JPS6229599A - 単クロ−ン性抗アシアロｇｍ↓１抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＧ　Ａ　１と特異的に反応する新規な単クロー
ン性抗体に関するものである。

本明細書において糖質、脂質の名称及び結合様式等は、
この分野の研究における通称名あるいは慣用名に従う。

糖脂質は細胞の今化、蚤化の研究に於て特に注目をあび
ている。糖脂質の研究には、その同定、定量及び精製の
ための手段として、旧来使用されてきた生化学的方法に
加えて、それらの糖脂質に対する特異的な抗体を用いる
免疫化学的手法が繁用されている。特にケーラー（Ｋ″
６ｈｌｅｒ　）とミルスタイン（Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ　
）によって開発された単クローン性抗体作製の技術が普
及した現在では、糖脂質の研究には単クローン性抗体の
使用が不可欠なものとなってきた。しかしながら、糖脂
質は通常使用される各種実験動物に共通に存在するもの
が多く、そのような場合にはそれらの動物間で免疫を行
なっても血中に抗体を出現させることはできないから、
従って単クローン性抗体の作製も不可能である。

また、例え、ある実験動物におい免疫が成立しても、そ
の動物の抗体産生細胞（以下免疫細胞とも呼ぶ）が、通
常ハイプリドーマ作製用に繁用されるミエローマ細胞と
の良好なパートナ−となり得ない場合には、単クローン
性抗体の作製も困難なものである。糖脂質ＧＡ、はその
例の１つである。

即ち、ＧＡ、はマウス、ラット及びヒト等では正常の組
織及び細胞表面に存在するが、ウサギには存在しないた
め、ＧＡ、に対する抗体はそれを通常ウサギに免疫する
ことによって得られる。しかしながら、ウサギの抗体産
生細胞はマウスあるいはラットのミエローマ細胞の良好
なパートナ−とならないことが多いため、これ迄にＧＡ
、に対する単クローン性抗体作製の成功例は全く無い。

本発明者らは、マウス、ラット及びヒトにおいて正常状
態で存在する物質、即ち、それらの動物あるいはヒトの
自己の成分に対する抗体作製を目標として鋭意研究を重
ねてきた。その過程で、ヒトの自己免疫疾患患者あるい
は自己免疫疾患モデル動物を用いることにより、自己の
成分あるいは、低免疫原性物質に対する抗血清及びクロ
ーン性抗体作製の技術を確立し、その技術も特許出願し
た。

本発明者はその技術の上に立って更にマウス、ラット及
びヒトでは自己の成分であるＧＡ、に対する単クローン
性抗体を作製することに成功し、本発明を完成させるに
至った。

また、そのＧＡ、に対する単クローン性抗体を用い、ヒ
ト癌患者血清中のＧＡ、の濃度を定量したところ、癌患
者にｉいては癌の種類に関係な（健常人あるいは非悪性
疾患患者に比較して、より高い濃度ＯＣＡ、が血中に存
在′することを知るに至った。

因みに抗ＧＡ、抗体を用いた血中ＧＡ、濃度の定量によ
る癌の診断に関しては滝ら（第４３回日本省学会総会記
事、４１８頁、昭和５９年）によってその報告がなされ
ているが、それはＧＡ、をウサギに免疫して得られた抗
血清から精製した多クローン性抗ＧＡ、抗体を用いて行
なわれた結果の報告である。

特に糖脂質等の多クローン性抗体による検出法は、単ク
ローン性抗体を用いた検出法と比較して、抗原の特異的
認識の精度の点で、今１つその信頼性に問題があると考
えられているので、本発明の単りローン性抗ＧＡ、抗体
を用いた癌の診断はより優れたものであると言える。

このように本発明の単りローン性抗ＧＡ、抗体は糖脂質
の基礎研究のみならず癌の診断という医療の面において
も高い有用性を有するものである。

本発明の単りローン性抗ＧＡ、抗体は糖脂質ＧＡ。

で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と
融合させてハイプリドーマを生成させ、これより上記特
性を有する単クローン性抗体を分離することにより製造
する。

本発明において、ハイブリドーマの作製は、公知の方法
、例えばＮａｔｕｒｅ、　２５６巻、４９５頁、１９７
５年に記載の方法及びその変法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｅｘｐｅ−ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１
５０巻、１００８頁１９７９年）等に準じて行なわれる
。

