DE19530273C1 - Monoclonal antibodies specific for cell-surface glyco-protein MGC-24 - Google Patents
Monoclonal antibodies specific for cell-surface glyco-protein MGC-24Info
- Publication number
- DE19530273C1 DE19530273C1 DE1995130273 DE19530273A DE19530273C1 DE 19530273 C1 DE19530273 C1 DE 19530273C1 DE 1995130273 DE1995130273 DE 1995130273 DE 19530273 A DE19530273 A DE 19530273A DE 19530273 C1 DE19530273 C1 DE 19530273C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- hybridoma cells
- cell
- mgc
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft einen Antikörper gegen Peanut Agglutinin (PNA)-bindendes Glykoprotein an ZelloberflächenThe invention relates to an antibody against peanut agglutinin (PNA) binding glycoprotein on cell surfaces
Maligne Zellen von vielen menschlichen Tumoren besitzen an ihrer Zelloberfläche Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Glykoproteine. Diese PNA-bindenden Glykoproteine bieten u. a. die Möglichkeit, Nachweisreagenzien und/oder therapeutisch wirksame Reagenzien direkt an die betreffenden Zellen heranzuführen und daran zu binden. Seit einigen Jahren bekannt sind die nach der inzwischen eingeführten MUC-Nomenklatur benannten Glykoproteine MUC1, MUC2 und MUC3. Ein kürzlich identifiziertes Zelloberflächen-Glyko protein ist das Protein MGC-24, dessen Aminosäuresequenz und dazugehörige Nukleotidsequenz von Masuzawa, et al., J. BIOCHEM. 112, 609-615, (1992) vollständig aufgeklärt wurde. Dieses Glykoprotein MGC-24 eignet sich daher besonders gut als Angriffs punkt für eine gezielte zelluläre Diagnose bzw. Therapie.Malignant cells from many human tumors have on them Cell surface peanut agglutinin (PNA) binding glycoproteins. These PNA-binding glycoproteins offer u. a. the possibility, Detection reagents and / or therapeutically effective reagents bring them directly to the cells in question and to them tie. They have been known for some years now introduced MUC nomenclature named glycoproteins MUC1, MUC2 and MUC3. A recently identified cell surface glyco protein is the protein MGC-24, its amino acid sequence and associated nucleotide sequence of Masuzawa, et al., J. BIOCHEM. 112, 609-615, (1992) has been fully elucidated. This Glycoprotein MGC-24 is therefore particularly suitable as an attack point for a targeted cellular diagnosis or therapy.
Als Vermittler für ein dementsprechendes, zellulär ziel gerichtetes Diagnostikum bzw. Therapeutikum kommt insbesondere ein Antikörper in Betracht, der spezifisch an dieses Glykoprotein MGC-24 bindet.As a mediator for a corresponding, cellular goal targeted diagnostic or therapeutic comes in particular consider an antibody specific to this glycoprotein MGC-24 binds.
Ein solcher Antikörper kann sowohl mit einfachen Nachweis reagenzien wie Fluoreszenzfarbstoffen oder radioaktiven Stoffen als auch mit speziellen therapeutisch wirksamen Reagenzien gekoppelt sein.Such an antibody can be obtained with both simple detection reagents such as fluorescent dyes or radioactive substances as well as with special therapeutically effective reagents be coupled.
Bisher ist jedoch nur ein polyklonaler und damit nur begrenzt verfügbarer und nicht identisch reproduzierbarer Antikörper bekannt, der zudem gegen eine modifizierte, nämlich deglykosi lierte Form des MGC-24-Proteins gerichtet ist.So far, however, it is only a polyclonal and therefore only limited available and not identically reproducible antibodies known, which also against a modified, namely deglykosi form of the MGC-24 protein is directed.
Mit einem derartigen Antikörper ist eine gezielte Behandlung bzw. ein gezielter Nachweis von MGC-24 tragenden Zellen u. a. im lebenden Organismus nicht möglich.With such an antibody is a targeted treatment or a targeted detection of MGC-24-carrying cells u. a. not possible in the living organism.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Antikörper bereitzustellen, der spezifisch an das native, unmodifizierte Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Zelloberflächen glykoprotein MGC-24 bindet und der in praktisch unbegrenzter Menge zur Verfügung steht. The present invention is therefore based on the object to provide an antibody that is specific to the native, unmodified peanut agglutinin (PNA) binding cell surfaces Glycoprotein MGC-24 binds and that in practically unlimited Amount is available.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gelöst, der spezifisch an das native, unmodifizierte Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 bindet und von Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, die unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegt sind. Er ist mit der Bezeichnung 105A5 benannt.This task is accomplished by providing a monoclonal Antibody solved, the specific to the native, unmodified Peanut agglutinin (PNA) binding cell surface glycoprotein MGC-24 binds and from Hybridoma cells are produced and released under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Zellkulturen GmbH, DSM. He is with the Designation 105A5 named.
