DD259138A1 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE ACTIVATING AGENT - Google Patents
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- DD259138A1 DD259138A1 DD30098787A DD30098787A DD259138A1 DD 259138 A1 DD259138 A1 DD 259138A1 DD 30098787 A DD30098787 A DD 30098787A DD 30098787 A DD30098787 A DD 30098787A DD 259138 A1 DD259138 A1 DD 259138A1
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Abstract
Das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper, die zum Nachweis von aktivierten Lymphozyten kurzfristig nach deren Stimulierung geeignet sind, hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groeszerer Mengen solcher Antikoerper zu ermoeglichen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, welche leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschlieszenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden. Die Aufgabe wird durch die Herstellung des Hybridoms H-BL-Ac/p26 mittels Zellfusion, dessen Kultivierung in vitro und in vivo sowie der Separierung und Reindarstellung des monoklonalen Antikoerpers BL-Ac/p26 geloest. Der monoklonale Antikoerper BL-Ac/p26 reagiert mit einem bisher unbekannten Zelloberflaechenantigen p26, welches aus einer einzelnen Polypeptidkette mit einer relativen Molekularmasse von 26 000 Da besteht. Dieses Antigen wird kurz nach der Aktivierung von Lymphozyten durch Antigene, Mitogene oder Anti-Rezeptorreagenzien auf der Zelloberflaeche exprimiert und kann durch den Antikoerper BL-Ac/p26 durch direkte oder indirekte Nachweisverfahren bestimmt werden. Der Antikoerper eignet sich fuer diagnostische Tests zum Nachweis aktivierter humaner Lymphozyten.{monoklonale Antikoerper; aktivierte Lymphozyten; Herstellung eines Hybridoms; Zelloberflaechenantigen p26; Nachweis aktivierter Lymphozyten}The aim of the process for producing monoclonal antibodies suitable for the detection of activated lymphocytes shortly after their stimulation is to make it possible, in a readily controllable manner, to produce relatively large quantities of such antibodies in a cost-effective manner. The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which hybridomas are first generated, which are easy and inexpensive to handle and their cultivation in technically and economically advantageous manner is possible. Using these hybridomas, monoclonal antibodies are to be generated in subsequent procedural steps. The object is achieved by the production of the hybridoma H-BL-Ac / p26 by means of cell fusion, its cultivation in vitro and in vivo as well as the separation and purification of the monoclonal antibody BL-Ac / p26. The monoclonal antibody BL-Ac / p26 reacts with a hitherto unknown cell surface antigen p26, which consists of a single polypeptide chain with a relative molecular mass of 26,000 Da. This antigen is expressed shortly after the activation of lymphocytes by antigens, mitogens or anti-receptor reagents on the cell surface and can be determined by the antibody BL-Ac / p26 by direct or indirect detection methods. The antibody is suitable for diagnostic tests for the detection of activated human lymphocytes. {Monoclonal antibodies; activated lymphocytes; Production of a hybridoma; Cell surface antigen p26; Detection of activated lymphocytes}
Description
Hierzu 2 Seiten ZeichnungenFor this 2 pages drawings
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der mit einem Zeiloberflächenmolekül reagiert, welches vori Lymphozyten relativ schnell nach Aktivierung exprimiert wird. Dadurch ist dieser monoklonale Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane Lymphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immunologischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Auch eine Nutzung des monoklonalen Antikörpers zur Eliminierung der aktivierten Lymphozyten ist möglich.The invention relates to a method for producing a monoclonal antibody which reacts with a cell surface molecule expressed relatively early in lymphocytes after activation. Thus, this monoclonal antibody is useful as a detection reagent for activated human lymphocytes which are found in various diseases involving immunological components, infectious diseases, lymphocytic neoplasia and transplantation crises. It is also possible to use the monoclonal antibody for the elimination of the activated lymphocytes.
Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions
Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg. E. L. Reinherz, B. F. Haynes, L. M.Nadler u. I.D.Bernstein: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystem und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktionellen Subpopulation im peripheren Blut nur bei sehr drastischen Störungen und Reaktionen des Immunsystems erfolgen, so daß immunologische Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Ahti-Subpopulations-Antikörpem erfaßt werden können.Progress of differentiation of lymphocytes fulfilling different functions by monoclonal antibodies (Leukocyte Typing II, Vol. 1-3, Ed. EL Reinherz, BF Haynes, LM Nadler and ID Bernstein: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) have significantly improved the diagnostics of diseases with immunological components, neoplasms of the immune system and the monitoring of transplants. It has been found, however, that changes in the levels of functional subpopulation in peripheral blood occur only in very drastic disorders and reactions of the immune system, so that immunological reactions, as far as they are within the normal physiological range, are not reliably detected with Ahti subpopulation antibodies can be.
Lymphozyten, die.durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr Zelloberflächenantigenmuster. Der durch die Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf andere physiologische Leistungen. Es werden Rezeptoren für Interleukine, wie z. B. das IL-2, Hormone, Nährstoffe und modifizierende Komponenten entweder neu oder verstärkt exprimiert.Lymphocytes activated by antigens, mitogens or monoclonal antibodies to certain cell surface antigens qualitatively and quantitatively alter their cell surface antigen pattern following this activation. Activation-induced entry into the cell cycle requires adjustment of the cell for other physiological benefits. There are receptors for interleukins, such. For example, the IL-2, hormones, nutrients and modifying components are either expressed new or enhanced.
Diese Veränderungen sind Voraussetzung für DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktioneile Enddifferenzierung.These changes are prerequisite for DNA synthesis, mitosis, proliferation and functional end-differentiation.
Die Aufklärung der Veränderungen desZelloberflächenmoleküls steht erst am Anfang. Einige dieser Veränderungen konnten schon durch die Markierung der Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden. Außer dem IL-2-Rezeptor (Mol.-Gew.The elucidation of cell surface molecule changes is just beginning. Some of these changes could already be detected by labeling the antigens with monoclonal antibodies. Except for the IL-2 receptor (Mol. Wt.
ca. 55000Da), der durch den Anti-Tac-Antikörper nachgewiesen werden kann (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732), sind monoklonale Antikörper gegen denTransferrinrezeptor (Mol.-Gew. 190000Da; GODING u. BURNS: J. Immunol. 127 [1981] 1256-1258) bekanntgeworden.55000Da), which can be detected by the anti-Tac antibody (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732), are monoclonal antibodies to the transferrin receptor (Mol.wt. 190000Da; GODING and BURNS: J. Med. Immunol., 127 [1981] 1256-1258).
Weiterhin sind monoklonale Antikörper beschrieben worden, die mit Zelloberflächenantigenen unbekannter Funktion reagieren, die jedoch nach Aktivierung erst verstärkt exprimiert werden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonalen Antikörper 4F4 (Mol.-Gew. 80000/40000Da; HAYNES et al.: J. Immunol. 126, [1981], 1409), der CDw26-Gruppe (Mol.-Gew. 120000, 200000 Da; Leukocyte Typing II. Vol. 1, Hrsg. E. L. REINHERZ, B. F. HAYNES, L. M. NADLER u. I. D. BERNSTEIN: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) und derCD30-Gruppe (Mol.-Gew. 95000/130000Da; WORKSHOP-Report des III. Leukocyte Differentiation Antigen Workshops, 1986, Oxford) erkannt werden.Furthermore, monoclonal antibodies have been described which react with cell surface antigens of unknown function, but which are first expressed to a greater extent after activation. These include the antigens identified by the monoclonal antibodies 4F4 (Mol.wt., 80000 / 40000Da, HAYNES et al .: J. Immunol., 126, [1981], 1409), the CDw26 group (mol.wt. , 200,000 Da, Leukocyte Typing II, Vol 1, eds EL REINHERZ, BF HAYNES, LM NADLER and ID BERNSTEIN: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) and the CD30 group (mol.wt. 95,000 / 130000Da; WORKSHOP Report of the III. Leukocyte Differentiation Antigen Workshop, 1986, Oxford).
