DD230878A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper fuer humanes ige - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer IgE. Es ist das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen dieses spezifischen Antikoerpers fuer humanes IgE gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, zunaechst ein Hybridom zu selektionieren, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung technisch einfach ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper verwirklicht werden, die zur Reaktion mit humanem IgE befaehigt sind. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst die Hybridome H-BL-IgE/1-10 selektioniert, kloniert und rekloniert werden und damit in vivo oder in vitro die entsprechenden Antikoerper hergestellt werden.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für humanes IgE

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die zur.Reaktion mit humanem IgE befähigt sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. Zu diesem Zweck werden zunächst durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie Hybridzellinien erzeugt, die permanent wachsen und stabil Antikörper sezernieren (Köhler, Milstein, Nature 256, (1975), 495). Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien hergestellt worden'sind, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren. Die Bildung der Antikörper kann dabei in vitro, aber auch in vivo erfolgen. Zum Beispiel sind Antikörper hergestellt worden, die mit verschiedenen humanen Immunglobulinen reagieren. Monoklonale Antikörper gegen humanes IgE sind von der Firma SEROTEC (Großbritannien) im Katalog ausgewiesen. Außer diesem sind jedoch keine Antikörper bekannt, die in der erforderlichen und gewünschten Weise mit humanem IgE reagieren.

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Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat daa Ziel, ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die- spezifisch mit Determinanten der schweren Kette des humanen IgE reagieren, anzugeben. Das Verfahren soll in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen dieses spezifischen Antikörpers gestatten. Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, der Antikörper soll stabil und lagerfähig sein und sich zur Verwendung in einem einfachen und exakten Nachreistest für humanes IgE eignen, wobei Kreuzreaktionen mit anderen humanen Immunglobulinisotypen nicht vorkommen sollen.

Darlegung, des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nachvollziehbares Verfahren zur Verfügung zu stellen, in dessen Verlauf zunächst ein Hybridom erzeugt wird, das leicht und unaufwendig handhabbar ist und dessen Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafter Weise möglich ist. Unter Verwendung dieses Hybridoms soll ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die zur spezifischen Reaktion mit humanem IgE befähigt sind, verwirklicht werden. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach an sich bekannten Verfahren eine Immunglobulinfraktion aus den Seren von Patienten (z.B. den Patienten mit den Abkürzungen Yu und HD), die IgS-Myelomprotein in hoher Konzentration enthalten, isoliert wird. Das kann z.B. durch Aussalzen und Ionenaustauschchromatographie geschehen. Aus diesen Iiimiunglobulinfraktionen werden nach dem von Nealin · ( Nezlin et al. Immunochem. _1Ο_, 1973, 681 beschriebenen Verfahren die Hyelomproteine IgE_v und IgSjm isoliert, mit denen erfindungsgemäß Mäuse immunisiert werden. Vorzugsweise werden 6 bis 8 Wochen alte weibliche A-Mäuse verwendet. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation, des Myelomproteins IgSy (jeweils 100/Ug/Maus), wobei die erste Antigengabe mit komplettem Preundschen Adjuvans

erfolgt. Vier Tage vor der Entnahme, der Milzen für die Fusion wird, mit dem Myelomprotein IgE™ eine Boosterung durchgeführt. Aus den Milzen derart hyperiinmuner Mäuse wurden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphozyten dieses Zellgemisches werden mit Maus-B—Kfcyelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die notwendigen Maus-B-Myelomzellen P 3 - X - 63 Ag 8.653 (KEARNEY et al., J.Immunol. V23, (1979), 1548) werden in RPMI-164O mit 10 % fetalem Kälberserum (MS) gezüchtet. In einem Kulturmedium, welches Hypoxanthin, Aminop-.terin und Thymidin enthält (Littlefield, Science, 165, (ί9β4), 709), werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und erfindungsgemäß ein Zeilklon selektioniert, der Antikörper der gewünschten Art sezerniert. Die Selektionierung des Eybridoms erfolgt in der Weise, daß ' die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200-/ul-KuItüren aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die mit dem Myelomprotein IgEy reagieren. Die Testung erfolgt zweckmäßigerweise mittels indirekter Radiobindungstechnik oder monoklonaler PAP-Technik. Dazu wird das Protein adsorptiv an Polyviuylchloridmikrotiterplatten gebunden, unspezifische Restbindungsstellen mit 2 % fetalem Kälberserum geblockt und mit den Hybridzellkulturuberständen inkubiert.,Spezifisch an das IgEy₁₁ gebundene Hybridomantikörper werden durch ⁹J-markierte Anti-Mausimmunglobulin-Antikörper oder durch einen monoklonalen PAP-Komplex nachgewiesen.

