DD259138B1 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE - Google Patents
PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE Download PDFInfo
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der mit einem Zeiloberflächenmolekül reagiert, welches von Lymphozyten relativ schnell nach Aktivierung exprimiert wird. Dadurch ist dieser monoklonale Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane Lymphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immunologischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Auch eine Nutzung des monoklonalen Antikörpers zur Eliminierung der aktivierten Lymphozyten ist möglich.The invention relates to a method of producing a monoclonal antibody which reacts with a cell surface molecule which is expressed by lymphocytes relatively rapidly upon activation. Thus, this monoclonal antibody is useful as a detection reagent for activated human lymphocytes which are found in various diseases involving immunological components, infectious diseases, lymphocytic neoplasia and transplantation crises. It is also possible to use the monoclonal antibody for the elimination of the activated lymphocytes.
Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg. E. L. Reinherz, B.F.Haynes, L. M.Nadleru. I.D.Bernstein: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystems und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktionellen Subpopulationen im peripheren Blut nur bei sehr drastischen Störungen und Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Anti-Subpopulattons-Antikörpern erfaßt werden können.The progress of differentiation of lymphocytes fulfilling different functions by monoclonal antibodies (Leukocyte Typing II, Vol 1-3, eds EL Reinherz, BF Haynes, LM Nadleru, ID Bernstein: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg , Tokyo 1986) have significantly improved the diagnostics of diseases with immunological components, neoplasms of the immune system and the monitoring of transplants. However, it has been found that changes in the levels of functional subpopulations in peripheral blood can not be reliably detected with anti-subpopulatton antibodies only in the case of very drastic disorders and reactions, as far as they are within the normal physiological range of variation.
Lymphozyten, die durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr Zelloberflächenantigenmuster. Der durch die Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf andere physiologische Leistungen. Es werden Rezeptoren für Interleukine, wie z. B. das IL-2, Hormone, Nährstoffe und modifizierende Komponenten entweder neu oder verstärkt exprimiert.Lymphocytes activated by antigens, mitogens or monoclonal antibodies to certain cell surface antigens qualitatively and quantitatively alter their cell surface antigen pattern following this activation. Activation-induced entry into the cell cycle requires adjustment of the cell for other physiological benefits. There are receptors for interleukins, such. For example, the IL-2, hormones, nutrients and modifying components are either expressed new or enhanced.
Diese Veränderungen sind Voraussetzung für DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktionell Enddifferenzierung.These changes are prerequisite for DNA synthesis, mitosis, proliferation and functional end-differentiation.
Die Aufklärung der Veränderungen des Zelloberflächenmolekülmusters steht erst am Anfang. Einige dieser Veränderungen konnten schon durch die Markierung der Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden.The elucidation of changes in the cell surface molecule pattern is just beginning. Some of these changes could already be detected by labeling the antigens with monoclonal antibodies.
Außerdem IL-2-Rezeptor (Mol-Gew. etwa 55000Da), der durch den Anti-Tac-Antikörper nachgewiesen werden kann (WALDMANN: Science 232, [1986) 727-732), sind monoklonale Antikörper gegen den Transferrinrezeptor (Mol-Gew. 190 000 Da; GODING u. BURNS: J.Immunol. 127 [1981] 1256-1258] bekanntgeworden.In addition, IL-2 receptor (mole wt. About 55000Da) which can be detected by the anti-Tac antibody (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-732), monoclonal antibodies against the transferrin receptor (mol. Wt 190 000 Da; GODING and BURNS: J. Immunol. 127 [1981] 1256-1258].
