ein hochempfindliches Detektionssystem geschaffen wird.It is known to prepare antisera against horseradish peroxidase. Such antisera may be used for the immunological coupling of peroxidase to antibodies of any specificity (Sternberger, I.A. et al., J. Histochem., Cytochem., 18 [197O] 315). This technique has been developed today mainly by the preparation of peroxidase / anti-peroxidase antibody (PAP) complex (Bosmann, F.T. et al., Histochemistry 67 [1980] 243). As a rule, such PAP complexes are prepared with rabbit anti-peroxidase antibodies. This is of practical importance because most antisera for the antigens to be detected are prepared in the rabbit. Thus, it is readily possible to couple these antibodies to the rabbit PAP complex via an anti-rabbit immunoglobulin antibody, thereby providing a highly sensitive detection system.
Die Einführung von monoklonalen Antikörpern gegen eine Vielzahl von Antigenen, auch von Zelloberflächenantigenen, führt zu dem Wunsch, diese monoklonalen Antikörper mit dem PAP-Komplexzu koppeln. Da aber die meisten monoklonalen Antikörper von der Maus gewonnen werden, benötigt man auch Maus-anti-Peroxidase-Antikörper, um einen Maus-PAP-Komplex zu formieren. Nun ist die Maus aber ein ungeeignetes Spendertier für größere Serummengen, da in der Regel pro Tier nicht mehr als 1 ml Serum gewonnen werden kann. Die Herstellung von monoklonalen Maus-anti-Peroxidase-Antikörpern, die von der permanent wachsenden Zellinie produziert werden, würde ausreichend große Mengen dieser Antikörper zur Verfügung stellen.The introduction of monoclonal antibodies to a variety of antigens, including cell surface antigens, results in the desire to couple these monoclonal antibodies to the PAP complex. However, since most monoclonal antibodies are obtained from the mouse, mouse anti-peroxidase antibodies are also needed to form a mouse PAP complex. Now, however, the mouse is an unsuitable donor animal for larger amounts of serum, since usually no more than 1 ml of serum can be obtained per animal. The production of monoclonal mouse anti-peroxidase antibodies produced by the permanently growing cell line would provide sufficiently large quantities of these antibodies.
Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein(Natjre 256, [1975], 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper gegen Schaf erythrozyten sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Auch monoklonale Antikörper gegen Meerrettichperoxidase sind bekanntgeworden. Diese monoklonalen Mausantikörper gehören ausschließlich der Subklasse IgGI an (D.Y.Mason et al.: J.-Histochem. Sytochem.30, [1982] 1111-1122,T.Ternyck, J.Gregoireand S.Avrameas: J. Immunol. Methods 58, [1983] 109-118, EP 137 657). Zudem handelt es sich dabei um wenig produktive Hybridome (T. Ternynck et al.: J. Immunol. Methods 58, [1983] 109-118) bzw. es werden nur indirekte Daten genannt, die nicht die Produktivität der Hybridome besonders erwähnen. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die monoklonale Antikörper gegen Meerrettichperoxidase von anderen Isotypen (IgM, lgG2a, lgG2b, lgG3 oder IgA) in großer Menge sezernieren. Diese monoklonalen Antikörpersollen die Peroxidase mit hoher Affinität binden, ohne deren Enzymaktivität negativzu beeinflussen.It is already known to produce monoclonal antibodies. For example, Köhler and Milstein (Natjre 256, [1975], 495) have generated a hybrid cell line that fuses permanently and stably releases antibodies against sheep erythrocytes by fusing antibody-forming cells with a permanently growing plasmacytoma line. This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. Monoclonal antibodies to horseradish peroxidase have also become known. These monoclonal mouse antibodies belong exclusively to the subclass IgGI (DYMason et al .: J.-Histochem.Sytochem.30, [1982] 1111-1122, T.Ternyck, J. Gregoir and S. Avrameas: J. Immunol. [1983] 109-118, EP 137 657). Moreover, these are poorly productive hybridomas (T. Ternynck et al .: J. Immunol., Methods 58, [1983] 109-118) or only indirect data are mentioned which do not mention the productivity of the hybridomas in particular. However, no hybridoma lines are known which secrete monoclonal antibodies to horseradish peroxidase from other isotypes (IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 or IgA) in large quantities. These monoclonal antibodies are designed to bind the peroxidase with high affinity without adversely affecting their enzyme activity.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörperfür Meerrettichperoxidase, die unterschiedlichen Immunglobulinisotypen angehören, gestattet.The object of the invention is to provide a process for the production of monoclonal antibodies which, in an easily controllable manner, permits the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies to horseradish peroxidase belonging to different immunoglobulin isotypes.
Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, die Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein, eine ausreichende hohe Affinität zur Peroxidase aufweisen, ohne deren enzymatische Aktivität negativ zu beeinflussen und sich zur Isolierung von Meerrettichperoxidase eignen.It should be guaranteed consistent quality, the antibodies should be stable and storable, have a sufficient high affinity for peroxidase, without affecting their enzymatic activity and are suitable for the isolation of horseradish peroxidase.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Herstellungsverfahren für Antikörper anzugeben, die spezifisch mit Meerrettichperoxidase reagieren, wobei in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafterweise möglich ist. Unter Verwendung der so erzeugten Hybridome soll in anschließenden Verfahrensschritten eine Serie von monoklonalen Antikörpern erzeugt werden, deren Glieder spezifisch mit Meerrettichperoxidase reagieren.The invention has for its object to provide a production process for antibodies that react specifically with horseradish peroxidase, in the course of which first hybridomas are generated that are easy and inexpensive to handle and their cultivation is technically and economically advantageously possible. Using the hybridomas thus produced, a series of monoclonal antibodies whose members react specifically with horseradish peroxidase should be generated in subsequent process steps.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mäuse des Stammes A mit hochgereinigter Meerrettichperoxidase immunisiert werden. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Zur Immunisierung wurde Meerrettichperoxidase mit einer Reinheitszahl RZ größer als 2 verwendet, die affinitätschromatographisch an ConA-Sepharose aus Rohperoxidase (RZ 0,3) präpariert wird. Zur ersten Immunisierung wurde die Peroxidase mit kompletten Freundschen Adjuvans vermischt i.p. injiziert. Die weiteren Immunisierungen erfolgen ohne Adjuvansi.p. und i.v. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphoblasten dieses Zellgemisches werden mit Mausmyelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die verwendeten Mausmyelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immun. 123, [1979], 1548) werden in RPM11640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. Zweckmäßig wird bei der Fusionierung ein Verhältnis von Myelomzellen zu B-Lymphoblasten wie 1 zu 1 eingehalten. In einem Kulturmedium nach Littlefield (Science 145, [1964], 709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt, und es werden erfindungsgemäß jeweils Zellklone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Art produzieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200μΙ-ΚυΙίυτβη aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die Meerrettichperoxidase binden. Die Auswahl geeigneter Hybridome des Typs H-BL-POD erfolgt zweckmäßigerweise durch indirekte Radiobindungstechnik mit gereinigter Meerrettichperoxidase (RZ 2,2).The object is achieved in that mice of strain A are immunized with highly purified horseradish peroxidase. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. Horseradish peroxidase with a purity number RZ greater than 2 was used for the immunization, which was prepared by affinity chromatography on ConA-Sepharose from crude peroxidase (RZ 0.3). For the first immunization, the peroxidase was mixed with Freund's complete adjuvant i.p. injected. The further immunizations are carried out without Adjuvansi.p. and i.v. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B-lymphoblasts of this cell mixture are fused or hybridized with mouse myeloma cells. The mouse myeloma cells P3-X-63 Ag 8.653 used (Kearney et al., J. Immun. 123, [1979], 1548) are cultured in RPM11640 with 10% fetal calf serum (FCS). Appropriately, a ratio of myeloma cells to B lymphoblasts such as 1 to 1 is maintained in the fusion. In a culture medium according to Littlefield (Science 145, [1964], 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells, and according to the invention cell clones which produce antibodies of the desired species are selected in each case. The selection of the hybridomas is carried out in such a way that the cells are divided immediately after the fusion in a plurality of separate 200μΙ-ΚυΙίυτβη. The supernatants of cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies that bind horseradish peroxidase. The selection of suitable hybridomas of the type H-BL-POD is expediently carried out by indirect radio-linkage technique with purified horseradish peroxidase (RZ 2,2).
