DD243185A3

DD243185A3 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für Meerrettich-Peroxidase

Info

Publication number: DD243185A3
Authority: DD
Publication date: 1987-02-25

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper fuer Meerrettichperoxidase. Das Ziel besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung einer Serie von monoklonalen Antikoerpern verschiedener Isotypen anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostenguenstige Produktion groesserer Mengen spezifischer Antikoerper fuer Meerrettichperoxidase gestattet. Die Aufgabe wird darin gesehen, in technisch einfacher Weise eine Serie entsprechender monoklonaler Antikoerper zu erzeugen. Die Aufgabe wird geloest, indem zunaechst Hybridome erzeugt und selektioniert werden. Diese werden entweder in Naehrmedien kultiviert oder zur in-vivo-Kultur in syngene Maeuse injiziert, um monoklonale Antikoerper der Serie BL-POD/1-12 zu produzieren.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die spezifisch Meerrettichperoxidase binden, ohne deren Enzymaktivität zu hemmen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, Antiseren gegen Meerrettichperoxidase herzustellen. Solche Antiseren können zur immunologischen Ankopplung von Peroxidase an Antikörper einer beliebigen Spezifität benutzt werden (Sternberger, I.A. et al. J. Histochem. Cytochem. 18[197O] 315). Diese Technik ist heute hauptsächlich durch die Präparation von Peroxidase/Anti-Peroxidase-Antikörper (PAP)-Komplex weiterentwickelt worden (Bosmann, F. T. et al. Histochemistry 67 [1980] 243). In der Regel werden solche PAP-Komplexe mit Kaninchen-anti-Peroxidase-Antikörpern hergestellt. Dies ist von praktischer Bedeutung, weil die meisten Antiseren für die nachzuweisenden Antigene im Kaninchen präpariert werden. Es ist somit leicht möglich, diese Antikörper über einen Anti-Kaninchenimmunglobulin-Antikörper mit dem Kaninchen-PAP-Komplex zu koppeln, wodurch ein hochempfindliches Detektionssystem geschaffen wird.

Die Einführung von monoklonalen Antikörpern gegen eine Vielzahl von Antigenen, auch von Zelloberflächenantigenen, führt zu dem Wunsch, diese monoklonalen Antikörper mit dem PAP-Komplexzu koppeln. Da aber die meisten monoklonalen Antikörper von der Maus gewonnen werden, benötigt man auch Maus-anti-Peroxidase-Antikörper, um einen Maus-PAP-Komplex zu formieren. Nun ist die Maus aber ein ungeeignetes Spendertier für größere Serummengen, da in der Regel pro Tier nicht mehr als 1 ml Serum gewonnen werden kann. Die Herstellung von monoklonalen Maus-anti-Peroxidase-Antikörpern, die von der permanent wachsenden Zellinie produziert werden, würde ausreichend große Mengen dieser Antikörper zur Verfügung stellen.

Es ist bereits bekannt, monoklonale Antikörper herzustellen. So haben Köhler und Milstein(Natjre 256, [1975], 495) durch Fusion antikörperbildender Zellen mit einer permanent wachsenden Plasmozytomlinie eine Hybridzellinie erzeugt, die permanent wächst und stabil Antikörper gegen Schaf erythrozyten sezerniert. Diese Prinziplösung hat dazu geführt, daß verschiedene Hybridomlinien, die Antikörper unterschiedlicher Spezifität produzieren, hergestellt worden sind. Auch monoklonale Antikörper gegen Meerrettichperoxidase sind bekanntgeworden. Diese monoklonalen Mausantikörper gehören ausschließlich der Subklasse IgGI an (D.Y.Mason et al.: J.-Histochem. Sytochem.30, [1982] 1111-1122,T.Ternyck, J.Gregoireand S.Avrameas: J. Immunol. Methods 58, [1983] 109-118, EP 137 657). Zudem handelt es sich dabei um wenig produktive Hybridome (T. Ternynck et al.: J. Immunol. Methods 58, [1983] 109-118) bzw. es werden nur indirekte Daten genannt, die nicht die Produktivität der Hybridome besonders erwähnen. Es sind jedoch keine Hybridomlinien bekannt, die monoklonale Antikörper gegen Meerrettichperoxidase von anderen Isotypen (IgM, lgG2a, lgG2b, lgG3 oder IgA) in großer Menge sezernieren. Diese monoklonalen Antikörpersollen die Peroxidase mit hoher Affinität binden, ohne deren Enzymaktivität negativzu beeinflussen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern anzugeben, das in leicht beherrschbarer Weise die kostengünstige Produktion größerer Mengen spezifischer Antikörperfür Meerrettichperoxidase, die unterschiedlichen Immunglobulinisotypen angehören, gestattet.

