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Die Erfindung betrifft einen neuen monoklonalen Antikörper,
der mit dem Glycolipid Asialo-GM1 (kurz als GA1 bezeichnet)
spezifisch reagiert.
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In der Beschreibung werden Zucker, Lipide und deren
Bindungsarten in einer solchen Weise beschrieben, wie sie im
allgemeinen oder gewöhnlich in der Technik eingesetzt werden.
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Glycolipide haben insbesondere auf dem Gebiet der
Differenzierung und Carcinogenese von Zellen öffentliche
Aufmerksamkeit erregt. Bei den Studien über Glycolipide sind häufig
nicht nur herkömmliche biochemische Verfahren, sondern auch
immunochemische Verfahren unter Verwendung eines für jedes
Glycolipid spezifischen Antikörpers bei der Identifizierung,
Bestimmung und Reinigung derselben angewendet worden. Da die
Techniken zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die von
Köhler und Milstein entwickelt worden sind, allgemein
anwendbar gemacht worden sind, ist es wichtig, beim Studium
von Glycolipiden monoklonale Antikörper zu verwenden. Jedoch
existieren viele im allgemeinen bei Tieren beobachtete
Glycolipide, die gewöhnlich in verschiedenen Experimenten
verwendet werden. In diesen Fällen kann die Immunisierung
dieser Tiere nicht zur Entwicklung irgendeines Antikörpers im
Blut führen, was die Herstellung monoklonaler Antikörper
unmöglich macht.
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Des weiteren ist es schwierig, sogar wenn eine Immunisierung
beim Tier erreicht werden kann, einen monoklonalen Antikörper
herzustellen, wenn die im folgenden auch als Immunozyten
bezeichneten, Antikörper-produzierenden Zellen des genannten
Tieres als Partner von Myelom-Zellen, die herkömmlicherweise
bei der Herstellung von Hybrid-Zellen verwendet werden, keine
zufriedenstellende Rolle spielen können. Das Glycolipid GA1
ist hierfür ein Beispiel. GA1 ist nämlich in den Geweben und
auf den. Zelloberflächen der Maus, Ratte und des gesunden
Menschen vorhanden, fehlt jedoch beim Kaninchen. Darum wird
ein Antikörper gegen GA1 normalerweise durch Immunisierung
eines Kaninchens erhalten. Jedoch wird häufig beobachtet, daß
die Antikörper-produzierenden Zellen des Kaninchens nicht der
wünschenswerte Partner der Myelom-Zellen von Maus oder Ratte
sein können. Somit gibt es bisher keinen Bericht über den
Erfolg bei der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
gegen GA1.
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Wir haben Studien durchgeführt zur Herstellung eines
Antikörpers gegen eine Substanz, die in der Maus, Ratte und
im Menschen im gesunden Zustand vorhanden ist, das heißt ein
Bestandteil per se ist. Als Ergebnis gelang uns die
Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen GA1, der ein
Bestandteil von Ratte und Mensch ist, indem ein Tier
ausgewählt wurde, das eine relativ starke Immunantwort auf
einen Stoff von geringer Immunogenität aufweist, wodurch die
Erfindung zustande kam.
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Des weiteren wurde unter Verwendung monoklonaler Antikörper
gegen das genannte GA1 die GA1-Konzentration in den Seren
menschlicher Patienten, die an Krebs litten, getestet und
schließlich gefunden, daß die GA1-Konzentration im Blut eines
Krebspatienten höher ist, als die eines gesunden Menschen
oder die von Patienten, die an gutartigen Krankheiten leiden
ohne Rücksicht auf den Typ des Krebses.
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Taki et al. berichteten über die Diagnose von Krebs durch den
Test auf die GA1-Konzentration im Blut unter Verwendung eines
Anti-GA1-Antikörpers (cf. 43rd Proceedings of the Japanese
Cancer Association, S. 418 (1984)). In dem oben genannten
Bericht wurde ein polyklonaler Anti-GA1-Antikörper verwendet,
der aus einem Antiserum aufgereinigt wurde, das durch
Immunisierung eines Kaninchen mit GA1 erhalten worden war.
