DD230883A1

DD230883A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONARY ANTIBODY FOR HUMANES IGA

Info

Publication number: DD230883A1
Application number: DD25465283A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Dietlind Haedge; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11
Also published as: DD230883B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer IgA. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer humanes IgA gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst eine Serie von Hybridomen zu selektionieren, die die entsprechenden Antikoerper produzieren koennen. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen die entsprechenden Antikoerper in technisch einfacher Weise herstellbar sein. Die Aufgabe wird geloest durch die Selektionierung, Klonierung, Reklonierung und Subklongewinnung der Hybridome H-BL-IgA/1-5 und deren Kultivierung in vitro oder in vivo.The invention relates to a process for the preparation of monoclonal antibodies for IgA. It is the object to provide a method of producing monoclonal antibodies which allows, in a readily controllable manner, the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies to human IgA. The task is seen first to select a series of hybridomas that can produce the corresponding antibodies. Using these hybridomas, the corresponding antibodies should be producible in a technically simple manner. The object is achieved by the selection, cloning, recloning and subclone production of the hybridomas H-BL-IgA / 1-5 and their cultivation in vitro or in vivo.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper,die in der Lage sind, humanes IgA spezifisch zu binden.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies capable of specifically binding human IgA.

Characteristic of the known technical solutions

IgA kommt beim Menschen sowohl im Serum als auch in Sekreten vor. Besonders durch die Anwesenheit in Schleimhautsekreten erfüllt das IgA eine wichtige immunologische Schutzfunktion. Die Konzentrationsbestimmungen von IgA sowie die Bestimmung des Gehaltes an IgA-Antikörpern erfordern spezifische Anti-lgA-Antiseren. Konventionelle Antiseren gegen Human-lgA sind bekannt, weisen jedoch eine Reihe von Mängeln auf. Am schwerwiegendsten ist die Unmöglichkeit, ein Antiserum genau zu reproduzieren. Dies ist durch die äußerst heterogene humorale Immunantwort der Serumspendertiere bedingt. Die Zusammensetzung der Antiseren, z. B. hinsichtlich der Häufigkeit einzelner Antikörpertypen, die durch ihre Affinität definiert sind, variiert von Versuchstier zu Versuchstier, ja sei bstvon einer Blutabnahme zur anderen bei einem Serumspender. Die Unmöglichkeit einer exakten Reproduktion eines Antiserums, bei einer endlichen gewinnbaren Antiserummenge, limitiert eine Standardisierung solcher Antiseren, wie sie jedoch für quantitative Bestimmungsverfahren zu fordern wäre. Monoklonale Antikörper, die von einer permanent wachsenden Zellinie sezerniert werden, überwinden diese Mängel konventioneller Antiseren.IgA occurs in humans in both serum and secretions. Especially due to its presence in mucosal secretions, IgA fulfills an important immunological protective function. Concentrations of IgA and determination of IgA antibody levels require specific anti-IgA antisera. Conventional antisera to human IgA are known, but have a number of deficiencies. The most serious is the impossibility of accurately reproducing an antiserum. This is due to the extremely heterogeneous humoral immune response of the serum donor animals. The composition of the antisera, z. For example, in terms of the frequency of individual antibody types defined by their affinity varies from animal to laboratory animal, even from one blood sample to another in a serum donor. The impossibility of accurate reproduction of an antiserum, with a finite amount of antiserum obtainable, limits the standardization of such antisera, as would be required for quantitative determination. Monoclonal antibodies secreted by a permanently growing cell line overcome these shortcomings of conventional antisera.