Ein weiterer monoklonaler Antikörper, der spezifisch an das native, unmodifizierte Peanut Agglutinin (PNA)-bindende Zellober flächenglykoprotein MGC-24 bindet, allerdings an ein anderes Epitop, wird von Hybridomzellen produziert und freigesetzt, die unter der Nummer DSM ACC 2221 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegt sind. Er ist mit der Bezeichnung 103B2 benannt. Dieser Antikörper ist Gegenstand der zeitgleich eingereichten deutschen Patentan meldung DE 195 30 272.Another monoclonal antibody that specifically targets the native, unmodified peanut agglutinin (PNA) binding cell top Area glycoprotein MGC-24 binds, but to another Epitope, is produced and released by hybridoma cells, the under the number DSM ACC 2221 at the German Collection of microorganisms and cell cultures GmbH, DSM, are deposited. It is named 103B2. This antibody is the subject of the German patent applications filed at the same time message DE 195 30 272.
Mit dem erfindungsgemäßen Antikörper und dem Antikörper aus der parallelen Patentanmeldung wurde erstmals jeweils ein mono klonaler Antikörper bereitgestellt, der standardisiert re produzierbar ist und somit potentiell unbegrenzt hergestellt werden kann, und der spezifisch an jeweils ein spezielles Epitop auf dem Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 bindet.With the antibody of the invention and the antibody the parallel patent application became a mono for the first time clonal antibody provided that standardized re is producible and thus potentially produced indefinitely can be, and the specific to a specific epitope on the cell surface glycoprotein MGC-24 binds.
Der erfindungsgemäße Antikörper ermöglicht eine gezielte Erkennung und Beeinflussung von Zellen, die eine extra zelluläre Domäne dieses Protein MGC-24 aufweisen. Er stellt damit ein bisher einzigartiges und vielseitig einsetzbares Mittel für den Arzt und Forscher dar, um einerseits solche Zellen nach zuweisen, und zwar sowohl in der Zellkultur als auch im Pati entenorganismus, und um andererseits diese Zellen ggf. zu manipulieren, entweder durch den Antikörper selbst oder durch daran gekoppelte spezifische Reagenzien.The antibody according to the invention enables a targeted Detection and manipulation of cells that have an extra cellular domain of this protein have MGC-24. Created a previously unique and versatile agent for the doctor and researcher to look for such cells on the one hand assign, both in cell culture and in Pati duck organism, and on the other hand these cells if necessary manipulate, either by the antibody itself or by specific reagents coupled to it.
Die Erfindung betrifft ferner Hybridomzellen, die einen mono klonalen Antikörper gegen das Protein MGC-24 erzeugen, unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegt sind und den Antikörper mit der Bezeichnung 105A5 produzieren.The invention further relates to hybridoma cells that have a mono generate clonal antibodies against the MGC-24 protein, at the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Zellkulturen GmbH, DSM, and the antibody with the designation 105A5.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von derartigen Hybridomzellen, die einen Antikörper gegen das native, unmodifizierte Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 synthetisieren und freisetzen. Dieses Verfahren umfaßt die im Stand der Technik grundsätzlich geläufigen Schritte, wie sie bspw. von Bühring et al. in Hybridoma 1991, Band 10, Nr. 1, S. 77-78 beschrieben wurden:The invention also relates to a method for Production of such hybridoma cells that have an antibody against the native, unmodified cell surface glycoprotein MGC-24 synthesize and release. This procedure includes the im State of the art basically familiar steps like them e.g. from Bühring et al. in Hybridoma 1991, Volume 10, No. 1, Pp. 77-78:
- 1. Immunisierung oder Sensibilisierung eines Tieres, vorzugs weise einer Maus vom Balb/c-Stamm, mit dem Antigen bzw. Immunogen;1. Immunization or sensitization of an animal, preferably a mouse from the Balb / c strain, with the antigen or Immunogen;
- 2. Gewinnung der antikörperproduzierenden Zellen, vorzugsweise der Milzlymphozyten dieses Tieres;2. Obtaining the antibody-producing cells, preferably the splenic lymphocytes of this animal;
- 3. Fusionierung dieser antikörperproduzierenden Zellen mit einer stabilen, immortalisierten Zellinie, vorzugsweise einer Myelomzellinie, zu Hybridomzellen; und3. Fusion of these antibody-producing cells with a stable, immortalized cell line, preferably a myeloma cell line, to hybridoma cells; and
- 4. Vereinzelung und Vermehrung (Klonierung) solcher Hybridom zellen, die einen Antikörper sezernieren, der an das Antigen bindet.4. Separation and multiplication (cloning) of such hybridomas cells that secrete an antibody that binds to the antigen binds.
Das erfindungsgemäß gefundene Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das Tier mit Zellen der undifferenzierten, megakaryo blastären Zellinie MOLM-1 immunisiert wird.The method found according to the invention is characterized by this from that the animal with cells of the undifferentiated, megakaryo blastic cell line MOLM-1 is immunized.
Dabei erwies sich als Vorteil, daß diese Zellinie eine starke Expression von MGC-24 zeigt, wie sich während der zu dem Antikörper 105A5 führenden Versuche zeigte.It turned out to be an advantage that this cell line was a strong one Expression of MGC-24 shows how it changed during the Antibody 105A5 showed leading experiments.