免疫原としては、ウシ脳から公知の方法で分離、精製し
たＧＡ汲び、それを表面に有する種々の哺乳動物類細胞
のいずれをも使用することができる。

ＧＡ、を免疫する哺乳動物の種類は特に限定されないが
、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮
して選択するのが好ましく、一般にはヒト、マウス、ラ
ットまた場合によってはウサギ等が使用される。

しかしながら、ＧＡ、はヒト、マウス及びラットにおい
ては自己の成分であるため、適当な免疫方法を用いて免
疫を行なっても充分な抗体価を生じせしめる事は困難で
ある事が多く、その場合には自己の特定成分に対して高
い自発性の抗体産生能を有する、自己免疫疾患の患者及
びそのモデル動物を用いることが望ましい。自己免疫疾
患はヒトの場合には例えば全身性エリテマトーデス（以
下ＳＬＥと略記する）あるいは慢性関節リウマチ（以下
ＲＡと略記する）等が、またモデル動物の場合には例え
ばＮＺＢ、ＮＺＷ、ＮＺＢ／ＷＦ、、ＭＲＬ−１ｐｒ／
ｌ！ｐｒの各系統のマウスあるいは本態性高血圧ラスト
（以下ＳＨＲと略記する）等が使用できる。

ＧＡ、の免疫にはｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ
　の免疫方法のいずれもが使用できる。ｉｎ　ｖｉｖｏ
の免疫の場合はＧＡ、を生理食塩液、リン酸緩衝食塩液
（ＰＢＳ　）等に適当濃度に希釈後、これを動物に静脈
内、皮下内、もしくは腹腔内注射等により投与すればよ
い。より具体的には、例えば精製したＧＡ、を用いる場
合には、これをＰＢＳ等で適当濃度に希釈し、サルモネ
ラ菌ミネソタ株、ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと略
記する）等の通常の担体と共に、これを動物に４〜１４
日毎に数回投与し、動物１個体当りの総投与量が１０〜
１００μｍ程度になるようにするのが好ましい。また１
ｎｖｉｖｏ　の免疫に膜成分もしくは細胞自体を用いる
場合も同様にして行なわれ、例えば膜成分を用いる場合
は総投与量が１〜１ｏｏ　ｑ／個体、細胞自体を用いる
場合は総投与量が１０’〜１０’個／個体となる様にす
るのが好ましい。生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ　）の免疫の
場合、抗体産生細胞は牌細胞、リンパ節細胞、腹腔内リ
ンパ球、あるいは末梢血リンパ球のいずれであっても構
わないが、最終免疫約４日後の肺臓細胞を用いるのが最
も好ましい。

また、　ｉｎ　ｖｔｔｒｏの系における免疫の場合には
、牌細胞、す７７節細胞、腹腔内リンパ球、及び末梢血
リンパ球のうちから適宜選ばれたリンパ球を抗原である
ＧＡ、と共に約１週間培養することによりＧＡ、に対す
る抗体産生細胞を出現させることを意図した、謂わゆる
ｉｎ　ｖｉｔｒｏの感作の方法が用いられる。この場合
、ＧＡ、が精製物であれば細胞培養用培地に溶解させる
か、あるいはヒツジ赤血球、リポソームあるいはサルモ
ネラ菌ミネソタ株などの適当な担体に吸着させて、リン
パ球と共に培養する。また、ＧＡ、を含有する細胞自体
あるいはその膜成分なＧＡ、の免疫原とする場合は培地
に溶解あるいは懸濁させ、リンパ球と共に培養する。

また、細胞自体を用いる時は、マイトマイシン処理ある
いは放射線照射などの処理を行なった後にリンパ球と培
養することが好ましい。

リンパ球の培養用培地はＲＰＭＩ　１６４０　、ダルベ
ツコ−のＭＥＮ等のリンパ球培養に通常使用されるもの
であれば、いずれを用いても構わないが、それらは使用
時にウシ胎児血清（以下ＦＣ８と略す）を５〜２０％の
濃度に添加することが望ましい。

また、培地には必要に応じて２−メルカプトエタノール
及びポークライードマイトジェン（以下ＰＷＭと略記す
る）をそれぞれ５　Ｘ　１０−’　Ｍ、及び５〜３０μ
Ｐ／Ｉｌｌの濃度に加えておくと、効率よくＧＡ、のｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ感作を成立させることができる。