Dabei werden durch den Einsatz radiomarkierter Anti-Mausimmunglobulinisotypen-Seren (Anti-lgM, -IgA, -IgGI, -IgG 2b, -IgG 3) von vornherein Hybridome berücksichtigt, die auch andere Isotypen als die häufigen IgGI-Antikörper sezernieren. Die durch diese Selektion erhaltenen Hybridome der Serie H-BL-POD/1-12 werden rekloniert und Subklone werden selektioniert, die zur stabilen Produktion von Meerrettichperoxidase erkennenden Antikörpern geeignet sind. Es ist vorteilhaft, die derart selektionierten Hybridome in einem Doppelantikörpertest, bestehend aus Ziege-anti-Mausimmunglobin-Antikörpern und Hybridomantikörpern BL-POD/1-12 sowie Meerrettichperoxidase daraufhin zu prüfen, ob die monoklonalen Antikörper in der Lage sind, die Peroxidase zu präzipitieren, ohne ihre Enzym aktivität zu hemmen. Die Präzipitate können gewaschen werden und durch eine geeignete Substratumsetzung die enzymatische Aktivität der immunspezifisch abgetrennten Meerrettichperoxidase nachgewiesen werden. Alle monoklonalen Antikörper der Serie BL-POD/1-12 binden Peroxidase ohne eine Behinderung der Enzymaktivität. Die Komplexe aus Peroxidase und den einzelnen Antikörpern BL-POD/1-12 können durch Anti-Mausimmunglobulin präzipitiert werden. Der Nachweis der Bindung der monoklonalen Antikörper an Peroxidase sowie der Nachweis, daß die monoklonalen Antikörper Komplexe mit Peroxidase bilden, die durch ein Anti-Mausimmunglobulinserum präzipiert werden können, ohne die enzymatische Aktivität der Peroxidase zu blockieren, ist in Tabelle 1 dokumentiert. Ebenso kann der Isotyp der jeweiligen monoklonalen Antikörper dieser Tabelle entnommen werden. Die Hybridome H-BL-POD/1-12 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig verfügbar.By using radiolabeled anti-mouse immunoglobulin isotype sera (anti-IgM, IgA, IgGI, IgG 2b, IgG 3), hybridomas are considered from the outset that also secrete isotypes other than the frequent IgGI antibodies. The hybridomas of the H-BL-POD / 1-12 series obtained by this selection are recloned and subclones selected for stable production of horseradish peroxidase-recognizing antibodies are selected. It is advantageous to check the thus selected hybridomas in a double antibody test consisting of goat anti-mouse immunoglobin antibodies and hybridoma antibodies BL-POD / 1-12 and horseradish peroxidase to see if the monoclonal antibodies are able to precipitate the peroxidase, without inhibiting their enzyme activity. The precipitates can be washed and the enzymatic activity of the immunospecifically separated horseradish peroxidase can be detected by suitable substrate conversion. All BL-POD / 1-12 monoclonal antibodies bind peroxidase without interfering with enzyme activity. The complexes of peroxidase and the individual antibodies BL-POD / 1-12 can be precipitated by anti-mouse immunoglobulin. Detection of the binding of the monoclonal antibodies to peroxidase and the demonstration that the monoclonal antibodies form complexes with peroxidase which can be precipitated by an anti-mouse immunoglobulin serum without blocking the enzymatic activity of the peroxidase is documented in Table 1. Likewise, the isotype of the respective monoclonal antibodies can be taken from this table. The hybridomas H-BL-POD / 1-12 are available from the Life Sciences Section of Karl Marx University Leipzig.