Wenn Hybridomzellen gesucht werden, die stammzellspezifische Antikörper produzieren, ist es bei der Vereinzelung der Hybridom zellen erforderlich, wenn solche Hybridomzellen ausgewählt werden, die Antikörper mit einer Spezifität für Knochenmarkzellen produzieren, wobei es ferner bevorzugt ist, wenn nur solche Hybridomzellen auf die Spezifität der von ihnen produzierten Antikörper mit Knochenmarkzellen getestet werden, bei denen zuvor nachgewiesen wurde, daß diese Antikörper eine schwache oder bevorzugt eine negative Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigen.When looking for hybridoma cells, the stem cell specific Produce antibodies, it is in the isolation of the hybridoma cells required when selecting such hybridoma cells, the antibodies with a specificity for bone marrow cells produce, it is further preferred if only such Hybridoma cells based on the specificity of the ones they produce Antibodies are tested with bone marrow cells in which it has previously been shown that these antibodies are weak or preferably a negative reaction with peripheral blood cells demonstrate.
Hier ist von Vorteil, daß ein schnelles Screening möglich ist, ohne das viele Zellen vergebens getestet werden müssen. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, daß MGC-24 auch auf Stammzellen exprimiert ist, so daß bei dem Screening die Tatsache ausgenutzt werden konnte, daß im Knochenmark verstärkt undiffe renzierte Zellen einschließlich von hämatopoetischen Stammzellen vorkommen, die das von dem Antikörper zu erkennende Antigen aufweisen. Durch den Vortest auf Reaktion mit peripheren Blutzellen können dabei solche Antikörper auf einfache Weise gewonnen werden, die selektiv an Antigene auf Knochenmarkzellen binden und nicht bzw. nur schwach auf peripheren Blutzellen exprimiert sind. Mit anderen Worten, die Spezifität bei der Auswahl wird hierdurch auf einfache Weise deutlich erhöht. The advantage here is that quick screening is possible, without having to test many cells in vain. It was namely surprisingly found that MGC-24 also on Stem cells is expressed, so in the screening the fact could be exploited that in the bone marrow intensified undiffe differentiated cells including hematopoietic stem cells occur that the antigen to be recognized by the antibody exhibit. Through the pre-test for reaction with peripheral Blood cells can easily produce such antibodies are obtained that are selective for antigens on bone marrow cells bind and not or only weakly on peripheral blood cells are expressed. In other words, the specificity in the Selection is thereby increased significantly in a simple manner.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung von Tumoren, insbesondere von Magen- und Coloncarcinomen.The invention also relates to the use of a monoclonal Antibody against the cell surface glycoprotein MGC-24 diagnostic and / or therapeutic treatment of tumors, especially gastric and colon carcinomas.
Tumorzellen, insbesondere Zellen von Magen- und Coloncarcinomen, zeichnen sich durch einen vergleichsweise hohen Gehalt an Zelloberflächenglykoprotein MGC-24 aus. Ein erfindungsgemäßer Antikörper, der mit einem Nachweismittel, beispielsweise einem radioaktiven Marker, gekoppelt ist, bindet dieses Nachweismittel indirekt an diese Zellen und ermöglicht damit den direkten Nachweis dieser Zellen, beispielsweise mit röntgendiagnostischen /szintigraphischen Methoden. Damit ist eine sehr frühe Tumor diagnose unter Umständen sogar in-vivo möglich.Tumor cells, especially cells of gastric and colon carcinomas, are characterized by a comparatively high content Cell surface glycoprotein MGC-24. An inventive Antibody with a detection agent, such as a radioactive marker, coupled, binds this means of detection indirectly to these cells and thus enables direct Detection of these cells, for example with X-ray diagnostic / scintigraphic methods. This is a very early tumor diagnosis may even be possible in vivo.
In entsprechender Art und Weise kann der Antikörper mit einem therapeutisch wirksamen Mittel gekoppelt sein und dadurch eine direkte und gezielte Beeinflussung oder gar Eliminierung von MGC-24 tragenden Zellen, insbesondere Tumorzellen, ermöglichen.In a corresponding manner, the antibody can be combined with a therapeutically effective agents can be coupled and thereby a direct and targeted influencing or even elimination of MGC-24 carrying cells, especially tumor cells.
Der erfindungsgemäße Antikörper, der von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegten Hybridomzellen produziert und freigesetzt wird, wird zu einer solchen diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung verwendet.The antibody of the invention, the of those under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of microorganisms and cell cultures GmbH, DSM Hybridoma cells that are produced and released become one diagnostic and / or therapeutic treatment used.