Aber auch die Ia-Antigene sind als Aktivierungsmarker von humanen T-Lymphozyten geeignet (DD-PS 230877).But the Ia antigens are suitable as activation marker of human T lymphocytes (DD-PS 230877).
Als früheste Veränderung des Antigenmusters von aktivierten Lymphozyten, besonders T-Lymphozyten, gilt das Auftreten des IL-2-Rezeptors, welcher ungefähr 6 h nach der Aktivierung vermehrt exprimiert wird (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732).The earliest change in the antigenic pattern of activated lymphocytes, especially T lymphocytes, is the appearance of the IL-2 receptor, which is expressed more extensively about 6 hours after activation (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732).
Für diagnostische Zwecke ist es jedoch auch von Bedeutung, die früheste Phase der Aktivierung unabhängig vom Erscheinen des IL-2-Rezeptors sicher durch monoklonale Antikörper zu erfassen. Dazu sind monoklonale Antikörper prinzipiell geeignet, jedoch sind keine bekannt, die als Nachweisreagenzien für die frühe Phase der Aktivierung von Lymphozyten geeignet sind und nicht auf der Bindung an den IL-2-Rezeptor beruhen.However, for diagnostic purposes, it is also important to securely detect the earliest phase of activation by monoclonal antibodies, regardless of the appearance of the IL-2 receptor. For this purpose, monoclonal antibodies are in principle suitable, but none are known which are suitable as detection reagents for the early phase of the activation of lymphocytes and are not based on the binding to the IL-2 receptor.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der Zeiloberflächenveränderungen von Lymphozyten, besonders von T-Zellen, erfaßt, die relativ schnell nach deren Aktivierung durch Antigene, analog wirkende Antikörper oder Mitogene vonstattengehen, anzugeben, das in leicht beherrschbare Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses Nachweisreagenzes gestattet.The invention aims to provide a method for producing a monoclonal antibody which detects cell surface changes of lymphocytes, especially T cells, which are relatively fast upon activation by antigens, analogous antibodies or mitogens, in an easily controlled manner the cost-effective production of larger amounts of this detection reagent allowed.
Das Verfahren soll gleichbleibende Qualität des monoklonalen Antikörpers gewährleisten. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest von aktivierten humanen Lymphozyten eignen.The method is intended to ensure consistent quality of the monoclonal antibody. The monoclonal antibodies should be stable and therefore storable and suitable for use in a simple detection assay of activated human lymphocytes.
Durch die Bereitstellung eines solchen Antikörpers soll die medizinische Diagnostik, besonders von Infektionskrankheiten, von Rejektionskrisen bei Transplantationen und von Neoplasien im Immunsystem, verbessert werden.The provision of such an antibody is intended to improve medical diagnostics, in particular of infectious diseases, of rejection crises in transplants and of neoplasms in the immune system.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms sollen in anschließenden Verfahrensschritten ein monoklonaler Antikörper erzeugt werden, der mit einem besonders geeigneten, bisher unbekannten Zelloberflächenantigen von Lymphozyten, die aktiviert worden sind, reagiert.The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which a hybridoma is first generated, which is easy and inexpensive to handle and its cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using this hybridoma, subsequent monoclonal antibodies are to be generated which react with a particularly suitable, previously unknown cell surface antigen of lymphocytes that have been activated.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß 6-8 Wochen alte, weibliche BALB/c-Mäuse mit humanen aktivierten T-Lymphozyten immunisiert werden.The object is achieved by immunizing 6-8 week old female BALB / c mice with human activated T lymphocytes.
