DD238168A3

DD238168A3 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MONOCLONAL ANTICOERPER

Info

Publication number: DD238168A3
Application number: DD25465083A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1986-08-13

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer T-Zell-Antigene. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer Zelloberflaechenantigene humaner T-Lymphozyten gestattet. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden, die mit hauptsaechlich auf T-Zellen ausgepraegtem Antigen reagieren. Die Aufgabe wird geloest durch die Erzeugung der Hybridome H-BL-T2 bzw. H-BL-T3, deren Kultivierung in vitro oder in vivo und Abtrennung der monoklonalen Antikoerper BL-T2 bzw. BL-T3.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies for T-cell antigens. The object of the invention is to provide a process for producing monoclonal antibodies which permits, in an easily controllable manner, the cost-effective production of relatively large quantities of specific antibodies for cell surface antigens of human T-lymphocytes. The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which hybridomas are first generated, which are easy and inexpensive to handle and their cultivation in technically and economically advantageous manner is possible. Using these hybridomas, it is intended to generate monoclonal antibodies in subsequent process steps which react with antigen mainly expressed on T cells. The object is achieved by the generation of the hybridomas H-BL-T2 or H-BL-T3, their cultivation in vitro or in vivo and separation of the monoclonal antibodies BL-T2 or BL-T3.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für T-Zell-Antigene.The invention relates to a method for producing monoclonal antibodies for T-cell antigens.

Characteristic of the known technical solutions

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, [1975], 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. So sind monoklonale Antikörper bekannt, die mit humanen T-Lymphozyten spezifisch reagieren (P.C. Kung, G.Goldstein, Human T-Lymphozyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies, Research Monographs in Immunology, Vol.3, S.5-15, Hrsg.: Turk, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam/New York/Oxford, 1981 sowie J. A. Ledbetter, A. E. Frankel, L. A. Herzenberg, Human Leu T-cell differentiation antigens: quantitative expression on normal lymphoid cells and cell-lines. Research Monographs in Immunology, Vol.3,It is already known to produce monoclonal antibodies. Thus, Köhler and Milstein (Nature 256, [1975], 495) have generated a hybrid cell line by fusing antibody-forming cells with a permanently growing plasmocytoma line, which is constantly growing and stably secretes antibodies. This principle solution has led to the production of various hybridoma lines which produce antibodies of different specificity. Thus, monoclonal antibodies are known which specifically react with human T-lymphocytes (PC Kung, G. Goldstein, Human T-Lymphocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies, Research Monographs in Immunology, Vol.3, p.5-15, eds. : Turk, Elsevier / North Holland Biomedical Press, Amsterdam / New York / Oxford, 1981, and JA Ledbetter, AE Frankel, LA Herzenberg, Human Leu T-cell differentiation antigens: quantitative expression on normal lymphoid cells and cell lines Immunology, Vol.3,

Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper vom Typ BL-T2oder BL-T3 sezernieren.However, no hybridoma lines are known which secrete monoclonal antibodies of the BL-T2 or BL-T3 type in high yield.

