DD250333B1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTI-HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANTIBODYPER - Google Patents
PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTI-HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANTIBODYPER Download PDFInfo
- Publication number
- DD250333B1 DD250333B1 DD29174186A DD29174186A DD250333B1 DD 250333 B1 DD250333 B1 DD 250333B1 DD 29174186 A DD29174186 A DD 29174186A DD 29174186 A DD29174186 A DD 29174186A DD 250333 B1 DD250333 B1 DD 250333B1
- Authority
- DD
- German Democratic Republic
- Prior art keywords
- lymphocytes
- human
- antibodies
- monoclonal antibodies
- cell
- Prior art date
Links
- FADJUGSUYLCNJQ-UHFFFAOYSA-N CC(CCC1)C1=C Chemical compound CC(CCC1)C1=C FADJUGSUYLCNJQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
T-Lymphozyten selbst. Dieser antigenspezifische Rezeptor ist ein durch Disulfidbrücken verbundenes Heterodimer (Mol.-Gew. ca. 90000), welches aus einer α-Kette (Mol.-Gew. 49000-53000) und einer ß-Kette (Mol.-Gew. 41000-45000) zusammengesetzt ist (S. MEUER et al., Ann. Rev. Immunol. 2, S.23-50 [1984]).T lymphocytes themselves. This antigen-specific receptor is a disulphide-linked heterodimer (mol. Wt. About 90000) which consists of an .alpha.-chain (mol. Wt. 49000-53000) and a .beta.-chain (mol. 41000-45000) (S. MEUER et al., Ann., Rev. Immunol., 2: 23-50 [1984]).
Der variable Teil sowohl der α- als auch der ß-Kette wird erst während der ontogenetischen Differenzierung der T-Lymphozyten durch Neuanordnung von Genstücken (V, D, J) individuell gebildet und mit dem Gen für den konstanten Teil der α- bzw. ß-Kette vereinigt. Dieser Vorgang ist der eigentliche entscheidende Differenzierungsschritt, der einen Lymphozyten irreversibel als T-ZeIIe prägt. Der vergleichbare irreversible Prägeschritt für die B-Lymphozyten ist die Neuanordnung der V-, D- u. J-Genstücke der H- sowie der V- und J-Teile der L-Ketten der Immunglobuline, die sowohl als Rezeptor als auch als Sekretionsprodukt fungieren.The variable part of both the α- and the β-chain is formed individually during the ontogenetic differentiation of the T-lymphocytes by rearrangement of gene pieces (V, D, J) individually and with the gene for the constant part of α- or ß Chain united. This process is the actual decisive differentiation step that irreversibly marks a lymphocyte as a T cell. The comparable irreversible embossing step for the B lymphocytes is the rearrangement of the V-, D-, and. J gene fragments of the H, V, and J portions of the immunoglobulin L chains, which function as both a receptor and secretion product.
Der antigenspezifische Rezeptor der T-Lymphozyten kann bisher immunologisch nur durch sogenannte klonotypische Antikörper identifiziert werden (S.Meuer et al.. Nature 303, S.808, [1983]). Diese klonotypischen Antikörper binden jedoch nur jeweils den T-Zellrezeptor des zur Immunisierung verwendeten Zellklons. Diese Antikörper reagieren nicht mit den Rezeptoren anderer T-Zellklone und normaler Mischpöpulationen von T-Lymphozyten, wie sie im Blut oder den lymphoiden Organen normalerweise vorkommen. Damit haben solche Antikörper keinen generellen diagnostischen Wert.The antigen-specific receptor of T lymphocytes can hitherto be immunologically identified only by so-called clonotypic antibodies (S.Meuer et al., Nature 303, p. 808, [1983]). However, these clonotypic antibodies bind only each of the T cell receptor of the cell clone used for immunization. These antibodies do not react with the receptors of other T-cell clones and normal mixed populations of T-lymphocytes normally found in the blood or lymphoid organs. Thus, such antibodies have no general diagnostic value.