Die aktivierten T-Lymphozyten werden durch Behandlung humaner peripherer Blutlymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 (DD-PS 291741), der spezifisch mit dem antigenspezifischen Rezeptor/CD3-Komplex reagiert, erzeugt. Durch die Behandlung mit BL-TRec/1 werden die T-Lymphozyten in einer Art und Weise aktiviert, die der Aktivierung durch ein Antigen sehr ähnlich ist. Im Gegensatz zur klonalen Aktivierung durch ein Antigen, wird durch dieses Verfahren jedoch die Mehrheit der Gesamt-T-Lymphozytenpopulation aktiviert.The activated T lymphocytes are produced by treating human peripheral blood lymphocytes with the monoclonal antibody BL-TRec / 1 (DD-PS 291741), which reacts specifically with the antigen-specific receptor / CD3 complex. Treatment with BL-TRec / 1 activates T lymphocytes in a manner very similar to activation by an antigen. Unlike clonal activation by an antigen, however, this method activates the majority of the total T lymphocyte population.
Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation solcher aktivierten T-Zellen. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Mausmyelomzellen fusioniert. Die geeigneten Myelomzellen P3-X63-Ag8,653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPM1-1640 mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. In einem Kulturmedium,welchesHypoxanthin,Aminopterinund Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die erfindungsgemäße Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenen Kulturen werden auf die'Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Oberflächenantigenen von aktivierten T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände im ersten Selektionsschritt auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit BL-TRec/1 -aktivierten T-Lymphozyten, nicht aber mit ruhenden peripheren Blutlymphozyten reagieren. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nur an aktivierte T-Lymphozyten, nicht aber an ruhende Zellen binden. Im zweiten Seiektionsschritt werden diejenigen Kulturen selektiert, deren Antikörper mit andersartig aktivierten Lymphozyten reagieren. Dazu werden sowohl durch bestrahlte allogene Leukozyten erzeugte Blasten (MLC-Blasten) als auch mitogenstimulierten Lymphoblasten (Phythämagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed Mitogen) eingesetzt. Nur entsprechend reagierende Antikörper produzierende Hybridzellen werden weiter kultiviert.The immunization is carried out by repeated application of such activated T cells. From the spleens of such hyperimmunized mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused with mouse myeloma cells. The appropriate myeloma cells P3-X63-Ag8,653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) are cultured in RPM1-1640 with 10% fetal calf serum. In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), the hybrid cells formed are separated from the unfused myeloma cells and cell clones are selected which secrete antibodies of the desired specificity. The selection of the hybridomas according to the invention is carried out in such a way that the cells are divided into a plurality of separate 200 μl cultures immediately after the fusion. The supernatants of the cultures containing the mature hybrid cells are tested for the presence of antibodies that react only with surface antigens of activated T lymphocytes. For this purpose, all culture supernatants are tested in the first selection step for the presence of antibodies that react with BL-TRec / 1 -activated T-lymphocytes, but not with resting peripheral blood lymphocytes. Only the cultures are still used whose antibodies bind only to activated T lymphocytes, but not to resting cells. In the second seeding step, those cultures are selected whose antibodies react with differently activated lymphocytes. Both blasts produced by irradiated allogeneic leukocytes (MLC blasts) and mitogen-stimulated lymphoblasts (phythemagglutinin, concanavalin A, pokeweed mitogen) are used for this purpose. Only appropriately reactive antibody-producing hybrid cells are cultivated further.
Im dritten Selektionsschritt wird geprüft, daß diese ausgewählten Hybridomkulturen keine Antikörper enthalten, die mit Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten und Granulozyten reagieren.In the third selection step, it is checked that these selected hybridoma cultures do not contain antibodies which react with erythrocytes, platelets, monocytes and granulocytes.