Object of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für Zelloberflächenantigene humaner T-Lymphozyten gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, die Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest für humane T-Lymphozyten eignen, wobei Kreuzreaktionen mit Zelloberflächenantigenen anderer Zellen nicht vorkommen sollen. Durch das Zurverfügungstellen der monoklonalen Antikörper soll der Stand der Technik bereichert und eine qualifizierte Auswahl unter monoklonalen Antikörpern für humane T-Zell-Antigene gewährleistet werden.The object of the invention is to provide a process for producing monoclonal antibodies which allows, in an easily controllable manner, the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies for cell surface antigens of human T-lymphocytes. It should be ensured consistent quality, the antibodies should be stable and thus storable and are suitable for use in a simple and accurate detection test for human T lymphocytes, cross-reactions with cell surface antigens of other cells should not occur. The provision of the monoclonal antibodies is intended to enrich the state of the art and to ensure a qualified selection among monoclonal antibodies to human T cell antigens.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome soll in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit auf T-Zellen ausgeprägten Antigenen reagieren.The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which hybridomas are first generated, which are easy and inexpensive to handle and their cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using these hybridomas, monoclonal antibodies which react with antigens expressed on T cells should be generated in subsequent process steps.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach dem an sich bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus peripherem Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle werden daraus T-Lymphozyten gewonnen. Eine zweite Variante der T-Lymphozytengewinnung besteht darin, aus humanen Thymus eine Zellsuspension herzustellen und die Bindegewebsanteile durch Dichtegradientenzentrifugation abzutrennen. Mit in der vorstehend beschriebenen oder auf eine andere Weise gewonnenen humanen T-Lymphozyten werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemischs werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-b-Myelomzellen P3—X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, [1979] werden in RPMI-1640mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält [Littlefield, Science, 145, [1964], 709], werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilklone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Art sezernieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-//,l-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosettentechnik und/oder Nylonwolleseparation gewonnen wurden, getestet. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit B-Lymphzyten, wohl aber mit unseparierten Blutlymphozyten oder angereicherten T-Zellen reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfloreszenz erfolgen. So selektionierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch mit der Immunfloreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Kulturüberstände verwendet werden, die mit B-Lymphozyten, O-Zellen, Monozyten, Granulozyten,Thrombozyten und Erythrozyten reagieren. Die durch derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und Subklone werden selektioniert, die Antikörper, die zur Erkennung humaner T-Lymphozyten geeignet sind, stabil produzieren.The object is achieved by first isolating lymphocytes from peripheral blood from healthy donors by the known method of density gradient centrifugation. By passage over nylon wool T lymphocytes are obtained. A second variant of the T-lymphocyte recovery is to produce a cell suspension from human thymus and to separate the connective tissue fractions by density gradient centrifugation. Mice are immunized according to the invention with human T lymphocytes obtained in the manner described above or otherwise. Preferably 6-8 week old female Α mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. From the spleens of such hyperimmune mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The necessary murine b myeloma cells P3-X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol., 123, [1979] are grown in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS) in a culture medium containing hypoxanthine, Aminopterin and thymidine contains [Littlefield, Science, 145, [1964], 709], the hybrids formed are separated from the unfused myeloma cells and according to the invention cell clones are selected which secrete antibodies of the desired kind cells are divided into a plurality of separate 200 μl cultures immediately after the fusion The supernatants of cultures containing the growing hybrid cells are assayed for the presence of antibodies which react only with cell surface antigens of human T lymphocytes For example, any culture supernatant that reacts with human blood lymphocytes will be treated with B lymphocytes by elimination of T cells by E-rosette technique and / or Nylon wool separation were obtained, tested. Only those cultures are still used whose antibodies do not react with B lymphocytes, but with unseparated blood lymphocytes or enriched T cells. The testing of the culture supernatants with the corresponding cells can be carried out both by indirect radio-binding technique and by indirect immunofluorescence. However, so selected cultures must be checked from this stage with the immunofluorescence technique. This precludes the use of culture supernatants which react with B lymphocytes, O cells, monocytes, granulocytes, platelets and erythrocytes. The hybridomas obtained by such selection are recloned and subclones are selected which stably produce antibodies suitable for human T lymphocyte recognition.

Die Hybridome werden als H-BL-T bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-BL-T2 und H-BL-T3. In der im folgenden beschriebenen Verfahrensweise wird auf diese beiden Hybridome abgestellt, die an der Karl-Marx-Universität Leipzig, Sektion Biowissenschaften, kultiviert werden und zugänglich sind.The hybridomas are referred to as H-BL-T. Particularly suitable are the cell cultures H-BL-T2 and H-BL-T3. In the procedure described below is based on these two hybridomas, which are cultivated and accessible at the Karl Marx University Leipzig, Section Life Sciences.