Die antikörperenthaltenden Kulturen werden dann in gleicher Weise mit Immunglobulinpräparationen der Klassen IgG, IgM, IgD, und IgA getestet. Hybridomkultüren, die mit, allen anderen humanen Immunglobulinklassen nicht reagieren, jedoch deutlich das Myelomprotein IgEy_u binden, werden auf ihre Bindungsfähigkeit an das Myelomprotein IgS,^ getestet. Hybridomkulturen, die Antikörper enthalten, die außer IgEy auch IgE₁^₀ binden, werden mit einem Hemmtest weiter charakterisiert. Hierzu wird versucht, die Bindung der Hybridomantikörper an PVC-adsorbiertes IgSy durch verschiedene Konzentrationen von

, IgEjjp, Human-IgE-haltige Standardseren der Firmen Pharmacia (Schweden) und Behringwerke AG (BRD) sowie eine Palette von Humanimmunglobulineη der Klassen IgG, IgM, IgD und IgA zu hemmen.

Auf die geschilderte Weise wird eine Serie von Hybridomen (H-Bl-IgE/1-10) erhalten, die wertvolle Eigenschaft haben, Antikörper zu sezernieren, die nicht nur mit den Immunogenen lgEy_u und .TgEjTQt sondern überraschenderweise auch spezifisch mit normalem Human-IgE reagieren. Die Hybridoma der Serie H-BL-IgE/1-1O sind sehr produktiv. Des weiteren sind sie gut zu handhaben und können über längere Zeit aufbewahrt werden. - Die durch die vorstehend beschriebene Selektion erhaltenen Hybridome werden rekloniert und Subklone werden erhalten, die stabil die gewünschten Antikörper produzieren.

Zur Herstellung der Antikörper der Serie BL-IgE/1-10, im folgenden kurz als BL-IgE bezeichnet, wird das entsprechende Hybridom in histokompatible A χ Balb/c-F.. Mäuse i,p. injiziert. Eg ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o. dgl. vorbehandelt worden sind. -Nach der Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z.B. durch Punktion. Aus der Aszitesflüssigkeit werden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z.B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des Hybridoma H-BL-IgE. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen Und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den monoklonalen Antikörper BL-IgE enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaust'auschchromatographie, Protein-A-Adsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp das BL-IgE spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-IgE antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer

Verfahre ns durchführung 5 bis 10 rag BL-IgJc. pro ml Flüssigkeit. -Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch .als HaηdeIspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, . z.B. mit 50 % gesättigter (ML)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen, Dialysieren gegen NH₁HCO--Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Pro-

ο dukt, das lyophilisiert bei +4 C haltbar ist.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die jeweiligen Hybridome aus der Serie H-BL-IgE/1-10 in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen, lach entsprechender Kultivierung in CO_?-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50 % gesättigtem (HEL)₂SO. versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Weitere Reinigung des Antikörpers ist nach an sich bekannten Verfahren wie Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie o. dgl. möglich. Es ist zweckmäßig, als Kulturmedium SiIEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o, dgl. anzuwenden* Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-164O, das in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit 10 mM HEPES, 5 *" 10"^ H--. Mercaptoethanol, 100 mg/1 Gentamycin versetzt ist. Als Serumzusatz dient fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum mit einem Anteil am Kulturmedium,von 5 bis 20 %, Vorteilhaft ist es, mit einem Serumanteil von 10 % zu arbeiten. Die Temperatur des Kulturmediums liegt zwischen 25⁰C und 40⁰C, insbesondere zwischen 35°C und 38⁰C. Vorteilhaft ist es, bei 37.C zu arbeiten. Der C0p-Geha2t der Atmosphäre über dem Kulturmedium beträgt günstig 2 bis 10 %, insbesondere 5 %, Vorteilhaft ist 'eine hohe Luftfeuchtigkeit, die bis zur Sättigung der Atmosphäre reichen kann.