Dabei soll gleichbleibende Qualität gewährleistet sein, die Antikörper sollen stabil und lagerfähig sein, eine ausreichende hohe Affinität zur Peroxidase aufweisen, ohne deren enzymatische Aktivität negativ zu beeinflussen und sich zur Isolierung von Meerrettichperoxidase eignen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Herstellungsverfahren für Antikörper anzugeben, die spezifisch mit Meerrettichperoxidase reagieren, wobei in dessen Verlauf zunächst Hybridome erzeugt werden, die leicht und unaufwendig handhabbar sind und deren Kultivierung in technisch und ökonomisch vorteilhafterweise möglich ist. Unter Verwendung der so erzeugten Hybridome soll in anschließenden Verfahrensschritten eine Serie von monoklonalen Antikörpern erzeugt werden, deren Glieder spezifisch mit Meerrettichperoxidase reagieren.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß Mäuse des Stammes A mit hochgereinigter Meerrettichperoxidase immunisiert werden. Die Immunisierung erfolgt durch mehrmalige Applikation des Antigens. Zur Immunisierung wurde Meerrettichperoxidase mit einer Reinheitszahl RZ größer als 2 verwendet, die affinitätschromatographisch an ConA-Sepharose aus Rohperoxidase (RZ 0,3) präpariert wird. Zur ersten Immunisierung wurde die Peroxidase mit kompletten Freundschen Adjuvans vermischt i.p. injiziert. Die weiteren Immunisierungen erfolgen ohne Adjuvansi.p. und i.v. Aus den Milzen derart hyperimmuner Mäuse werden die Lymphozyten in an sich bekannter Weise separiert. Die B-Lymphoblasten dieses Zellgemisches werden mit Mausmyelomzellen fusioniert bzw. hybridisiert. Die verwendeten Mausmyelomzellen P3-X-63 Ag 8.653 (Kearney et al., J. Immun. 123, [1979], 1548) werden in RPM11640 mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) gezüchtet. Zweckmäßig wird bei der Fusionierung ein Verhältnis von Myelomzellen zu B-Lymphoblasten wie 1 zu 1 eingehalten. In einem Kulturmedium nach Littlefield (Science 145, [1964], 709) werden die gebildeten Hybride von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt, und es werden erfindungsgemäß jeweils Zellklone selektioniert, die Antikörper der gewünschten Art produzieren. Die Selektionierung der Hybridome erfolgt in der Weise, daß die Zellen unmittelbar nach der Fusion in eine Vielzahl von separaten 200μΙ-ΚυΙίυτβη aufgeteilt werden. Die Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen werden auf die Anwesenheit von Antikörpern geprüft, die Meerrettichperoxidase binden. Die Auswahl geeigneter Hybridome des Typs H-BL-POD erfolgt zweckmäßigerweise durch indirekte Radiobindungstechnik mit gereinigter Meerrettichperoxidase (RZ 2,2).