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, (1975), 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent Wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper für humanes IgA sezernieren.It is already known to produce monoclonal antibodies. For example, Kohler and Milstein (Nature 256, (1975), 495) have generated a hybrid cell line by fusing antibody-forming cells with a permanently growing plasmocytoma line, which is constantly growing and stably secretes antibodies. This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. However, no hybridoma lines are known which secrete monoclonal antibodies to human IgA in high yield.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers des Typs BL-IgA anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für humanes IgA gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörpersoll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest für humanes IgA eignen.The invention aims to provide a method for producing a monoclonal antibody of the type BL-IgA, which allows in an easily controllable way the cost-effective production of larger amounts of this specific antibody for human IgA. It should ensure consistent quality, the antibody should be stable and storable and suitable for use in a simple and accurate detection test for human IgA.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper abzuwickeln, die für humanes IgA spezifisch sind. Das Verfahren soll in reproduzierbarer Weise Antikörper hoher Affinität und Spezifität liefern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus dem Serum gesunder Spender isoliert wird, z. B. durch Aussalzen. Aus dieser Immunglobulinfraktion wird durch lonenaustauschchromatographie an DEAE-Zellulose reines IgA isoliert, mit dem erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Myelomzellen dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3 - X - 63Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, (1979),1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (Littlefield, Science 145, (1964), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilklone selektioniert, die Antikörper, die spezifisch mit Human-lgA reagieren, sezernieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200^l-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit humanem IgA reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Als Antigen wird humanes IgA verwendet, das aus Serum oder Colostrum präpariert wurde. Weitergezüchtet werden aber nur solche Hybridome, die sowohl mit Serum- als auch mit Colostrum-lgA, nicht aber mit humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgD, IgE oder isolierten λ- und κ-Ketten reagieren. Die Bindung des Antikörpers erfolgt dabei an alpha-kettenspezifische Determinanten des IgA. — Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen selektioniert, die die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu produzieren, die spezifisch mit humanem IgA reagieren. Jedes Hybridom wird kloniert und rekloniert, wodurch jeweils Subklone erhalten werden, die stabil und mit guter Ausbeute den entsprechenden monoklonalen Antikörper sezernieren. Die so klonierten und selektionierten Hybridome erhalten die Bezeichnungen H-BL-IgA, speziell H-BL-lgA/1 bis 5. Die Hybridome können nach an sich bekannten Verfahren eingefroren werden und auf flüssigem Stickstoff gelagert werden.Zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Satzes BL-lgA/1-5 wird das jeweilige Hybridom aus der Serie H-BL-lgA/1—5 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkuitur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SCU versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Der derart erzeugte jeweilige monoklonale Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 kann lyophilisiert werden. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsfofm der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100 mg/l Gentamycin versetzt ist.The invention has for its object to provide a method for producing monoclonal antibodies that are specific for human IgA. The method is intended to reproducibly produce antibodies of high affinity and specificity. The object is achieved in that first, according to known methods, an immunoglobulin fraction from the serum of healthy donors is isolated, for. B. by salting out. From this immunoglobulin fraction, pure IgA is isolated by ion exchange chromatography on DEAE cellulose, with which mice according to the invention are immunized. Preferably 6 to 8 week old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B-myeloma cells of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The necessary murine B myeloma cells P3-X-63Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol., 123, (1979), 1548) are grown in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (Littlefield, Science 145, (1964), 709), the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, cell clones are selected which specifically react with human IgA, secrete. The selection of the hybridomas is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 μl cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react with human IgA. The testing is expediently carried out by means of indirect radio-binding technique or monoclonal PAP technique. The antigen used is human IgA prepared from serum or colostrum. However, only those hybridomas that react both with serum and with colostrum IgA but not with human immunoglobulins of the isotypes IgG, IgM, IgD, IgE or isolated λ and κ chains are further bred. The binding of the antibody takes place at alpha-chain-specific determinants of IgA. - In the manner described, a series of hybridomas is selected that have the valuable property of producing antibodies that react specifically with human IgA. Each hybridoma is cloned and recloned to give subclones which stably and with good yield secrete the corresponding monoclonal antibody. The hybridomas thus cloned and selected are designated H-BL-IgA, especially H-BL-IgA / 1 to 5. The hybridomas may be frozen according to methods known in the art and stored on liquid nitrogen. For the preparation of a monoclonal antibody of the kit BL-IgA / 1-5, the respective hybridoma from the series H-BL-IgA / 1-5 is cultivated in a culture medium with added serum in bulk. After appropriate cultivation in a CO ₂ -containing atmosphere, the culture medium now containing the antibody is mixed with 50% saturated (NH ₄ I ₂ SCU and a gamma globulin fraction is obtained Further purification of the antibody is possible according to methods known per se, such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like. The BL-IgA / 1-5 series monoclonal antibody thus produced can be lyophilized It is convenient to use MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like as the culture medium MEM Especially useful is the use of RPMI-1640, which is disclosed in U.S. Pat a preferred embodiment of the invention with 1OmM HEPES, 5 x 10 " ⁵ M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin is added.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35 ⁰C und 38⁰C. Vorteilhaft ist es, bei 37^CC zu arbeiten.As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20%. It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 ⁰ C and 38 ⁰ C. It is advantageous to work at 37 ^C C.