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Es wird angenommen, daß ein Verfahren zur Detektion eines
Glycolipids unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers
dafür im Vergleich zu dem, bei dem ein monoklonaler
Antikörper verwendet wird, hinsichtlich seiner Genauigkeit
nicht völlig zuverlässig ist. Darum ist die Diagnose von
Krebs unter Verwendung des erfindungsgemäßen monoklonalen
Anti-GA1-Antikörpers überlegen.
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Somit ist der erfindungsgemäße Anti-GA1-Antikörper nicht nur
bei den grundlegenden Studien über Glycolipide sehr nützlich,
sondern auch bei der Diagnose von Krebs.
Zusammenfassung der Erfindung
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Der erfindungsgemäße monoklonale Anti-GA1-Antikörper wird
hergestellt, indem Antikörper-produzierende Zellen eines
Säugers, der mit dem Glycolipid GA1 immunisiert worden ist,
mit Myelom-Zellen zu einem Säuger, der mit Glycolipid GA1
immunisiert worden ist, mit Myelom-Zellen verschmolzen
werden, um so Hybrid-Zellen zu bilden, und indem ein
monoklonaler Antikörper mit dessen oben erwähnten Eigenschaften
isoliert wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
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Fig. 1 zeigt die Konzentrationen von GA1 (ng/ml), die durch
das ELISA-Verfahren in den Blutproben bestimmt wurde, die von
Patienten gesammelt wurden, die an verschiedenen Krebsarten
litten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Herstellung der
Hybrid-Zellen nach einem bekannten Verfahren durchgeführt
werden, beispielsweise nach dem in Nature, 256, 495 (1975)
beschriebenen Verfahren und durch Variationen desselben (cf.
J. Expt. Med., 150, 1008 (1979)).
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Als Immunogen kann GA1, das aus Rinderhirn oder Zellen
verschiedener
Säuger, die dasselbe auf der Oberfläche aufweisen,
aufgereinigt worden ist, verwendet werden.
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Das mit GA1 zu immunisierende Säugetier ist nicht streng
begrenzt. Vorzugsweise wird das genannte Tier ausgewählt,
indem die Eignung für die bei der Zellfusion verwendeten
Myelom-Zellen betrachtet wird. Mensch, Maus und Ratte werden
im allgemeinen verwendet, obwohl in einigen Fällen auch ein
Kaninchen oder andere Tiere verwendet werden können.
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Des weiteren können, falls erforderlich, Modelltiere für
Autoimmunkrankheiten, wie NBZ-, NZW- oder NZB-/WF1-Mäuse,
verwendet werden.
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Die Immunisierung mit GA1 kann entweder in vitro oder in vivo
durchgeführt werden. Wird sie in vivo durchgeführt, kann GA1
beispielsweise mit einer physiologischen Salzlösung oder
einer Phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) verdünnt werden,
um eine passende Konzentration zu ergeben und kann
intravenös, subkutan oder intraperitoneal an ein Tier
verabreicht werden. Insbesondere wird gereinigtes GA1
vorzugsweise beispielsweise mit PBS passend verdünnt und
gleichzeitig mit herkömmlichen Trägerstoffen wie Salmonella
minnesota oder Rinderserum-Albumin, das hier im folgenden als
BSA abgekürzt wird, mehrmals in Intervallen von 4 bis 14
Tagen an ein Tier verabreicht, um eine Gesamtdosis von 10 bis
100 ug pro Individuum zu ergeben. Eine Immunisierung in vivo
unter Verwendung von Membranbestandteilen oder Zellen an sich
kann auf ähnliche Weise wie die oben beschriebene
durchgeführt werden. Beispielsweise können
Membranbestandteile in einer Gesamtdosis von 1 bis 100 mg pro
Individuum verabreicht werden, während Zellen an sich in
einer Gesamtdosis von 10&sup6; bis 10&sup8; pro Individuum verabreicht
werden können. Die Antikörper-produzierenden Zellen, die bei
der Immunisierung in vivo verwendet werden, können
Milzzellen, Lymphknotenzellen, peritoneale Lymphozyten oder
periphere Blutlymphozyten sein. Am meisten bevorzugt werden
Milzzellen etwa 4 Tage nach der endgültigen Immunisierung
verwendet.