Borst et al. (The Journal of Immunology, 136 [2], 601, [1986]) beschreibt einen monoklonalen Antikörper, der mit bestimmten T-Zellrezeptor-Molekülen reagieren kann. Die von diesem monoklonalen Antikörper erkannte Determinante hat idiotypischen Charakter. Diese Determinante des T-Zellrezeptors wird nur von 3 bis maximal 13% der T-Lymphozyten exprimiert. Damit ist dieser monoklonale Antikörper nicht zur Bestimmung der Gesamtheit der Lymphozyten, die den α,β-Τ-Zellrezeptor tragen, geeignet. Der von Borst et al. beschriebene Antikörper ist insoweit nur zur Identifizierung einer Subpopulation von T-Lymphozyten befähigt.Borst et al. (The Journal of Immunology, 136 [2], 601, [1986]) describes a monoclonal antibody that can react with certain T cell receptor molecules. The determinant recognized by this monoclonal antibody has an idiotypic character. This T cell receptor determinant is only expressed from 3 to a maximum of 13% of T lymphocytes. Thus, this monoclonal antibody is not suitable for the determination of the whole of the lymphocytes carrying the α, β-Τ-cell receptor. Borst et al. described antibody is so far only capable of identifying a subpopulation of T lymphocytes.
Unter den durch die CD-Nomenklatur definierten Antikörpern sind die CD3-Antikörper von Bedeutung, weil sie mit unterschiedlichen Determinanten von 3 Membranproteinen (Mol.-Gew. 25000,20000 und 20000) reagieren, die auf der T-Zellmembran einen assoziierten, aber nicht kovalent verbundenen Komplex formieren, der seinerseits mit dem antigenspezifischen Rezeptor der T-Zellen assoziiert ist (H.d. Royer et al., Behring Inst. Mit. 77, S. 1-21 [1985]). In Ermangelung eines Anti-Rezeptor-Antikörpers für alle T-Lymphozyten gelten CD3-Antikörper als sicherste Nachweisreagenzien für humane T-Zellen. Die Unzulänglichkeit der CD3-Antikörper besteht darin, daß sie an Moleküle binden, die mehr oder weniger eng und regelmäßig mit dem eigentlichen antigenspezifischen Rezeptor der T-Zellen assoziiert sind. Die Expression derCD3-Antigene und des antigenspezifischen Rezeptors erfolgt offenbar korreliert, dies schließt jedoch nicht aus, daß beide Komponenten, besonders bei Immundefekten oder Neoplasien, auch einzeln ausgeprägt werden. Der alleinige Nachweis des CD3-Antigens führt in solchen Fällen ebenso zu Fehlinterpretationen wie die Determination einer Zelle als Nicht-T-Lymphozyt aufgrund des Fehlens des CD 3-Antigens.Among the antibodies defined by CD nomenclature, the CD3 antibodies are important because they react with different determinants of 3 membrane proteins (mole 25,000,20000 and 20,000) that associate with one another on the T cell membrane, but not covalently linked complex, which in turn is associated with the antigen-specific receptor of the T cells (Roy Royer et al., Behring Inst., Mit. 77, pp. 1-21 [1985]). In the absence of an anti-receptor antibody for all T lymphocytes, CD3 antibodies are considered to be the safest human T cell detection reagents. The inadequacy of the CD3 antibodies is that they bind to molecules that are more or less closely and regularly associated with the actual antigen-specific receptor of T cells. The expression of the CD3 antigens and of the antigen-specific receptor appears to be correlated, but this does not exclude that both components, especially in immunodeficiencies or neoplasias, are also individually expressed. The sole detection of the CD3 antigen in such cases also leads to misinterpretations as the determination of a cell as a non-T lymphocyte due to the absence of the CD 3 antigen.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörperfür den antigenspezifischen Rezeptor (Mol.