DerCO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen sollte.The CO ₂ content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10%, especially 5%. It is advantageous to have a high level of humidity, which should extend to the saturation of the atmosphere.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung /on 3 bis 4 Tagen. Anschließend ist ein teilweiser Kulturmediumwechsel notwendig. Dabei ist erneut eine optimale Zelldichte sinzustellen.The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is expedient to cultivate on 3 to 4 days. Subsequently, a partial culture medium change is necessary. Again, an optimal cell density must be set.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers des Satzes BL-lgA/1-5 die jeweiligen Hybridome H-BL-lgA/1-5 in histokompatible A χ BALB/c-F_rMäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms H-BL-lgA/1-5. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder einer weiteren Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschgromatographie o.dgi. in Frage, die den Isotyp des jeweiligen BL-lgA/1-5 spezifisch anreichem, oder Verfahren der Immunadsorption, die die Antikörper BL-lgA/1-5 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg des jeweiligen monoklonalen Antikörpers der Serie BL-lgA/1-5 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.In a second embodiment of the invention, to produce a monoclonal antibody of the set BL-IgA / 1-5, the respective hybridomas H-BL-IgA / 1-5 are injected ip into histocompatible A χ BALB / cF _r mice. It is advantageous if the mice used have been pretreated with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the respective monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 is removed, e.g. B. by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the respective hybridoma H-BL-IgA / 1-5. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the corresponding monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For further purification, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography o.dgi. in question, which specifically enrich the isotype of the respective BL-IgA / 1-5, or immunoadsorption methods which antigen-specifically isolate the antibodies BL-IgA / 1-5. The ascites contains 5 to 10 mg of the respective monoclonal antibody of the series BL-lgA / 1-5 per ml of liquid in the inventive process implementation. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist. Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1-5 weisen das in Tabelle 1 dokumentierte Bindungsmuster mit humanen Immunglobulinen aufTo produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for. B. with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution and taken up in buffered saline. Dialysing against NH ₄ HCO ₃ solution results in a lyophilizable product which is lyophilized at + 4 ⁰ C preserved. BL-IgA / 1-5 series monoclonal antibodies have the human immunoglobulin binding pattern documented in Table 1

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert werden: The invention will be explained below with reference to two embodiments:

1. Ausführungsbeispiel1st embodiment

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen der Serie H-BL-lgA/1-5 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 · 10⁵ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen .Hybrid nitrogen cells of the H-BL-IgA / 1-5 series are thawed and washed twice with culture medium. Cell density is adjusted to 1-5 x 10 ⁵ cells per ml of culture medium and placed in appropriate tissue culture flasks.

kultiviert.cultured.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10"⁵M) Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.The culture medium consists of RPMI-1640 supplemented with sodium bicarbonate (2g / l), mercaptoethanol (5 x 10 ^"5 M) gentamicin (100 mg / l) and N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-ethanesulfonic acid (1OmM) is added.

Dieses Medium wird mitThis medium comes with

a) fetalem Kälberserum odera) fetal calf serum or

b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. 10% serum content has proven to be suitable.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igenCO2-Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells are incubated at +37 ⁰ C in a water-saturated 5% igenCO2 atmosphere.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.After 3 to 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. However, it is important to pay attention to the optimal cell density. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They can be used for sowing in new culture vessels.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den jeweiligen monoklonalen Antikörper der Serie BL-lgA/1-5. Die Konzentration des jeweiligen Antikörpers BL-lgA/1-5 ist ausreichend für diagnostische Nachweisverfahren von Human-lgA (wie z. B.The cell-free culture supernatants contain the respective monoclonal antibody of the series BL-IgA / 1-5. The concentration of the respective antibody BL-IgA / 1-5 is sufficient for diagnostic detection of human IgA (eg.

enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).enzyme immunological detection, radio-linkage techniques).

Gegebenenfalls kann derTiter mit einer geeigneten Technik (z. B. indirekte Radiobindungstechnik) bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.Optionally, the titer may be determined by a suitable technique (e.g., indirect radio bonding technique). High titre culture supernatants allow dilution to the desired working concentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie. Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.If higher concentrations of the antibody are required, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated ammonium sulfate. The gammaglobulin fraction thus obtained can be further purified by further known separation techniques (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.).

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobuünantikörpervon den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer PH 2.8) von diesem Immunadsorbes wieder isoliert werden.If highly purified monoclonal antibodies are required, these can be separated from the calf serum or horse serum-derived accompanying proteins by immunoadsorption to carrier-fixed anti-mouse immunoburn antibodies and re-isolated from this immuno-adsorber by gentle-acting desorbents (3 M KSCN or glycine / HCl buffer PH 2.8) ,

2. Ausführungsbeispiel2nd embodiment

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1-5, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵ bis 5 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert.Cells of a hybridoma of the series H-BL-IgA / 1-5, which are optionally pre-cultured in vitro, are used. After washing in serum-free physiological saline, 10 ⁵ to 5 × 10 ⁷ live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice.

