DD230879A1

DD230879A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMAN IGM

Info

Publication number: DD230879A1
Application number: DD25464783A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Reinhard Gruhn; Ingrid Behn; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11
Also published as: DD230879B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer Human-IgM. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer Human-IgM anzugeben, das die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualitaet gewaehrleistet sein, der Antikoerper soll stabil und lagerfaehig sein und sich zur einfachen und exakten Bestimmung von humanem IgM eignen. Die Aufgabe wird darin gesehen, Antikoerper hoher Affinitaet und guter Spezifitaet herzustellen. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst ein Hybridom erzeugt, selektioniert, kloniert und rekloniert wird, das in der Lage ist, Antikoerper fuer Human-IgM zu sezernieren. Mit Hilfe dieses Hybridoms wird in vivo oder in vitro der Antikoerper BL-IgM/1 hergestellt. Er ist spezifisch, stabil und lagerfaehig.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies for human IgM. It is the object to provide a method for producing monoclonal antibodies to human IgM, which allows the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody. The aim is to ensure consistent quality, the antibody should be stable and storable and suitable for the simple and accurate determination of human IgM. The object is to produce antibodies of high affinity and good specificity. The task is solved by first generating, selecting, cloning and recloning a hybridoma capable of secreting antibodies to human IgM. With the help of this hybridoma, the antibody BL-IgM / 1 is produced in vivo or in vitro. It is specific, stable and storable.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die in der Lage sind, humanes IgM spezifisch zu bilden.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of specifically forming human IgM.

Characteristic of the known technical solutions

Es ist bereits bekannt, konventionelle Antiseren gegen Human-lgM herzustellen. Diese Antiseren können zur Konzentrationsbestimmung von humoralen IgM und zur Bestimmung von Antikörpern der IgM-Klasse verwendet werden. Solche konventionellen Antiseren haben eine Reihe von Nachteilen. Dabei ist besonders die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion anzuführen, was eine Standardisierung nur begrenzt zuläßt. Die Ursache hierfür ist die äußerst heterogene humorale Immunantwort der Serumspendertiere. Die qualitative Zusammensetzung der Antiseren unterscheidet sich von Tier zu Tier, ja selbst von Blutabnahme zu Blutabnahme bei ein und demselben Individuum. Monoklonal Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zellinie gebildet werden, überwinden diesen Nachteil.It is already known to prepare conventional antisera to human IgM. These antisera can be used to determine the concentration of humoral IgM and to determine antibodies of the IgM class. Such conventional antisera have a number of disadvantages. It is particularly the impossibility of an exact reproduction lead, which allows a limited standardization. The reason for this is the extremely heterogeneous humoral immune response of the serum donor animals. The qualitative composition of the antisera differs from animal to animal, even from blood collection to blood sampling in the same individual. Monoclonal antibodies, which are formed by a permanently growing cell line, overcome this disadvantage.