Das Hybridom H-BL-T2bzw. H-BL-T3wird in histokompatible Ax BALB/c-F_rMäusei.p. injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinumsubliquidum,Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-T2 bzw. H-BL-T3. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zu letzterem kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschachromatographie, Protein-AAdsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-T2 (IgG 2 b) bzw. BL-T3 (IgG) spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die die Antikörper antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-10 mg BL-T2 bzw. BL-T3 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.The hybridoma H-BL-T2bzw. H-BL-T3 is inserted into histocompatible Ax BALB / cF _r mice no. injected. It is advantageous if the mice used have been pretreated with a tumor stimulator such as paraffin subliquidum, pristane or the like. After ascites formation, which becomes visible as a result of swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-T2 or BL-T3 is removed by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-T2 or H-BL-T3. It is conveniently washed with physiological saline and can be re-injected. The clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-T2 or BL-T3 is either used directly or in a suitable dilution or subjected to further purification. For the latter, methods such as DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography or the like which specifically enrich the isotype of BL-T2 (IgG 2 b) or BL-T3 (IgG), or immunoadsorption methods, are contemplated to isolate the antibodies antigen-specific. When carrying out the process according to the invention, the ascitic fluid contains 5-10 mg of BL-T2 or BL-T3 per ml of fluid. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml.

Zum Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei 4°C haltbar ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die zur Antikörperproduktion befähigten Hybridomzellen H-BL-T2 bzw. H-BL-T3 in einem Kulturmedium mit Serumsatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung versetzt und eine Gammaglobinfraktion erhalten. Weiter Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o.dgl. möglich. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist dieTo produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for example with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution and taken up in buffered physiological saline. Dialyzing against NH ₄ HCO ₃ solution results in a lyophilizable product that is lyophilized at 4 ° C. In another embodiment of the invention, the hybridoma cells H-BL-T2 or H-BL-T3 capable of producing antibodies are raised in mass culture in a culture medium with serum conversion. After appropriate cultivation in a CO ₂ -containing atmosphere, the culture medium now containing antibody is mixed with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution and a gamma globin fraction is obtained. Further purification of the antibody is according to known methods such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like. possible. It is useful as a culture medium MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI or the like. apply. Particularly favorable is the

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%.As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20%.

Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 25 und 40°C, insbesondere zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37^CC zu arbeiten.It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 25 and 40 ° C, in particular between 35 ° C and 38 ° C. It is advantageous to work at 37 ^C C.

Der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.The CO2 content of the atmosphere above the culture medium is favorably 2 to 10%, in particular 5%. The advantage is a high humidity, which can reach saturation of the atmosphere.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen.The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is advisable to cultivate for 3 to 4 days.

Die nach einer der beiden Verfahrensvarianten hergestellten monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 weisen das in Tabelle angegebene Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik (RBT) und indirekter Immunfloreszenz (ilF) bestimmt.The monoclonal antibodies BL-T2 or BL-T3 prepared according to one of the two process variants have the reaction pattern with human blood cells given in the table. Binding was determined by indirect radio-binding technique (RBT) and indirect immunofluorescence (ilF).

Die Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 besitzen mit etablierten, permanent wachsenden Zellinien das in Tabelle 2 dargestellte Bindungsmuster.The antibodies BL-T2 and BL-T3 have the binding pattern shown in Table 2 with established, permanently growing cell lines.

Der Antikörper BL-T3 stimuliert humane Blutlymphozyten bei Zugabe in das Kulturmedium zur Proliferation.The antibody BL-T3 stimulates human blood lymphocytes to proliferate when added to the culture medium.

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein.The invention will be explained in more detail below with reference to two exemplary embodiments, without being restricted thereto.

example 1

Hybridomzellen H-BL-T2 werden auf eine Zelldichte von 1 bis 5 · 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, das mit NaHCO₃ (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10"⁵M), Gentamycin (100 mg/l) und N-2-Hydroxy-ethylpiperazin-N' -ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mitHybridoma cells H-BL-T2 are adjusted to a cell density of 1 to 5 x 10 ⁶ cells per ml culture medium and cultured in tissue culture flasks. The culture medium consists of RPMI-1640 supplemented with NaHCO ₃ (2g / l), mercaptoethanol (5 x 10 ^"5 M), gentamycin (100 mg / l) and N-2-hydroxy-ethylpiperazine-N '-ethane sulfonic acid (1OmM ) This medium is used with

a) fetalem Kälberseruma) fetal calf serum

b) Pferdenormalserumb) Horse Normal Serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als besonders geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.supplemented. The possible shares are 5 to 20%. Particularly suitable is 10% serum content has been found.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei 37⁰C in einer wasserdampfgesättigten 5%igenCO₂-Atmosphäre bebrütet werden.The best culture conditions are achieved when the cells at 37 ⁰ C in a water vapor-saturated 5% igenCO ₂ atmosphere are incubated.