Die Kultivierung des Hybridoms erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen,

1. Ausführungsbeispiel

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte .Hybridomzellen (H-BL-IgE/1-10) werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5x1O⁵ Zellen pro ml . Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPMI I640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2 g/l), Mercaptoethanol (5x10 ""^M) , Gentamycin (IOO mg/1) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N^f-, ethansulfonsäure (10 mM) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenorma!serum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20 %. Als geeignet hat sich 10 % Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37 C in einer wassergesättigten 5%igen CO^-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z,T.' an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Medium versorgt und bebrütet werden« Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-IgS". Die Konzentration des Antikörpers BL-IgE ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren von Human—IgE (wie z.B. enzy.miimnunologische Nachweise, Radiobindungstechniken)..

Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur. gewünschten Irbeitskonzentration..

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50 % gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden.

Werden hochgereinigte monoklonale Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Maus-Immunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 MKSCN, oder Glycin/HCL-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden,

2, Ausfuhrungsbeispiel

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms der Serie H-BL-IgE/1-10, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier ühysiologischer Koch-

5 7 salzlösung werden 10^ bis 5 ^β 10 lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F..-Hybride der Stämme Ä uha Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,5 nil Paraffinum subliquidum i.p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion'behandelt worden sind. Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen AszitesflÜ3sigkeiten, die den monoklonaleη Antikörper BL-IgE enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des Eybridoms H-BL-IgE. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Musen i.p, injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Inmunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50 % gesättigtem (KH*)„SO. präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5 %-ige KH.HCO--Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Der Antikörper BL-IgE ist lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar. Der -Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und .Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von PVC.-Mikrotiterplatten, die mit einem IgE-Eyelomprotein beschichtet sind,'ermittelt. «Als Titer wird diejenige größte Verdünnung des monoklonalen Antikörpers angegeben, bei der 50 % der radiomarkierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikorper, die bei maximaler Bindung angelagert sind, gebunden werden.

Die monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgE/1-10 haben die überraschende Eigenschaft, epsilonkettenspezifische Determinanten von normalem humanem IgE zu erkennen. Daraus ergeben sich günstige diagnostische und therapeutische Möglichkeiten. Die Antikörper selbst sind unkompliziert zu handhaben, gut lagerfähig und in größeren Mengen herstellbar. Durch das angegebene Verfahren zu ihrer Herstellung wird einem seit langem bestehenden gesellschaftlichen Bedürfnis entsprochen.

Claims (26)

Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für humanes IgS,

dadurch gekennzeichnet, daß

Mäuse mit humanen IgE-Myelomproteinen immunisiert werden, die Milzlymphozyten der hyperimmunen Muse mit liyelomzellen hybridisiert werden,

Kybridomzellen der Art H-BL-IgE/1-10 selektioniert werden, die selektionierten Eybridomzellen kultiviert oder in Mäuse injiziert, die -Äszitesflussigkext gewonnen und die jeweiligen Antikörper isoliert werden,

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Immunisierung 6 bis 8 Wochen alte weibliche A-Mäuse verwendet werden. ·

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als • Eyelomaellen solche der Linie P 3 - Σ - 63 Ag 8.653 eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunisierung' der Mäuse durch eine Reihe von Injektionen mit dem humanen Myelomprotein IgEy, erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 4, dadurch gekennzeichnet, daß die letzte Immunisierung 4 Tage vor der Isolierung der für die Hybridisierung bestimmten B-Lymphozyten mit einem anderen humanen IgE-lyelomprotein, wie z.B. IgS^, vorgenommen wird.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Myelomzellen und B-Lymphoblasten, die zur Fusion bestimmt sind, etwa 1 : 1 beträgt.