Es ist bereits bekannt, monoklonaie Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, (1975) 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörpersezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonaie Antikörper vom Typ BL-IgM sezernieren, die spezifisch humanes IgM binden.It is already known to produce monoclonal antibodies. Thus Köhler and Milstein (Nature 256, (1975) 495) have generated a hybrid cell line by fusion of antibody-forming cells with a permanently growing plasmocytoma line, which is constantly growing and stably emitting antibodies. This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. However, no hybridoma lines are known which secrete in high yield monoclonal antibodies of the BL-IgM type, which specifically bind human IgM.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines mo'noklonalen Antikörpers des Typs BL-IgM anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem sensitiven und exakten Nachweistest für humanes IgM eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen Immunglobulinen nicht vorkommen sollen.The invention aims to provide a method for the production of a monoclonal antibody of the type BL-IgM, which allows in an easily controllable way, the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody. It should be ensured consistent quality, the antibody should be stable and storable and are suitable for use in a sensitive and accurate detection assay for human IgM, cross-reactions with other immunoglobulins should not occur.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die für humanes IgM spezifisch sind, abzuwickeln. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst in an sich bekannter Weise eine Immunglobulinf raktion aus dem Serum eines Patienten mit Waldenströms Makroglobulinämie isoliert wird, z. B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch tropfenweises Zugeben der Immunglobulinlösung in 2% Borsäure eine IgM-reiche Fraktion ausgefällt. Das Präzipitat wird in 0,1 M Tris/HCL-Puffer (pH 8,0) gelöst und durch Gelchromatographie an Sepharose 6B wird eine IgM-Präparation hergestellt.The invention has for its object to provide a method for producing monoclonal antibodies that are specific for human IgM to handle. The method is intended to reproducibly produce antibodies of high affinity and specificity. The object is achieved in that initially in a known manner an immunoglobulin raktion from the serum of a patient with Waldenströms macroglobulinemia is isolated, for. B. by salting out. From this immunoglobulin fraction, an IgM-rich fraction is precipitated by dropwise addition of the immunoglobulin solution in 2% boric acid. The precipitate is dissolved in 0.1 M Tris / HCl buffer (pH 8.0) and an IgM preparation is prepared by gel chromatography on Sepharose 6B.

Mit diesem IgM-Myelomprotein werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die 2. Immunisierung wird mit einem Waldenström-lgM vorgenommen, welches aus dem Serum eines anderen Patienten präpariert wird. Eine dritte Immunisierung wird wieder mit dem zuerst verwendeten Waldström- IgM durchgeführt. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-jul-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgM reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgM verwendet, das aus Serum von Patienten mit Waldenströms Makroglobulinämie präpariert wurde. Weitergezüchtet werden nur die Hybridome, die mit humanerem IgM, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgA, IgG, IgD, IgE reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an eine μ-kettenspezifische Determinante des IgM. — Auf die geschilderte Weise wird ein Hybridom selektioniert, das die wertvolle Eigenschaft hat. Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgM reagieren. Das Hybridom kann kloniertund rekloniert werden und ein Subklon wird erhalten, der stabil und mit guter Ausbeute die entsprechenden Antikörper sezerniert. Dieses Hybridom erhält die Bezeichnung H-BL-lgM/1. Es kann nach an sich bekanner Weise eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden.According to the invention, mice are immunized with this IgM myeloma protein. Preferably 6 to 8 week old female Α mice are used. The second immunization is done with a Waldenström IgM prepared from the serum of another patient. A third immunization is again performed with the first used Waldström IgM. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The necessary mouse B myeloma cells P3-X-63 Ag 8.653 (Keearney et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) are cultured in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (Littlefield, Science, 145, [1964], 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, a cell clone is selected which secretes antibodies of the desired kind. The selection of the hybridoma is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 μl cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react with human IgM. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. The antigen used is human IgM prepared from serum from patients with Waldenstrom's macroglobulinemia. Only the hybridomas that react with human IgM, but not with human immunoglobulins of the isotypes IgA, IgG, IgD, IgE, are bred. The binding of the antibody is carried out on a μ- chain-specific determinant of IgM. - In the manner described, a hybridoma is selected, which has the valuable property. To produce antibodies that specifically react with human IgM. The hybridoma can be cloned and recloned and a subclone is obtained which stably and with good yield secretes the corresponding antibodies. This hybridoma is named H-BL-IgM / 1. It can be frozen according to known manner and stored on liquid nitrogen.