Dabei werden durch den Einsatz radiomarkierter Anti-Mausimmunglobulinisotypen-Seren (Anti-lgM, -IgA, -IgGI, -IgG 2b, -IgG 3) von vornherein Hybridome berücksichtigt, die auch andere Isotypen als die häufigen IgGI-Antikörper sezernieren. Die durch diese Selektion erhaltenen Hybridome der Serie H-BL-POD/1-12 werden rekloniert und Subklone werden selektioniert, die zur stabilen Produktion von Meerrettichperoxidase erkennenden Antikörpern geeignet sind. Es ist vorteilhaft, die derart selektionierten Hybridome in einem Doppelantikörpertest, bestehend aus Ziege-anti-Mausimmunglobin-Antikörpern und Hybridomantikörpern BL-POD/1-12 sowie Meerrettichperoxidase daraufhin zu prüfen, ob die monoklonalen Antikörper in der Lage sind, die Peroxidase zu präzipitieren, ohne ihre Enzym aktivität zu hemmen. Die Präzipitate können gewaschen werden und durch eine geeignete Substratumsetzung die enzymatische Aktivität der immunspezifisch abgetrennten Meerrettichperoxidase nachgewiesen werden. Alle monoklonalen Antikörper der Serie BL-POD/1-12 binden Peroxidase ohne eine Behinderung der Enzymaktivität. Die Komplexe aus Peroxidase und den einzelnen Antikörpern BL-POD/1-12 können durch Anti-Mausimmunglobulin präzipitiert werden. Der Nachweis der Bindung der monoklonalen Antikörper an Peroxidase sowie der Nachweis, daß die monoklonalen Antikörper Komplexe mit Peroxidase bilden, die durch ein Anti-Mausimmunglobulinserum präzipiert werden können, ohne die enzymatische Aktivität der Peroxidase zu blockieren, ist in Tabelle 1 dokumentiert. Ebenso kann der Isotyp der jeweiligen monoklonalen Antikörper dieser Tabelle entnommen werden. Die Hybridome H-BL-POD/1-12 sind an der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig verfügbar.

Auf dem dargestellten Weg erhaltene Hybridomzellen der Serie H-BL-POD/1-12 werden in einem Kulturmedium mit Serumzusatz in Massenkultur aufgezogen. Nach entsprechender Kultivierung in CO2-haltiger Atmosphäre wird das nunmehr antikörperenthaltende Kulturmedium mit 50% gesättigtem (NH₄)₂SO4-Lösung versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten. Der jeweilige Antikörper kann sofort eingesetzt werden oder weiteren Reinigungs- und Anreicherungsverfahren unterzogen werden. i

Es ist vorteilhaft, als Kulturmedium MEM Eagle, Dulbeccos MEM, RPMI o.dgl. einzusetzen. Besonders günstig ist die Verwendung von RPMI-1640. Dem Kulturmedium kann 1OmM HEPES, 5 10"⁵M Mercaptoethanol, 100mg/l Gentamycin zugesetzt werden.

Als Serumzusatz dient vorteilhaft fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum, am besten in einem Anteil am Medium von ca. 10%.

Die Kultivierung der Hybridome erfolgt vorteilhaft bei 37°C, der CO₂-Gehalt der Atmosphäre über dem Medium soll 2 bis 10% betragen, wobei hohe Luftfeuchtigkeit die Kultivierung besonders begünstigt. Die Serie der wie vorstehend beschriebenen hergestellten monoklonalen Antikörper ist geeignet, Meerrettichperoxidase zu binden, ohne deren Enzymaktivität zu beeinträchtigen. Daraus ergeben sich vielfältige Einsatzmöglichkeiten der Antikörper insbesondere in der klinischen Diagnostik. Die Kultivierung der Hybridome erfolgt über einen üblichen Zeitraum von mehreren Tagen. Zweckmäßig ist eine Kultivierung von 3 bis 4 Tagen. Anschließend wird ein Teil des antikörperhaltigen Mediums geerntet und frisches Medium zugegeben. Dabei ist die optimale Zelldichte wieder neu einzustellen. *