Auf dem dargestellten Weg erhaltene Hybridomzellen der Serie H-BL-POD/1-12 werden in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH4)2SO4-Lösung versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Der jeweilige Antikörper kann sofort eingesetzt werden oder weiteren Reinigungs- und Anreicherungsverfahren unterzogen werden. iHybridoma cells of the H-BL-POD / 1-12 series obtained in the pathway shown are reared in culture medium supplemented with serum. After appropriate cultivation in a CO2-containing atmosphere, the culture medium now containing antibody is mixed with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 solution and a gamma globulin fraction is obtained. The respective antibody can be used immediately or subjected to further purification and enrichment procedures. i
Es ist vorteilhaft, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. einzusetzen. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640. Dem Kulturmedium kann 1OmM HEPES, 5 10"5M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.It is advantageous to use MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like as a culture medium. use. Particularly favorable is the use of RPMI-1640. The culture medium may 1OmM HEPES, 5 10 "5 M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin may be added.
Als Serumzusatz dient vorteilhaft fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum, am besten in einem Anteil am Medium von ca. 10%.The serum supplement used is preferably fetal calf serum or normal horse serum, preferably in a proportion of about 10% of the medium.
Die Kultivierung der Hybridome erfolgt vorteilhaft bei 37°C, der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium soll 2 bis 10% betragen, wobei hohe Luftfeuchtigkeit die Kultivierung besonders begünstigt. Die Serie der wie vorstehend beschriebenen hergestellten monoklonalen Antikörper ist geeignet, Meerrettichperoxidase zu binden, ohne deren Enzymaktivität zu beeinträchtigen. Daraus ergeben sich vielfältige Einsatzmöglichkeiten der Antikörper insbesondere in der klinischen Diagnostik. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend wird ein Teil des antikörperhaltigen Mediums geerntet und frisches Medium zugegeben. Dabei ist die optimale Zelldichte wieder neu einzustellen. *The cultivation of the hybridomas is advantageously carried out at 37 ° C, the CO 2 content of the atmosphere over the medium should be 2 to 10%, with high humidity especially favors the cultivation. The series of monoclonal antibodies prepared as described above is capable of binding horseradish peroxidase without affecting its enzyme activity. This results in a variety of possible uses of antibodies, especially in clinical diagnostics. The cultivation of the hybridomas takes place over a customary period of several days. It is advisable to cultivate for 3 to 4 days. Subsequently, part of the antibody-containing medium is harvested and fresh medium is added. The optimal cell density has to be readjusted. *
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die Hybridome H-BL-POD/1-12 in histokompatible A x Balb/c-Fr Mäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristän o.dgi. vorbehandelt worden sind. Nach einer Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den entsprechenden monoklonalen Antikörper aus der Serie POD/1-12 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Funktion.AusderAszitesflüssigkeitwerden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms H-BL-POD/1-12. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-AAdsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des jeweiligen BL-POD/1-12 spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-POD/1-12 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg des entsprechenden monoklonalen Antikörpers BL-POD/1-12 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.In a second embodiment of the invention, the hybridomas H-BL-POD / 1-12 are injected ip into histocompatible A x Balb / cF r mice. It is advantageous if the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristän o.dgi. have been pretreated. After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the corresponding monoclonal antibody from the POD / 1-12 series is withdrawn, e.g. By function of the excipient, the cellular components are separated, e.g. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the respective hybridoma H-BL-POD / 1-12. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the respective monoclonal antibody BL-POD / 1-12 is used either directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like, which specifically enrich the isotype of the respective BL-POD / 1-12, or immunoadsorption methods comprising the antibody BL-POD / 1 Isolate antigen-specifically. The ascitic fluid in the process according to the invention contains 5 to 10 mg of the corresponding monoclonal antibody BL-POD / 1-12 per ml of fluid. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.
Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B mit 50% gesättigter (NH4)2SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH4NCO3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +40C haltbar istTo produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for. B was taken up with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 solution and in buffered saline. Dialyzing against NH 4 NCO 3 solution results in a lyophilizable product which is lyophilized at + 4 0 C preserved
Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments.
Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-POD/1-12 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 x 10s Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.Hybrid nitrogen cells H-BL-POD / 1-12 stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 x 10 s cells per ml of culture medium and cultured in appropriate tissue culture flasks.
Das Kulturmedium besteht aus RPM11640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol {5 x 10"6M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.The culture medium consists of RPM11640 which with sodium bicarbonate (2g / l), mercaptoethanol {5 x 10 "6 M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (1OmM) is added.
Dieses Medium wird mit:This medium comes with:
a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or
b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum
supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.
Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37°Cin einer wassergesättigten 5%igen CO2-Atmosphäre bebrütet werden.The most favorable culture conditions are achieved when the cells are incubated at + 37 ° C in a water saturated 5% CO 2 atmosphere.
Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Mediunrversorgtund bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall may be re-supplied with fresh media and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.
Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12. Die Konzentration des jeweiligen Antikörpers BL-POD/1-12 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren. Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BL-POD / 1-12. The concentration of the respective antibody BL-POD / 1-12 is sufficient for the usual diagnostic detection methods. Optionally, the titer can be determined by a suitable technique. High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.
Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie. Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden. Werden hochgereinigte monoklonal Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The gammaglobulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.). If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or horse serum-derived accompanying proteins by immunoadsorption on carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and by gently acting desorbents (3 M KSCN or glycine / HCl buffer pH 2.8) of this immunoadsorbent be isolated again.
Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms aus der Serie H-BL-POD/1-12, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10s bis 5 · 107 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F,-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,4ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of a hybridoma from the series H-BL-POD / 1-12, which are optionally pre-cultured in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 10 s to 5 x 10 7 live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice. As histocompatible mice F, hybrids of strains A and Balb / c are used, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.4 ml Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before the hybridoma injection.
Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the respective monoclonal antibody BL-POD / 1-12 are separated by centrifugation into cellular components and into ascites fluid.
Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des entsprechenden Hybridoms H-BL-POD/1-12. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.The cellular portion consists predominantly of cells of the corresponding hybridoma H-BL-POD / 1-12. These hybridoma cells are washed with physiological saline and used as described above by injecting histocompatible mice i. p. be injected. Such passages are possible repeatedly.
Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH4J2SO4 präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH4HCO3-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper BL-POD/1-12 sind lyophilisiert bei +40C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH 4 J 2 SO 4 and taken up in buffered saline, dialyzed against 0.5% NH 4 HCO 3 solution, followed by lyophilization -POD / 1-12 are lyophilized at +4 0 C without loss of binding properties.
Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von peroxidasebeschichteten PVC-Mikrotiter-Platten und 125J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern bestimmt.Antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-linkage technique using peroxidase-coated PVC microtiter plates and 125 I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies.
Charakterisierung der monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 hinsichtlich ihres Isotypes, der Bindung an festphasengebundene Peroxidase und der Wirkung auf die enzymatische Aktivität des Enzyms nach Bindung an die monoklonalen AntikörperCharacterization of monoclonal antibody BL-POD / 1-12 in terms of its isotype, binding to solid phase-bound peroxidase and the effect on the enzymatic activity of the enzyme after binding to the monoclonal antibodies
1) Bindung an PVC-gebundene Meerrettichperoxidase, Entwicklung mit12Sl-markierten Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern1) Binding to PVC-bound horseradish peroxidase, development with 12S l-labeled goat anti-mouse immunoglobulin antibodies
2) Fällung der Peroxidase- Anti-Peroxidase — Komplexe (PAP) durch Anti-Mausimmunglobulin-Serum und Bestimmung der Enzymaktivität durch die Messung der Farbumsetzung nach Zugabe von o-Phenylendiamin/H202 2) Precipitation of the peroxidase-anti-peroxidase complexes (PAP) by anti-mouse immunoglobulin serum and determination of the enzyme activity by measuring the color conversion after addition of o-phenylenediamine / H 2 0 2
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