Um die therapeutische und/oder diagnostische Applikation des erfindungsgemäßen Antikörpers zu erleichtern, kann der Anti körper mit entsprechend geeigneten Hilfssubstanzen in einer pharmazeutischen Zubereitung vermischt sein. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein pharmazeutisches Mittel zur diagno stischen und/oder therapeutischen Behandlung von Tumoren, das einen erfindungsgemäßen Antikörper, wie er von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikro organismen und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegten Hybridom zellen produziert und freigesetzt wird.To the therapeutic and / or diagnostic application of the To facilitate antibody according to the invention, the anti body with correspondingly suitable auxiliary substances in one pharmaceutical preparation. The invention therefore also relates to a pharmaceutical agent for diagnosis tical and / or therapeutic treatment of tumors, the an inventive Antibodies like those of the below the number DSM ACC 2222 at the German Micro Collection organisms and cell cultures GmbH, DSM, deposited hybridoma cells are produced and released.
Mit einem erfindungsgemäßen Antikörper können MGC-24 tragende Zellen aus einer Suspension verschiedenartiger Zellen mit den im Stand der Technik bekannten Testverfahren, wie z. B. dem Enzyme linked immunosorbet assay, kurz ELISA, oder dem Radioimmunoassay, kurz RIA, nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb auch einen Kit zum Nachweis von Peanut Agglutinin (PNA)- bindendem Zelloberflächenglykoprotein, der einen monoklonalen Antikörper umfaßt, der spezifisch an das native Glykoprotein MGC-24 bindet.With an antibody according to the invention MGC-24 bearing Cells from a suspension of different types of cells with the test methods known in the prior art, such as. B. the enzyme linked immunosorbet assay, ELISA for short, or the radioimmunoassay, RIA for short. The present invention relates to therefore also a kit for the detection of peanut agglutinin (PNA) - binding cell surface glycoprotein, which is a monoclonal Antibody that is specific to the native glycoprotein MGC-24 binds.
Der Kit ist dadurch gekenn zeichnet, daß der Kit einen Antikörper umfaßt, wie er von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird.The kit is known records that the kit includes an antibody as described by the under number DSM ACC 2222 at the Deutsche Sammlung von Microorganisms and cell cultures GmbH, DSM, deposited Hybridoma cells is generated.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde - wie bereits erwähnt - überraschenderweise gefunden, daß der monoklonale Antikörper mit der Bezeichnung 105A5, der von den unter der Nummer DSM ACC 2222 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganis men und Zellkulturen GmbH, DSM, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, an Stammzellen bindet.In the context of the present invention - as already mentioned - surprisingly found that the monoclonal Antibody designated 105A5 by those listed under the Number DSM ACC 2222 at the German Microorganism Collection men und Zellkulturen GmbH, DSM, deposited hybridoma cells is generated, binds to stem cells.
Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung des Antikörpers 105A5, zum Nachweis von hämatopoetischen Zellen, sowie einen Kit zum Nachweis von hämatopoetischen Zellen, der den Antikörper 105A5, enthält. Dadurch ist es möglich, undifferenzierte CD 34⁺ Subpopulationen aufzutrennen und für funktionelle Analysen Zellen der erythroiden Reihe bzw. aus dem Knochenmark zu selektieren und aufzureinigen.The invention therefore also relates to the use of the antibody 105A5, for the detection of hematopoietic cells, as well as a Kit for the detection of hematopoietic cells, the the antibody 105A5, contains. This makes it possible to undifferentiated CD 34⁺ Separate subpopulations and cells for functional analysis the erythroid row or from the bone marrow and clean up.
Als weiterer überraschender Effekt wurde gefunden, daß die Zugabe von monoklonalem Antikörper 105A5 zu unausgereiften erythroiden Zellen die in-vitro Hämatopoese hemmt.As a further surprising effect, it was found that the addition from monoclonal antibody 105A5 to immature erythroids Cells that inhibit hematopoiesis in vitro.
Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung des Antikörpers 105A5 zur Hemmung der Hämatopoese.The invention therefore also relates to the use of the antibody 105A5 to inhibit hematopoiesis.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.Further advantages result from the description below.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.It is understood that the above and the following standing features to be explained not only in each specified combination, but also in other combinations or can be used alone, without the scope of to leave the present invention.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Anwendungs- und Ausführungsbeispielen näher erläutert.The invention is based on application and Exemplary embodiments explained in more detail.
Als Antigen werden Zellen der undifferenzierten, megakaryo blastären Zellinie MOLM-1 verwendet (Matsuo Y, Adachi T, Tsubota T, Imanishi J, Minowada J. Establishment and characterization of a novel megakaryoblastoid cell line, MOLM-1, from a patient with chronic myelogenous leukemia. Human Cell 1991; 4: 261-264).Cells of the undifferentiated, megakaryo are used as antigen blastic cell line MOLM-1 used (Matsuo Y, Adachi T, Tsubota T, Imanishi J, Minowada J. Establishment and characterization of a novel megakaryoblastoid cell line, MOLM-1, from a patient with chronic myelogenous leukemia. Human Cell 1991; 4: 261-264).
Acht Wochen alte Balb/c-Mäuse werden zweimal in Intervallen von 10 Tagen intraperitoneal mit 10⁷ Zellen der Zellinie MOLM-1 immunisiert. Vier Tage vor der Fusion werden 5 × 10⁵ Zellen direkt in die Milz appliziert, um die Immunantwort zu verstärken.Eight-week-old Balb / c mice are intervalized twice of 10 days intraperitoneally with 10⁷ cells of the cell line MOLM-1 immunized. Four days before the fusion, 5 × 10⁵ cells become direct applied to the spleen to strengthen the immune response.