Zur Herstellung des Antikörpers BL-lgM/1 wird das Hybridom H-BL-lgM/1 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen werden. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SCU versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonaie Antikörper BL-lgM/1 gehört der lgG2a-Klasse an und ist potentiell in der Lage, Komplement zu binden.For the production of the antibody BL-IgM / 1, the hybridoma H-BL-IgM / 1 will be grown in a culture medium supplemented with serum in mass culture. After appropriate cultivation in a CO ₂ -containing atmosphere, the culture medium now containing antibody is mixed with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SCU and a gamma globulin fraction is obtained Further purification of the antibody is possible according to methods known per se such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like. The monoclonal antibody BL-IgM / 1 thus produced belongs to the IgG2a class and is potentially capable of binding complement.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle; Duibeccos MEM, RPM! o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausfühfungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.It is convenient, as a culture medium MEM Eagle; Duibecco's MEM, RPM! o. Like. Apply. It is particularly favorable to use RPMI-1640, the ^"5 M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin is displaced in a preferred Ausfühfungsform the invention with 1OmM HEPES, 5 x 10 degrees.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35⁰C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37°C zu arbeiten.As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20%. It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 ⁰ C and 38 ° C. It is advantageous to work at 37 ° C.

DerCCVGehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.The CCV content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10%, especially 5%. It is advantageous to have a high level of humidity, which should extend to the saturation of the atmosphere.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend wird ein Teii des Kulturmediums erneuert. Dabei ist die optimale Zelldichte wieder neu einzustellen. ' ·The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is advisable to cultivate for 3 to 4 days. Subsequently, a Teii of the culture medium is renewed. The optimal cell density has to be readjusted. '·

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-lgM/1 in histokompatible A χ Balb/c-F_rMäuse i.p.In a second embodiment of the invention, the hybridoma H-BL-IgM / 1 is transfected into histocompatible A χ Balb / cF _r mice ip

injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl.injected. It is advantageous if the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan o. The like.

vorbehandelt worden sind.have been pretreated.

Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen,z.B. durch Punktion.After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-IgM / 1 is removed, e.g. by puncture.

Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen desHybridoms H-BL-lgM/1. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.From the ascites fluid, the cellular components are separated, e.g. by centrifuging. The cellular portion consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-IgM / 1. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-IgM / 1 is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography o.

dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-lgM/1 (lgG2a) spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-lgM/1 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg BL-lgM/1 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20mg/ml.Like. In question, which specifically accumulate the isotype of BL-IgM / 1 (IgG2a), or methods of immunoadsorption, which isolate the antibody BL-IgM / 1 antigen-specific. The ascitic fluid in the process according to the invention contains 5 to 10 mg BL-IgM / l per ml of fluid. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist. Der monoklonal Antikörper besitzt das in der Tabejle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immunglobulinen.To produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for example with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution and taken up in buffered physiological saline. Dialysing against NH ₄ HCO ₃ solution results in a lyophilizable product which is lyophilized at + 4 ⁰ C preserved. The monoclonal antibody has the binding pattern with human immunoglobulins documented in Tabejle 1.

Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail below by exemplary embodiments.

1. Ausführungsbeispiel ~ ~ ~~~~1st embodiment ~~~~~~

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-lgM/1 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und ingeeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 χ 10"⁵M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mitHybridoma cells H-BL-IgM / 1 stored on liquid nitrogen are thawed and washed twice with culture medium. The cell density is adjusted to 1-5 χ 10 ⁵ cells per ml culture medium and cultured in suitable tissue culture flasks. The culture medium consists of RPMI-1640 supplemented with sodium bicarbonate (2g / l), mercaptoethanol (5 χ 10 ^"5 M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (1OmM) is added. This medium comes with

a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or

b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igen CCV Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells strength at +37 ⁰ C in a water saturated atmosphere of 5% CCV are incubated.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenden Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1. Die Konzentration des Antikörpers BL-lgM/1 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von humanem IgM (wie z. B. enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BL-IgM / 1. The concentration of the antibody BL-IgM / 1 is sufficient for the usual diagnostic detection methods of human IgM (such as enzyme immunological detection, radio binding techniques).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer can be determined by a suitable technique (eg, indirect radio-link technique). High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The gamma globulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobin-Antikörpervon den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begieitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH 2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, they can be separated from the calf serum or horse serum-derived sympathetic proteins by immunoadsorption to carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies and by gently acting desorbents (3 M KSCN or glycine / HCl buffer pH 2.8) from this immunoadsorbent be isolated.

