DD259138B1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen ein fruehes aktivierungsantigen humaner lymphozyten - Google Patents

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der mit einem Zeiloberflächenmolekül reagiert, welches von Lymphozyten relativ schnell nach Aktivierung exprimiert wird. Dadurch ist dieser monoklonale Antikörper als Nachweisreagens für aktivierte humane Lymphozyten, die bei verschiedenen Krankheiten mit immunologischen Komponenten, bei Infektionskrankheiten, bei Neoplasien des lymphozytären Systems sowie bei Transplantationskrisen auftreten, geeignet. Auch eine Nutzung des monoklonalen Antikörpers zur Eliminierung der aktivierten Lymphozyten ist möglich.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Fortschritte der Differenzierung von Lymphozyten, die unterschiedliche Funktionen erfüllen, durch monoklonale Antikörper (Leukocyte Typing II. Vol. 1-3, Hrsg. E. L. Reinherz, B.F.Haynes, L. M.Nadleru. I.D.Bernstein: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986) haben die Diagnostik von Krankheiten mit immunologischer Komponente, von Neoplasien des Immunsystems und die Überwachung von Transplantationen deutlich verbessert. Es hat sich jedoch gezeigt, daß Veränderungen der Anteile von funktionellen Subpopulationen im peripheren Blut nur bei sehr drastischen Störungen und Reaktionen, soweit sie in der normalen physiologischen Schwankungsbreite liegen, nicht sicher mit Anti-Subpopulattons-Antikörpern erfaßt werden können.

Lymphozyten, die durch Antigene, Mitogene oder monoklonale Antikörper gegen bestimmte Zelloberflächenantigene aktiviert werden, verändern im Gefolge dieser Aktivierung qualitativ und quantitativ ihr Zelloberflächenantigenmuster. Der durch die Aktivierung ausgelöste Eintritt in den Zellzyklus erfordert die Einstellung der Zelle auf andere physiologische Leistungen. Es werden Rezeptoren für Interleukine, wie z. B. das IL-2, Hormone, Nährstoffe und modifizierende Komponenten entweder neu oder verstärkt exprimiert.

Diese Veränderungen sind Voraussetzung für DNA-Synthese, Mitose, Proliferation und funktionell Enddifferenzierung.

Die Aufklärung der Veränderungen des Zelloberflächenmolekülmusters steht erst am Anfang. Einige dieser Veränderungen konnten schon durch die Markierung der Antigene mit monoklonalen Antikörpern erfaßt werden.

Außerdem IL-2-Rezeptor (Mol-Gew. etwa 55000Da), der durch den Anti-Tac-Antikörper nachgewiesen werden kann (WALDMANN: Science 232, [1986) 727-732), sind monoklonale Antikörper gegen den Transferrinrezeptor (Mol-Gew. 190 000 Da; GODING u. BURNS: J.Immunol. 127 [1981] 1256-1258] bekanntgeworden.

Weiterhin sind monoklonale Antikörper beschrieben worden, die mit Zelloberflächenantigenen unbekannter Funktion reagieren, die jedoch nach Aktivierung erst verstärkt exprimiert werden. Dazu gehören die Antigene, die durch die monoklonalen Antikörper 4F4 (Mol-Gew.80000/40000Da; HAYNES et al.: J.Immunol. 126, [1981] 1409), der CDw26-Gruppe (Mol-Gew. 120000, 200000 Da; Leukocyte Typing II. Vol. 1, Hrsg. E. L REINHERZ, B. F. HAYNES, L. M. NADLER u. I. D. BERNSTEIN: Springer-Verlag; New York, Berlin, Heidelberg, Tokyo 1986), der CD30-Gruppe (Mol-Gew.95000/130000 Da; WORKSHOP-Report des III. Leukocyte Differentiation Antigen Workshops, 1986, Oxford) und dem EA1 -Antigen, welches frühzeitig nach Behandlung von T-Zellen mit dem Tumorpromotor ^-o-Tetradecanoylphorboi-IS-acetat (T.HARA et al.: J.Exp. Med. 164 [1986] 1988-2005) erkannt werden.

Aber auch die Ia-Antigene sind als Aktivierungsmarker von humanen T-Lymphozyten geeignet (DD-PS 230877).