7. Verfahren nach Punkt 1, 3> 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Verfahrensschritt der Abtrennung der nicht hybridisierten !fyelomzellen von den Hybridzellen das verwendete Kulturmedium Milzzellen von nicht immunisierten A χ Balb/c-F.-Hybridmausen enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß, die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf ihre Reaktion mit humanem IgS mit der indirekten Radiobindungstechnik oder der monoklonalen PAP-Technik bei Verwendung von IgE-Myelomproteinen und normalem IgE erfolgt und der Nachweis des Nichtreagierens mit einer Serie von humanen Immunglobulinen der Isotypen IgG, IgM, IgA und IgD geführt wird,

9. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das jeweilige Hybridom selektioniert, kloniert und rekloniert wird und ein Subklon selektioniert wird, der zur Erkennung von humanem IgE geeignete Antikörper produziert.

10, Verfahren nach Punkt T, dadurch gekennzeichnet, daß die Eybridome H-BL-IgE/1 bis 10 jeweils einzeln in histokompatible A x. Balb/c-P.-Mäuse i.p. injiziert werden, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen

- wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper der Serie BL-IgE/1 bis 10 enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird

oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z.B. mit 50 % gesättigter (Mi.)pSO,-Lösung, Aufnahme des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen ver-. dünnte HH-HCO--Lösung und anschließende Lyophilisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.

11. Verfahren nach Punkt 1 und 10 dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennten zellulären Bestandteile, die hauptsächlich aus Zellen des eingesetzten Hybridoms der Serie H-BL-IgE/1 bis 10 bestehen, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut histokompatiblen Musen injiziert werden können.

12. Verfahren nach Punkt 1 und 10 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristan o, dgl. vorbehandelt werden.

13« Verfahren nach -Punkt 1 und 10 bis 1-2 dadurch gekennzeichnet, daß ein entsprechender Tumorstimulator 3 Tage bis 6 Wochen vor der Eybridominjektion gegeben wird,

14. Verfahren nach· Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lyophilisierte Antikörper BL-IgE bei .+4⁰C aufbewahrt wird.

15· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzeilen der Eybridomserie H-BL-IgE/1 bis 10 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium ein Serum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in COphaltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium mit 50 % gesättigtem (KH.)pSO. versetzt und eine Gananaglobulinfraktiön erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der monoklonale Antikörper isoliert wird.

16. Verfahren nach Punkt 1 und 15» dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium Eagle, Dulbeccos 11EM, RPMI o. dgl. eingesetzt wird.

17. Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Kulturmedium RPH-I64O verwendet wird,

18. Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kulturmedium 10 mM HEPES, 5·10~^ M Mercaptoethanol, 100-.:mg/l Gentamycin zugesetzt werden,

19. Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis.18, dadurch gekennzeichnet, daß als Serum fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum eingesetzt werden,

20. Verfahren nach Punkt 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des fetalen Kälberserums am Kulturmedium ca, '10 %, der des Pferdenormalserums ebenfalls, ca. 10 % beträgt.

21. Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierungstemperatur 35 bis 3S^ beträgt.

22.. Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß bei 37⁰C kultiviert wird.

23. Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der CCU-Gehalt der Atmosphäre über dem
Kulturmedium 2 bis 10 % beträgt.

24« Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 23,. dadurch gekennzeichnet, daß der COp-Gehalt über dem Kulturmedium
5 % beträgt.

25» Verfahren nach Punkt 1 und 15 bis 24» dadurch gekenn-• zeichnet, daß über dem Kulturmedium hohe Luftfeuchtigkeit herrscht, die bis zur Sättigung der Atmosphäre
mit Wasserdampf reichen kann.

26. Verfahren nach Punkt.1 und 15 bis .25» dadurch gekennzeichnet, daß 3 bis 4 Tage kultiviert wird.