Weiterhin sind monoklonale Antikörper beschrieben worden, die mit Zelloberflächenantigenen unbekannter Funktion reagieren, die jedoch nach Aktivierung erst verstärkt exprimiert werden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonalen Antikörper 4F4 (Mol-Gew.80000/40000Da; HAYNES et al.: J.Immunol. 126, [1981] 1409), der CDw26-Gruppe (Mol-Gew. 120000, 200000 Da; Leukocyte Typing II. Vol. 1, Hrsg. E. L REINHERZ, B. F. HAYNES, L. M. NADLER u. I. D. BERNSTEIN: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986), der CD30-Gruppe (Mol-Gew.95000/130000 Da; WORKSHOP-Report des III. Leukocyte Differentiation Antigen Workshops, 1986, Oxford) und dem EA1 -Antigen, welches frühzeitig nach Behandlung von T-Zellen mit dem Tumorpromotor ^-o-Tetradecanoylphorboi-IS-acetat (T.HARA et al.: J.Exp. Med. 164 [1986] 1988-2005) erkannt werden.Furthermore, monoclonal antibodies have been described which react with cell surface antigens of unknown function, but which are first expressed to a greater extent after activation. These include the antigens identified by the monoclonal antibodies 4F4 (mole% 80000 / 40000Da; HAYNES et al .: J. Immunol., 126, [1981] 1409), the CDW26 group (mole% 120000, 200,000 Da Leukocyte Typing II. Vol. 1, eds. E. L REINHERZ, BF HAYNES, LM NADLER and ID BERNSTEIN: Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986), the CD30 group (Mol.W. 95000/130000 th; WORKSHOP report of the III leukocyte differentiation antigen workshop, 1986, Oxford) and the EA1 antigen, which was administered early after treatment of T cells with the tumor promoter ^ -o-tetradecanoylphorboi-IS-acetate (T.HARA et al .: J. Exp. Med. 164 [1986] 1988-2005).
Aber auch die Ia-Antigene sind als Aktivierungsmarker von humanen T-Lymphozyten geeignet (DD-PS 230877).But the Ia antigens are suitable as activation marker of human T lymphocytes (DD-PS 230877).
Als früheste Veränderung des Antigenmusters von aktivierten Lymphozyten, besonders T-Lymphozyten, gilt das Auftreten des IL-2-Rezeptors, welcher ungefähr 6h nach der Aktivierung vermehrt exprimiert wird (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-The earliest change in the antigen pattern of activated lymphocytes, especially T lymphocytes, is the appearance of the IL-2 receptor, which is expressed more frequently about 6 hours after activation (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-
Für diagnostische Zwecke ist es jedoch auch von Bedeutung, die früheste Phase der Aktivierung unabhängig vom Erscheinen des IL-2-Rezeptors sicher durch monoklonale Antikörper zu erfassen. Dazu sind monoklonale Antikörper prinzipiell geeignet, jedoch sind keine bekannt, die als Nachweisreagenzien für die frühe Phase der Aktivierung von Lymphozyten geeignet sind und nicht auf der Bindung an den IL-2-Rezeptor beruhen.However, for diagnostic purposes, it is also important to securely detect the earliest phase of activation by monoclonal antibodies, regardless of the appearance of the IL-2 receptor. For this purpose, monoclonal antibodies are in principle suitable, but none are known which are suitable as detection reagents for the early phase of the activation of lymphocytes and are not based on the binding to the IL-2 receptor.
Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren гиг Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der Zeiloberflächenveränderungen von Lymphozyten, besonders von T-Zellen, erfaßt, die relativ schnell nach deren Aktivierung durch Antigene, analog wirkende Antikörper oder Mitogene vonstattengehen, anzugeben, das in leicht beherrschbare Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses Nachweisreagenzes gestatten.The invention aims to provide a method of producing a monoclonal antibody detecting cell surface changes of lymphocytes, especially T cells, which are relatively fast upon activation by antigens, analogous antibodies or mitogens, in an easily controlled manner allow the cost effective production of larger amounts of this detection reagent.
Das Verfahren soll gleichbleibende Qualität des monoklonalen Antikörpers gewährleisten. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest von aktivierten humanen Lymphozyten eignen.The method is intended to ensure consistent quality of the monoclonal antibody. The monoclonal antibodies should be stable and therefore storable and suitable for use in a simple detection assay of activated human lymphocytes.