Die Antikörper-Bildung im Mausorganismus wird dadurch überprüft, daß das Blutserum des betreffenden Tieres in dem dem Fachmann geläufigen ELISA-Test auf Bindungseigenschaften mit dem Antigen untersucht wird.The antibody formation in the mouse organism is checked by that the blood serum of the animal in question in the specialist common ELISA test for binding properties with the antigen is examined.
Nach ca. 3 Wochen werden die Lymphozyten des erfolgreich immunisierten Tieres gewonnen, indem die Milz herausoperiert und zu einer Zellsuspension zerkleinert wird.After about 3 weeks, the lymphocytes become successful immunized animal by operating out the spleen and crushed into a cell suspension.
Die suspendierten Milzzellen werden in Anwesenheit von Poly ethylenglykol mit Myelomzellen des bekannten Stammes SP2/0 fusio niert. Die Fusionskultur wird in Hypoxanthin-, Aminopterin- und Thymidin-(HAT-)haltigem Medium, hier in HAT-RPMI-1640, kultiviert, in dem sich nur Hybridzellen vermehren können, da diese sowohl die Eigenschaft der Myelomzellen zur unbegrenzten Teilungsfähigkeit als auch die Eigenschaft der Antikörper produzierenden Lymphozyten zum Wachstum in HAT-haltigem Medium haben.The suspended spleen cells are removed in the presence of poly ethylene glycol with myeloma cells of the well-known strain SP2 / 0 fusio kidney. The fusion culture is in hypoxanthine, aminopterin and thymidine (HAT) containing medium, here in HAT-RPMI-1640, cultivated in which only hybrid cells can reproduce, because this both the property of myeloma cells to unlimited Divisibility as well as the property of the antibodies producing lymphocytes for growth in HAT-containing medium to have.
Nach der Fusion werden die Zellen in Napfplatten ausplattiert und bei 37°C, 5% Co₂ inkubiert. After the fusion, the cells are plated out in well plates and incubated at 37 ° C, 5% Co₂.
Die Kulturüberstände werden nach 10-14 Tagen auf der MOLM-1 Zellinie im Durchflußzytometer gescreent. In einem zweiten Schritt werden die Überstände auf Reaktivität mit peripheren Blutzellen getestet, da diese keine selektiven Stammzellantigene exprimieren. Überstände, die eine negative oder schwache Reaktion mit peripheren Blutzellen zeigen, werden anschließend auf Reaktivität mit Knochenmarkzellen getestet. Hybridome, die Antikörper mit Spezifität für Knochenmarkzellen produzieren, werden ausgewählt und nach dem bekannten Grenzverdünnungs verfahren vereinzelt und kultiviert, d. h. kloniert.The culture supernatants are removed on the MOLM-1 after 10-14 days Screened cell line in flow cytometer. In a second Step the supernatants on reactivity with peripheral Blood cells tested because they are not selective stem cell antigens express. Supernatants that have a negative or weak reaction with peripheral blood cells will show up afterwards Bone marrow cell reactivity tested. Hybridomas that Produce antibodies with specificity for bone marrow cells, are selected and according to the known limit dilution procedure isolated and cultivated, d. H. cloned.
Bei dieser Screening-Strategie wird Nutzen aus der Tatsache gezogen, daß im Knochenmark verstärkt undifferenzierte Zellen einschließlich von hämatopoetischen Stammzellen vorkommen.This screening strategy takes advantage of the fact drawn that enhanced undifferentiated cells in the bone marrow including hematopoietic stem cells.
Positiv reagierende Hybridomzellkulturen werden weiter kulti viert, die Antikörper angereichert, gereinigt und charakte risiert.Hybridoma cell cultures reacting positively will continue to be cultivated Fourth, the antibodies are enriched, purified and characterized rized.
Nach der obigen Screening-Strategie wurde der monoklonale Anti körper 105A5 erhalten. Die Isotype wurde über PE-konjugierte Anti-Isotyp-spezifische Antiseren durch direkte Immunfluoreszenz zu IgM (nachgereicht) bestimmt.According to the screening strategy above, the monoclonal anti body 105A5 received. The isotype was conjugated via PE Anti-isotype-specific antisera through direct immunofluorescence determined to be IgM (subsequently submitted).
Die Produktion, Reinigung und Charakterisierung der Antikörper erfolgte mit den in Fachkreisen allgemein bekannten Methoden.The production, purification and characterization of the antibodies was carried out using the methods generally known in specialist circles.
Der Antikörper 105A5, der von den unter der Nummer DSM ACC 2222
bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GmbH, DSM, hinterlegten Hybridomzellen erzeugt wird, weist die
folgenden charakteristischen Merkmale auf:
Immunglobulinklasse: IgM (nachgereicht)
spezifische Bindungsaffinität an: MGC-24
The antibody 105A5, which is generated by the hybridoma cells deposited under the number DSM ACC 2222 at the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSM, has the following characteristic features:
Immunoglobulin class: IgM (subsequently submitted)
specific binding affinity to: MGC-24
Die Identifizierung des Antigens erfolgte über eine Stroma- Expressionsbibliothek.The antigen was identified using a stroma Expression library.