リンパ球の培養時の細胞濃度は、培養に用いる器具によ
っても異なるが、一般には１０６〜１０７／ｍｌが望ま
し−・。

免疫原である精製ＧＡ、、ＧＡ、含有細胞、およびその
膜成分は、それぞれ１〜２０μｆ／ｌｎＩ！、　　１〜
１００１ｎ９　／　ｍｌ　、および０．１〜１０ｍ９／
ＷＬｌ！の濃度で使用することが望ましい。

次いで、上記の如きｉｎ　ｖｉｖｏあるいは１ｌｖｉ１
ｒ。

の系で免疫することにより得られた抗体産生細胞とミエ
ローマ細胞を融合する。

ミエローマ細胞としては、すでに公知の種々の細胞、例
えばマウスにおけるＭＳ−１、Ｐ３、Ｐ３−Ｕｌ、Ｘ４
５、Ｘ　６３．６．５．３、　ＳＦ３、ラットにおける
Ｙ３．Ａｇ１．２．３等が使用される。細胞融合は公知
の方法に準じて行なわれ、例えば融合促進剤含有培地中
でインキ−ベートすることによって行われる。

融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（
以下ＰＥＧと略記する）、センダイウィルス等が使用さ
れ、更に融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド
等の補助剤を添加することができる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用比は一般の方法と変
りがなく、例えばミエローマ細胞に対し、免疫細胞を約
１〜１０倍程度用いればよい。

上記融合時の培地としては、細胞培養に利用される通常
の各種培地が利用でき、通常はＦＣ８等の血清を抜いス
おくのがよい。

融合は、上記免疫細胞とミエローマ細胞の所定量を上記
培地内でよく混ぜ、遠心後上清を除去し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば平均分子量１，０００
〜６，０００程度のものを通常培地に約３０〜６０Ｗ／
Ｖ％の濃度で加えてまぜあわせることにより行なわれる
。以後、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去
する操作を繰り返すことによりハイブリドーマが形成さ
れる。

所望のハイプリドーマの分離は、上記細胞融合後の細胞
を、通常のノ・イブリドーマ選択用培地で培養すること
により行なわれる。前記したミエローマ細胞株はヒポキ
サ／テングアニンホスホリボジルトランスフェラーゼ（
ＨＧＰＲＴ　）欠損株であり、したがって、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む
培地）中では生育できない。それ故、ＨＡＴ培地中で増
殖してくる細胞を選択すればよい。該ＨＡＴ培地での細
胞の培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞が死
滅するのに充分な時間、通常数日〜数週間行なえばよい
。

かくして得られるハイプリドーマは通常の限界希釈法に
従い、目的とする抗体の産生株の検索及び単クローン化
が行なわれる。

該産生株の探索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｊａｐａｎ−
ｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎ
ｔａ／　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　５１巻、３０９頁、１９８
１年）及びプラーク法、スポット法、凝集反応法、オク
タ−ウニ−法、ＲＩＡ法等の一般に抗体の検出に用いら
れている種々の方法によって行なわれる。

より具体的には精製したＧＡ、をコーティングしたプラ
スチックプレートを用いこれを被験ハイブリドーマの培
養上清と反応させ、該精製糖脂質に結合する抗体の存在
を常法に従い、例えばパーオキシダーゼ標識抗マウス免
疫グロブリン（マウスの免疫細胞を用いた場合）による
パーオキシダーゼ反応を行なわせることにより確認し、
所望の抗体産生株を選択する。

かくして得られる本発明の単クローン性抗体を産生ずる
ハイプリドーマは、通常め培地で継代培養が可能であり
、また液体窒素中で容易に長期間保存が可能である。

本発明者は、このハイプリドーマの代表として、後記の
実施例によって得られたものを自ら分譲可能な状態に保
持している。

上記のようにして得た特定のハイプリドーマから本発明
の単クローン性抗体を得るには、ハイプリドーマを常法
に従って培養し、その培養上清から分離する方法、ある
いはハイプリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投
与し増殖させ、その血清ある〜・は腹水から分離する方
法が採用される。