Nach 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei soll die o.a. Zelldichte erreicht werden. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugieren abgetrennt. Sie werden zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet.After 4 days, the cell culture supernatants are removed under sterile conditions. The z.T. Cells adhering to the vessel wall can be re-supplied with fresh medium and incubated. The o.a. Cell density can be achieved. The hybrid cells contained in the culture supernatant are separated by centrifugation. They are used for sowing in new culture vessels.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-T2. Die erreichte Konzentration der Antikörper ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von T-Lymphozyten. Werden höhere Konzentration der Antikörper gewünscht, werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem (NH₂I₂SO₄ gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere, an sich bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie. Gelfiltration usw.) weiter gereinigt werden. Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper BL-T2 benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oderGlycin/HCI-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens isoliert werden.The cell-free culture supernatants contain the monoclonal antibody BL-T2. The achieved concentration of antibodies is sufficient for the usual diagnostic detection methods of T lymphocytes. If higher concentrations of the antibodies are desired, the culture supernatants are precipitated with 50% saturated NH ₂ I ₂ SO _4. The gamma globulin fraction thus obtained can be further purified by further separation techniques known per se (ion exchange chromatography, gel filtration, etc.) to become highly purified monoclonal antibodies BL-T2 required, they can be separated by immunoadsorption to carrier-fixed anti-mouse immunoglobulin antibodies from the accompanying calf serum or horse serum accompanying proteins and by gently acting desorbents (3 M KSCN or glycine / HCl buffer pH 2.8) are isolated from this immunoadsorbent ,

In gleicherweise kann der monoklonale Antikörper BL-T3 erhalten werden.Likewise, the monoclonal antibody BL-T3 can be obtained.

Example 2

Hybridomzellen H-BL-T3, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden, wäscht man mit serumfreier physiologischer Kochsalzlösung. iO⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen werden histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.Hybridoma cells H-BL-T3, which are optionally pre-cultured in vitro, are washed with serum-free physiological saline. OK ⁵ to 5 x 10 ⁷ live cells are injected intraperitoneally into histocompatible mice. As histocompatible mice F _r hybrids of strains A and BALB / c are used, which have been treated with a tumor stimulator, here with 0.5 ml Paraffinum subliquidum ip 2 weeks before the hybridoma injection.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-T3 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt. Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-T3. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p.After the onset of ascites formation, the mice are punctured. The collected ascitic fluids containing the monoclonal antibody BL-T3 are separated by centrifugation into cellular components and into ascites fluid. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-T3. These hybridoma cells are washed with physiological saline and used as described above by injecting histocompatible mice i. p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.be injected. Such passages are possible repeatedly.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung.The immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid is precipitated with 50% saturated (NH ₄ J ₂ SO ₄ and taken up in buffered saline solution, which is dialyzed against 0.5% NH ₄ HCO ₃ solution, followed by lyophilization.

Für die in vivo oder in vitro hergestellten monoklonalen Antikörper BL-T3 wird derTiter durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung humaner Blutlymphozyten und einem geeigneten FITC-markierten Anti-Maus-Immunglobulinserum bestimmt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle T-Lymphozyten markiert werden.For monoclonal antibody BL-T3 produced in vivo or in vitro, the titer is determined by preparing a serial dilution and testing by indirect immunofluorescence using human blood lymphocytes and a suitable FITC-labeled anti-mouse immunoglobulin serum. The titer is the highest dilution at which all T-lymphocytes are still clearly marked.

In entsprechender Weise wird der monoklonale Antikörper BL-T2 erhalten.Similarly, the monoclonal antibody BL-T2 is obtained.