Im vierten Selektionsschritt werden erfindungsgemäß die Hybridzellkulturüberstände mit aktivierten Lymphozyten, zu unterschiedlichen Zeiten nach Stimulierung, geprüft. Dabei werden Hybridome selektiert, die mit Lymphozyten schon wenige Stunden nach deren Stimulierung reagieren. Die geeigneten Hybridzellkulturen werden rekloniert und produktive Subklone selektiert. Diese erfindungsgemäße Selektionsstrategie führt zu Hybridomen, die den in der Zielstellung aufgestellten Anforderungen gerecht werden. Besonders günstige Eigenschaften weist das Hybridom H-BL-Ac/p26 auf. Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers BL-Ac/p26, der mit einem frühzeitig nach der Aktivierung von Lymphozytenexprimierten Antigen reagiert, basiert auf einem Verfahren, weichesauf die Verwendung des Hybridoms H-BJ.-Ac/p26 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-Ac/p26 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviertvor und ist zugänglich. Der monokionale Antikörper BL-Ac/p 26 bzw. das ihn sezernierende Hybridom hat die Registriernummer DDR - 0148 im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Für die Kultivierung ist zweckmäßig als Medium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das'in einer bevorzugten Ausführungsform mit 1OmM HEPES, 5 χ 10"5M Mercaptoethanol und 100ml/! Genamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder ein anderes geeignetes Serum, z. B. Pferdeserum, mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es, mit einem Anteil von 10% zu arbeiten. Vorteilhaft ist es weiterhin, bei37°Czu kultiveren. Der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Von Vorteil ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei die Kuiturdauer von 3-4Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt.In the fourth selection step, according to the invention, the hybrid cell culture supernatants are tested with activated lymphocytes at different times after stimulation. Hybridomas are selected that react with lymphocytes a few hours after their stimulation. The appropriate hybrid cell cultures are recloned and productive subclones selected. This selection strategy according to the invention leads to hybridomas that meet the requirements set in the objective. The hybridoma H-BL-Ac / p26 has particularly favorable properties. The preparation of the monoclonal antibody BL-Ac / p26, which reacts with an antigen expressed early after activation of lymphocytes, is based on a method directed to the use of the hybridoma H-BJ.Ac / p26. The hybridoma H-BL-Ac / p26 is cultured at the Life Sciences Section of the Karl Marx University in Leipzig. It is cryopreserved and accessible. The monoclonal antibody BL-Ac / p 26 or the hybridoma secreting it has received the registration number DDR-0148 in the Central Institute for Molecular Biology of the AdW of the GDR. For cultivation it is expedient to use MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPM 11640 or the like as the medium. It is particularly favorable to use RPM11640, das'in a preferred embodiment, with 1OmM HEPES, 5 χ 10 "5 M mercaptoethanol and 100ml! Genamycin is offset /. Fetal calf serum or other suitable serum, z. B. horse serum is used as the addition of serum, It is advantageous to work with a proportion of 10% and it is also advantageous to cultivate at 37 ° C. The CO 2 content of the atmosphere above the medium is 5% in the most favorable case. It is advantageous to have a high humidity that can reach saturation of the atmosphere.The cultivation of the hybridomas takes place over a customary period of several days, the duration of the culture being 3-4 days, after which the medium is changed and the cell count is again changed to one optimal output value set.
Dermonoklonale Antikörper BL-Ac/p26 ist bis zu einer Konzentration von 150Mg/ml im Kulturüberstand enthalten und kann aus ihm nach den üblichen Methoden isoliert werden. Der monokionale Antikörper BL-Ac/p 26 ist ein lgG3-lmmunglobulin. Zur Gewinnung größerer Antikörpermengen wird das Hybridom H-BL-Ac/p26 in BALB/c-Mäuse i.p. inokuliert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan od. dgl. vorbehandelt werden. Nach Aszitesbildung wird die den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Von der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-Ac/p26 bestehen. Diese können zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziertDermonoclonal antibody BL-Ac / p26 is contained in the culture supernatant up to a concentration of 150 μg / ml and can be isolated from it by the usual methods. The monoclonal antibody BL-Ac / p 26 is an IgG3 immunoglobulin. To obtain larger amounts of antibody, the hybridoma H-BL-Ac / p26 is injected i.p. into BALB / c mice. inoculated. It is advantageous if the mice used are pretreated with a tumor stimulator, such as paraffinum subliquidum, pristane or the like. After ascites formation, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-Ac / p26 is removed by puncture. From the ascitic fluid, the cellular components are separated by centrifugation, which consist predominantly of cells of the hybridoma H-BL-Ac / p26. These may conveniently be injected into new, pre-treated mice
-3- Zt)H ΙύΟ -3- Zt) H ΙύΟ
werden. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthält, wird entweder direkt verwendet oder einer weiteren Reinigung unterzogen.become. The cell-free supernatant containing the monoclonal antibody BL-Ac / p26 is either used directly or subjected to further purification.
