DD250333A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler anti-human-t-lymphozytenrezeptor-antikoerper - Google Patents

Abstract

Das Verfahren zur Herstellung monoklonaler Anti-Human-T-Zellrezeptor-Antikoerper hat das Ziel, in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer den antigenspezifischen Rezeptor (Mol.-Gew. etwa 90 000, Dimer aus alpha- und beta-Ketten) der humanen T-Lymphozyten zu ermoeglichen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden, die mit dem antigenspezifischen Rezeptor der humanen T-Lyphozyten reagieren. Die Aufgabe wird durch die Herstellung des Hybridoms H-BL-TRec/1 mittels Zellfusion, dessen Kultivierung in vitro und in vivo sowie der Separierung der monoklonalen Antikoerper BL-TRec/1, geloest.

Description

Hierzu 2 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die mit einer allgemeinen Determinante des antigenspezifischen Rezeptors der humanen T-Lymphozyten reagieren und dadurch zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von funktionell reifen T-Lymphozyten sowie von T-Zellneoplasien eingesetzt werden können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt monoklonale Antikörper herzustellen. So haben KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256, S.495 [1975]) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie Hybridzellen erzeugt, die permanent wuchsen und stabil Antikörper sezernierten. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper genau definierter Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. So sind monoklonale Antikörper bekannt, die mit humanen T-Lymphozyten spezifisch reagieren (P. C. KUNG, G.GOLDSTEIN: Human T-Iymphocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies, Research Monographs in Immunology, Vol.3, S.5-15, Hrsg.: TURK, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdamm/New York/Oxford, 1981 sowie J. A. LEDBETTER, A. E. FRANKEL, L. A. HERZENBERG: Human

Leu-T-cell differentiation antigens: quantitative expression on normal lymphoid cells and cell-lines. Research Monographs in Immunology, Vol.3, S. 16-22).

Zu den verbreitetsten monoklonalen Antikörpern mit Spezifität für die Gesamtheit der humanen T-Lymphozyten zählen OKT3 und OKT1 (US-PS 4381295). Mittlerweile sind auch andere monoklonale Antikörper bekannt geworden, die mit T-Lymphozyten spezifisch reagieren. Die Einordnung dieser Antikörper wurde auf dem 1. und 2. Internationalen Workshop für Differenzierungsantigene humaner Leukozyten (Paris 1982, Boston 1984) vorgenommen. Nach dieser Nomenklatur werden 5 „cluster of differentiation" (CD) unterschieden, die monoklonale Antikörper erfassen, die mit den 5 bekannten unterschiedlichen Antigenen reagieren, die alle von der gesamten T-Lymphozytenklasse ausgeprägt werden: CD2, CD3, CD 5, CD 6 und CD7. Darüber hinaus sind weitere monoklonale Antikörper bekannt geworden, die ebenfalls T-ZeII spezifisch reagieren. Soweit bisher bekannt, reagieren diese Antikörper alle mit Antigenen, die in irgend einer Weise mit den T-Lymphozyten zusammenhängen. Keiner dieser Antikörper reagiert jedoch mit dem antigenspezifischen Zellmembranrezeptor der T-Lymphozyten selbst. Dieser antigenspezifische Rezeptor ist ein durch Disulfidbrücken verbundenes Heterodimer (Mol.-Gew. ca. 90000), welches aus einer α-Kette (Mol.-Gew. 49000-53000) und einer /3-Kette (Mol.-Gew. 41000-^45000) zusammengesetzt ist (S. MEUER et al., Ann. Rev. Immunol. 2, S. 23-50 [1984]). Der variable Teil sowohl der a- als auch der /3-Kette wird erst während der ontogenetischen Differenzierung der T-Lymphozyten durch Neuanordnung, von Genstücken (V, D, J) individuell gebildet und mit dem Gen für den konstanten Teil der α- bzw./3-Kette vereinigt. Dieser Vorgang ist der eigentliche entscheidende Differenzierungsschritt, der einen Lymphozyten irreversibel als T-ZeIIe prägt. Der vergleichbare irreversible Prägungsschritt für die B-Lymphozyten ist die Neuanordnung der V-, D- u. J-Genstücke der H- sowie der V- u. J-TeNe der L-Ketten der Immunglobuline, die sowohl als Rezeptor als auch als Sekretionsprodukt fungieren.