Table 1

Zellencell

RBTRBT

Γ' T2Γ 'T2

ilFILF

T3T3

Intensität²¹ T2Intensity ²¹ T2

T3T3

% markierte Zellen T2 T3% labeled cells T2 T3

Erythrozyten Granulozyten Thrombozyten Monozyten Lymphozyten³¹ T-Zellen⁴¹ B-Zellen⁵¹ O-Zellen⁶¹ ThymozytenErythrocytes granulocytes platelets monocytes lymphocytes ³¹ T cells ⁴¹ B cells ⁵¹ O cells ⁶¹ thymocytes

00 00 00 00 00 00 00 00 69 ±869 ± 8 65 ±665 ± 6 100100 100100 00 00 00 00 > 90(25)> 90 (25) ca. 20about 20

CLL-LymphozytenCLL lymphocytes

>85⁷ > 85 ⁷

1) Bindungsindex I = Ipm BL-T2 bzw. 8L-T3/1) binding index I = Ipm BL-T2 or 8L-T3 /

Ipm BL-DNP (IgGD I > 10: + + +, <10>4: ++,<4> 1,5: + , < 1,5 > 1:—Ipm BL-DNP (IgGD I> 10: + + +, <10> 4: ++, <4> 1.5: +, <1.5> 1: -

2) Subjektive Bewertung der Fluoreszenzintensität von+ + +bis —2) Subjective evaluation of fluorescence intensity from + + + to -

3) Lymphozyten des peripheren Bluts3) peripheral blood lymphocytes

4) Mit Schaferythrozyten Rosetten-bildende Lymphozyten (E⁺ — Lymphozyten)4) Rosary-forming lymphocytes (E ⁺ lymphocytes) with sheep erythrocytes

5) lmmunglobulinpositive(lg⁺)-Zellen (E~-Lymphozyten)5) immunoglobulin positive (Ig ⁺ ) cells (E ~ lymphocytes)

6) lg--,E--Zellen6) Ig, E cells

7) gilt für die Lymphozyten von 21 bis 23 durch die konventionelle klinische Diagnostik eingestufte CLL-Patienten.7) lymphocytes from 21 to 23 CLL patients classified by conventional clinical diagnostics.

Table 2

Zellencell

RBTRBT

BL-TBL-T

ilFILF

B L-TB L-T

Intensität²* BL-TIntensity ² * BL-T

BL-T 3BL-T 3

% markierte Zellen BL-T 2 BL-T 3% labeled cells BL-T 2 BL-T 3

T-cell lines

SKW-3 MOLT-3 MOLT-4 CCRF-CEMSKW-3 MOLT-3 MOLT-4 CCRF-CEM

CCRF-HSB-2 O-Zellinien NALM-6CCRF-HSB-2 O cell lines NALM-6

REH B-Zellinien DAUDI HMy-2REH B cell lines DAUDI HMy-2

STAU Myeloide Linie HL-60JAM Myeloid HL-60 line

U-937 Erythroide Linie K 562U-937 erythroid line K 562

>50> 50 00 >50> 50 <10<10 <50<50 <50<50 >50> 50 00 >80> 80 <10<10 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00