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Die Immunisierung in vitro kann auf dem Wege einer
sogenannten in vitro-Sensibilisierung durchgeführt werden. Es
werden nämlich Lymphozyten, die aus Milzzellen,
Lymphknotenzellen, peritonealen Lymphozyten und peripheren
Blutlymphozyten ausgewählt werden, mit GA1, das als Antigen dient,
eine Woche lang inkubiert, um so die Zellen zu entwickeln,
die den Antikörper gegen GA1 produzieren. In diesem Falle
kann gereinigtes GA1 in einem Medium für die Zellinkubation
aufgelöst werden, oder an einem geeigneten Trägerstoff, wie
Schaf-Erythrozyten, Liposomen oder Salmonella minnesota,
adsorbiert werden, worauf sich die Inkubation mit den
Lymphozyten anschließt. Bei Verwendung von Zellen an sich
oder ihrer Membranbestandteile, die GA1 als Immunogen
enthalten, können sie in einem Medium aufgelöst oder
suspendiert werden und mit Lymphozyten inkubiert werden. Bei
Verwendung von Zellen an sich werden dieselben vorzugsweise
mit Mitomyzin behandelt oder vor der Inkubation mit
Lymphozyten bestrahlt.
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Irgendein Medium, das gewöhnlich zur Inkubation von
Lymphozyten verwendet wird, beispielsweise RPMI 1640 oder
Dulbeccos MEM-Medien, können zur Inkubation der Lymphozyten
verwendet werden. Zweckmäßigerweise wird fötales Kalbserum,
das im folgenden als FCS abgekürzt wird, in einer
Konzentration von 5 bis 20% bei der Verwendung zugesetzt.
Weiterhin kann das Medium 2-Mercaptoethanol und
Kermesbeerenmitogen, im folgenden als PWM abgekürzt, in einer
Konzentration von 5 · 10&supmin;&sup5; M bzw. 5 bis 30 ug/ml enthalten,
wenn es erforderlich ist, um somit GA1 wirksam in vitro zu
sensibilisieren.
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Die Zellkonzentration der Lymphozyten variiert je nach
Vorrichtung, die bei der Inkubation verwendet wird. Im
allgemeinen ist es wünschenswert, dieselbe innerhalb eines
Bereiches von 10&sup6; bis 10&sup7;/ml einzustellen.
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Es ist wünschenswert, gereinigtes GA1, GA1-enthaltende Zellen
und deren Membranbestandteile, die als Immunogene dienen, in
Konzentrationen von 1 bis 20 ug/ml, 1 bis 100 mg/ml bzw. 0,1
bis 10 mg/ml zu verwenden.
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Die Antikörper-produzierenden Zellen, die durch Immunisierung
entweder in vivo oder in vitro, wie oben beschrieben,
erhalten worden sind, werden dann mit den Myelom-Zellen
verschmolzen.
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Was die Myelom-Zellen betrifft, so können verschiedene
bekannte, wie NS-1, P3, P3-U1, X45, X63.6.5.3 und SP2 aus der
Maus und Ys.AGl.2.3 aus der Ratte, eingesetzt werden. Die
Zellverschmelzung kann nach einem bekannten Verfahren
durchgeführt werden, beispielsweise durch Inkubation in einem
Medium, das Fusogene enthält.
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Beispiele für Fusogene sind Polyethylenglycol, das im
folgenden als PEG abgekürzt wird, und das Sendai-Virus. Des
weiteren können Hilfsmittel wie Dimethylsulfoxid verwendet
werden, um so die Fusionseffektivität zu vergrößern.
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Die Immunozyten und Myelom-Zellen können in denselben
Anteilen, wie sie bei herkömmlichen Verfahren eingesetzt
werden, verwendet werden. Beispielsweise können jene in einer
Menge von etwa ein- bis zehnmal so viel wie die letzteren
verwendet werden.
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Irgendein bei der Zellinkubation verwendetes herkömmliches
Medium kann bei der Verschmelzung verwendet werden. Es ist im
allgemeinen zweckmäßig, Seren wie FCS daraus zu entfernen.