Als früheste Veränderung des Antigenmusters von aktivierten Lymphozyten, besonders T-Lymphozyten, gilt das Auftreten des IL-2-Rezeptors, welcher ungefähr 6h nach der Aktivierung vermehrt exprimiert wird (WALDMANN: Science 232, [1986] 727-

Für diagnostische Zwecke ist es jedoch auch von Bedeutung, die früheste Phase der Aktivierung unabhängig vom Erscheinen des IL-2-Rezeptors sicher durch monoklonale Antikörper zu erfassen. Dazu sind monoklonale Antikörper prinzipiell geeignet, jedoch sind keine bekannt, die als Nachweisreagenzien für die frühe Phase der Aktivierung von Lymphozyten geeignet sind und nicht auf der Bindung an den IL-2-Rezeptor beruhen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren гиг Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der Zeiloberflächenveränderungen von Lymphozyten, besonders von T-Zellen, erfaßt, die relativ schnell nach deren Aktivierung durch Antigene, analog wirkende Antikörper oder Mitogene vonstattengehen, anzugeben, das in leicht beherrschbare Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses Nachweisreagenzes gestatten.

Das Verfahren soll gleichbleibende Qualität des monoklonalen Antikörpers gewährleisten. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest von aktivierten humanen Lymphozyten eignen.

Durch die Bereitstellung eines solchen Antikörpers soll die medizinische Diagnostik, besonders von Infektionskrankheiten, von Rejektionskrisen bei Transplantationen und von Neoplasien im Immunsystem, verbessert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms sollen in anschließenden Verfahrensschritten ein monoklonaler Antikörper erzeugt werden, der mit einem besonders geeigneten, bisher unbekannten Zelloberflächenantigen von Lymphozyten, die aktiviert worden sind, reagiert.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß 6-8 Wochen alte, weibliche BALB/c-Mäuse mit humanen aktivierten T-Lymphozyten immunisiert werden.

Die aktivierten T-Lymphozyten werden durch Behandlung humaner peripherer Blutlymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 (DD-PS 291741), der spezifisch mit dem antigenspezifischen Rezep'or/CDS-Komplex reagiert, erzeugt. Durch die Behandlung mit BL-TRec/1 werden die T-Lymphozyten in einer Art und Weise aktiviert, die der Aktivierung durch ein Antigen sehr ähnlich ist. Im Gegensatz zur klonalen Aktivierung durch ein Antigen, wird durch dieses Verfahren jedoch die Mehrheit der Gesamt-T-Lymphozytenpopulation aktiviert.

Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation solcher aktivierten T-Zel!en. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Mausmyelomzellen fusioniert. Die geeigneten Myelomzellen P3-X63-Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10%fetalem Kälberserum gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin,Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science 145, [1964], 709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und Zeilklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die erfindungsgemäße Selektierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200pl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Oberflächenantigenen von aktivierten T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände im ersten Selektionsschritt auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit BL-TRec/1-aktivierten T-Lymphozyten, nicht aber mit ruhenden peripheren Blutlymphozyten reagieren. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nur an aktivierte T-Lymphozyten, nicht aber an ruhende Zellen binden. Im zweiten Selektionsschritt werden diejenigen Kulturen selektiert, deren Antikörper mit andersartig aktivierten Lymphozyten reagieren. Dazu werden sowohl durch bestrahlte allogene Leukozyten erzeugte Blasten (MLC-Blasten) als auch mitogenstimulierte Lymphoblasten (Phyhämagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed Mitogen) eingesetzt. Nur entsprechend reagierende Antikörper produzierende Hybridzellen werden weiter kultiviert.

Im dritten Selektionsschritt wird geprüft, daß diese ausgewählten Hybridomkulturen keine Antikörper enthalten, die mit Erythrozyten, Thrombozyten, Monozyten und Granulozyten reagieren.