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden die Hybridome H-BL-POD/1-12 in histokompatible A x Balb/c-F_r Mäuse i. p. injiziert. Es ist vorteilhaft, wenn die eingesetzten Mäuse mit einem Tumorstimulator wie Paraffinum subliquidum, Pristän o.dgi. vorbehandelt worden sind. Nach einer Aszitesbildung, die durch Anschwellen sichtbar wird, wird die den entsprechenden monoklonalen Antikörper aus der Serie POD/1-12 enthaltende Aszitesflüssigkeit entnommen, z. B. durch Funktion.AusderAszitesflüssigkeitwerden die zellulären Bestandteile abgetrennt, z. B. durch Zentrifugieren. Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Teil aus Zellen des jeweiligen Hybridoms H-BL-POD/1-12. Er wird zweckmäßigerweise mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und kann erneut injiziert werden. Der klare Überstand, der den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 enthält, wird entweder direkt bzw. in geeigneter Verdünnung eingesetzt oder weiterer Reinigung unterzogen. Zur weiteren Reinigung kommen Verfahren wie DEAE-Ionenaustauschchromatographie, Protein-AAdsorption, Affinitätschromatographie o. dgl. in Frage, die den Isotyp des jeweiligen BL-POD/1-12 spezifisch anreichern, oder Verfahren der Immunadsorption, die den Antikörper BL-POD/1-12 antigenspezifisch isolieren. Die Aszitesflüssigkeit enthält bei erfindungsgemäßer Verfahrensdurchführung 5 bis 10mg des entsprechenden monoklonalen Antikörpers BL-POD/1-12 pro ml Flüssigkeit. Anreicherung führt zu einem Produkt mit einem Antikörpergehalt von ca. 20 mg/ml.

Zum Herstellen einer stabilen Aufbewahrungsform, die auch als Handelspräparat geeignet ist, wird die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit präzipitiert, z. B mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Dialysieren gegen NH₄NCO₃-Lösung führt zu einem lyophilisierbaren Produkt, das lyophilisiert bei +4⁰C haltbar ist

Die Erfindung soll nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1

Auf flüssigem Stickstoff gelagerte Hybridomzellen H-BL-POD/1-12 werden aufgetaut und zweimal mit Kulturmedium gewaschen. Die Zelldichte wird auf 1-5 x 10^s Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und in geeigneten Gewebekulturflaschen kultiviert.

Das Kulturmedium besteht aus RPM11640, welches mit Natriumhydrogenkarbonat (2g/l), Mercaptoethanol {5 x 10"⁶M), Gentamycin (100mg/l) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure (1OmM) ergänzt wird.

Dieses Medium wird mit:

a) fetalem Kälberserum oder

b) Pferdenormalserum

supplementiert. Die möglichen Anteile sind 5 bis 20%. Als geeignet hat sich 10% Serumanteil erwiesen.

Die günstigsten Kulturbedingungen werden erreicht, wenn die Zellen bei +37°Cin einer wassergesättigten 5%igen CO₂-Atmosphäre bebrütet werden.

Nach 3 bis 4 Tagen werden die Zellkulturüberstände steril entnommen. Die z.T. an der Gefäßwand anhaftenden Zellen können erneut mit frischem Mediunrversorgtund bebrütet werden. Dabei ist jedoch auf die optimale Zelldichte zu achten. Die im Kulturüberstand enthaltenen Hybridzellen werden durch Zentrifugation abgetrennt. Sie können zur Aussaat in neue Kulturgefäße verwendet werden.

Die zellfreien Kulturüberstände enthalten den monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12. Die Konzentration des jeweiligen Antikörpers BL-POD/1-12 ist ausreichend für die üblichen diagnostischen Nachweisverfahren. Gegebenenfalls kann der Titer mit einer geeigneten Technik bestimmt werden. Hochtitrige Kulturüberstände gestatten eine Verdünnung bis zur gewünschten Arbeitskonzentration.