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Die Verschmelzung kann durchgeführt werden, indem die obigen
Immunozyten sorgfältig mit den Myelom-Zellen in dem oben
definierten Medium vermischt werden, dieselben zentrifugiert
werden, der Überstand abgetrennt und eine Lösung aus PEG
eines durchschnittlichen Molekulargewichtes von 1000 bis
6000, die zuvor auf etwa 37ºC erwärmt worden ist, zu einem
herkömmlichen Medium in einer Konzentration von etwa 30 bis
60 Gew.-%/Vol.-% zugegeben wird, worauf sich das Vermischen
damit anschließt. Im Anschluß daran kann das Verfahren, bei
dem ein geeignetes Medium hinzugegeben wird, das Gemisch
zentrifugiert und der Überstand abgetrennt wird, nacheinander
wiederholt werden, um somit die Hybrid-Zellen zu bilden.
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Die erhaltenen Hybrid-Zellen können nach der
Zellverschmelzung durch Inkubation der Zellen in einem bei der Auswahl von
Hybrid-Zellen herkömmlicherweise verwendeten Medium isoliert
werden. Der oben genannte Myelom-Zellstamm ist Hypoxanthin-
Guanin-Phosphoribosyltransferase-deficient. Somit kann er
nicht in einem HAT-Medium wachsen, das Hypoxanthin,
Aminopterin und Thymidin enthält. Darum können die Zellen,
die in HAT-Medium wachsen, selektiert werden. Die
Zellinkubation in dem genannten HAT-Medium kann ausreichend
lange durchgeführt werden, bis alle Zellen außer den
gewünschten Hybrid-Zellen absterben, im allgemeinen mehrere
Tage bis mehrere Wochen lang.
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Die so erhaltenen Hybrid-Zellen können einem herkömmlichen
Grenzverdünnungsverfahren unterzogen werden, um somit die
gewünschten Antikörper-produzierenden Zellen und die
Monoklonalisierung derselben zu detektieren.
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Die genannten Antikörper-produzierenden Zellen können durch
verschiedene Verfahren, die im allgemeinen zur Detektion von
Antikörpern verwendet werden, detektiert werden, wie das
enzymverknüpfte Immunosorptionstestverfahren (ELISA) (cf.
Jpn. J. Expt. Med., 51, 309 (1981)), das Plattenverfahren,
das Tüpfelverfahren, das Agglutinationsverfahren, das
Ouchterlonyverfahren und der Radioimmuntest (RIA).
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Insbesondere wird eine mit gereinigtem GA1 beschichtete
Kunststoffplatte mit dem Überstand, der aus der Inkubation
der Probe-Hybrid-Zellen erhalten worden ist, umgesetzt. Das
Vorliegen des an das entsprechende gereinigte Glycolipid
gebundenen Antikörpers wird auf herkömmliche Weise bestätigt,
beispielsweise durch eine Peroxidase-Reaktion unter
Verwendung eines Peroxidase-konjugierten Antikörpers gegen
Maus-Immunglobuline, wenn es sich bei den Immunozyten um die
handelt, die sich von der Maus ableiten, um die gewünschten
Antikörper-produzierenden Zellen zu selektieren.
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Die so erhaltenen Hybrid-Zellen, die den erfindungsgemäßen
monoklonalen Antikörper produzieren, können in einem
herkömmlichen Medium subkultiviert und sofort in flüssigem
Stickstoff für längere Zeit aufbewahrt werden.
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Das Hybrid MW-1, das wie unten beschrieben in Beispiel 1
hergestellt wird, wurde bei IFO (Institute for Fermentation,
Osaka) unter der Nr. IFO 50091 hinterlegt.
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Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann aus
bestimmten, oben erhaltenen Hybrid-Zellen erhalten werden,
indem die genannten Hybrid-Zellen auf herkömmliche Weise
inkubiert werden und der gewünschte Antikörper aus dem
Überstand isoliert wird, oder indem die genannten Hybrid-
Zellen an einen dafür geeigneten Säuger verabreicht werden,
und der gewünschte Antikörper aus seinem Serum oder seiner
Ascites-Flüssigkeit isoliert werden.
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Wie unten beschrieben, erkennt der so erhaltene
erfindungsgemäße monoklonale Antikörper spezifisch GA1, das im Serum
eines menschlichen Patienten auftritt, der an Krebs leidet.
Darum ist er bei der Diagnose, Behandlung und bei Studien des
menschlichen Krebs extrem nützlich.
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Um die vorliegende Erfindung weiter zu erläutern, werden die
folgenden Beispiele angeführt.