1) und 2) siehe Legende zu Tabelle1) and 2) see legend to table

Technical and economical advantages of the invention

Immunhistologische Untersuchungen zeigen, daß die monoklonalen Antikörer BL-T2 und BL-T3 bevorzugt reife Thymozyten, also exportfähige T-Zellen, erkennen. In den kortikalen Bereichen des Thymus werden nur einzelne Zellen angefärbt. In der Tosille markieren beide monoklonalen Antikörper die Lymphozyten in den typischen T-Zellkompartimenten, während in den B-Zellregionen (Keimzentren) nur vereinzelte Zellen (eingewanderte T-Lymphozyten) angefärbt werden. Darüber hinaus markiert der BL-T2 jedoch Zellen an der Grenzzone von T- und B-Zellkompartiment besonders stark. Diese Zellen werden von anderen T-ZeII-Antikörpern gar nicht oder nur sehr schwach markiert, so daß sie nicht deutlich hervorgehoben werden. Diese Kontaktzone von B-und T-Lymphozyten ist aber von großer biologischer Bedeutung, da sich hier die zellulären Kooperationen zwischen B- und T- sowie zwischen T- und T-Zellen bei der Regulation der Immunantwort abspielen. Durch die starke Markierung der T-Lymphozyten in dieser Zone hat der BL-T2 zusätzlichen, völlig überraschenden Effekt, gerade solche T-Zellen besonders deutlich zu markieren, die sich in einer Phase funktioneller Aktivität befinden. Damit eröffnen sich neue Anwendungsbereiche für die Erforschung von immunologisch bedingten Krankheiten, die durch den monoklonalen Antikörper BL-T2 erschlossen werden.Immunohistological studies show that the monoclonal antibodies BL-T2 and BL-T3 preferentially recognize mature thymocytes, ie exportable T cells. In the cortical areas of the thymus, only individual cells are stained. In Tosille, both monoclonal antibodies label the lymphocytes in the typical T cell compartments, while in the B cell regions (germinal centers) only isolated cells (immigrated T lymphocytes) are stained. In addition, however, the BL-T2 particularly marked cells at the border zone of the T and B cell compartment. These cells are not or only very weakly labeled by other T-cell antibodies, so that they are not clearly highlighted. However, this contact zone of B lymphocytes and T lymphocytes is of great biological importance, since here the cellular cooperations between B and T as well as between T and T cells take place in the regulation of the immune response. Due to the strong labeling of the T-lymphocytes in this zone, the BL-T2 has an additional, completely surprising effect of marking particularly clearly those T cells which are in a phase of functional activity. This opens up new areas of application for the research of immunological diseases, which are opened up by the monoclonal antibody BL-T2.

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Das Reaktionsmuster mit permanenten Zellinien sowie die im Durchschnitt 4% geringeren Zahlen markierter peripherer Lymphozyten im Vergleich zum BL-T2 weisen die BL-T3 als originären Antikörper aus, der seinerseits prospektive Bedeutung für die Typisierung von T-Zell-Lymphomen und -Leukämien besitzt.The reaction pattern with permanent cell lines and the average 4% lower numbers of labeled peripheral lymphocytes compared to BL-T2 show the BL-T3 as a primary antibody, which in turn has prospective significance for the typing of T-cell lymphomas and leukemias.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der monoklonalen Antikörper BL-T2 und BL-T3 ist ihre starke Bindung an die antigentragenden Zellen. So werden beide monoklonalen Antikörper durch wiederholte Waschvorgänge nicht von den markierten Lymphozyten abgelöst. Die Markierung ist bei ausreichender Antikörperkonzentration in außergewöhnlich kurzer Zeit abgeschlossen. So reichen z. B. 30 see Kontakt für eine Markierung der Lymphozyten aus, obwohl alle einschlägigen Verfahrensvorschriften, die andere monoklonare Antikörper einsetzen, dafür 15-30 min vorsehen.Another advantageous property of the monoclonal antibodies BL-T2 and BL-T3 is their strong binding to the antigen-carrying cells. Thus, both monoclonal antibodies are not replaced by repeated washings of the labeled lymphocytes. The label is completed with sufficient antibody concentration in an exceptionally short time. So z. See, for example, contact for lymphocyte labeling, although all of the pertinent procedures using other monoclonal antibodies provide for 15-30 min.

Diese vorteilhafte Eigenschaft der monoklonalen Antikörper BL-T2 und BL-T3 ist auf ihre hohe Affinität zurückzuführen und stellt ein wesentliches Qualitätsmerkmal dar. Hierdurch werden z. B. Fehlbestimmungen der T-Zellen, die auf eine mangelnde Inkubation zurückgehen, völlig ausgeschlossen. Hinsichtlich ihrer Stabilität und Lagerfähigkeit weisen BL-T2 und BL-T3 hervorragende Eigenschaften auf. Dies gilt sowohl bei der Aufbewahrung in flüssiger Form bei + 4°C als auch in lyophilisierter Form.This advantageous property of the monoclonal antibodies BL-T2 and BL-T3 is due to their high affinity and represents an essential quality feature. B. Misregulations of the T cells, which go back to a lack of incubation, completely excluded. In terms of stability and shelf life, BL-T2 and BL-T3 have excellent properties. This applies both when stored in liquid form at + 4 ° C and in lyophilized form.