Werden höhere Konzentrationen des Antikörpers benötigt, so werden die Kulturüberstände mit 50% gesättigtem Ammoniumsulfat gefällt. Die so erhaltene Gammaglobulinfraktion kann durch weitere bekannte Trenntechniken (lonenaustauschchromatographie. Gelfiltration usw.) weitergereinigt werden. Werden hochgereinigte monoklonal Antikörper benötigt, so können diese durch Immunadsorption an trägerfixierte Anti-Mausimmunglobulinantikörper von den aus Kälberserum bzw. Pferdeserum stammenden Begleitproteinen abgetrennt werden und durch schonend wirkende Desorbentien (3 M KSCN oder Glycin/HCI-Puffer pH 2,8) von diesem Immunadsorbens wieder isoliert werden.

Ausführungsbeispiel 2

Eingesetzt werden Zellen eines Hybridoms aus der Serie H-BL-POD/1-12, die gegebenenfalls in vitro vorkultiviert werden. Nach Waschen in serumfreier physiologischer Kochsalzlösung werden 10^s bis 5 · 10⁷ lebende Zellen histokompatiblen Mäusen intraperitoneal injiziert. Als histokompatible Mäuse werden F,-Hybride der Stämme A und Balb/c eingesetzt, die mit einem Tumorstimulator, hier mit 0,4ml Paraffinum subliquidum i. p. 2 Wochen vor der Hybridominjektion behandelt worden sind.

Nach dem Einsetzen der Aszitesbildung werden die Mäuse punktiert. Die abgenommenen Aszitesflüssigkeiten, die den jeweiligen monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 enthalten, werden durch Zentrifugieren in zelluläre Bestandteile und in Aszitesflüssigkeit getrennt.

Der zelluläre Anteil besteht zum überwiegenden Anteil aus Zellen des entsprechenden Hybridoms H-BL-POD/1-12. Diese Hybridomzellen werden mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie oben beschrieben eingesetzt, indem sie histokompatiblen Mäusen i. p. injiziert werden. Solche Passagen sind wiederholt möglich.

Die Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit wird mit 50% gesättigtem (NH₄J₂SO₄ präzipitiert und in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung aufgenommen. Diese Lösung wird gegen 0,5%ige NH₄HCO₃-Lösung dialysiert. Anschließend erfolgt die Lyophilisierung. Die Antikörper BL-POD/1-12 sind lyophilisiert bei +4⁰C ohne Verlust der Bindungseigenschaften haltbar.

Der Antikörpertiter wird durch Herstellen einer Verdünnungsreihe und Austestung mittels indirekter Radiobindungstechnik unter Verwendung von peroxidasebeschichteten PVC-Mikrotiter-Platten und ¹²⁵J-markierten Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern bestimmt.

Tabelle 1

Charakterisierung der monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 hinsichtlich ihres Isotypes, der Bindung an festphasengebundene Peroxidase und der Wirkung auf die enzymatische Aktivität des Enzyms nach Bindung an die monoklonalen Antikörper

Monoklonaler	Isotyp	Bindung an	Enzymatische Aktiv.
Antikörper		Peroxidase^1!/lpM/	der geb. Peroxidase²
			/E₄₅₅/
BL-POD/1	IgGI	2130 + 210	1,45
BL-POD/2	lgG2b	2364 ±195	0,75
BL-POD/3	IgGI	2760 ± 230	1,64
BL-POD/4	lgG2a	1455 ±120	>2
BL-POD/5	IgM	1590 ±135	>2
BL-POD/6	lgG2b	2363 ±150	>2
BL-POD/7	lgG2a	1328 ±175	0,11
BL-POD/8	lgG3	1845 ±200	>2
BL-POD/9	IgGI	1215 ±115	1,54
. BL-POD/10	lgG3	1673 ±135	0,76
BL-POD/11	IgGI	1905 ±160	1,55
BL-POD/12	IgM	1478 ±210	0,63
Anti-DNP(IE5)	IgM	120±10	<0,01
BL-IG-L/1	IgGI	103 ±20	<0,01