Beispiel 1
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100 ug gereinigtes GA1 und 400 ug eines mit
Formaldehydversetzten Salmonella minnesota-Stammes (ATCC Nr. 9700)
wurden zu 4 ml einer phyiologischen Salzlösung, die bei 40ºC
gehalten wurde, gegeben und sorgfältig verrührt, um eine
homogene Suspension zu ergeben. Die erhaltene Suspension
wurde einer Maus 4 Tage lang, jeweils einmal in einer
Einzeldosis von 10 ug GA1 insgesamt viermal intravenös
verabreicht. 4 Tage nach der letzten Verabreichung wurde die
Milz herausgenommen und 3 · 10&sup8; Milzzellen mit 3 · 10&sup7; NS-1
Myelom-Zellen (ATCC Nr. TIB18) in Gegenwart von 50% PEG
verschmolzen. Die so erhaltenen Hybrid-Zellen wurden auf
flachbödige Kunststoffplatten mit 96 Vertiefungen pipettiert
und in einem Dulbecco-MEM-Medium, das ein HAT-Medium
enthielt, zu welchem 10% FCS unter einer Atmosphäre aus 5%
Kohlendioxidgas bei 37ºC gegeben wurde, inkubiert. Das
Vorliegen des Anti-GA1-Antikörpers wurde in den Überständen
der Vertiefungen bestimmt, in denen das Wachstum der Hybrid-
Zellen beobachtet wurde, indem das ELISA-Verfahren befolgt
wurde. 0,05 ml Portionen einer GA1-Lösung in Ethylalkohol (10
ug/ml) wurden in die Vertiefungen jeder Kunststoffplatte mit
96 Vertiefungen pipettiert. Das Lösungsmittel wurde
eingedampft. Somit war GA1 an der Platte adsorbiert. Der
Testinkubationsüberstand, der als primärer Antikörper
eingesetzt wurde, wurde in jeder Vertiefung umgesetzt. Nach
sorgfältigem Waschen wurde der Peroxidase-konjugierte
Antikörper gegen Maus-Immunglobuline, der als Sekundär-Antikörper
eingesetzt wurde, darin umgesetzt.
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Anschließend wurde eine Peroxidase-Reaktion unter Verwendung
von o-Phenylendiamin als Substrat durchgeführt. Dann wurde
das Ausmaß der Farbentwicklung in jeder Vertiefung mit dem
bloßen Auge oder mit einem ELISA-Selbstlesegerät für 96
Vertiefungen bei 490 nm beobachtet.
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Die Hybrid-Zellen in den Vertiefungen, in denen Anti-GA1-
Antikörpertiter im Überstand beobachtet wurde, wurden durch
das Grenzverdünnungsverfahren weiter der Klonierung
unterzogen,
um Monoklone zu ergeben.
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Die so erhaltenen monoklonalen Hybrid-Zellen wurden in einem
Inkubationskolben aus Kunststoff gezüchtet und
intraperitoneal in eine nackte BALB/c-Maus transplantiert, die
zuvor mit einem immunsuppressiven Mittel, Pristan (2,6,10,14-
Tetramethylpentadecan, hergestellt von Aldrich Chemical Co.,
Inc.) behandelt worden war.
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Dann wurden die monoklonalen Antikörper aus der erhaltenen
Ascites-Flüssigkeit durch das Ammon-Sulfat-Fällungsverfahren
bei 50%iger Sättigung aufgereinigt.
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Somit konnten die monoklonalen Anti-GA1-Antikörper von dem
getesteten Tier erhalten werden. In den Testbeispielen, die
unten beschrieben werden, wurden 4 Klone, die hier erhalten
worden waren, das heißt Nr. MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4,
eingesetzt.
Beispiel 2
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2 mg gereinigtes GA1 und 1 mg BSA wurden suspendiert oder in
1 ml einer physiologischen Salzlösung aufgelöst. Dann wurde
eine Wasser-in-Öl-Emulsion unter Verwendung desselben
Volumens eines Freund's Komplett-Hilfsstoffes gebildet. 0,2
ml-Portionen der erhaltenen Emulsion wurden in die 4-
gliedrigen Fußkissen eines weißen Neuseeland-Kaninchens
injiziert. 4 Wochen danach wurde eine Emulsion, die GA1
enthielt, auf dieselbe Weise wie die, die bei der ersten
Immunisierung verwendet worden war, hergestellt. 1 ml dieser
Emulsion wurde in das Dorsum des Tiers als Booster injiziert.