Der antigenspezifische Rezeptor der T-Lymphozyten kann bisher immunologisch nur durch sogenannte klonotypische Antikörper identifiziert werden (S. MEUER et al., Nature 303, S. 808 [1983]). Diese klonotypischen Antikörper binden jedoch nur jeweils den T-Zellrezeptor des zur Immunisierung verwendeten Zellklons. Diese Antikörper reagieren nicht mit den Rezeptoren anderer T-Zellklone und normaler Mischpopulationen von T-Lymphozyten, wie sie im Blut oder den lymphoiden Organen normalerweise vorkommen. Damit haben solche Antikörper keinen generellen diagnostischen Wert. Unter den durch die CD-Nomenklatur definierten Antikörpern sind die CD3-Antikörper von Bedeutung, weil sie mit unterschiedlichen Determinanten von 3 Membranproteinen (Mol.-Gew. 25000,20000 und 20000) reagieren, die auf der T-Zellmembran einen assoziierten, aber nicht kovalent verbundenen Komplex formieren, der seinerseits mit dem antigenspezifischen Rezeptor der T-Zellen assoziiert ist (H. D. ROYER et al., Behring Inst. Mit. 77, S. 1-21 [1985]). In Ermanglung eines Anti-Rezeptor-Antikörpers für alle T-Lymphozyten gelten CD3-Antikörper als sicherste Nachweisreagenzien für humane T-Zellen. Die Unzulänglichkeit der CD3-Antikörper besteht darin, daß sie an Moleküle binden, die mehr oder weniger eng und regelmäßig mit dem eigentlichen antigenspezifischen Rezeptor der T-Zellen assoziiert sind. Die Expression derCD3-Antigene und des antigenspezifischen Rezeptors erfolgt offenbar korreliert, dies schließt jedoch nicht aus, daß beide Komponenten, besonders bei Immundefekten oder Neoplasien, auch einzeln ausgeprägt werden. Der alleinige Nachweis des CD3-Antigens führt in solchen Fällen ebenso zu Fehlinterpretationen wie die Determination einer Zelle als Nicht-T-Lymphozyt aufgrund des Fehlens des CD3-Antigens.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für den antigenspezifischen Rezeptor (Mol.-Gew. ca. 90000, Dimer aus a- und /3-Kette) der humanen T-Lymphozyten gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein. Die monoklonalen Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen Nachweistest fürT-Lymphozyten aufgrund der Ausprägung eines antigenspezifischen Rezeptors, dem sichersten und schärfsten Kriterium für die Identifikation eines Lymphozyten als T-ZeIIe, eignen

Durch die Zurverfügungstellung solcher monoklonalen Antikörper soll die Diagnostik qualifiziert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit dem antigenspezifischen Rezeptor der humanen T-Lymphozyten reagieren.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach den bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus peripherem Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle werden daraus T-Lymphozyten gewonnen. Eine zweite Variante der T-Lymphozytengewinnung besteht darin, aus humanem Thymus eine Zellsuspension herzustellen und die Bindegewebsanteile durch Dichtegradientenzentrifugation abzutrennen.

Mit in der vorstehend beschriebenen oder auf eine andere Weise gewonnenen humanen T-Lymphozyten werden Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert.

Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die geeigneten Maus-B-Myelomzellen P3-X63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J. Immunol. 123, [1979] S. 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (LITTLEFIELD, Science, 145, [1964], S.709), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zellklone selektiert, die Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200/xl-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von

Antikörpern geprüft, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosettentechnik und/oder Nylonwolleseparation gewonnen werden, getestet. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit B-Lymphozyten, wohl aber mit der großen Mehrheit der Blutlymphozyten und allen separierten T-Zellen reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfluoreszenz erfolgen. So selektierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch auf jeden Fall mit der Immunfluoreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Hybridome weitergezogen werden, deren Antikörper mit B-Lymphozyten, Non-B/Non-T-Zellen, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten reagieren. Unter den in solcher Art vorselektierten Hybridomen werden nun erfindungsgemäß solche gesucht, ' deren Antikörper in der Lage sind mit einem T-Zelloberflächenprotein von ca. 90000 Da, welches nach Reduktion der Disulfidbrücken in zwei Polypeptidketten mit Molekulargewichten von ca. 41000—45000 und 49000-53000 zerfällt, zu reagieren. Dazu werden die Oberflächenproteine von peripheren humanen T-Lymphozyten nach der Laktoperoxidasemethode radioiodiert oder anderweitig markiert. Die Nonidet P-40-Lysate solcher markierten T-Zellen werden mit den zu untersuchenden Hybridomkulturüberständen inkubiert und anschließend die monoklonalen Mausantikörper durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum präzipitiert. Die von unspezifisch gebundenen Komponenten freigewaschenen Präzipitate werden in Natriumdodezylsulfat-Puffer aufgelöst, bei einem Aliquot die Disulfidbrücken der Proteine reduziert, und anschließend beide Proben einer NDS-Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen (5—10%) unterzogen. An Hand von Referenzproteinen wird das apparente Molekulargewicht der radioiodierten, durch den monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten T-Zeilantigene bzw. deren Polypeptidketten bestimmt. Es werden solche Hybridome ausgewählt, die mit einem Zelloberflächenantigen von humanen T-Lymphozyten reagieren, welches im unreduzierten Zustand ein app. Molekulargewicht von ca. 90000 und nach Reduktion 2 Polypeptidketten im Molekulargewichtsbereich von 40000-55000 aufweist.

Im dritten Selektionsschritt werden erfindungsgemäß die monoklonalen Antikörper der so ausgewählten Hybridome geprüft, ob das von ihnen erkannte Antigen mit dem CD3-Komplex reifer, humaner T-Zellen assoziiert ist.

Dazu wird derCD3-Komplexund mit ihm derantigenspezifische Rezeptor durch einen modulierenden CD3-Antikörpervon den Oberflächen der T-Lymphozyten entfernt. Dies erreicht man durch Inkubation der T-Zellen mit geeigneten Antikörperkonzentrationen für 24 Stunden bei +37⁰C. Unter den Pan-T-Lymphozyten-Hybridomen, deren monoklonale Antikörper ein obengenanntes Heterodimer binden, werden erfindungsgemäß diejenigen ausgewählt, die vor der Modulation mit allen T-Lymphozyten reagieren, nach der Entfernung des CDS/T-Zellrezeptor-Komplexes durch einen modulierenden CD3-Antikörpervon den T-Zellen nicht mehr an eine Zelloberflächenstruktur dieser Lymphozyten binden. Die durch derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und hochproduktive Subklone selektiert, die die gewünschten monoklonalen Antikörper stabil produzieren. Die so erhaltenen Hybridome werden als H-BL-TRec bezeichnet. Besonders geeignet ist der Zellklon H-BL-TRec/1. Die Herstellung der monoklonalen Anti-T-Zell-Rezeptor-Antikörper BL-TRec/1 basiert auf einem Verfahren, welches auf der Verwendung des Hybridoms H-BL-TRec/1 ausgerichtet ist. Das Hybridom H-BL-TRec/1 wird an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig kultiviert. Es liegt kryokonserviert vor und ist zugänglich.

Das Hybridom H-BL-TRec/1 produziert bei In-vitro-Kultur bis zu 100yu,g/ml monoklonalen Antikörper BL-TRec/1. Für die Gewinnung größerer Mengen dieses Antikörpers wird das Hybridom H-BL-TRec/1 in histokompatible BALB/c-Mäuse i. p. injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator, wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl., vorbehandelt wurden.

Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-TRec/1. Die Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und zweckmäßigerweise in neue, vorbehandelte Mäuse injiziert. Der zellfreie Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt einer weiteren Reinigung unterzogen. Zu letzterem kommen Salzpräzipitationen, DEÄE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage. Die Aszitesflüssigkeit erhält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-10mg BL-TRec/1 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehait von ca. 20mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung, und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialyse gegen NH4HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei 4°C häHtbar ist.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die zur Antikörperproduktion befähigten Hybridomzellen H-BL-TRec/1 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Durch Verkapselung oder Einbringung in Hohlfasersysteme kann die Zelldichte und die Antikörperausbeute erhöht werden. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ behandelt und somit eine Gammaglobulinfraktion ausgefällt. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatogrpahie o.dgl. möglich.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI 1640 o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMl 1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5 · 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%. Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35 und 38°C. Vorteilhaft ist es bei 37⁰C zu kultivieren. Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondre 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann. Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kulturdauer von 3 bis 4 Tagen. Danach wird das Medium gewechselt und die Zellzahl erneut auf einen optimalen Ausgangswert eingestellt. Die nach einer dieser Verfahrensvarianten hergestellten monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 weisen das in Tabelle 1 angegebene Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Mit permanent wachsenden humanen Zellinien reagieren sie in der in Tabelle 2 dokumentierten Art und Weise.

HumaneT-Lymphozyten werden durch den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 in der in Abb. 1 dargestellten Art durch indirekte Immunfluoreszenz markiert. Nach der Modulation von T-Lymphozyten durch CD3-Antikörper tritt keine Markierung auf (Abb. 2).

Der mofioklonale Antikörper BL-TRec/1 moduliert den T-Zellrezeptor/CDS-Komplex ebenfalls, wobei andere T-Zellantigene, wie z. B. CD 2 nicht beeinflußt werden (Abb.3). Das vom BL-TRec/1 gebundene T-Zellantigen ist ein Heterodimer (Mol.-Gew. ca. 90000), welches aus 2 Ketten mit apparenten Molekulargewichten von ca. 45000 und 51 000 besteht. Der monoklonale Antikörper BL-TRec/1 beeinflußt nach Bindung an die T-Lymphozyten deren biologische Funktion.

Tabelle

Indirekte Immunfluoreszenz von monoklonalen Antikörpern BL-TRec/1 mit verschiedenen humanen Blutzellen

Zellen	% markierte Zellen
Erythrozyten	0
Granulozyten	0
Thrombozyten	0
Monozyten	0
Lymphozyten11	72 ±8
T-Zellen2)	>95
B-Zellen31	<3
O-Zellen4)	0
Thymozyten	20-50

1 Lymphozyten des peripheren Blutes

2 E⁺-Lymphozyten

3 E~, Ig⁺-Lymphozyten

4 E", Ig--Lymphozyten

Tabelle 2 ',

Indirekte Immunfluoreszenz von monoklonalen Antikörpern BL-TRec/1 mit verschiedenen permanenten humanen

Zellinie Bindung

T-Zellinien CCRF-CEM CCRF-HSB-2 MOLT-4 JURKAT

O-Zellinien

NALM-6

B-Zellinien

Myeloide Linien

Erythroide Linie

Legenden zu den Abbildungen Abbildung

Histogramm von indirekt durch den monoklonalen Antikörper BL-TRec/1 markierten T-Lymphozyten aus dem peripheren Blut. Zelldurchflußzytometrie mittels FACS 440.

Abbildung

Die gleichen Lymphozyten wie in Abb. 1 nach Modulierung mit einem CD3-Antikörper (24h, 37°C) und nach indirekter Immunfluoreszenz mit BL-TRec/1.

Die fehlende Anfärbung ist auf die Komodulation des Antigens mit dem CD3-Antigenkomplex zurückzuführen.

Abbildung

Oberer Teil: Markierung der humanen T-Zellen von Blut-Lymphozyten mit BL-TRec/1 ( ),CD3-Antikörpern ( )und

einem CD2-Antikörper( ).

Unterer Teil: Modulierung der T-Zellen mit BL-TRec/1.

Das CD3-Antigen komoduliert, während das CD2-Antigen unverändert exprimiert wird.

Histogramme der Analyse am FACS 440.

Claims (5)

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Anti-Human-T-Lymphozytenrezeptor-Antikörper durch Immunisierung von Mäusen mit humanen T-Lymphozyten, Fusion von aus der Milz der Mäuse gewonnenen B-Lymphozyten mit murinen Myelomzellen, Separierung gebildeter Hybridzellen von nichtfusioniertenMyelomzellen, Selektierung von Hybridomen, die Antikörper produzieren, welche nur mit Zelloberflächenantigenen humaner T-Lymphozyten reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridome, deren Antikörper mit einem T-Zelloberflächenglykoprotein von ca. 90000Da, welches nach Reduktion von Disulfidbrücken in 2 Polypeptidketten mit Molekulargewichten von 41 000 bis 45000 und 49 000 bis 53000 zerfällt, spezifisch reagieren, dergestalt spezifisch selektiert werden, daß Oberflächenproteine humanerT-Lymphozyten markiert werden, die Nonidet-P40-Lysate derart markierter T-Zellen mit entsprechenden Hybridomkulturüberständen inkubiert werden, die monoklonalen Mausantikörper präzipitiert werden, z. B. durch Zugabe von Anti-Mausimmunglobulin-Serum, die Präzipitate von unspezifisch gebundenen Komponenten freigewaschen und in einem Puffer aufgelöst werden, bei einem Aliquot die Disulfidbrücken der Proteine reduziert werden, beide Proben einer NDS-Elektrophorese aus Polyacrylamidgelen unterzogen werden, das Molekulargewicht der durch den monoklonalen Antikörper spezifisch abgetrennten T-Zellantigene bzw. deren Polypeptidketten bestimmt werden, diejenigen Hybridome ausgesucht werden, deren Antikörper die Forderung nach Reaktion mit einem Zelloberflächenantigen von humanen T-Lymphozyten, welches im unreduzierten Zustand ein app. Molekulargewichtvon 90000 und nach Reduktion 2 Polypeptidketten im Molekulargewichtsbereich von 41 000 bis 45000 bzw. 49000 bis 53000 aufweist, und mit dem CD3-Antigenkomplex komoduliert, erfüllen, die Hybridome in vitro und in vivo kultiviert werden, die produzierten Antikörper isoliert werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung der Oberflächenproteine humaner T-Lymphozyten durch Radioiodierung mit der Laktoperoxidasemethode erfolgt.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Puffer zum Lösen des Präzipitates ein Natriumdodecylsulfathaltiger benutzt wird.

4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ausgewählten Hybridome rekloniert und produktive Subklone selektiert werden.

5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur In-vivo-Produktion des monoklonalen Antikörpers histokompatible BALB/c-Mäuse eingesetzt werden.