Dafür kommen Salzpräzipitationen, lonenaustauschchromatographie, HPLC, FPLC, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage.For this come Salzpräzipitationen, ion exchange chromatography, HPLC, FPLC, protein A adsorption, affinity chromatography or the like. in question.
Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5—20mg der monoklonalen Antikörper.The ascitic fluid contains 5-20 mg of the monoclonal antibodies when carrying out the method according to the invention.
Anreicherungen führen zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von mehr als 20 mg/ml.Enrichments lead to a product with an antibody content of more than 20 mg / ml.
Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit oder des Zellkulturüberstandes präzipitiert, z. B. mit 40-50% gesättigem (NH4J2SO4, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse/gegen NH4HCC>3-Lösung führt nach Lyophilisierung zu einem salzfreien Präparat, welches bei +40C haltbar ist.To produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid or of the cell culture supernatant is precipitated, for. B. with 40-50% saturated (NH 4 J 2 SO 4 , and taken up in buffered saline dialysis / against NH 4 HCC> 3 solution leads after lyophilization to a salt-free preparation, which is stable at + 4 0 C.
Der nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellte monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 besitzt hohe Spezifität für aktivierte Lymphozyten (Tab. 1). Das von dem monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 erkannte Antigen erscheint erst nach der Aktivierung derT-Lymphozyten auf der Zellmembran. Es handelt sich dabei um einfrühes Aktivierungsantigen, welches vordem IL-2-Rezeptorexprimiertwird (Abb. 1). Es wird sowohl von antigenspezifischen humanen T-Zellklonen, die durch IL-2-enthaltendes Medium bei periodischerStimulierung mit Antigen oderdurch Mitogen gezüchtet werden, als auch auf permanentwachsenden T-Zellinien ausgeprägt (Tab. 2). Die Präsenz des durch BL-Ac/p26 erkannten Antigens auf allen aktivierten proliferierenden T-Zellen spricht für eine essentielle Funktion dieses Antigens bei dem Prozeß der Zellaktivierung.The monoclonal antibody BL-Ac / p26 prepared according to one of these process variants has high specificity for activated lymphocytes (Table 1). The antigen recognized by the monoclonal antibody BL-Ac / p26 does not appear until after activation of the T-lymphocytes on the cell membrane. It is a premature activating antigen previously expressed in the IL-2 receptor (Figure 1). It is expressed both by antigen-specific human T cell clones bred by IL-2 containing medium on periodic stimulation with antigen or by mitogen, as well as on permanently growing T cell lines (Table 2). The presence of the antigen recognized by BL-Ac / p26 on all activated proliferating T cells indicates an essential function of this antigen in the process of cell activation.