4 Tage danach wurde die Milz des Tieres herausgenommen und
mit Ns-1-Myeloma-Zellen verschmolzen, worauf sich eine
Klonierung auf dieselbe Weise wie die, die in Beispiel 1
beschrieben worden war, anschloß, um monoklonale Antikörper
zu ergeben. Nach der Zellverschmelzung wurden die Hybrid-
Zellen in einem HAT-Medium unter Verwendung einer
Kunststoffplatte mit 24 Vertiefungen gezüchtet. Der
Peroxidase-konjugierte Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobuline
wurde als Sekundär-Antikörper bei dem ELISA-Verfahren
eingesetzt.
Beispiel 3
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Es wurden einkernige Lymphozyten aus menschlichem peripherem
Blut auf herkömmliche Weise unter Verwendung von Ficoll-Paque
(hergestellt von Pharmacia AB) hergestellt, und in einer
Konzentration von 1 · 10&sup7;/ml suspendiert.
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Zu einem RPM1 1640-Medium, das 10% FCS enthielt, wurden
weiterhin 2-Mercaptoethanol und PWM hinzugegeben, um
Konzentrationen von 5 · 10&supmin;&sup5; beziehungsweise 30 ug/ml bei der
Verwendung zu ergeben.
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Anschließend wurden 1 ml der Lymphozyt-Suspension (1 ·
10&sup7;/ml) beziehungsweise 10 ml eines Mediums ohne PWM in das
innere und äußere Gefäß eines Anzuchtkolbens vom Typ Marbrook
eingefüllt. Eine Dialysemembran war an der Grenzfläche der
inneren und äußeren Flüssigkeit vorgesehen.
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GA1 wurde in Liposomen bestehend aus Eigelblecithin und
Cholesterin eingebracht, die nach dem Verfahren von Uchida et
al. (cf. J. Biochem 87 1829 (1980)) hergestellt worden
waren, und in einer GA1-Konzentration von 5 ug/ml in das
innere Gefäß des Anzuchtkolbens gegeben.
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Somit wurden die Lymphozyten zusammen mit GA1 in einer
Atmosphäre aus 5% Kohlendioxidgas bei 37ºC 6 Tage lang
inkubiert. Anschließend wurden die Zellverschmelzung mit NS-1
und die Klonierung auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1
beschrieben durchgeführt, um so monoklonale Antikörper zu
ergeben.
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In diesem Beispiel wurde ein Peroxidase-konjugierter
Antikörper gegen menschliche Immunglobuline als
Sekundär-Antikörper beim ELISA-Verfahren verwendet.
Testbeispiel 1: Immunglobulinklasse
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Die Immunglobulinklassen der monoklonalen Anti-GA1-Antikörper
MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4, wie in Beispiel 1 erhalten, wurden
mit dem ELISA-Verfahren bestimmt. Es wurde jeder monoklonale
Anti-GA1-Antikörper, der als Antigen diente, mit einem
Antikörper gegen jede Klasse Peroxidase-konjugierter Maus-
Immunglobuline umgesetzt. Dann wurde die Farbentwicklung
durch eine enzymatische Reaktion der Peroxidase unter
Verwendung von o-Phenylendiamin als Substrat durchgeführt.
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Folglich wurde gefunden, daß alle von MW-1, MW-2, MW-3 und
MW-4 zu IgM gehörten.
Testbeispiel 2
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Die Antikörpertiter von MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4, wie in
Beispiel 1 auf GlcCer, LacCer, Gb3, Gb4, GA2, GM3, GM2, GM1,
GD1a und GD1b, wie in Beispiel 1 erhalten, wobei jedes eine
dem GA1 ähnliche Struktur aufwies, wurden gemäß dem ELISA-
Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Der
Antikörpertiter eines jeden Anti-GA1-Antikörpers auf jedem
Glycolipid wurde durch das maximale Verdünnungsverhältnis,
ausgedrückt als Potenz von 2, dargestellt, bei dem die
Farbbildung mit dem bloßen Auge beobachtet werden konnte.