Im vierten Selektionsschritt werden erfindungsgemäß die Hybridzellkulturüberstände mit aktivierten Lymphozyten, zu unterschiedlichen Zeiten nach Stimulierung, geprüft. Dabei werden Hybridome selektiert, die mit Lymphozyten schon wenige Stunden nach deren Stimulierung reagieren. Die geeigneten Hybridzellkulturen werden rekloniert und produktive Subklone selektiert. Diese erfindungsgemäße Selektionsstrategie führt zu Hybridomen, die den in der Zielstellung aufgestellten Anforderungen gerecht werden. Besonders günstige Eigenschaften weist das Hybridom H-BL-Ac/p26auf. Die Herstellung des monoklonalen Antikörpers BL-Ac/p26, der mit einem frühzeitig nach der Aktivierung von Lymphozyten exprimierten Antigen reagiert, basiert auf einem Verfahren, weichesauf die Verwendung des Hybridoms H-BL-Ac/p 26 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-Ac/p 26 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviert vor und ist zugänglich. Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p 26 bzw. das ihn sezernierende Hybridom hat die Registriernummer DDR-0148 im Zentralen Institut für Molekularbiologie der AdW der DDR erhalten. Für die Kultivierung ist zweckmäßig als Medium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPM11640 o. dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPM11640, das in einer bevorzugten Ausführungsform mit 1OmM HEPES, 5 x 10"⁵M Mercaptoethanol und 100mg/l Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder ein anderes geeignetes Serum, z. B. Pferdeserum, mit einem Anteil von 5-20% am Kulturmedium. Vorteilhaft ist es, mit einem Anteil von 10% zu arbeiten. Vorteilhaft ist es weiterhin, bei 37°C zu kultivieren. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt im günstigsten Fall 5%. Von Vorteil ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen, wobei die Kulturdauer von 3 bis 4 Tagen geeignet ist. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt.

Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p 26 ist bis zu einer Konzentration von 150цд/тІ im Kulturüberstand enthalten und kann aus ihm nach den üblichen Methoden isoliert werden. Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 ist ein lgG3-lmmunglobulin.Zur Gewinnung größerer Antikörpermengen wird das Hybridom H-BL-Ac/p 26 in BALB/c-Mäusen i.p. inokuliert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden. Nach Aszitesbildung wird die den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Von der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt, die überwiegend

aus Zellen des Hybridoms H-BL-Ac/p26 bestehen. Diese können zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert werden. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 enthält, wird entweder direkt verwendet oder einer weiteren Reinigung unterzogen.

Dafür kommen Salzpräzipitationen, lonenaustauschchromatographie, HPLC, FPLC, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage.

Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-20 mg der monoklonalen Antikörper.

Anreicherungen führen zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von mehr als 20mg/ml.

Zur Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit oder des Zellkulturüberstandes präzipitiert, z. B. mit 40-50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse gegen NH₄HCO₃-Lösung führt nach Lyophilisierung zu einem salzfreien Präparat, welches bei +4°C haltbar ist.

Der nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellt monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 besitzt hohe Spezifität für aktivierte Lymphozyten (Tab.1). Das von dem monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 erkannte Antigen erscheint erst nach der Aktivierung der T-Lymphozyten auf der Zellmembran. Es handelt sich dabei um ein frühes Aktivierungsantigen, welches vor dem IL-2-Rezeptor exprimiert wird (Abb. 1). Es wird sowohl von antigenspezifischen humanen T-Zellklonen, die durch IL-2-enthaltendes Medium bei periodischer Stimulierung mit Antigen oder durch Mitogen gezüchtet werden, als auch auf permanent wachsenden T-Zellinien ausgeprägt (Tab. 2). Die Präsenz des durch BL-Ac/p26 erkannten Antigens auf allen aktivierten proliferierenden T-Zellen spricht für eine essentielle Funktion dieses Antigens bei dem Prozeß der Zellaktivierung.

Die biologische Funktion des von BL-Ac/p26 erkannten Antigens ist noch unbekannt. Das erkannte Antigen (p26) besitzt ein Molekulargewicht von etwa 26000Da. Es bildet keine kovalenten durch Disulfidbrücken gebundene Homooligomere, da es sowohl in unreduzierter als auch in reduzierter Form bei NDS-Polyacrylamidelektrophorese-Analyse nur als eine Bande mit dem angegebenen Molekulargewicht erscheint. Die Isolierung des Antigens erfolgt dabei durch die Bindung an den monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26.

Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p26 eignet sich als Nachweisreagens von aktivierten humanen Lymphozyten, besonders von T-Lymphozyten, durch indirekte Immunfluoreszenz sowohl bei Auswertung mit einem Durchflußzytometer als auch bei fluoreszenzmikroskopischer Auswertung.