-Gew. ca. 90000, Dimer aus α- und ß-Kette) der humanen T-Lymphozyten gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest für T-Lymphozyten aufgrund der Ausprägung eines antigenspezifischen Rezeptors, dem sichersten und schärfsten Kriterium für die Identifikation eines Lymphozyten als T-ZeIIe, eignen. Durch die Zurverfügungstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die Diagnostik qualifiziert werden.The object of the invention is to provide a process for producing monoclonal antibodies which can easily control the cost-effective production of larger quantities of specific antibodies for the antigen-specific receptor (molecular weight about 90000, α- and β-chain dimers) of the human T lymphocytes allowed. It should be ensured consistent quality. The monoclonal antibodies should be stable and thus storable and suitable for use in a simple detection assay for T lymphocytes due to the expression of an antigen-specific receptor, the safest and most stringent criterion for the identification of a lymphocyte as a T cell. By providing such monoclonal antibodies, the diagnosis should be qualified.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit dem antigenspezifischen Rezeptor der humanen T-Lymphozyten reagieren.The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which hybridomas are first generated, which are easy and inexpensive to handle and their cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using these hybridomas, monoclonal antibodies which react with the antigen-specific receptor of the human T lymphocytes are to be generated in subsequent process steps.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus peripherem Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle werden daraus T-Lymphozyten gewonnen. Eine zweite Variante der T-Lymphozytengewinnung besteht darin, aus humanem Thymus eine Zellsuspension herzustellen und die Bindegewebsanteile durch Dichtegradientenzentrifugation abzutrennen.The object is achieved by first isolating lymphocytes from peripheral blood from healthy donors by the known methods of density gradient centrifugation. By passage over nylon wool T lymphocytes are obtained. A second variant of the T-lymphocyte recovery is to produce a cell suspension from human thymus and to separate the connective tissue fractions by density gradient centrifugation.
Mit in der vorstehend beschriebenen oder auf eine andere Weise gewonnenen humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.Mice are immunized with human T lymphocytes obtained in the manner described above or otherwise. Preferably, 6-8 week old female BALB / c mice are used. The immunization is carried out by repeated application of the antigen. From the spleens of such hyperimmunized mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner.
Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die geeigneten Maus-B-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J.Immunol. 123, [1979] S. 1548) werden in RPMI-1640mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science, 145, [1964], S. 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezenieren.The B lymphocytes of this cell mixture are fused or hybridized with mouse B myeloma cells. The appropriate mouse B myeloma cells P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979] p. 1548) are grown in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum (FCS). In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (LITTLEFIELD, Science, 145, [1964], p. 709), the hybrid cells formed are separated from the unfused myeloma cells and, according to the invention, cell clones are selected which secrete antibodies of the desired specificity.
Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-Ml-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosettentechnik und/oder Nylonwolleseparation gewonnen werden, getestet.The selection of the hybridomas is done by dividing the cells immediately after the fusion into a plurality of separate 200 Ml cultures. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react only with cell surface antigens of human T-lymphocytes. For this purpose, all culture supernatants which react with human blood lymphocytes are tested with B lymphocytes, which are obtained by elimination of the T cells by E-rosette technique and / or nylon wool separation.
Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Zellen reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen. So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch auf jeden Fall mit der Immunfluoreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit B-Lymphozyten, Non-B/Non-T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren. Unter den in solcher Art vorselektierten Hybridomen werden nun erfindungsgemäß solche gesucht, deren Antikörper in der Lage sind, mit einem T-Zelloberflächenprotein von ca. 90000 Da, welches nach Reduktion der Disulfidbrücken in zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von ca. 41000-45000 und 49000-53000 zerfällt, zu reagieren. Dazu werden die Oberflächenproteine von peripheren humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert oder anderweitig markiert. Die Nonidet P-40-Lysate solcher markierten T-Zellen werden mit den zu untersuchenden Hybridomkulturüberständen inkubiert und anschließend die monoklonalen Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert. Die von unspezifisch gebundenen Komponenten freigewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodezylsulfat-Puffer aufgelöst, bei einem Aliquot die Disulfidbrücken der Proteine reduziert, und anschließend beiden Proben einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5-10%) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten T-Zellantigene bzw. deren Polypeptidketten bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, die mit einem Zelloberflächenantigen von humanen T-Lymphozyten reagieren, welches im unreduzierten Zustand ein app. Molekulargewicht von ca. 90000 und nach Reduktion 2 Polypeptidketten im Molekulargewichtsbereich von 40000-55000 aufweist.Only the cultures continue to be used whose antibodies do not react with B lymphocytes, but with the vast majority of blood lymphocytes and all separated T cells. The testing of the culture supernatants with the corresponding cells can be carried out both by indirect radio-binding technique and by indirect immunofluorescence. However, cultures selected in this way must definitely be checked with the immunofluorescence technique from this stage. This precludes the ability to continue the production of hybridomas whose antibodies react with B lymphocytes, non-B / non-T cells, monocytes, granulocytes, platelets and erythrocytes. According to the invention, among the hybridomas preselected in such a manner are those whose antibodies are capable of carrying a T cell surface protein of about 90,000 Da, which, after reduction of the disulfide bridges, into two polypeptide chains having molecular weights of about 41,000-45,000 and 49,000. 53000 decays to react. For this purpose, the surface proteins of peripheral human T-lymphocytes are radioiodinated or otherwise labeled according to the Lactoperoxidasemethode. The Nonidet P-40 lysates of such labeled T cells are incubated with the hybridoma culture supernatants to be examined and then the mouse monoclonal antibodies are precipitated by addition of anti-mouse immunoglobulin serum. The precipitate washed free of unspecifically bound components is dissolved in sodium dodecyl sulfate buffer, the disulfide bridges of the proteins reduced in one aliquot, and then subjected to both samples of NDS electrophoresis on polyacrylamide gels (5-10%). By reference proteins, the apparent molecular weight of the radioiodinated, specifically separated by the monoclonal antibody T cell antigens or their polypeptide chains is determined. Those hybridomas are selected which react with a cell surface antigen of human T-lymphocytes which has an app. Molecular weight of about 90,000 in the unreduced state and 2 polypeptide chains in the molecular weight region of 40000-55000 after reduction.
Im dritten Selektionsschritt werden erfindungsgemäß die monoklonalen Antikörper der so ausgewählten Hybridome geprüft, ob das von ihnen erkannte Antigen mit dem CD 3-Komplex reifer, humaner T-Zellen assoziiert ist.In the third selection step, according to the invention, the monoclonal antibodies of the hybridomas selected in this way are checked as to whether the antigen recognized by them is associated with the CD 3 complex of mature, human T cells.
Dazu wird der CD 3-Komplex und mit ihm der antigenspezifische Rezeptor durch einen modulierenden CD 3-Antikörper von den Oberflächen der T-Lymphozyten entfernt. Dies erreicht man durch Inkubation der T-Zellen mit geeigneten Antikörperkonzentrationen für 24 Stunden bei +37°C. Unter den Plan-T-Lymphozyten-Hybridomen, deren monoklonale Antikörper ein obengenanntes Heterodimer binden, werden erfindungsgemäß diejenigen ausgewählt, die vor der Modulation mit allen T-Lymphozyten reagieren, nach der Entfernung des CD 3/T-Zellrezeptor-Komplexes durch einen modulierenden CD 3-Antikörper von den T-Zellen nicht mehr an eine Zelloberflächenstruktur dieser Lymphozyten binden. Die durch derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil produzieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TRec bezeichnet. Besonders geeignet ist der Zeilklon H-BL-TRec/1. Die Herstellung der monoklonalen Anti-T-Zell-Rezeptor-Antikörper BL-TRec/1 basiert auf einem Verfahren, welches auf der Verwendung des Hybridoms H-BL-TRec/1 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-TRec/1 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviert vor und ist zugänglich.For this purpose, the CD 3 complex and with it the antigen-specific receptor by a modulating CD 3 antibody is removed from the surfaces of the T lymphocytes. This is achieved by incubating the T cells with appropriate antibody concentrations for 24 hours at + 37 ° C. Among the plan T lymphocyte hybridomas whose monoclonal antibodies bind an above-mentioned heterodimer, according to the invention those are selected which react with all T lymphocytes before modulation after removal of the CD 3 / T cell receptor complex by a modulating CD 3 antibodies from the T cells no longer bind to a cell surface structure of these lymphocytes. The hybridomas obtained by such selection are recloned and highly productive subclones are selected which stably produce the desired monoclonal antibodies. The hybridomas thus obtained are referred to as H-BL-TRec. Particularly suitable is the Zeilklon H-BL-TRec / 1. The preparation of the anti-T cell receptor monoclonal antibody BL-TRec / 1 is based on a method which is directed to the use of the hybridoma H-BL-TRec / 1. The hybridoma H-BL-TRec / 1 is cultivated at the Life Sciences Section of the Karl Marx University in Leipzig. It is cryopreserved and accessible.