1) Bindung an PVC-gebundene Meerrettichperoxidase, Entwicklung mit^12Sl-markierten Ziege-anti-Mausimmunglobulin-Antikörpern

2) Fällung der Peroxidase- Anti-Peroxidase — Komplexe (PAP) durch Anti-Mausimmunglobulin-Serum und Bestimmung der Enzymaktivität durch die Messung der Farbumsetzung nach Zugabe von o-Phenylendiamin/H₂0₂

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper für Mehrrettichperoxidase durch Immunisieren von Mäusen mit Meerrettichperoxidase, Separieren von Lymphozyten aus den Milzen derart behandelter Mäuse, Hybridisieren derart gewonnener Lymphozyten mit Myelomzellen, Selektionieren von Hybridomen und deren Kultivierung zur Gewinnung von Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß 6 bis 8 Wochen alte weibliche a-Mäuse mit gereinigter Meerrettichperoxidase immunisiert werden, entsprechend gewonnene Lymphozyten mit Myelomzellen der Linie P3-X-63-Ag 8.653 hybridisiert werden, Hybridome der Serie H-BL-POD/1-12 selektioniert werden, indem die Prüfung der Überstände der die aufwachsenden Hybridzellen enthaltenden Kulturen auf die Anwesenheit von Antikörpern, die Meerrettichperoxidase binden und damit die Auswahl geeigneter Hybridome H-BL-POD bestimmt, durch indirekte Radiobindungstechnik mit hochgereinigter Meerrettichperoxidase erfolgt, die selektionierten Hybridome in vitro kultiviert oder in Mäuse injiziert werden und aus dem Kulturmedium bzw. der Aszitesf lüssigkeit die entsprechenden monoklonalen Antikörper BL-POD/1-12 in an sich bekannter Weise separiert werden.
2. Verfahren nach Punkt !,dadurch gekennzeichnet, daß Hybridome, die Antikörper verschiedener Isotypen mit Peroxidasespezifität sezernieren, mit Hilfe markierter Anti-Mausimmunglobulinisotypen-Seren selektioniert werden.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die selektionierten Hybridome H-BL-POD in einem Doppelantikörpertest, bestehend aus Anti-Mausimmunglobulin-Antikörpem und Hybridomantikörpern BL-POD sowie Meerrettichperoxidase geprüft werden, daß die Anlagerung der monoklonalen Antikörper BL-POD die Enzymaktivität der Meerrettichperoxidase nicht hemmt.
4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß antikörperproduzierende Hybridomzellen der Hybridomserie H-BL-POD/1-1 2 in einem Kulturmedium in Massenkultur aufgezogen werden, wobei dem Kulturmedium fetales Kälberserum oder Pferdenormalserum zugesetzt wird, nach entsprechender Kultivierung in C02-haltiger Atmosphäre das nunmehr antikörperhaltige Kulturmedium bei 50% gesättigtem (NH₄I₂SO₄ versetzt und eine Gammaglobulinfraktion erhalten wird, aus der nach weiterer Aufarbeitung in an sich bekannter Weise der m onoklonale Antikörper isoliert wird.
5. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Hybridome der Serie H-BL-POD/1-12 jeweils einzeln in histokompatibleA χ BALB/c-FrMäusei.p. injiziert werden, nach der Aszitesbildung die Aszitesflüssigkeit entnommen wird, die zellulären Bestandteile abgetrennt werden, der klare Überstand, der den entsprechenden monoklonalen Antikörper der Serie BL-POD/1-12 enthält, entweder direkt weiter verwendet wird oder Reinigungs- und Anreicherungsoperationen unterzogen wird oder durch Ausfällen der Immunglobulinfraktion der zellfreien Aszitesflüssigkeit z. B. mit 50% gesättigter (NH₄)₂SO₄-Lösung, Aufnehmen des Präzipitats in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, dialysieren gegen verdünnte NH₄HCO3-Lösung und anschließende Lyophylisierung in eine dauerhafte Aufbewahrungsform überführt wird.