Abbildung 2 zeigt die Markierung von unterschiedlich aktivierten humanen T-Lymphozyten mit dem monoklonalen Antikörper BL-Ac/p26 bei durchflußzytometrischer Auswertung im Vergleich zu ruhenden Lymphozyten.

Die Auswertung der durch indirekte Immunfluoreszenz (FITC-Ziege-anti-Mausimmunglobulin) markierten Zellen erfolgte mittels

Markierung mitBL-Ac/p26( ) und einem inerten monoklonalen Antikörper des gleichen lgG3-lsotypes( ).

A: Ruhende periphere Lymphozyten (PBL)

B: PBL 3 Tage nach Aktivierung mit BL-TRec/1

C: PBL 3 Tage nach Aktivierung mit Phytohämagglutinin

D: PBL 5 Tage nach Stimulierung mit allogenen Leukozyten

Der monoklonale Antikörper kann mit geeigneten Verfahren mit Markierungssubstanzen, wie Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. FITC, TRlTC, Phycoerythrin), Enzymen (z.B. Peroxidase, alkalische Phosphatase), kolloidalem Gold oder Radioisotopen gekoppelt werden. Dabei kann der markierte BL-Ac/p26zum Nachweis von aktivierten Lymphozyten sowohl in der Zellsuspension als auch am histologischen Schnitt eingesetzt werden.

Der monoklonale Antikörper BL-Ac/p 26 kann damit in vielfältiger Weise als immunologisches Nachweisreagenz für humane aktivierte Lymphozyten in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden.

Tab.1: Bindungsmuster des monoklonalen Antikörpers BL-Ac/p26 mit verschiedenen humanen Blutzellen und Blasten

Markierungen mit dem mAKBL-Ac/p26 Zielzellen Positive Stärke

Zellen (%) der Markierung

Erythrozyten 0 —

Thrombozyten 0 -

Monozyten 0 -

Granulozyten 0 —

Lymphozyten (PBL)¹¹ 0-5 +

Aktivierte

Lymphozyten²¹·' PHA 40-70 +-

Co n A 40-50 + -

PWM 20-40 + -*+ + +

MLC 10-25 +-

BL-TRec/1 50-70 + -

CD3 40-60 + -

''Periphere mononukleare Zellen aus dem Blut gesunder Spender

²J Bezogen auf alle Lymphozyten unabhängig von der Große. Die Auswertung erfolgte bei der gemischten allogenen Lymphozytenkultur (MLC) am 4. Tag, bei allen anderen am 2. Tag.

Tab. 2: Bindung des monoklonalen Antikörpers an Zielzellen

Zielzellen Reaktivität mit BL-Ac/p

T-Zellklone

AK15(CD8⁺)

KU10(CD8⁺)

KT2(CD4⁺) T-Zellinien

CEM ±

SKW-3 +

MOLT-3 +

MOLT-4 +

Jurkat +

Non-T, Non-B

REH B-Zellinien

Staudte -

1419 ±

Myelo monozytäre Linien

U 937 ±

Erythroide Linie

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen ein frühes Aktivierungsantigen humaner Lymphozyten, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Immunisierung verwendeten T-Lymphozyten durch Behandlung mit dem monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 aktiviert werden, die Selektion der Hybridome zuerst durch die Bindung an aktivierte Lymphozyten, die durch einen monoklonalen Antikörper gegen Antigenrezeptor-CDS-Antigen-Komplex stimuliert wurden, erfolgt, anschließend mit andersartig aktivierten Lymphozyten überprüft und mit ruhenden Lymphozyten sowie anderen Blutzellen gegengetestet wird, das Hybridom H-BL-Ac/p26 (DDR-0148ZIM) ausgewählt wird, und die aus diesem Hybridom in an sich bekannter Weise gewonnenen monoklonalen Antikörper BL-Ac/ p26 spezifisch mit einem lymphozytären Zelloberflächenantigen reagieren, welches von einer einzelnen Polypeptidkette mit einem Molekulargewicht von etwa 26 kDa gebildet und frühzeitig nach Aktivierung auf der Oberfläche von humanen Lymphozyten exprimiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Testung verwendeten andersartig aktivierten Lymphozyten durch allogene Zellen oder durch Mitogen aktiviert werden.