Als histokompatible Mäuse werden FTHybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5ml Paraffinum subliquidum, i.p. 2 Wochen vorder Hybridominjektion behandelt worden sind.The histocompatible mice used are FTH hybrids of strains A and Balb / c, which are incubated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum, i.p. 2 weeks before hybrid injection.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascites fluids containing the respective monoclonal antibody BL-IgA / 1-5 are separated by centrifugation into cellular components and into ascites fluid.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms der Serie H-BL-lgA/1-5. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.The cellular portion consists predominantly of cells of the respective hybridoma of the series H-BL-IgA / 1-5. These hybridoma cells are washed with physiological saline and used as described above by injecting histocompatible mice i. p. be injected. Such passages are possible repeatedly.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO3-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper der Serie BL-igA/1-5 sind lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄ and taken up in buffered saline, this solution is dialyzed against 0.5% NH ₄ HCO ₃ solution, followed by lyophilization BL-igA / 1-5 are lyophilized at +4 ⁰ C without loss of binding properties.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik bestimmt.The antibody titer is determined by preparing a dilution series and testing by indirect radio-link technique.

Table 1

Reaktion der monoklonalen Antikörper BL-lgA/1-5 mit humanen Immunglobulinen bzw. deren Polypeptidketten mittels indirekter Radiobindungstechnik.Reaction of the monoclonal antibodies BL-IgA / 1-5 with human immunoglobulins or their polypeptide chains by means of indirect radio-linkage technology.

Antigenantigen

BL-lgA/1 BL-lgA/2 . BL-lgA/3 BL-lgA/4 BL-lgA/5BL-IgA / 1 BL-IgA / 2. BL-IgA / 3 BL-IgA / 4 BL-IgA / 5

Serum-lgA τ +++Serum IgA τ +++

Colostr.-lgA igA(K)_Hep2)Colostr.-IgA igA (K) _H ep2)

lgM(K)_Loh igM(\p_ra IgD(K)₁ IgD(X)₁,(IgM (K) _Loh IgM \ p _ra IgD (K) ₁ IgD (X) _1,

igE(X)_ND se⁴¹ igE (X) _N D se ⁴¹

K-Kette⁵⁾ λ-Kette⁵¹ K chain ⁵⁾ λ chain ⁵¹

1) Zur Testung der monoklonalen Antikörper auf deren Reaktion mit den entsprechenden Antigenen wurden die Antikörper in Mikrotiterplatten aus PVC, die mit den entsprechenden Antigenen beschichtet worden waren, inkubiert. Die gebundenen monoklonalen Antikörper wurden dann durch ¹²⁵J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper nachgewiesen. Der Bindungsindex I entspricht dem Verhältnis der Zählrate des jeweiligen gebundenen Antikörpers der Serie BL-lgA/1-5 zu der des monoklonalen Antikörpers BL-DNP/II, der als Kontrolle für die unspezifische Bindung dient, nach Entwicklung mit ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpem.1) To test the monoclonal antibodies for their reaction with the corresponding antigens, the antibodies were incubated in microtiter plates made of PVC, which had been coated with the corresponding antigens. The bound monoclonal antibodies were then detected by ¹²⁵ I-labeled anti-mouse immunoglobulin antibodies. The binding index I corresponds to the ratio of the count rate of the respective bound antibody of the series BL-IgA / 1-5 to that of the monoclonal antibody BL-DNP / II, which serves as a control for the nonspecific binding, after development with ¹²⁵ I-labeled antibodies. mouse immunoglobulin antibodies.

K 10 : + + +, 10 < K 4: ++,4 < K 2 : +, I <2 : -K 10: + + +, 10 <K 4: ++, 4 <K 2: +, I <2: -

2) Die Indizes geben die Herkunft der Myelomproteine von entsprechenden Patienten an.2) The indices indicate the origin of the myeloma proteins from corresponding patients.

3 HGG-Präparation der Firma SERVA, Heidelberg.3 HGG preparation from SERVA, Heidelberg.

4 Sekretorische Komponente des IgA.4 Secretory component of IgA.

5 Standard-K-bzw. -lambda-Präparation der Behringwerke AG, Marburg.5 standard K resp. lambda preparation of Behringwerke AG, Marburg.