Durch die Bereitstellung eines solchen Antikörpers soll die medizinische Diagnostik, besonders von Infektionskrankheiten, von Rejektionskrisen bei Transplantationen und von Neoplasien im Immunsystem, verbessert werden.The provision of such an antibody is intended to improve medical diagnostics, in particular of infectious diseases, of rejection crises in transplants and of neoplasms in the immune system.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms sollen in anschließenden Verfahrensschritten ein monoklonaler Antikörper erzeugt werden, der mit einem besonders geeigneten, bisher unbekannten Zelloberflächenantigen von Lymphozyten, die aktiviert worden sind, reagiert.The invention has for its object to provide a comprehensible method, in the course of which a hybridoma is first generated, which is easy and inexpensive to handle and its cultivation is possible in a technically and economically advantageous manner. Using this hybridoma, subsequent monoclonal antibodies are to be generated which react with a particularly suitable, previously unknown cell surface antigen of lymphocytes that have been activated.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß 6-8 Wochen alte, weibliche BALB/c-Mäuse mit humanen aktivierten T-Lymphozyten immunisiert werden.The object is achieved by immunizing 6-8 week old female BALB / c mice with human activated T lymphocytes.
Die aktivierten T-Lymphozyten werden durch Behandlung humaner peripherer Blutlymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 (DD-PS 291741), der spezifisch mit dem antigenspezifischen Rezep'or/CDS-Komplex reagiert, erzeugt. Durch die Behandlung mit BL-TRec/1 werden die T-Lymphozyten in einer Art und Weise aktiviert, die der Aktivierung durch ein Antigen sehr ähnlich ist. Im Gegensatz zur klonalen Aktivierung durch ein Antigen, wird durch dieses Verfahren jedoch die Mehrheit der Gesamt-T-Lymphozytenpopulation aktiviert.The activated T lymphocytes are produced by treating human peripheral blood lymphocytes with the monoclonal antibody BL-TRec / 1 (DD-PS 291741), which reacts specifically with the antigen-specific receptor / CDS complex. Treatment with BL-TRec / 1 activates T lymphocytes in a manner very similar to activation by an antigen. Unlike clonal activation by an antigen, however, this method activates the majority of the total T lymphocyte population.
Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation solcher aktivierten T-Zel!en. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Mausmyelomzellen fusioniert. Die geeigneten Myelomzellen P3-X63-Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10%fetalem Kälberserum gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin,Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und Zeilklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die erfindungsgemäße Selektierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Oberflächenantigenen von aktivierten T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände im ersten Selektionsschritt auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit BL-TRec/1-aktivierten T-Lymphozyten, nicht aber mit ruhenden peripheren Blutlymphozyten reagieren. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nur an aktivierte T-Lymphozyten, nicht aber an ruhende Zellen binden. Im zweiten Selektionsschritt werden diejenigen Kulturen selektiert, deren Antikörper mit andersartig aktivierten Lymphozyten reagieren. Dazu werden sowohl durch bestrahlte allogene Leukozyten erzeugte Blasten (MLC-Blasten) als auch mitogenstimulierte Lymphoblasten (Phyhämagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed Mitogen) eingesetzt. Nur entsprechend reagierende Antikörper produzierende Hybridzellen werden weiter kultiviert.The immunization is carried out by repeated application of such activated T cells. From the spleens of such hyperimmunized mice, the lymphocytes are separated in a conventional manner. The B lymphocytes of this cell mixture are fused with mouse myeloma cells. The appropriate myeloma cells P3-X63-Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) are cultured in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum. In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), the hybrid cells formed are separated from the unfused myeloma cells and cell clones are selected which secrete antibodies of the desired specificity. The selection of the hybridomas according to the invention is carried out in such a way that the cells are divided into a plurality of separate 200 μl cultures immediately after the fusion. The supernatants of the cultures containing the growing hybrid cells are checked for the presence of antibodies which react only with surface antigens of activated T-lymphocytes. For this purpose, all culture supernatants in the first selection step are tested for the presence of antibodies that react with BL-TRec / 1-activated T lymphocytes, but not with dormant peripheral blood lymphocytes. Only the cultures are still used whose antibodies bind only to activated T lymphocytes, but not to resting cells. In the second selection step, those cultures are selected whose antibodies react with differently activated lymphocytes. Both blasts produced by irradiated allogeneic leukocytes (MLC blasts) and mitogen-stimulated lymphoblasts (phyhämagglutinin, concanavalin A, pokeweed mitogen) are used for this purpose. Only appropriately reactive antibody-producing hybrid cells are cultivated further.