2. Ausführungsbeispiel:2nd embodiment:

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-lgM/1, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatibie Mäuse werden FrHybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Cells of the hybridoma H-BL-IgM / 1, which are optionally pre-cultured in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 10 ⁵ to 5 x 10 ⁷ live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice. The histocompatible mice used are Frybrids of strains A and Balb / c, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml of Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before hybridoma injection.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung wurden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-lgM/1 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice were punctured. The collected ascitic fluids containing the monoclonal antibody BL-IgM / 1 are separated by centrifugation into cellular components and ascites fluid.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-lgM/1. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i.p.The cellular portion consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-IgM / 1. These hybridoma cells are washed with saline and used as described above by loading i.p. into histocompatible mice.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.be injected. Such passages are possible repeatedly.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophiiisierung. Der Antikörper BL-lgM/1 ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄ and taken up in buffered saline, dialyzed against 0.5% NH ₄ HCO ₃ solution, followed by lyophilization -lgM / 1 is lyophilized at +4 ⁰ C without loss of binding properties.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.The antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-link technique.

Table 1

Reaktion des monoklonalen Antikörpers BL-lgM/1 mit humanen Immunglobulinen bzw. Polypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.Reaction of the monoclonal antibody BL-IgM / 1 with human immunoglobulins or polypeptide chains by means of indirect radio-linkage technique.

Antigen l¹⁾ Antigen l ¹⁾

lgM(A)_Pra ²⁾ ' · +++lgM (A) _Pra ²⁾ '· +++

lgM{K)_Loh + + +lgM {K) _Loh + + +

lgM(K)_Rom IgG³¹ lgM (K) _Rome IgG ³¹

I SriI Sri

igG2_Bu igG2 _Bu

lgG2wai lgG3_Tök IgAlgG2wai lgG3 _T eco IgA

Yu IgE(X) _ND Yu IgE (X) _ND

/(-Kette⁴¹ A-Kette⁴ / (- chain ⁴¹ A-chain ⁴

1) Zur Testung des monoklonalen Antikörpers BL-lgM/1 auf seine Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in PVC-Mikrotiterplatten, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden dann durch ¹²⁵J-markierte Anti-Maus-immunglobulin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des gebundenen Antikörpers BL-lgM/1 zu der des monoklonalen Antikörpers BL-DNP/II, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpem.1) In order to test the monoclonal antibody BL-IgM / 1 for its reaction with the corresponding antigens, the antibodies were incubated in PVC microtiter plates which had been coated with the corresponding antigens. The bound monoclonal antibodies were then detected by ¹²⁵ I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies. The binding index I corresponds to the ratio of the count rate of the bound antibody BL-IgM / 1 to that of the monoclonal antibody BL-DNP / II serving as a control for the non-specific binding after development with ¹²⁵ I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies.

2) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.2) The indices indicate the origin of the myeloma proteins from corresponding patients.

3) Humangammaglobulin der Firma SERVA, Heidelberg3) human mammalian globulin from SERVA, Heidelberg

4) Standard-A-bzw.-K-Präparationen der Behring-Werke AG, Marburg. Mischungen von mehreren Bence-Jones-Proteinen.4) Standard A or K preparations of Behring-Werke AG, Marburg. Mixtures of several Bence-Jones proteins.

Claims

_! _ 546 Inventions claim:

1. A method for the production of monoclonal antibodies to human IgM, characterized in that mice are immunized with human IgM, the spleen lymphocytes of hyperimmune mice are hybridized with myeloma cells, hybridoma cells H-BL-lgM / 1 are selected, the selected hybridoma cells cultured or in Mice are injected, ascites fluid recovered and the antibody BL-IgM / 1 is isolated.

2. The method according to item 1, characterized in that 6 to 8 weeks old female Α mice are used for immunization.

3. The method according to item 1, characterized in that those of the line P3-X-63Ag8.653 were used as myeloma cells.

4. The method according to item 1 and 2, characterized in that the immunization of the mice is carried out by a series of injections with the human IgM.