Um das Gen zu isolieren, das für das Antigen codiert, das von dem monoklonalen Antikörper 105A5 erkannt wird, wurde eine retro virale Expressionsbibliothek nach dem Verfahren erstellt, das von Rayner und Gonda in Mol. Cell. Biol. 1994, Band 14, Seite 880 beschrieben wurde. Bei dem hier verwendeten Verfahren wurde mRNA aus kultivierten Stromazellen des menschlichen Knochenmarks verwendet.In order to isolate the gene encoding the antigen that is derived from the monoclonal antibody 105A5 is recognized, a retro viral expression library created according to the procedure that by Rayner and Gonda in Mol. Cell. Biol. 1994, volume 14, page 880 has been described. The process used here was mRNA from cultivated stromal cells of the human bone marrow used.
cDNA-Transkripte wurden direkt in den retroviralen Plasmid-Vektor pRUF.Neo kloniert. DNA aus der Bibliothek wurde verwendet, um eine amphotrope Wirtszellinie (PA317) zu transfizieren. Über gangsweise erzeugte retrovirale Partikel wurden geerntet und dazu verwendet, eine ecotrope Wirtszellinie stabil zu infizieren. Von diesen Zellen produzierte Viren wurden daraufhin verwendet, um die faktorabhängige hämatopoetische murine Zellinie FDC-P1 zu infizieren.cDNA transcripts were inserted directly into the retroviral plasmid vector pRUF.Neo cloned. DNA from the library was used to to transfect an amphotropic host cell line (PA317). About Commonly generated retroviral particles were harvested and used to stably infect an ecotropic host cell line. Viruses produced by these cells were then used the factor-dependent hematopoietic murine cell line FDC-P1 to infect.
Infizierte FDC-P1-Zellen wurden bezüglich der G418-Resistenz ausgewählt, woraufhin Zellen isoliert und angereichert wurden, die das von dem Antikörper 105A5 erkannte Antigen exprimieren. Die Anreicherung von Zellen, die von dem Antikörper erkannt wurden, erfolgte dabei durch Einsatz mehrerer Durchläufe einer immuno-magnetischen Zellsortierung (Dynabeads). Nach dieser FACS-Sortierung wurden klonale Populationen der transfizierten Zellen etabliert. Infected FDC-P1 cells were tested for G418 resistance selected, whereupon cells were isolated and enriched, expressing the antigen recognized by antibody 105A5. Enrichment of cells recognized by the antibody were carried out by using several runs one immuno-magnetic cell sorting (Dynabeads). After this FACS sorting were transfected clonal populations Cells established.
Daraufhin wurden die proviralen cDNA-Inserts von genomischer DNA der infizierten Zellen zurückgewonnen. Zu diesem Zweck wurde eine PCR-Amplifikation durchgeführt, wobei spezifische retro virale Primer verwendet wurden, die die Klonierungsstelle in dem Plasmidvektor flankieren. Auf diese Weise war es möglich, ein cDNA-Insert von ungefähr 3 kBp zu isolieren.Thereupon, the proviral cDNA inserts became genomic DNA of the infected cells recovered. For this purpose PCR amplification was carried out, with specific retro viral primers were used, which the cloning site in flank the plasmid vector. In this way it was possible isolate a cDNA insert of approximately 3 kbp.
Eine Sequenzanalyse ergab, daß dieses Insert ein zuvor kloniertes Gen identifizierte, das zu der mucin-Familie gehört, nämlich das MGC-24, das von Masuzawa et al., J. Biochem. 112, 609-615 (1992), vollständig aufgeklärt wurde.Sequence analysis revealed that this insert was previously cloned Gen that belongs to the mucin family, namely MGC-24, which was developed by Masuzawa et al., J. Biochem. 112, 609-615 (1992), has been fully elucidated.
Um die Funktion der Antigene zu untersuchen, die von dem monoklonalen Antikörper 105A5 erkannt werden, wurde der Anti körper auf seine Fähigkeit hin untersucht, die hämatopoetische Zellentwicklung zu stören.To study the function of the antigens produced by the monoclonal antibody 105A5 was recognized, the anti body examined for its ability to hematopoietic Disrupt cell development.
In einem ersten Versuch wurden gereinigte monoklonale Antikörper in zunehmenden Konzentrationen über den Bereich von 0,01-30 µg/ml zu halb-festen Klonierungslösungen von hämatopoetischen mensch lichen Vorläuferzellen zugegeben. Diese Lösungen wurden unter Verwendung von normalen menschlichen Knochenmarkzellen herge stellt, die das CD34-Antigen exprimieren. Die Reinheit dieser Zellpopulation betrug in allen Versuchen 95-98,5%.In a first experiment, purified monoclonal antibodies were used in increasing concentrations over the range of 0.01-30 µg / ml to semi-solid cloning solutions from hematopoietic humans added precursor cells. These solutions have been under Use of normal human bone marrow cells that express the CD34 antigen. The purity of this Cell population was 95-98.5% in all experiments.