Claims

claims:

1. A process for the preparation of monoclonal antibodies which recognize T cell antigens, characterized in that A mice are immunized with human T lymphocytes, the spleen lymphocytes of the hyperimmune mice are hybridized with myeloma cells, hybridoma cells H-BL-T2 or H-BL-T3 can be selected, cultured or injected into mice with selected hybridoma cells, the ascites fluid recovered and the antibodies BL-T2 and BL-T3 isolated.

2. The method according to item 1, characterized in that the hybridoma cells H-BL-T2 and H-BL-T3 are cloned and recloned and a subclone is selected.

3. The method according to item 1, characterized in that 6 to 8 weeks old female Α mice are used for immunization.

4. The method according to item 1, characterized in that are used as myeloma cells of the line P3-X63-Ag 8.653.

5. The method according to item 1 and 3 to 4, characterized in that the immunization of the mice is carried out by a series of injections with human T-lymphocytes or thymocytes.

6. The method according to item 1 and 3 to 5, characterized in that the last immunization 4 days before the isolation of the determined for the hybridization B-lymphocytes is made.

7. The method according to item 1 and 4, characterized in that the ratio of myeloma cells and B-lymphoblasts, which are intended for fusion, about 1: 1.

8. The method according to item 1, characterized in that in the step of separating the unhybridized myeloma cells from the hybrid cells, the culture medium used contains spleen cells of unimmunized Ax BALB / c-Ft hybrid mice.

9. The method according to item 1, characterized in that the hybridoma cells H-BL-T2 and H-BL-T3 are cultivated so that they are reared in a culture medium such as MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPMI o.

10. The method according to item 1 and 9, characterized in that is used as the culture medium RPMI-1640.

11. Verfahrennach point 1,9,10, characterized in that the culture medium 1OmMHEPES, 5 x 10 ^-5 M mercaptoethanol, 100 mg / l gentamycin be added ~.

12. The method according to item 1 and 9 to 11, characterized in that are used as serum fetal calf serum or normal horse serum.

13. The method according to item 11, characterized in that the proportion of fetal calf serum in the culture medium is about 10%, that of the horse normal serum is also about 10%.

14. The method according to item 1 and 9 to 13, characterized in that the cultivation temperature is 35 to 38 ⁰ C.

15. The method according to item 1 and 14, characterized in that cultured at 37 ° C.

16. The method according to item 1 and 9 to 15, characterized in that the CO ₂ content of the atmosphere over the culture medium is 2 to 10%.

17. The method according to item 16, characterized in that the CO ₂ content over the culture medium is 5%.

18. The method according to item 1 and 9 to 17, characterized in that above the culture medium high humidity prevails, which may extend to saturation of the atmosphere with water vapor.

19. The method according to item 1 and 9 to 18, characterized in that 3 to 4 days is cultivated.

20. The method according to item 1, characterized in that the cellular constituents are separated from the ascitic fluid obtained, the clear supernatant containing the monoclonal antibody BL-T2 or BL-T3 is either used directly or subjected to purification and enrichment operations or by precipitating the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid z. B. with 50% saturated (NH ₄ ) ₂ SO ₄ solution, receiving the precipitate in buffered saline, dialyzed against dilute NH ₄ HCO 3 solution and subsequent lyophilization in a permanent storage form is transferred.

21. The method according to item 1 and 20, characterized in that the separated cellular components, which consist mainly of cells of the hybridoma H-BL-T2 or H-BL-T3, washed with saline and can be injected again histocompatible mice.

22. The method according to item 1 and 20, characterized in that the mice used with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan o. The like. Be pretreated.

23. The method according to item 1, characterized in that a corresponding tumor stimulator is given 3 days to 6 weeks before Hybridominjektion.

24. The method according to item 1, characterized in that the lyophilized antibodies BL-T2 or BL-T3 are stored at +4 ⁰ C.