Die biologische Funktion des von BL-Ac/p26 erkannten Antigens ist noch unbekannt. Das erkannte Antigen (p26) besitzt ein Molekulargewicht von ca. 26000 Da. Es bildet keine kovalenten durch Disulfidbrücken gebundene Horhooligomere, da es sowohl in unreduzierter als auch in reduzierter Form bei NDS-Polyacrylamidelektrophorese-Analyse nur als eine Bande mit dem angegebenen Molekulargewicht erscheint. Die Isolierung des Antigens erfolgt dabei durch die Bindung an den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p 26.The biological function of the antigen recognized by BL-Ac / p26 is still unknown. The recognized antigen (p26) has a molecular weight of about 26,000 Da. It does not form covalent disulphide-bridged horhooligomers, as it appears only as a band of the indicated molecular weight in both unreduced and reduced form in NDS polyacrylamide electrophoresis analysis. The isolation of the antigen takes place by binding to the monoclonal antibody BL-Ac / p 26th
Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 eignet sich als Nachweisreagens von aktivierten humanen Lymphozyten, besonders vonT-Lymphozyten, durch indirekte Immunfluoreszenz sowohl bei Auswertung mit einem Durchflußfluorzytometer (Abb. 2) als auch bei fluoreszenzmikroskopischer Auswertung.The monoclonal antibody BL-Ac / p26 is useful as a detection reagent of activated human lymphocytes, especially T lymphocytes, by indirect immunofluorescence both by evaluation with a flow cytometer (Figure 2) and by fluorescence microscopy.
Der monoklonale Antikörper kann mit geeigneten Verfahren mit Markierungssubstanzen wie Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. FITC, TRITC, Phycoerythrin), Enzymen (z. B. Peroxidase, alkalische Phosphatase), kolloidalem Gold oder Radioisotopen gekoppelt werden. Dabei kann der markierte BL-Ac/p 26 zum Nachweis von aktivierten Lymphozyten sowohl in der Zellsuspension als auch am histologischen Schnitt eingesetzt werden.The monoclonal antibody may be coupled by appropriate methods to labeling substances such as fluorescent dyes (eg, FITC, TRITC, phycoerythrin), enzymes (eg, peroxidase, alkaline phosphatase), colloidal gold, or radioisotopes. The labeled BL-Ac / p 26 can be used to detect activated lymphocytes both in the cell suspension and in the histological section.
Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 kann damit in vielfältiger Weise als immunologisches Nachweisreagenz für humane aktivierte Lymphozyten in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden.The monoclonal antibody BL-Ac / p26 can thus be used in many ways as an immunological detection reagent for human activated lymphocytes in medical diagnostics.
Tab. 1: Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers BI-Ac/p26 mit verschiedenen humanen Blutzellen und BlastenTab. 1: Binding pattern of the monoclonal antibody BI-Ac / p26 with different human blood cells and blasts
11 Periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut gesunder Spender ^ 11 Peripheral Mononuclear Cells from the Blood of Healthy Donors ^
21 Bezogen auf alle Lymphozyten unabhängig von der Größe. Die Auswertung erfolgte bei der gemischten allogenen Lymphozytenkultur (MLC) am 4.Tag, bei allen anderen am 2.Tag. 21 Based on all lymphocytes regardless of size. The evaluation took place in the mixed allogeneic lymphocyte culture (MLC) on the 4th day, in all other on the 2nd day.
Tab. 2: Bindung des monoklonalen Antikörpers an Zielzellen Zielzellen Reaktivität mit BL-Ac/p 26Tab. 2: Binding of the monoclonal antibody to target cells Target cells Reactivity with BL-Ac / p 26
T-ZellkloneT-cell clones
AK15(CD8+) KU10(CD8+) KT2(CD4+)AK15 (CD8 + ) KU10 (CD8 + ) KT2 (CD4 + )
T-ZellinienT-cell lines
CEM ±CEM ±
SKW-3 +SKW-3 +
MOLT-3 +MOLT-3 +
MOLT-4 +MOLT-4 +
Jurkat +Jurkat +
Non-T, Non-B REHNon-T, Non-B REH
B-ZellinienB cell lines
StaudteStaudte
IM 9 • 1419 Myelo-monozytäre LinienIM 9 • 1419 myelo-monocytic lines
U 937 Erythroide LinieU 937 erythroid line
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| DD30098787A DD259138B1 (en) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DD259138B1 DD259138B1 (en) | 1990-08-01 |
Family
ID=5587639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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-
1987
- 1987-03-20 DD DD30098787A patent/DD259138B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD259138B1 (en) | 1990-08-01 |
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