Die CD34⁺-Zellen wurden für 14 Tage mit einer anfänglichen Konzentration von 1000 Zellen pro Milliliter in IMDM kultiviert, das durch L-Glutamin, Penicillin, Streptomycin, Beta-Mercapto ethanol, 0,9% (Gewicht/Volumen) Methyl-Zellulose, 1% Rinder serumalbumin, 30% (Volumen/Volumen) fötales Kälberserum und 10 ng/ml der folgenden, gereinigten rekombinanten menschlichen Zytokine ergänzt wurde: IL-1, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, SCF und Erythropoetin.The CD34⁺ cells were grown for 14 days with an initial Concentration of 1000 cells per milliliter cultivated in IMDM, that through L-glutamine, penicillin, streptomycin, beta-mercapto ethanol, 0.9% (weight / volume) methyl cellulose, 1% cattle serum albumin, 30% (volume / volume) fetal calf serum and 10 ng / ml of the following purified recombinant human Cytokines were supplemented: IL-1, IL-3, IL-6, G-CSF, GM-CSF, SCF and erythropoietin.
Nach 14 Tagen wurden die Kulturen in Übereinstimmung mit Standardkriterien nach der Anwesenheit von Kolonien durchgezählt, die sich aus Vorläuferzellen von Knochenmarkzellen (CFU-GM) oder erythroiden Zellen (BFU-E) ergaben. Verglichen mit einem bindenden (P4C2) und einem nicht bindenden (AA6) Kontroll antikörper vom gleichen Isotyp IgG3, der in gleichen Konzen trationen zugegeben wurde, führte der Antikörper 105A5 zu einer dosisabhängigen Inhibierung der Koloniebildung sowohl bei CFU-GM als auch bei BFU-E.After 14 days, the cultures were in line with Standard criteria counted according to the presence of colonies, which are derived from progenitor cells of bone marrow cells (CFU-GM) or erythroid cells (BFU-E). Compared to one binding (P4C2) and a non-binding (AA6) control antibodies of the same isotype IgG3, in the same concentration was added, the antibody 105A5 led to a dose-dependent inhibition of colony formation in both CFU-GM as well as at BFU-E.
Als zweites wurde der Antikörper daraufhin untersucht, ob er die Hämatopoese in einer Stromazell-abhängigen Langzeitkultur stören kann. Der Antikörper 105A5 oder ein Kontrollantikörper wurden zu Kulturen von Stromazellen aus dem Knochenmark hinzu gegeben. Diese Kulturen wurden aus Knochenmark hergestellt, das von normalen Spendern stammte. Die kultivierten Stromazellen wurden bestrahlt (1500 rad), um hämapoetische Zellen eine Woche vor dem Start des Experimentes abzutöten. Die Langzeitkultur wurde dann etabliert, indem 3 × 10⁴ CD34⁺-Zellen pro Kultur unter Anwesenheit der oben erwähnten Antikörper in einer Konzentration von 10 µg/ml hinzugegeben wurden.Second, the antibody was tested to see if it hematopoiesis in a stromal cell-dependent long-term culture can disturb. The 105A5 antibody or a control antibody were added to cultures of bone marrow stromal cells given. These cultures were made from bone marrow that came from normal donors. The cultivated stromal cells were irradiated (1500 rad) to hematopoietic cells a week kill before starting the experiment. The long-term culture was then established by taking 3 × 10⁴ CD34⁺ cells per culture Presence of the above-mentioned antibodies in a concentration of 10 µg / ml were added.
Eine Woche nach der Zugabe der Antikörper konnte eine voll ständige Blockierung der Hämatopoese in diesem System beobachtet werden, was durch das vollständige Fehlen von nachweisbaren hämatopoetischen Vorläuferzellen und durch den Tod der Stroma zellen angezeigt wurde.A week after the addition of the antibodies, one could be full constant blocking of hematopoiesis was observed in this system be what is due to the complete absence of detectable hematopoietic progenitor cells and by the death of the stroma cells was displayed.