Im dritten Selektionsschritt wird geprüft, daß diese ausgewählten Hybridomkulturen keine Antikörper enthalten, die mit Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten und Granulozyten reagieren.In the third selection step, it is checked that these selected hybridoma cultures do not contain antibodies which react with erythrocytes, platelets, monocytes and granulocytes.
Im vierten Selektionsschritt werden erfindungsgemäß die Hybridzellkulturüberstände mit aktivierten Lymphozyten, zu unterschiedlichen Zeiten nach Stimulierung, geprüft. Dabei werden Hybridome selektiert, die mit Lymphozyten schon wenige Stunden nach deren Stimulierung reagieren. Die geeigneten Hybridzellkulturen werden rekloniert und produktive Subklone selektiert. Diese erfindungsgemäße Selektionsstrategie führt zu Hybridomen, die den in der Zielstellung aufgestellten Anforderungen gerecht werden. Besonders günstige Eigenschaften weist das Hybridom H-BL-Ac/p26auf. Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers BL-Ac/p26, der mit einem frühzeitig nach der Aktivierung von Lymphozyten exprimierten Antigen reagiert, basiert auf einem Verfahren, weichesauf die Verwendung des Hybridoms H-BL-Ac/p 26 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-Ac/p 26 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviert vor und ist zugänglich. Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p 26 bzw. das ihn sezernierende Hybridom hat die Registriernummer DDR-0148 im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Für die Kultivierung ist zweckmäßig als Medium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das in einer bevorzugten Ausführungsform mit 1OmM HEPES, 5 x 10"5M Mercaptoethanol und 100mg/l Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder ein anderes geeignetes Serum, z. B. Pferdeserum, mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es, mit einem Anteil von 10% zu arbeiten. Vorteilhaft ist es weiterhin, bei 37°C zu kultivieren. Der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Von Vorteil ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei die Kulturdauer von 3 bis 4 Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt.In the fourth selection step, according to the invention, the hybrid cell culture supernatants are tested with activated lymphocytes at different times after stimulation. Hybridomas are selected that react with lymphocytes a few hours after their stimulation. The appropriate hybrid cell cultures are recloned and productive subclones selected. This selection strategy according to the invention leads to hybridomas that meet the requirements set in the objective. The hybridoma H-BL-Ac / p26 has particularly favorable properties. The production of the monoclonal antibody BL-Ac / p26, which reacts with an antigen expressed early after activation of lymphocytes, is based on a method which is directed to the use of the hybridoma H-BL-Ac / p26. The hybridoma H-BL-Ac / p 26 is cultured at the Life Sciences Section of the Karl Marx University in Leipzig. It is cryopreserved and accessible. The monoclonal antibody BL-Ac / p 26 or the hybridoma secreting it has received the registration number DDR-0148 in the Central Institute for Molecular Biology of the AdW of the GDR. For cultivation it is expedient to use MEM Eagle, Dulbecco's MEM, RPM 11640 or the like as the medium. It is particularly favorable to use RPM11640, which is "5 M mercaptoethanol and 100 mg / l gentamycin added in a preferred embodiment, with 1OmM HEPES, 5 x 10 z is used as the addition of serum fetal calf serum or other suitable serum. B. horse serum with. It is advantageous to work with a proportion of 10% and it is also advantageous to cultivate at 37 ° C. The CO 2 content of the atmosphere above the medium is, in the most favorable case, 5 It is advantageous to have a high humidity that can reach saturation of the atmosphere.The hybridomas are cultivated over a typical period of several days, with a culture time of 3 to 4 days, after which the medium is changed and the cell count is changed set again to an optimal starting value.
Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p 26 ist bis zu einer Konzentration von 150цд/тІ im Kulturüberstand enthalten und kann aus ihm nach den üblichen Methoden isoliert werden. Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 ist ein lgG3-lmmunglobulin.Zur Gewinnung größerer Antikörpermengen wird das Hybridom H-BL-Ac/p 26 in BALB/c-Mäusen i.p. inokuliert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden. Nach Aszitesbildung wird die den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Von der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegendThe monoclonal antibody BL-Ac / p 26 is contained in the culture supernatant to a concentration of 150 kd / тІ and can be isolated from it by the usual methods. The monoclonal antibody BL-Ac / p26 is an IgG3 immunoglobulin. To obtain larger quantities of antibody, the hybridoma H-BL-Ac / p 26 in BALB / c mice is administered i.p. inoculated. It is advantageous if the mice used are pretreated with a tumor stimulator, such as Paraffinum subliquidum, Pristan or the like. After ascites formation, the ascitic fluid containing the monoclonal antibody BL-Ac / p26 is removed by puncture. From the ascites fluid, the cellular components are separated by centrifugation, the predominant
aus Zellen des Hybridoms H-BL-Ac/p26 bestehen. Diese können zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert werden. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthält, wird entweder direkt verwendet oder einer weiteren Reinigung unterzogen.consist of cells of the hybridoma H-BL-Ac / p26. These may conveniently be injected into new, pre-treated mice. The cell-free supernatant containing the monoclonal antibody BL-Ac / p26 is either used directly or subjected to further purification.
Dafür kommen Salzpräzipitationen, lonenaustauschchromatographie, HPLC, FPLC, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage.For this come Salzpräzipitationen, ion exchange chromatography, HPLC, FPLC, protein A adsorption, affinity chromatography or the like. in question.
Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-20 mg der monoklonalen Antikörper.The ascitic fluid contains 5-20 mg of the monoclonal antibodies when carrying out the process according to the invention.
Anreicherungen führen zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von mehr als 20mg/ml.Enrichments lead to a product with an antibody content of more than 20 mg / ml.
Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit oder des Zellkulturüberstandes präzipitiert, z. B. mit 40-50% gesättigtem (NH4J2SO4, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse gegen NH4HCO3-Lösung führt nach Lyophilisierung zu einem salzfreien Präparat, welches bei +4°C haltbar ist.To produce a stable storage form which is also suitable as a commercial preparation, the immunoglobulin fraction of the cell-free ascitic fluid or of the cell culture supernatant is precipitated, for. B. 40-50% saturated (NH 4 J 2 SO 4, and taken up in buffered physiological saline. Dialysis against NH 4 HCO 3 solution resulting after lyophilization to a salt-free preparation which is stable at + 4 ° C.
Der nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellt monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 besitzt hohe Spezifität für aktivierte Lymphozyten (Tab.1). Das von dem monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 erkannte Antigen erscheint erst nach der Aktivierung der T-Lymphozyten auf der Zellmembran. Es handelt sich dabei um ein frühes Aktivierungsantigen, welches vor dem IL-2-Rezeptor exprimiert wird (Abb. 1). Es wird sowohl von antigenspezifischen humanen T-Zellklonen, die durch IL-2-enthaltendes Medium bei periodischer Stimulierung mit Antigen oder durch Mitogen gezüchtet werden, als auch auf permanent wachsenden T-Zellinien ausgeprägt (Tab. 2). Die Präsenz des durch BL-Ac/p26 erkannten Antigens auf allen aktivierten proliferierenden T-Zellen spricht für eine essentielle Funktion dieses Antigens bei dem Prozeß der Zellaktivierung.The monoclonal antibody BL-Ac / p26 prepared according to one of these process variants has high specificity for activated lymphocytes (Table 1). The antigen recognized by the monoclonal antibody BL-Ac / p26 does not appear until after activation of the T-lymphocytes on the cell membrane. It is an early activation antigen that is expressed in front of the IL-2 receptor (Figure 1). It is expressed both by antigen-specific human T-cell clones grown by IL-2-containing medium with periodic stimulation with antigen or by mitogen, as well as on permanently growing T-cell lines (Table 2). The presence of the antigen recognized by BL-Ac / p26 on all activated proliferating T cells indicates an essential function of this antigen in the process of cell activation.
Die biologische Funktion des von BL-Ac/p26 erkannten Antigens ist noch unbekannt. Das erkannte Antigen (p26) besitzt ein Molekulargewicht von etwa 26000Da. Es bildet keine kovalenten durch Disulfidbrücken gebundene Homooligomere, da es sowohl in unreduzierter als auch in reduzierter Form bei NDS-Polyacrylamidelektrophorese-Analyse nur als eine Bande mit dem angegebenen Molekulargewicht erscheint. Die Isolierung des Antigens erfolgt dabei durch die Bindung an den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26.The biological function of the antigen recognized by BL-Ac / p26 is still unknown. The recognized antigen (p26) has a molecular weight of about 26,000 Da. It does not form covalent homo-oligomers linked by disulfide bonds since it appears only as a band of the indicated molecular weight in both unreduced and reduced form in NDS polyacrylamide electrophoresis analysis. The isolation of the antigen takes place by binding to the monoclonal antibody BL-Ac / p26.
Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 eignet sich als Nachweisreagens von aktivierten humanen Lymphozyten, besonders von T-Lymphozyten, durch indirekte Immunfluoreszenz sowohl bei Auswertung mit einem Durchflußzytometer als auch bei fluoreszenzmikroskopischer Auswertung.The monoclonal antibody BL-Ac / p26 is useful as a detection reagent of activated human lymphocytes, especially of T-lymphocytes, by indirect immunofluorescence both by evaluation with a flow cytometer and by fluorescence microscopic evaluation.
Abbildung 2 zeigt die Markierung von unterschiedlich aktivierten humanen T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 bei durchflußzytometrischer Auswertung im Vergleich zu ruhenden Lymphozyten.Figure 2 shows the labeling of differently activated human T lymphocytes with the monoclonal antibody BL-Ac / p26 in flow cytometric evaluation compared to resting lymphocytes.
Die Auswertung der durch indirekte Immunfluoreszenz (FITC-Ziege-anti-Mausimmunglobulin) markierten Zellen erfolgte mittelsThe evaluation of the cells labeled by indirect immunofluorescence (FITC goat anti-mouse immunoglobulin) was carried out by means of
Markierung mitBL-Ac/p26( ) und einem inerten monoklonalen Antikörper des gleichen lgG3-lsotypes( ).Labeling with BL-Ac / p26 () and an inert monoclonal antibody of the same IgG3 isotype (FIG.
A: Ruhende periphere Lymphozyten (PBL)A: Resting peripheral lymphocytes (PBL)
B: PBL 3 Tage nach Aktivierung mit BL-TRec/1B: PBL 3 days after activation with BL-TRec / 1
C: PBL 3 Tage nach Aktivierung mit PhytohämagglutininC: PBL 3 days after activation with phytohemagglutinin
D: PBL 5 Tage nach Stimulierung mit allogenen LeukozytenD: PBL 5 days after stimulation with allogeneic leukocytes
Der monoklonale Antikörper kann mit geeigneten Verfahren mit Markierungssubstanzen, wie Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. FITC, TRlTC, Phycoerythrin), Enzymen (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphatase), kolloidalem Gold oder Radioisotopen gekoppelt werden. Dabei kann der markierte BL-Ac/p26zum Nachweis von aktivierten Lymphozyten sowohl in der Zellsuspension als auch am histologischen Schnitt eingesetzt werden.The monoclonal antibody can be coupled by suitable methods to labeling substances such as fluorescent dyes (e.g., FITC, TRICTC, phycoerythrin), enzymes (e.g., peroxidase, alkaline phosphatase), colloidal gold, or radioisotopes. The labeled BL-Ac / p26 for the detection of activated lymphocytes can be used both in the cell suspension and in the histological section.
Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p 26 kann damit in vielfältiger Weise als immunologisches Nachweisreagenz für humane aktivierte Lymphozyten in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden.The monoclonal antibody BL-Ac / p 26 can thus be used in a variety of ways as an immunological detection reagent for human activated lymphocytes in medical diagnostics.
Tab.1: Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-Ac/p26 mit verschiedenen humanen Blutzellen und BlastenTable 1: Binding pattern of the monoclonal antibody BL-Ac / p26 with various human blood cells and blasts
Markierungen mit dem mAKBL-Ac/p26 Zielzellen Positive StärkeMarks with the mAKBL-Ac / p26 Target Cell Positive Strength
Zellen (%) der MarkierungCells (%) of the label
Erythrozyten 0 —Erythrocytes 0 -
Thrombozyten 0 -Platelets 0 -
Monozyten 0 -Monocytes 0 -
Granulozyten 0 —Granulocytes 0 -
Lymphozyten (PBL)11 0-5 +Lymphocytes (PBL) 11 0-5 +
Aktivierteactivated
Lymphozyten21·' PHA 40-70 +-Lymphocytes 21 · 'PHA 40-70 + -
Co n A 40-50 + -Co n A 40-50 + -
PWM 20-40 + -*+ + + PWM 20-40 + - * + + +
MLC 10-25 +-MLC 10-25 + -
BL-TRec/1 50-70 + -BL-TRec / 1 50-70 + -
CD3 40-60 + -CD3 40-60 + -
''Periphere mononukleare Zellen aus dem Blut gesunder Spender'' Peripheral mononuclear cells from the blood of healthy donors
2J Bezogen auf alle Lymphozyten unabhängig von der Große. Die Auswertung erfolgte bei der gemischten allogenen Lymphozytenkultur (MLC) am 4. Tag, bei allen anderen am 2. Tag. 2 J Related to all lymphocytes regardless of size. The evaluation took place in the mixed allogeneic lymphocyte culture (MLC) on the 4th day, in all other on the 2nd day.
Tab. 2: Bindung des monoklonalen Antikörpers an ZielzellenTab. 2: Binding of the monoclonal antibody to target cells
Zielzellen Reaktivität mit BL-Ac/pTarget cells reactivity with BL-Ac / p
AK15(CD8+)AK15 (CD8 + )
KU10(CD8+)KU10 (CD8 + )
KT2(CD4+) T-ZellinienKT2 (CD4 + ) T cell lines
CEM ±CEM ±
SKW-3 +SKW-3 +
MOLT-3 +MOLT-3 +
MOLT-4 +MOLT-4 +
Jurkat +Jurkat +
Non-T, Non-BNon-T, Non-B
REH B-ZellinienREH B cell lines
Staudte -Staudte -
1419 ±1419 ±
Myelo monozytäre LinienMyelo monocytic lines
U 937 ±U 937 ±
Erythroide LinieErythroid line
Claims (2)
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| DD30098787A DD259138B1 (en) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| DD30098787A DD259138B1 (en) | 1987-03-20 | 1987-03-20 | PROCESS FOR THE PREPARATION OF MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST A BREAKING HUMAN LYMPHOCYTE |
Publications (2)
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| DD259138A1 DD259138A1 (en) | 1988-08-17 |
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Family
ID=5587639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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-
1987
- 1987-03-20 DD DD30098787A patent/DD259138B1/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DD259138A1 (en) | 1988-08-17 |
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