DD238168A3 - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerpers - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer T-Zell-Antigene. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer Zelloberflaechenantigene humaner T-Lymphozyten gestattet. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunaechst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und oekonomisch vorteilhafter Weise moeglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome sollen in anschliessenden Verfahrensschritten monoklonale Antikoerper erzeugt werden, die mit hauptsaechlich auf T-Zellen ausgepraegtem Antigen reagieren. Die Aufgabe wird geloest durch die Erzeugung der Hybridome H-BL-T2 bzw. H-BL-T3, deren Kultivierung in vitro oder in vivo und Abtrennung der monoklonalen Antikoerper BL-T2 bzw. BL-T3.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für T-Zell-Antigene.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, [1975], 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. So sind monoklonale Antikörper bekannt, die mit humanen T-Lymphozyten spezifisch reagieren (P.C. Kung, G.Goldstein, Human T-Lymphozyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies, Research Monographs in Immunology, Vol.3, S.5-15, Hrsg.: Turk, Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam/New York/Oxford, 1981 sowie J. A. Ledbetter, A. E. Frankel, L. A. Herzenberg, Human Leu T-cell differentiation antigens: quantitative expression on normal lymphoid cells and cell-lines. Research Monographs in Immunology, Vol.3,

Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die in hoher Ausbeute monoklonale Antikörper vom Typ BL-T2oder BL-T3 sezernieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörper für Zelloberflächenantigene humaner T-Lymphozyten gestattet. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, die Antikörper sollen stabil und damit lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest für humane T-Lymphozyten eignen, wobei Kreuzreaktionen mit Zelloberflächenantigenen anderer Zellen nicht vorkommen sollen. Durch das Zurverfügungstellen der monoklonalen Antikörper soll der Stand der Technik bereichert und eine qualifizierte Auswahl unter monoklonalen Antikörpern für humane T-Zell-Antigene gewährleistet werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren anzugeben, in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieser Hybridome soll in anschließenden Verfahrensschritten monoklonale Antikörper erzeugt werden, die mit auf T-Zellen ausgeprägten Antigenen reagieren.

Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zunächst nach dem an sich bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus peripherem Blut von gesunden Spendern isoliert werden. Durch Passage über Nylonwolle werden daraus T-Lymphozyten gewonnen. Eine zweite Variante der T-Lymphozytengewinnung besteht darin, aus humanen Thymus eine Zellsuspension herzustellen und die Bindegewebsanteile durch Dichtegradientenzentrifugation abzutrennen. Mit in der vorstehend beschriebenen oder auf eine andere Weise gewonnenen humanen T-Lymphozyten werden erfindungsgemäß Mäuse immunisiert. Vorzugsweise werden 6-8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemischs werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-b-Myelomzellen P3—X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immunol. 123, [1979] werden in RPMI-1640mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält [Littlefield, Science, 145, [1964], 709], werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß Zeilklone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Art sezernieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-//,l-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die nur mit Zelloberflächenantigenen von humanen T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände, die mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit B-Lymphozyten, die durch Eliminierung der T-Zellen durch E-Rosettentechnik und/oder Nylonwolleseparation gewonnen wurden, getestet. Nur die Kulturen werden weiter verwendet, deren Antikörper nicht mit B-Lymphzyten, wohl aber mit unseparierten Blutlymphozyten oder angereicherten T-Zellen reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellen kann sowohl durch indirekte Radiobindungstechnik als auch durch indirekte Immunfloreszenz erfolgen. So selektionierte Kulturen müssen ab dieser Stufe jedoch mit der Immunfloreszenztechnik überprüft werden. Dadurch wird ausgeschlossen, daß Kulturüberstände verwendet werden, die mit B-Lymphozyten, O-Zellen, Monozyten, Granulozyten,Thrombozyten und Erythrozyten reagieren. Die durch derartige Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und Subklone werden selektioniert, die Antikörper, die zur Erkennung humaner T-Lymphozyten geeignet sind, stabil produzieren.

Die Hybridome werden als H-BL-T bezeichnet. Besonders geeignet sind die Zellkulturen H-BL-T2 und H-BL-T3. In der im folgenden beschriebenen Verfahrensweise wird auf diese beiden Hybridome abgestellt, die an der Karl-Marx-Universität Leipzig, Sektion Biowissenschaften, kultiviert werden und zugänglich sind.

Das Hybridom H-BL-T2bzw. H-BL-T3wird in histokompatible Ax BALB/c-F_rMäusei.p. injiziert. Es ist von Vorteil, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinumsubliquidum,Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. — Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 enthaltende Aszitesflüssigkeit durch Punktion entnommen. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-T2 bzw. H-BL-T3. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zu letzterem kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschachromatographie, Protein-AAdsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-T2 (IgG 2 b) bzw. BL-T3 (IgG) spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die die Antikörper antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5-10 mg BL-T2 bzw. BL-T3 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellung einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z.B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei 4°C haltbar ist. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die zur Antikörperproduktion befähigten Hybridomzellen H-BL-T2 bzw. H-BL-T3 in einem Kulturmedium mit Serumsatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung versetzt und eine Gammaglobinfraktion erhalten. Weiter Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o.dgl. möglich. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. anzuwenden. Besonders günstig ist die

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%.

Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 25 und 40°C, insbesondere zwischen 35°C und 38°C. Vorteilhaft ist es, bei 37^CC zu arbeiten.

Der CO2-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen.

Die nach einer der beiden Verfahrensvarianten hergestellten monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 weisen das in Tabelle angegebene Reaktionsmuster mit humanen Blutzellen auf. Die Bindung wurde mittels indirekter Radiobindungstechnik (RBT) und indirekter Immunfloreszenz (ilF) bestimmt.

Die Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 besitzen mit etablierten, permanent wachsenden Zellinien das in Tabelle 2 dargestellte Bindungsmuster.

Der Antikörper BL-T3 stimuliert humane Blutlymphozyten bei Zugabe in das Kulturmedium zur Proliferation.

Die Erfindung soll nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Hybridomzellen H-BL-T2 werden auf eine Zelldichte von 1 bis 5 · 10⁶ Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, das mit NaHCO₃ (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10"⁵M), Gentamycin (100 mg/l) und N-2-Hydroxy-ethylpiperazin-N' -ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als besonders geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei 37⁰C in einer wasserdampfgesättigten 5%igenCO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei soll die o.a. Zelldichte erreicht werden. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugieren abgetrennt. Sie werden zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-T2. Die erreichte Konzentration der Antikörper ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von T-Lymphozyten. Werden höhere Konzentration der Antikörper gewünscht, werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem (NH₂I₂SO₄ gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere, an sich bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie. Gelfiltration usw.) weiter gereinigt werden. Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper BL-T2 benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oderGlycin/HCI-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens isoliert werden.

In gleicherweise kann der monoklonale Antikörper BL-T3 erhalten werden.

Beispiel 2

Hybridomzellen H-BL-T3, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden, wäscht man mit serumfreier physiologischer Kochsalzlösung. iO⁵ bis 5 · 10⁷ lebende Zellen werden histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F_rHybride der Stämme A und BALB/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den monoklonalen Antikörper BL-T3 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt. Der zelluläre Anteil besteht überwiegend aus Zellen des Hybridoms H-BL-T3. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung.

Für die in vivo oder in vitro hergestellten monoklonalen Antikörper BL-T3 wird derTiter durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung humaner Blutlymphozyten und einem geeigneten FITC-markierten Anti-Maus-Immunglobulinserum bestimmt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle T-Lymphozyten markiert werden.

In entsprechender Weise wird der monoklonale Antikörper BL-T2 erhalten.

Tabelle 1

Zellen

RBT

Γ' T2

ilF

T3

Intensität²¹ T2

T3

% markierte Zellen T2 T3

Erythrozyten Granulozyten Thrombozyten Monozyten Lymphozyten³¹ T-Zellen⁴¹ B-Zellen⁵¹ O-Zellen⁶¹ Thymozyten

0	0
0	0
0	0
0	0
69 ±8	65 ±6
100	100
0	0
0	0
> 90(25)	ca. 20

CLL-Lymphozyten

>85⁷

1) Bindungsindex I = Ipm BL-T2 bzw. 8L-T3/

Ipm BL-DNP (IgGD I > 10: + + +, <10>4: ++,<4> 1,5: + , < 1,5 > 1:—

2) Subjektive Bewertung der Fluoreszenzintensität von+ + +bis —

3) Lymphozyten des peripheren Bluts

4) Mit Schaferythrozyten Rosetten-bildende Lymphozyten (E⁺ — Lymphozyten)

5) lmmunglobulinpositive(lg⁺)-Zellen (E~-Lymphozyten)

6) lg--,E--Zellen

7) gilt für die Lymphozyten von 21 bis 23 durch die konventionelle klinische Diagnostik eingestufte CLL-Patienten.

Tabelle 2

Zellen

RBT

BL-T

ilF

B L-T

Intensität²* BL-T

BL-T 3

% markierte Zellen BL-T 2 BL-T 3

T-Zellinien

SKW-3 MOLT-3 MOLT-4 CCRF-CEM

CCRF-HSB-2 O-Zellinien NALM-6

REH B-Zellinien DAUDI HMy-2

STAU Myeloide Linie HL-60

U-937 Erythroide Linie K 562

>50	0
>50	<10
<50	<50
>50	0
>80	<10
0	0
0	0
0	0
0	0
0	0
0	0
0	0
0	0

1) und 2) siehe Legende zu Tabelle

Technische und ökonomische Vorteile der Erfindung

Immunhistologische Untersuchungen zeigen, daß die monoklonalen Antikörer BL-T2 und BL-T3 bevorzugt reife Thymozyten, also exportfähige T-Zellen, erkennen. In den kortikalen Bereichen des Thymus werden nur einzelne Zellen angefärbt. In der Tosille markieren beide monoklonalen Antikörper die Lymphozyten in den typischen T-Zellkompartimenten, während in den B-Zellregionen (Keimzentren) nur vereinzelte Zellen (eingewanderte T-Lymphozyten) angefärbt werden. Darüber hinaus markiert der BL-T2 jedoch Zellen an der Grenzzone von T- und B-Zellkompartiment besonders stark. Diese Zellen werden von anderen T-ZeII-Antikörpern gar nicht oder nur sehr schwach markiert, so daß sie nicht deutlich hervorgehoben werden. Diese Kontaktzone von B-und T-Lymphozyten ist aber von großer biologischer Bedeutung, da sich hier die zellulären Kooperationen zwischen B- und T- sowie zwischen T- und T-Zellen bei der Regulation der Immunantwort abspielen. Durch die starke Markierung der T-Lymphozyten in dieser Zone hat der BL-T2 zusätzlichen, völlig überraschenden Effekt, gerade solche T-Zellen besonders deutlich zu markieren, die sich in einer Phase funktioneller Aktivität befinden. Damit eröffnen sich neue Anwendungsbereiche für die Erforschung von immunologisch bedingten Krankheiten, die durch den monoklonalen Antikörper BL-T2 erschlossen werden.

-Ö- £OO IOO

Das Reaktionsmuster mit permanenten Zellinien sowie die im Durchschnitt 4% geringeren Zahlen markierter peripherer Lymphozyten im Vergleich zum BL-T2 weisen die BL-T3 als originären Antikörper aus, der seinerseits prospektive Bedeutung für die Typisierung von T-Zell-Lymphomen und -Leukämien besitzt.

Eine weitere vorteilhafte Eigenschaft der monoklonalen Antikörper BL-T2 und BL-T3 ist ihre starke Bindung an die antigentragenden Zellen. So werden beide monoklonalen Antikörper durch wiederholte Waschvorgänge nicht von den markierten Lymphozyten abgelöst. Die Markierung ist bei ausreichender Antikörperkonzentration in außergewöhnlich kurzer Zeit abgeschlossen. So reichen z. B. 30 see Kontakt für eine Markierung der Lymphozyten aus, obwohl alle einschlägigen Verfahrensvorschriften, die andere monoklonare Antikörper einsetzen, dafür 15-30 min vorsehen.

Diese vorteilhafte Eigenschaft der monoklonalen Antikörper BL-T2 und BL-T3 ist auf ihre hohe Affinität zurückzuführen und stellt ein wesentliches Qualitätsmerkmal dar. Hierdurch werden z. B. Fehlbestimmungen der T-Zellen, die auf eine mangelnde Inkubation zurückgehen, völlig ausgeschlossen. Hinsichtlich ihrer Stabilität und Lagerfähigkeit weisen BL-T2 und BL-T3 hervorragende Eigenschaften auf. Dies gilt sowohl bei der Aufbewahrung in flüssiger Form bei + 4°C als auch in lyophilisierter Form.

Claims (24)

1. Patentansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die T-Zell-Antigene erkennen, dadurch gekennzeichnet, daß A-Mäuse mit humanen T-Lymphozyten immunisiert werden, die Milz-Lymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen H-BL-T2 bzw. H-BL-T3 selektioniert werden, dieselektionierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert werden, die Ascitesflüssigkeit gewonnen und die Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 isoliert werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzellen H-BL-T2 bzw. H-BL-T3 kloniert und rekloniert werden und ein Subklon selektioniert wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3-X63-Ag 8.653 eingesetzt werden.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1 und 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit humanen T-Lymphozyten oderThymozyten erfolgt.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1 und 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten Ax BALB/c-Ft Hybridmäusen enthält.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzellen H-BL-T2 bzw. H-BL-T3 derart kultiviert werden, daß sie in einem Kulturmedium wie MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o. dgl. aufgezogen werden.
10. 10. Verfahren nach Punkt 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI-1640 verwendet wird.
11. 11. Verfahrennach Punkt 1,9,10, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmMHEPES, 5 · 10~⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.
12. 12. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
13. 13. Verfahren nach Punkt 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.
14. 14. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 35 bis 38⁰C beträgt.
15. 15. Verfahren nach Punkt 1 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37°C kultiviert wird.
16. 16. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium 2 bis 10% beträgt.
17. 17. Verfahren nach Punkt 16, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.
18. 18. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.
19. 19. Verfahren nach Punkt 1 und 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4Tage kultiviert wird.
20. 20. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß von der gewonnenen Aszitesflüssigkeit die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO4-Lösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, Dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO3-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
21. 21. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des Hybridoms H-BL-T2 bzw. H-BL-T3 bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können.
22. 22. Verfahren nach Punkt 1 und 20, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden.
23. 23. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechender Tumorstimulator 3 Tage bis 6 Wochen vorder Hybridominjektion gegeben wird.
24. 24. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die lyophilisierten Antikörper BL-T2 bzw. BL-T3 bei +4⁰C aufbewahrt werden.