Mischungen von mehreren Bence-Jones-Proteinen.Mixtures of several Bence-Jones proteins.

Claims

--1- 546 52

Invention claim:

1. A process for producing monoclonal antibodies to human IgA, characterized in that mice are immunized with human IgA, the spleen lymphocytes of hyperimmune mice are hybridized with myeloma cells, hybridoma cells of the type H-BL lgA / 1-5 are selected, the selected hybridoma cells cultured or injected into mice, the ascites obtained and the respective antibodies are isolated.

2. Process according to item 1, characterized in that 6 to 8 weeks old female Α mice are used for immunization.

3. The method according to item 1, characterized in that are used as myeloma cells of the line P3 - X - 63 Ag 8.653.

4. The method according to item 1 and 2, characterized in that the immunization of the mice is carried out by a series of injections with the human IgA.

5. The method according to item 1,2,4, characterized in that the last immunization is carried out 4 days before isolation of the determined for the hybridization B lymphocytes.

6. The method according to item 1 to 3, characterized in that the ratio of myeloma cells and B-lymphoblasts, which are intended for fusion, about 1: 1.

7. The method according to item 1,3, 6, characterized in that in the step of separating the unhybridized myeloma cells from the hybrid cells, the culture medium used contains spleen cells of non-immunized A χ BALB / cF _r hybrid mice.

8. The method according to item 1, characterized in that the examination of the supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells on the presence of antibodies which react with the α-chain, and thus the selection of suitable hybridomas H-BL-IgA determined by indirect Radio-linkage technique or monoclonal PAP technique using IgA prepared from the serum and from the colostrum, and the detection of non-reacting with a series of human immunoglobulins of the isotypes IgG, IgM, IgD and IgE is performed.

9. The method according to item 1, characterized in that antibody-producing hybridoma cells of hybridoma cells of the hybridoma series H-BL IgA / 1 to 5 are grown in a culture medium in mass culture, wherein a serum is added to the culture medium, after appropriate cultivation in CO ₂ -containing Atmosphere the now antibody-containing culture medium with 50% saturated (NH ₄ I ₂ SO _{4 is} added and a gamma globulin fraction is obtained, from which after further workup in a conventional manner the monoclonal antibody is isolated.

10. The method according to item 1 and 9, characterized in that the culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like. is used.

11. The method according to item 1 and 9 to 10, characterized in that is used as the culture medium RPMI-1640.

12. The method according to item 1 and 9 to 11, characterized in that the culture medium 1OmM HEPES, 5 x 10 " ⁵ M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin be added.

13. The method according to item 1 and 9 to 12, characterized in that are used as serum fetal calf serum or normal horse serum.

14. The method according to item 13, characterized in that the proportion of fetal calf serum in the culture medium is about 10%, that of the horse normal serum is also about 10%.

15. The method according to item 1 and 9 to 14, characterized in that the cultivation temperature is 35 to 38 ° C.

16. The method according to item 1 and 9 to 15, characterized in that cultured at 37 ⁰ C.

17. The method according to item 1 and 9 to 16, characterized in that the CO ₂ content above the culture medium is 5%.

18. The method according to item 1 and 9 to 17, characterized in that above the culture medium high humidity prevails, which may extend to saturation of the atmosphere with water vapor.

19. The method according to item 1 and 9 to 18, characterized in that 3 to 4 days is cultivated.

20. Method according to item 1, characterized in that the hybridomas of the series H-BL-IgA / 1 to 5 are each injected individually into histocompatible A χ BALB / cF _r mice, after ascites the ascitic fluid is removed, the cellular components are separated off, the clear supernatant containing the corresponding monoclonal antibody of the series BL-IgA / 1 to 5 is either used directly again or subjected to purification and enrichment operations, or by precipitating the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid e.g. B. with 50% saturated (NH _A ) ₂ SO ₄ solution, receiving the precipitate in buffered saline, dialyzed against dilute NHiHCO3 solution and subsequent lyophilization in a permanent storage form is transferred.

21. The method according to item 1 and 20, characterized in that the separated cellular components, which consist mainly of cells of the inserted hybridoma series H-BL-IgA / 1 to 5, washed with saline and can be injected again histocompatible mice.

22. The method according to item 1 and 20, dadu-ch characterized in that the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgi. pretreated.

23. Method according to items 1 and 22, characterized in that a corresponding tumor stimulator is given 3 days to 6 weeks before hybrid injection.

24. The method according to item 1, characterized in that the lyophilized antibody BL-IgA is stored at +4 ⁰ C.