Claims (12)
- 1. Immunisierung oder Sensibilisierung eines Tieres mit dem Antigen bzw. Immunogen;
- 2. Gewinnung der antikörperproduzierenden Zellen dieses Tieres;
- 3. Fusionierung dieser antikörperproduzierenden Zellen mit einer stabilen, immortalisierten Zellinie zu Hybridomzellen; und
- 4. Vereinzelung und Vermehrung (Klonierung) solcher Hybridomzellen, die einen Antikörper sezernieren, der an das Antigen bindet,
- 1. immunization or sensitization of an animal with the antigen or immunogen;
- 2. Obtaining the antibody-producing cells of this animal;
- 3. Fusion of these antibody-producing cells with a stable, immortalized cell line to hybridoma cells; and
- 4. isolation and multiplication (cloning) of such hybridoma cells which secrete an antibody which binds to the antigen,
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1995130273 DE19530273C1 (en) | 1995-08-17 | 1995-08-17 | Monoclonal antibodies specific for cell-surface glyco-protein MGC-24 |
| PCT/EP1996/003508 WO1997007204A1 (en) | 1995-08-17 | 1996-08-08 | Antibody 105a5 to 'peanut agglutinin' (pna)-binding glycoprotein on cell surfaces |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1995130273 DE19530273C1 (en) | 1995-08-17 | 1995-08-17 | Monoclonal antibodies specific for cell-surface glyco-protein MGC-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19530273C1 true DE19530273C1 (en) | 1996-12-12 |
Family
ID=7769718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1995130273 Expired - Fee Related DE19530273C1 (en) | 1995-08-17 | 1995-08-17 | Monoclonal antibodies specific for cell-surface glyco-protein MGC-24 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE19530273C1 (en) |
| WO (1) | WO1997007204A1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19727815C1 (en) * | 1997-06-30 | 1998-06-18 | Univ Eberhard Karls | Monoclonal antibody specific for CD164 |
| EP0889054A2 (en) * | 1997-06-30 | 1999-01-07 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Antibody 67D2 against CD164 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6161179A (en) * | 1997-09-05 | 2000-12-12 | Wea Manufacturing, Inc. | Key-based protection method for light-readable discs |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5030559A (en) * | 1986-04-01 | 1991-07-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the identification of metastatic human tumors |
-
1995
- 1995-08-17 DE DE1995130273 patent/DE19530273C1/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-08-08 WO PCT/EP1996/003508 patent/WO1997007204A1/en active Application Filing
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Biochem. 112, S. 609-615, 1992 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19727815C1 (en) * | 1997-06-30 | 1998-06-18 | Univ Eberhard Karls | Monoclonal antibody specific for CD164 |
| EP0889054A2 (en) * | 1997-06-30 | 1999-01-07 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Antibody 67D2 against CD164 |
| EP0889054A3 (en) * | 1997-06-30 | 2001-05-09 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Antibody 67D2 against CD164 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997007204A1 (en) | 1997-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE19608769C1 (en) | Monoclonal antibody BV10A4H2 specific for human FLT3/FLK2 receptor | |
| DE60019111T2 (en) | METHOD FOR CELL SAVING USING IMMUNO STUDS | |
| EP0787743B1 (en) | A3C6E2, a monoclonal antibody to the human stem cell factor (SCF)-receptor | |
| DE4244715C2 (en) | Process for the preparation of individual-specific anti-tumor antigen monoclonal antibodies | |
| JPH06504186A (en) | CD53 cell surface antigen and its uses | |
| AT400577B (en) | METHOD FOR PRODUCING A MONOCLONAL ANTIBODY AND METHOD FOR DETECTING MALIGNAL CELLS | |
| EP1805221A1 (en) | Monoclonal antibody against frizzled receptors | |
| EP0093436B1 (en) | Process for preparing permanent animal and human cell lines, and their use | |
| EP0586445A1 (en) | Monoclonal antibodies against c-kit | |
| EP0340604B1 (en) | Monoclonal antibody and its use | |
| EP0499176A2 (en) | Monoclonal antibodies against human pancreatic islet cells | |
| DE19727814C1 (en) | Monoclonal antibody specific for human tyrosine kinase receptor protein | |
| DE60132221T2 (en) | REAGENTS FOR CELL SELECTION AND METHOD OF USE | |
| Ellison et al. | Gamma delta T cells in the pathobiology of murine acute graft-versus-host disease. Evidence that gamma delta T cells mediate natural killer-like cytotoxicity in the host and that elimination of these cells from donors significantly reduces mortality. | |
| DE69434024T2 (en) | SURFACE PROTEINS EXPRESSED ON HUMAN CORTICAL THYMOCYTES AND THEIR USE | |
| DE19530273C1 (en) | Monoclonal antibodies specific for cell-surface glyco-protein MGC-24 | |
| EP1049490B1 (en) | Method for inhibiting cd95-independent apoptosis in aids | |
| DE19530272C1 (en) | Monoclonal antibody specific for cell-surface glyco-protein MGC-24 | |
| DE19727813C1 (en) | Monoclonal antibody specific for CD164 | |
| DE3490527T (en) | New monoclonal antibodies | |
| DE19727815C1 (en) | Monoclonal antibody specific for CD164 | |
| DE19647426C1 (en) | Human colon carcinoma cell lines with stable HSP72 expression | |
| DE3239863A1 (en) | METHOD FOR PRODUCING SUBCULTIVABLE LYMPHOKIN-FORMING HUMAN T-CELL HYBRIDOMAS | |
| DE19632755C1 (en) | Monoclonal antibody specific for CDw109 cell surface protein | |
| EP0115062A2 (en) | Monoclonal antibody specific for human blood group antigen D (Rh0), and reactive in a direct agglutination test, and hybridoma cell lines procuding these monoclonal antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
| D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
| 8364 | No opposition during term of opposition | ||
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |