DD230877A1

DD230877A1 - Verfahren zur herstellung eines monoklonalen antikoerper fuer eine hla-dr-assoziierte determinante

Info

Publication number: DD230877A1
Application number: DD25464383A
Authority: DD
Inventors: Helmut Fiebig; Ingrid Behn; Hartmut Kupper; Herwart Ambrosius
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-09-08
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1985-12-11
Also published as: DD230877B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikoerpers fuer eine HLA-DR-assoziierte Determinante. Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Antikoerpers anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers erlaubt. Der Antikoerper soll stabil und lagerfaehig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest eignen. Die Aufgabe wird darin gesehen, einen Antikoerper hoher Affinitaet zur Verfuegung zu stellen, der nur mit dem genannten Antigen reagiert. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst ein Hybridom H-BL-DR/1 erzeugt und selektioniert wird, das kloniert und rekloniert wird, woran sich eine Antikoerperherstellung in vivo oder in vitro anschliesst.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für eine HLA-DR-assoziierte Determinante.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß die Regulation der Immunantwort wesentlich von genetischen Faktoren gesteuert wird. Von besonderer Bedeutung sind dabei die für die Stärke der Immunantwort verantwortlichen IR-Gene. Die bekannten Proteine, die von dieser Genregion kodiert werden, sind die Ia-Antigene. Die vermutlichen homologen Strukturen von menschlichen Lymphozyten zu diesen Ia-Antigenen, die besonders in Mäusen untersucht worden sind, stellen die von der HLA-D-Region kodierten Genprodukte dar. In der Regel werden Anti-HLA-D-Antiseren verwendet, die allotypische Determinanten erkennen. Solche Antiseren werden von Frauen nach mehrfachen Schwangerschaften, von Patienten mit wiederholten Bluttransfusionen oder von freiwillig immunisierten Spendern gewonnen. Die Antiseren sind niedrigtitrig und reagieren nur mit einem oder einer Gruppe von Allotypen der HLA-D-Genprodukte.

Heteroimmunisierungen haben keinen durchschlagenden Erfolg bei der Präparation von Antiseren gegen diese HLA-D- oder HLA-DR-Antigene gebracht, weil die Absorption der Antiseren zur Eliminierung von Antikörpern gegen andere Zelloberflächenantigene äußerst schwierig ist. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern macht die Absorption unnötig und ermöglicht eine ständige Reproduktion dieser Immunreagentien.

Es ist bereits prinzipiell bekannt, monoklonale Antikörper herzusteilen. So haben Köhler und Milstein (Nature 256, [1975] 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß Antikörper unterschiedlicher Spezifität hergestellt worden sind.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers anzugeben, das in leicht beherrsch barer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers für eine HLA-DR-assoziierte Determinante erlaubt. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachweistest eignen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von für_eine HLA-DR-assoziierte Determinante spezifischen monoklonalen Antikörper abzuwickeln, das in reproduzierbarer Weise einen Antikörper hoher Affinität liefert, der nur mit dem genannten Antigen reagiert.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach dem an sich bekannten Verfahren der Dichtegradientenzentrifugation Lymphozyten aus peripherem Blut von gesunden Spendern isoliert werden. DieT-Zellen werden aus dieser Zellsuspension durch Adhärenz an Plastoberflächen, z. B. Plastpetrischalen, die vorher mit einem T-zellspezifischen monoklonalen Antikörper wie z. B. BL-T2 beschichtet worden waren, entfernt. Mit der so erhaltenen Zellsuspension, die B-Lymphozyten hochangereichert enthält, werden Mäuse immunisiert, vorzugsweise 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemischs werden mit Maus-B-Myelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P3-X - 63 Ag8.653 (Kearney et al., J. Immun. 123, [1979], 1548) werden in RPMI-1640 mit 10% fetalem Kälberserum gezüchtet. In einem Kulturmedium nach Littlefield (Science 145, [1964] 709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zellklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. DieSelektionierung des Hybridoms erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200 μΙ-Kulturen aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit allen peripheren B-Lymphozyten, der Mehrheit der Blutmonozyten, aber nur mit einer Subpopulation der peripheren T-Lymphozyten reagieren. Hierzu werden alle Kulturüberstände der Hybridzeilkulturen, die Antikörper enthalten, welche mit humanen Blutlymphozyten reagieren, mit angereicherten B-Lymphozyten, angereicherten adhärierenden Zellen (Monozyten) und separierten T-Lymphozyten getestet. Die dafür notwendigen B-Lymphozyten werden durch Eliminierung der T-Lymphozyten mittels Adhärenz dieser Zellen an mit dem monoklonalen, T-zellspezifischen Antikörper BL-T2 beschichteten Plastpetrischalen gewonnen. Mit Monozyten angereicherte Zellsuspensionen werden durch Inkubation (37°C, 2 Stunden) von mononukleären Blutzellen in Plastpetrischalen in RPMI-Medium, welches mit 10% fetalem Kälberserum supplementiert wurde, durch Ablösen der adhärierenden Zellen mit z. B. einem Gummischaber gewonnen. So lassen sich auch die T-Lymphozyten gewinnen, die von mit dem monoklonalen Antikörper BL-T2 beschichteten Plastepetrischalen nach Inkubation von Blutlymphozyten von der adhärenten Zellpopulation gewonnen werden. Alternativ können die T-Lymphozyten auch durch E-Rosettentechnik und/oder Nylonwolleseparation angereichert werden. Die Testung der Hybridomüberstände erfolgt durch indirekte Radiobindungstechnik und indirekte Immunfluoreszenz. Diese Verfahrensweise führt zur Auslese von Hybridzellkulturen, deren Antikörper mit allen B-Lymphozyten oder angereicherten Monozyten, aber nur mit einer Subpopulation von T-Zellen gesunder Spender reagieren. Die Testung der Kulturüberstände mit den entsprechenden Zellarten erfolgt am zweckmäßigsten durch die Methode der indirekten immunfluoreszenz. Die Kulturüberstände werden dazu mit den Testzellen inkubiert und der Anteil der markierten Zellen mittels FITC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum bestimmt. Nur solche Zellkulturen werden berücksichtigt, deren Antikörpermit mehr als 90% der B-Lymphozyten und Monozyten, aber nur mit weniger als 30% der T-Lymphozyten von gesunden Spendern reagieren.

Durch indirekte Immunfluoreszenz wird ausgeschlossen, daß die Kulturüberstände der verwendbaren Hybridzellkulturen mit Erythrozyten, Granulozyten, Thrombozyten reagieren.

Das durch die oben beschriebene Selektion erhaltene Hybridom H-BL-DR/1 wird rekloniert und ein Subklon wird selektioniert, der Antikörper stabil produziert.

Das auf die vorstehend geschilderte Weiseerhaltene Hybridom H-BL-DR/1 ist durch die überraschende, vorteilhafte Eigenschaft charakterisiert, Antikörper zu sezernieren, die mit humanen peripheren B-Lymphozyten, Monozyten und einer Subpopulation von peripheren T-Lymphozyten reagieren.

Zur Herstellung dieser Antikörper wird das Hybridom H-BL-DR/1 in einem Kulturmedium unter Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CCVhaltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄^SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten.

Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, lonenaustauschchromatographie o.dgl. möglich. Der derart erzeugte monoklonale Antikörper BL-DR/1 gehört der IgG-Klasse an, bindet Komplement und ist zur zytotoxischen Zerstörung der Zielzellen geeignet.

Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. einzusetzen. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 1OmM HEPES, 5-10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin versetzt ist.

Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum (FKS) oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium von 5 bis 20%.

Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10% zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 35 und 38°C.

Vorteilhaft ist es, bei 37⁰C zu arbeiten.

Der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10%, insbesondere 5%. Vorteilhaft ist eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend ist ein teilweiser Mediumwechsel notwendig, wobei die optimale Zelldichte wieder einzustellen ist.

Der monoklonale Antikörper BL-DR/1 ist in den Kulturüberständen enthalten.

Der monoklonale Antikörper BL-DR/1 ist durch das in Tabelle 1 angegebene Bindungsmuster gekennzeichnet.

Tabelle 1

Zellen RBT ilF

l¹⁾ Intensität²¹ % markierte Zeilen

Erythrozyten Granulozyten Thrombozyten Monozyten Lymphozyten³¹ T-Zellen⁴⁾ B-Zellen⁵⁾ O-Zellen⁶⁾ Thymozyten

	0
	0
	0
größer	80
	18 + 5
	8 + 3
größer	95
kleiner	10
kleiner	5

T-Zellenvor	7±2
Aktivierung⁷¹ + + +
T-Zellen nach	42 + 5
Aktivierung⁷¹ + + + + + +

1 Bindungsindex I = Ipm BL-DR/1/lmp BL-DNP (IgGD !größer 10: + ++, < 10 > 4: ++, < 4 >1,5: +,< 1,5 > 1: -

2 Subjektive Bewertung der Fluoreszenzintensität von+ + +bis —

3 Lymphozyten des peripheren Blutes

4 MitSchaferythrozyten rosettenbildende Lymphozyten (E⁺-Lymphozyten)

5 Immunglobulinpositive Ig⁺-Zellen (E~-Lymphozyten)

6 lg~-, E~-Zellen

7 Zellen vor der Aktivierung und nach 4 Tagen MLC-Kultur mit bestrahlten B-Zellen. Nur die BL-DR/1-positiven Zellen kamen zur Auswertung, die mitTRITC-markiertenZiege-anti-Humanimmuriglobulin nicht markiert waren.

In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Hybridom H-BL-DR/1 in histokompatible A xBalb/c-F_r Mäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o.dgl. vorbehandelt worden sind. Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-DR/1 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoms H-BL-DR/1. Es wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung oewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-DR/1 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-lonenaustauschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o.dgl. in Frage, die den Isotyp des BL-DR/1 (IgG) spezifisch anreichem, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-DR/1 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10 mg BL-DR/1 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehait von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SOyLösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄HCO3-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4°C haltbar ist.

Der monoklonale Antikörper BL-DR/1 reagiert mit einer Determinante, die auf HLA-DR-Molekülen von B-Lymphozyten, Monozyten und aktivierten T-Lymphozyten anwesend ist. Werden die Zelloberflächenproteine der genannten Zellen mit ¹²⁵J markiert und durch Behandlung mit 0,5% Nonidet P 40 solubilisiert, so können durch Sandwich-Präzipitation mit BL-DR/1 und Ziege-anti-MausimmunglobulinAntigenmoleküle isoliert werden, die bei SDS-Gelelektrophorese in 7,5% Acrylamidgelen unter reduzierenden Bedingungen aus zwei Peptidketten mit scheinbaren Molekulargewichten von 33 000 und 29000 Dalton bestehen. Diese Molekulargewichte sind charakteristisch für Antigene aus der HLA-DR-Region bzw. damit eng assoziierten Regionen. Das Zellverteilungsmuster der durch BL-DR/1 erkannten Antigenmoleküle in Zusammenhang mit den Molekulargewichten der erkannten Antigene zeigt, daß es sich um eine Determinante handelt, die auf HLA-DR-Molekülen und damit assoziierten Antigenen vorhanden ist

Die Erfindung soll nachstehend an Anführungsbeispielen näher erläutert werden.

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen (H-BL-DR/1) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 χ 10^s Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert. Das Kulturmedium besteht aus RPMI-1640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol (5 χ 10"⁵M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird. Dieses Medium wird mit:

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37⁰C in einer wassergesättigten 5%igenCO2-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-DR/1. Die Konzentration des Antikörpers BL-DR/1 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von B-Lymphozyten, Monozyten und aktivierten T-Zellen (wie

z. B. indirekte Immunfluoreszenz, enzymimmunologische Nachweise, Radiobindungstechniken).

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeignten Technik (z. B. indirekte Immunfluoreszenz) bestimmt werden, hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigten Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörpervon den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begieitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCL-PufferpH2.8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

2. Ausführungsbeispiel

Zellen des Hybridoms H-BL-DR/1 werden wie in Beispiel 1 kultiviert und vermehrt. Nach Erreichen einer hinreichenden Zellanzahl werden die Hybridomzellen geerntet und mehrmals mit serumfreiem Zellzuchtmedium gewaschen. Anschließend werden die Hybridomzellen in einer Dichte von 2-5 - 10⁶ Zellen pro 1 ml in einem serumfreien Zellzuchtmedium wie z.B. RPMI-1640, das mit NaHCO₃ (2g/l), Mercaptoethanol (5 · 10"⁵M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethyipiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird, kultiviert. Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei 37⁰C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden. Die Inkubation dauert 12-24 Stunden. Der zellfreie Kulturüberstand enthält den monoklonalen Antikörper des jeweiligen Hybridoms H-BL-DR/1 ohne Serumproteine, die sonst als Mediumzusatz verwendet werden. Der monoklonale Antikörper kann durch DEAE-Ionenaustauschchromatographie oder Protein-A-Adsorption o. dgl. weiter konzentriert werden, wenn das gewünscht wird.

3. Ausführungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen des Hybridoms H-BL-DR/1, die gegebenenfalls in vitro vorkuitiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10⁵bis5.· 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F-i-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 ml Paraffium subliquidum i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Der abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den _; monoklonalen Antikörper BL-DR/1 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht aus überwiegenden Anteil aus Zellen des Hybridoms H-BL-DR/1. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p.

injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (HN₁J₂SC^ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO3-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-DR/1 ist lyophilisiert bei+4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Immunfluoreszenz unter Verwendung frischer humaner Blutlymphozyten und einem geeigneten FlTC-markierten Anti-Mausimmunglobulinserum bestimmt. Als Titer wird diejenige größte Verdünnung angegeben, bei der noch deutlich alle B-Lymphozyten markiert werden.

Claims

-1- 546 43

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der eine HLA-DR-assoziierte Determinante erkennt, dadurch gekennzeichnet, daß Mäuse mit einer Zellsuspension, die B-Lymphozyten und Monozyten hochangereichert enthält, immunisiert werden, die Milz-Lymphozyten der hyperimmunen Mäuse mit Myelomzellen hybridisiert werden, Hybridomzellen H-BL-DR/1 selektioniert werden,

die selektionierten Hybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert werden, die Aszitesflüssigkeit gewonnen

und der Antikörper BL-DR/1 isoliert wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzellen H-BL-DR/1 kloniert und rekloniert werden und ein Subklon selektioniert wird.
3. Verfahrennach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche Α-Mäuse verwendet werden.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Myelomzellen solche der Linie P3 — X — 63Ag 8.653 eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit humanen B-Lymphozyten erfolgt.
6. Verfahren nach Punkt 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten vorgenommen wird.
7. Verfahren nach Punkt 1 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1:1 beträgt.
8. Verfahren nach Punkt 1 und 3-7, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten Myelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ Balb/c-F,-Hybridmäusen enthält.
9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit humanen Blutlymphozyten durch indirekte Radiobindungstechnik, auf die mit B-Lymphozyten, Monozyten und T-Lymphozyten jedoch mit der indirekten Immunfluoreszenz erfolgt.
10. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mitg humanen B-Lymphozyten, Monozyten undT-Zellen mittels FITC-markiertem Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Serum erfolgt.
11. Verfahrennach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen H-BL-DR/1 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in CO₂-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.
12. Verfahren nach Punkt 1 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o. dgl. eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Punkt 1 und 11-12, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPMI-1640 verwendet wird.
14. Verfahren nach Punkt 1 und 11-13, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 1OmM HEPES, 5 · 10_₅M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.
15. Verfahren nach Punkt 1 und 11-14, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Punkt 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca. 10%, der des Pferdenormalserums ebenfalls ca. 10% beträgt.
17. Verfahren nach Punkt 1 und 11-16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 35 bis 38°C beträgt.
18. Verfahren nach Punkt 1 und 11—17, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37^CC kultiviert wird.
19. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hybridom H-BL-DR/1 in histokompatible A χ Balb/c-F_rMäuse i.p. injiziert wird,

die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-DR/1 enthält, entweder direkt weiter verwendet wird

oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird

oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)_?SO₄-Lösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO₃-Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.
20. Verfahren nach Punkt 1 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des Hybridoms H-BL-DR/1 bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Mäusen injiziert werden können.
21. Verfahren nach Punkt 1 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt werden.
22. Verfahren nach Punkt 1 und 21, dadurch gekennzeichnet, daßeinentsprechenderTumorstimulatorS Tagebis6 Wochenvor der Hybridominjektion gegeben wird.
23. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-DR/1 bei +4⁰C aufbewahrt wird.
24. Verfahren nach Punkt 1 und 19-23, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Kulturmedium 2 bis 10% beträgt.
25. Verfahren nach Punkt 1 und 24, dadurch gekennzeichnet, daß der CO₂-Gehalt über dem Kulturmedium 5% beträgt.
26. Verfahren nach Punkt 1 und 19-25, dadurch gekennzeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre mit Wasserdampf reichen kann.
27. Verfahren nach Punkt 1 und 19, dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis:4 Tage kultiviert wird.