Das Hybridom H-BL-TRec/1 produziert bei In-vitro-Kultur bis zu 100цд/тІ monoklonalen Antikörper BL-TRec/1. Für die Gewinnung größerer Mengen dieses Antikörpers wird das Hybridom H-BL-TRec/1 in histokompatible BALB/c-Mause i. p. injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl., vorbehandelt wurden.The hybridoma H-BL-TRec / 1 produces up to 100% monoclonal antibody BL-TRec / 1 in vitro culture. For the recovery of larger amounts of this antibody, the hybridoma H-BL-TRec / 1 in histocompatible BALB / c mice i. p. injected. It is advantageous if the mice used were pretreated with a tumor stimulator such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like.
Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen.After ascites formation, which becomes visible by swelling, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-TRec / 1 is removed by puncture.
Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-TRec/1. Die Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt einer weiteren Reinigung unterzogen. Zu letzterem kommen Salzpräzipitationen, DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage. Die Aszitesflüssigkeit erhält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-10 mg BL-TRec/1 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml. Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH4)2SO4-Lösung, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen.From the ascites fluid, the cellular components are separated, z. B. by centrifugation. The cellular part consists predominantly of cells of the hybridoma H-BL-TRec / 1. The cells are washed in physiological saline and conveniently injected into new pretreated mice. The cell-free supernatant containing the monoclonal antibody BL-TRec / 1 is subjected to further purification either directly or in a suitable dilution. For the latter are salt precipitations, DEAE ion exchange chromatography, protein A adsorption, affinity chromatography o. The like. In question. In the process according to the invention, the ascitic fluid receives 5-10 mg of BL-TRec / 1 per ml of fluid. Enrichment leads to a product with an antibody content of approx. 20 mg / ml. To produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascites fluid is precipitated, for. B. with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 solution, and taken up in buffered saline.
Dialyse gegen HN4HCO3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei 4°C haltbar ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die zur Antikörperproduktion befähigten Hybridomzellen H-BL-TRec/1 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Durch Verkapselung oder Einbringung in Hohlfasersysteme kann die Zelldichte und die Antikörperausbeute erhöht werden. Nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre wird das antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH4)2SO4 behandelt und somit eine Gammaglobulinfraktion ausgefällt. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o.dgl. möglich.Dialysis against HN 4 HCO 3 solution results in a lyophilizable product that is lyophilized at 4 ° C. In another embodiment of the invention, the hybridoma cells H-BL-TRec / 1 capable of producing antibodies are cultivated in a culture medium supplemented with serum in mass culture. Encapsulation or incorporation into hollow fiber systems can increase cell density and antibody yield. After appropriate cultivation in a CO 2 -containing atmosphere, the culture medium containing the antibody is treated with 50% saturated (NH 4 ) 2 SO 4 and thus a gamma globulin fraction is precipitated. Further purification of the antibody is according to known methods such as gel filtration, ion exchange chromatography or the like. possible.
Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"5M Mercaptoethanol, 100 mg/1 Gentamycin versetzt ist.It is expedient to use MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPM 11640 or the like as the culture medium. Particularly favorable is the use of RPM11640, which is added in a preferred embodiment of the invention with 1OmM HEPES, 5 x 10 " 5 M mercaptoethanol, 100 mg / 1 gentamycin.
Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35 und 38°C. Vorteilhaft ist es bei 37°C zu kultivieren. Der CO2-GeIIaIt der Atmosphäre über dem Medium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kulturdauer von 3 bis 4 Tagen. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt. Die nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellten monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 weisen das in Tabelle 1 angegebene Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Mit permanent wachsenden humanen Zellinien reagieren sie in der in Tabelle 2 dokumentierten Art und Weise.As a serum supplement is fetal calf serum or normal horse serum with a proportion of the culture medium of 5 to 20%. It is advantageous to work with a serum content of 10%. The temperature of the culture medium is between 35 and 38 ° C. It is advantageous to cultivate at 37 ° C. The CO 2 concentration of the atmosphere over the medium is favorably 2 to 10%, in particular 5%. The advantage is a high humidity, which can reach saturation of the atmosphere. The cultivation of the hybridoma takes place over a customary period of several days. It is expedient for a culture period of 3 to 4 days. Thereafter, the medium is changed and the cell count is adjusted again to an optimal initial value. The monoclonal antibodies BL-TRec / 1 prepared according to one of these process variants have the reaction pattern with human blood cells given in Table 1. With permanently growing human cell lines, they react in the manner documented in Table 2.
(Abb. 2).(Fig. 2).
z. B. CD 2 nicht beeinflußt werden (Abb. 3). Das vom BL-TRec/1 gebundene T-Zeilantigen ist ein Heterodimer (Mol.-Gew. ca.z. B. CD 2 are not affected (Fig. 3). The T-cell antigen bound by the BL-TRec / 1 is a heterodimer (mol. Wt.
90000), welches aus 2 Ketten mit apparenten Molekulargewichten von ca. 45000 und 51000 besteht.90000), which consists of 2 chains with apparent molecular weights of about 45,000 and 51,000.
1 Lymphozyten des peripheren Blutes.1 lymphocytes of the peripheral blood.
2 E+-Lymphozyten.2 E + lymphocytes.
3 E",lg+-Lymphozyten.3 E ", Ig + lymphocytes.
4 E~,lg~-Lymphozyten.4 E ~, lg ~ lymphocytes.
CCRF-CEMCCRF-HSB-2MOLT-4CCRF-HSB-CEMCCRF 2MOLT-4
JURKAT O-ZellinienNALM-6JURKAT O cell lines NALM-6
REH B-ZellinienDAUDIHMy-2REH B cell lines DAUDIHMy-2
RAJI Myeloide Linien HL-60RAJI myeloid lines HL-60
U-937 Erythroide Linie K-562U-937 erythroid line K-562
Abbildung 1illustration 1
Histogramm von indirekt durch den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 markierten T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut. Zelldurchflußzytometrie mittels FACS 440.Histogram of peripheral blood T lymphocytes indirectly detected by monoclonal antibody BL-TRec / 1. Cell flow cytometry using FACS 440.
Abbildung 2Figure 2
Die gleichen Lymphozyten wie in Abb. 1 nach Modulierung mit einem CD 3-Antikörper (24h, 37°C) und nach indirekter Immunfluoreszenz mit BL-TRec/1.The same lymphocytes as in Fig. 1 after modulation with a CD 3 antibody (24h, 37 ° C) and after indirect immunofluorescence with BL-TRec / 1.
Die fehlende Anfärbung ist .auf die Komodulation des Antigens mit dem CD 3-Antigenkomplex zurückzuführen.The lack of staining is due to the comodulation of the antigen with the CD 3 antigen complex.
Abbildung 3Figure 3
Oberer Teil: Markierung der humanen T-Zellen von Blut-Lymphozyten mit BL-TRec/1 ( ), CD 3-Antikörpern ( ) und einemUpper part: Labeling of Human T-cells from Blood Lymphocytes with BL-TRec / 1 (), CD3 Antibodies () and One
CD 2-Antikörper ( ).CD 2 antibody ().
Unterer Teil: Modulierung derT-Zellen mit BL-TRec/1.Lower part: Modulation of T cells with BL-TRec / 1.
Das CD 3-Antigen komoduliert, während das CD 2-Antigen unverändert exprimiert wird.The CD 3 antigen is comodulated while the CD 2 antigen is expressed unaltered.
Histogramme der Analyse am FACS 440.Histograms of the analysis on FACS 440.
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD29174186A DD250333B1 (en) | 1986-06-27 | 1986-06-27 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTI-HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANTIBODYPER |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DD29174186A DD250333B1 (en) | 1986-06-27 | 1986-06-27 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTI-HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANTIBODYPER |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DD250333A1 DD250333A1 (en) | 1987-10-08 |
DD250333B1 true DD250333B1 (en) | 1991-04-25 |
Family
ID=5580284
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DD29174186A DD250333B1 (en) | 1986-06-27 | 1986-06-27 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTI-HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANTIBODYPER |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DD (1) | DD250333B1 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5766947A (en) * | 1988-12-14 | 1998-06-16 | Astra Ab | Monoclonal antibodies reactive with an epitope of a Vβ3.1 variable region of a T cell receptor |
-
1986
- 1986-06-27 DD DD29174186A patent/DD250333B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DD250333A1 (en) | 1987-10-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE19608769C1 (en) | Monoclonal antibody BV10A4H2 specific for human FLT3/FLK2 receptor | |
DE3346336C2 (en) | ||
CH652145A5 (en) | METHOD FOR IN VITRO PRODUCTION OF HYBRID OMEN WHAT human monoclonal antibodies GENERATE. | |
EP0657533A1 (en) | Monoclonal antibodies with high cytotoxicity against the human CD16 antigen, and bispecific monoclonal antibodies using such monoclonal antibodies and the CD30-HRS-3 antibody | |
EP0241811B1 (en) | Monoclonal antibodies against the human interleukin-2 receptor | |
DE19727814C1 (en) | Monoclonal antibody specific for human tyrosine kinase receptor protein | |
DE3490527C2 (en) | ||
DD250333B1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTI-HUMAN T-LYMPHOCYTE RECEPTOR ANTIBODYPER | |
DD272473B3 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE EPSILON CHAIN OF CD 3 ANTIGEN HUMAN T-LYMPHOCYTES | |
DE19708877C1 (en) | Monoclonal antibody specific for megakaryocytes | |
DD238168A3 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MONOCLONAL ANTICOERPER | |
DD259139A1 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IDENTIFYING NON-T, NON-B ACIDS OF LYMPHOBLASTIC LEUKAEMIA | |
DD272472A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A 50 KDA ANTIGEN HUMAN T-LYMPHOCYTES | |
DD267737A1 (en) | PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST EPITOPES OF A 67 KDA CELL SURFACE ANTIGEN HUMAN T-LYMPHOCYTES AND B CLL | |
DD297899A7 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A 40 KDA ANTIGEN HUMAN T-LYMPHOCYTES | |
DD267738A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A GP 120 ANTIGEN HUMAN T-LYMPHOCYTES | |
DD259138A1 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE ACTIVATING AGENT | |
DD230884A1 (en) | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMAN IGG | |
DD272471B3 (en) | Process for the preparation of monoclonal antibodies against the IL-2 receptor of human T-lymphocytes | |
DD272471A1 (en) | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST THE IL-2 RECEPTOR OF HUMAN T-LYMPHOCYTES | |
DD230882B1 (en) | METHOD FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR A MONOCYTE ANTIGEN | |
DD243184A3 (en) | Process for the preparation of monoclonal antibodies for L chains | |
DD230879B1 (en) | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMAN IGM | |
DE3634017A1 (en) | Method for the activation and multiplication of T-cells, in particular of subpopulations thereof | |
DD230883B1 (en) | PROCESS FOR PREPARING MONOCLONAL ANTIBODY FOR HUMANES IGA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RPI | Change in the person, name or address of the patentee (searches according to art. 11 and 12 extension act) | ||
ENJ | Ceased due to non-payment of renewal fee |