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Als Ergebnis zeigten MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4 jeweils einen
hohen Antikörpertiter auf GA1 (2¹&sup6; bis 2¹&sup8;). Jedoch reagierte
keiner dieser Antikörper mit den anderen Glycolipiden, das
heißt jeder Antikörpertiter darauf betrug 2&sup4; oder weniger.
Testbeispiel 3
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Es ist bekannt, daß polyklonale Anti-GA1-Antikörper, die
durch Immunisierung eines Kaninchens erhalten worden sind,
natürliche Maus-Killerzellen, die im folgenden als NK-Zellen
abgekürzt werden, in Gegenwart eines Zusatzstoffes schädigen
können (cf. Eur. J. Immun., 10, 175 (1980)).
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Somit wurde geprüft, ob die erfindungsgemäßen monoklonalen
Anti-GA1-Antikörper eine ähnliche Wirkung zeigen konnten oder
nicht.
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Milzzellen einer C57BL/6-Maus wurden in einer zehnfachen
Verdünnung von MW-1, MW-2, MW-3 oder MW-4 suspendiert. Die
erhaltene Suspension wurde 30 Minuten lang bei 4ºC
stehengelassen. Dann wurden die Milzzellen sorgfältig gewaschen, in
Meerschweinchenserum, das als Zusatzstoff eingesetzt wurde,
suspendiert und 40 Minuten lang bei 37ºC gehalten. 5 · 10&sup5; so
erhaltene vermehrungsfähige Milzzellen und 1 · 10&sup4; YAC-1
Lymphomzellen, die mit &sup5;¹Cr markiert worden waren, wurden zu
0,2 ml eines RPM1 1640-Mediums gegeben, das 10% FCS
enthielt, und bei 37ºC in einer Atmosphäre aus 5%
Kohlendioxidgas gehalten. 4 Stunden danach wurde 0,1 ml des
Überstands gesammelt und die darin enthaltene Radioaktivität
von &sup5;¹Cr mit einem Gamma-Zählrohr bestimmt.
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Die NK-Aktivität wurde auf herkömmliche Weise nach der
folgenden Gleichung berechnet, worin die spontane
Auslösezählrate,
beziehungsweise die maximale Auslösezählrate die
Zählrate darstellen, die unter Verwendung der YAC-1-Zellen
erhalten worden war und die, die in Gegenwart von 0,5 N
Chlorwasserstoffsäure erhalten worden war.
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NK-Aktivität (%) = (Zählrate der Testgruppe) - (spontane Auslösezählrate)/(maximale Auslösezählrate) - (spontane Auslösezählrate) · 100
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Wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt, schädigte jeder
monoklonale Antikörper Maus-NK-Zellen ähnlich, wie die
polyklonalen Kaninchen-Antikörper. Dieses Ergebnis legt weiterhin
nahe, daß MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4 Antikörper sind, die auf
GA1 spezifisch sind.
Tabelle 1
Behandlung auf Milzzellen NK-Aktivität relativer Wert* Unbehandelt Zusatzstoff allein Zusatzstoff Serum einer normalen Maus + Zusatzstoff Anti-GA1 Kaninchen-Antikörper + Zusatzstoff *: Der Wert der mit Zusatzstoff allein behandelten Gruppe wird auf 100 festgesetzt.
Testbeispiel 4
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Die epitope Spezifität von MW-1, MW-2, MW-3 oder MW-4, die
jeweils in Beispiel 1 erhalten worden waren, wurde durch
Enzym-Immunanfärbung der durch Dünnschichtchromatographie
fraktionierten Glycolipide getestet.
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Verschiedene gereinigte Glycolipide, einschließlich GA1,
wurden auf Dünnschichtplatten aus Silicagel (Polygram Sil G;
hergestellt von Macherei-Nagel) nach dem Verfahren von
Matsumoto et al. (cf. J. Biochem., 95, 1517 (1984))
aufgetüpfelt. Dann wurde jede Platte unter Verwendung von
Chloroform/Methanol/0,25% Kaliumchlorid (50 : 40 : 10, bezogen auf
das Volumen) als Lösungsmittel etwa 25 Minuten lang
entwickelt. Nach der Entwicklung wurde die Lage des Flecks eines
jeden Glycolipids durch die Orcinol-Reaktion bestimmt.