5. Method according to item 1,2,4, characterized in that the last immunization is carried out 4 days before the isolation of the B lymphocytes intended for hybridization.

6. The method according to item 1 to 3, characterized in that the ratio of myeloma cells and B-lymphoblasts, which are intended for fusion, about 1: 1.

7. The method of item 1,3,6, characterized in that in process step includes the separation of non-hybridized myeloma cells from the hybrid cells, the Kulurmedium used spleen cells from unimmunized A χ Balb / cF _r hybrid mice.

8. The method according to item 1, characterized in that the examination of the supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells on the presence of antibodies. Which react with the / n-chain, and thus determines the selection of suitable hybridomas H-BL-IgM, by indirect radio-linkage technique or monoclonal PAP technique using IgM myeloma proteins and IgM prepared from normal serum, and detecting non-reactivity with a series of human immunoglobulins of the isotypes IgG, IgA, IgD and IgE.

9. Method according to item 1, characterized in that the hybridoma H-BL-IgM / 1 is selected, cloned, recloned and that a subclone which stably produces antibody BL-IgM / 1 is selected.

10. The method according to item 1, characterized in that antibody-producing hybridoma cells of the hybridoma H-BL-IgM / 1 are grown in a culture medium in mass culture, wherein the culture medium, a serum is added, after appropriate cultivation in CO ₂ -containing atmosphere now containing the antibody Culture medium with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO _{4 is} added and a Gammaglobulin fraction is obtained, from which after further processing in a conventional manner the monoclonal antibody is isolated.

11. The method according to item 1 and 10, characterized in that as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI o. The like. Is used.

12. The method according to item 1 and 10 to 11, characterized in that is used as the culture medium RPMI-1640.

13. The method according to item 1 and 10 to 12, characterized in that the culture medium 1OmM HEPES, 5 x 10 " ⁵ M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin be added.

14. The method according to item 1 and 10 to 13, characterized in that are used as serum fetal calf serum or normal horse serum.

15. The method according to item 14, characterized in that the proportion of fetal calf serum in the culture medium is about 10%, that of the horse normal serum is also about 10%.

16. The method according to item 1 and 10 to 15, characterized in that the cultivation temperature is 35 to 38 ° C.

17. The method according to item 1 and 10 to 16, characterized in that cultured at 37 ° C.

18. The method according to item 1 and 10 to 17, characterized in that the CCV content of the atmosphere over the culture medium is 2 to 10%. "~

19. The method according to item 1 and 10 to 18, characterized in that the CO ₂ content above the culture medium is 5%.

20. The method according to item 1 and 10 to 19, characterized in that above the culture medium high humidity prevails, which may extend to saturation of the atmosphere with water vapor.

21. The method according to item 1 and 10 to 20, characterized in that is cultivated for 3 to 4 days.

22. The method according to item 1, characterized in that the hybridoma H-BL-IgM / 1 is injected into histocompatible A χ BALB / cF _r mice ip, after ascites the ascites is removed, the cellular components are separated, the clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-IgM / 1, either being used directly or undergoing purification and enrichment operations, or by precipitating the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid, e.g. B. with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution, receiving the precipitate in buffered saline, dialyzed against dilute NH ₄ HCO ₃ solution and subsequent lyophilization in a permanent storage form is transferred.

23. The method according to item 1 and 22, characterized in that the separated cellular components, which consist mainly of cells of the hybridoma H-BL-IgM / 1, washed with saline and can be injected again histocompatible mice ·.

24. The method according to item 1 and 22, characterized in that the mice used with a tumor stimulator such as paraffin subliquidum, pristane o. The like. Be pretreated.

25. The method according to item 1 and 22 to 24, characterized in that a corresponding tumor stimulator-3 days to 6 weeks before the Hybridominjekttion is given.

26. The method according to item 1, characterized in that the lyophilized antibody BL-IgM / 1 is stored at +4 ⁰ C.