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Die Dünnschichtchromatographie für die Enzym-Immunanfärbung
wurde auf folgende Weise gleichzeitig mit der Orcinol-
Reaktion durchgeführt. Und zwar wurden MW-1, MW-2, MW-3 oder
MW-4, die jeweils als primärer Antikörper eingesetzt worden
waren, mit jeder entwickelten Dünnschichtplatte umgesetzt,
und dann wurde ein peroxidase-konjugierter Antikörper gegen
Maus-Immunglobuline, das heißt der sekundäre Antikörper,
damit weiter umgesetzt. 4-chlor-1-naphthol wurde als Substrat
für die Peroxidase verwendet. Jeder Fleck wurde durch die
enzymatische Reaktion einer Farbentwicklung unterzogen.
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Zusätzlich wurde Erdnußagglutin, das bekanntlich Gal 1-
3GalNAc spezifisch erkennt und im folgenden als PNA abgekürzt
wird, als Referenz eingesetzt (cf. Carbonhydrate Research,
51, 107 (1976)). In diesem Fall wurde ein
Peroxidasekonjugierter Antikörper gegen PNA als sekundärer Antikörper
verwendet.
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Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigte jedes Glycolipid, das bei
diesem Test eingesetzt worden war, einen charakteristischen
Rf-Wert. Das Ergebnis der Enzym-Immunanfärbung legt nahe, daß
alle von MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4 mit dem Fleck, der GA1
allein entsprach, reagierten. Andererseits reagierte PNA mit
den Flecken, die GA1 und GM1 entsprachen.
Tabelle 2
Glycolipid Rf-Wert enzymatische Anfärbung* rohes * - bedeutet eine negative Farbentwicklung, während + eine positive Farbentwicklung anzeigt.
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Diese Ergebnisse legen nahe, daß jeder der monoklonalen Anti-
GA1-Antikörper der vier in Beispiel 1 hergestellten Klone,
das heißt MW-1, MW-2, MW-3 und MW-4 die Struktur von Galβ1 →
3GalNacβl → 4Galβl → 4Glc oder Galβ1 → 3GalNAcβl → 4Gal
erkennen könnte.
Testbeispiel 5: Test auf GA1 im Blut von Krebspatienten
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Die Konzentrationen von GA1 in Blutproben, die von Patienten
erhalten worden waren, die an Krebs litten, wurden mit dem
ELISA-Verfahren unter Verwendung von MW-1, der im Beispiel 1
erhalten worden war, getestet.
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MW-1 wurde in geeigneter Weise verdünnt und mit jedem
Testserum vermischt. Das erhaltene Gemisch wurde dann 2 Stunden
lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurden
Polystyrolkugeln, an die GA1 adsorbiert war, zu dem Gemisch
gegeben und 4 Stunden lang bei 37ºC gehalten. Dann wurden die
Kugeln sorgfältig gewaschen. Eine passend verdünnte Lösung
eines Peroxidase-konjugierten polyklonalen
Kaninchen-Antikörpers gegen Maus-Immunglobulin wurde dazu gegeben. Das
erhaltene Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC umgesetzt.
Anschließend wurde eine enzymatische Reaktion unter Verwendung
von o-Phenylendiamin als Substrat durchgeführt. Die so
erzeugte Farbentwicklung wurde bei 490 nm bestimmt.
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Eine Standardkurve wurde unter Verwendung der Seren aus
gesunden Testpersonen aufgezeichnet, die GA1 unter Verwendung
eines Anti-GA1 Kaninchen-Antikörpers sorgfältig absorbierten
und die die erforderliche Konzentration an GA1 enthielten.
Die GA1-Konzentrationen eines jeden Testserums wurden
bestimmt.
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Fig. 1 zeigt das Ergebnis. Die Patienten, die an Krebs
litten, zeigten, ohne Rücksicht auf den Krebstyp, im Blut höhere
GA1-Konzentrationen als die gesunden Testpersonen (ca. 10
ng/ml).
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Demgemäß sind die erfindungsgemäßen monoklonalen Anti-GA1-
Antikörper bei der Diagnose von Krebs sehr nützlich.
Tabelle 3
Glycolipid Struktur * In der obigen Tabelle bedeutet Glc, Gal, GalNAC, SA und Cer Glucose, Galactose, N-Acetylgalactosamin, Sialinsäure beziehungsweise Ceramid.