か（して得られる本発明の単りロー／性抗体は、後述す
るようにヒト癌患者の血中に出現するＧＡ。

を特異的に認識するので、ヒト癌の診断、治療及び研究
に極めて有用なものである。

次に実施例及び試験例を挙げて説明する。

実施例１ 精製したＧＡ、　１００μｍとホルマリン処理サルモネ
ラ菌ミネソタ株（ＡＴＣＣ番号９７００　）　４００　
Ａｆを４０℃に保温した生理食塩液４ｍｌに加え、よく
攪拌し、均一な懸濁液とした。得られた懸濁液をＮＺ　
Ｂ％ＮＺＢ／ＷＦ、、　ＮＺＷ、　ＭＲＬ−１ｐｒ／ｌ
ｐｒの各系統のマウスあるし・はＳＨＲに４日毎に１回
当りＧＡ、　Ｉ　Ｏμ？含有分ずつ、合計４回静脈内投
与した。最終投与の４日後に肺臓を摘出し、牌細胞３Ｘ
１０’個とＭＳ−１ミエローマ細胞（ＡＴＣＣ番号Ｔｌ
Ｂ１８　）３Ｘ１０７個と５０％ポリエチレングリコー
ル存在下で細胞融合を行なわせた。このハイプリドーマ
を９６ウエル平底プラスチツクプレート（Ｃｏ５ｔａｒ
社製、カタログ番号３５９６　）に分注し、ＨＡＴ培地
を含む１０％ＦＣ８添加、ダルベンコーＭＥＭ培地中で
５％炭酸ガス、３７℃の条件下で培養した。ハイプリド
ーマの増殖が認められたウェルについて以下に記載する
ＥＬＩＳＡ法を用いて培養上清中の抗ＧＡ、抗体の存在
の有無を測定した。ＥＬＩＳＡ法は９６ウエルブラスチ
ノクブレー）　（ＦａｌｃｏｎＯ製、カタログ番号３９
１２　）を用い、まずエチルアルコールに１０μ’ｉ−
／　ｍｌの濃度に溶解したＧＡ、液０．０５１ｔｌずつ
を各ウェルに分注し、反応させ、よ（洗滌の後、２次抗
体としてパーオキシダーゼ標識抗マウス（ＳＨＲの場合
は抗ラット）免疫グロブリン抗体を反応させた。

引き続きオルトフェニレンジアミンを基質としたパーオ
キシダーゼ反応を行なわせ、各ウェルの発色度を肉眼で
、あるいは９６穴ＥＬＩＳＡ用自動光度計（波長４１４
　ｎｍ　）を用いて読みとった。

培養上清に抗ＧＡ、抗体価が認められたウェル内のハイ
プリドーマは、さらに限界希釈法でクローニングを行な
い単クローンとした。

このようにして得られた単クローンのハイプリドーマは
プラスチック培養フラスコで増殖させた後、免疫抑制剤
ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン、Ａ７ｄｒｉｃｈ社）で前処理したＢＡＬＢ　／
　Ｃ由来ヌードマウスの腹腔内に移植した。

得られた腹水から５０％飽和硫酸アンモニウム液沈殿法
により単クローン性抗体を精製した。

このようＫして、用いた動物のいずれからも単りローン
性抗ＧＡ、抗体を得ることができたが、後述の試験例で
はＮＺＷマウスから得られたクローン番号ＭＷ−１、Ｍ
Ｗ−２、ＭＷ−３及びＭＷ−４を例として用いた。

実施例２ 精製したＧＡ、２１ｎ９とＢ５Ａ１ｍ９を生理食塩液１
ｍｌに懸濁あるいは溶解させた後、等容量の７０インド
完全アジユバントを用いて油中水型エマルジョンを作製
し、その０．２　ｍｌずつをニー−シーラント白色ウサ
ギの四肢の足継部に注射した。その４週間後に、初回免
疫の場合と同様な方法でＧＡ、を含むエマルジョンを作
製し、背部皮下に計１　ｒｒｒｌを注射し追加免疫を行
なった。その４日後に肺臓を摘出し、実施例１で述べた
ものと同様な方法でＮ５−１との細胞融合及びクローニ
ング等を行ない、単クローン性抗体（ＲＡ−１、ＲＡ−
２）を得た。尚、細胞融合後ＨＡＴ培地中でのバイブリ
ドーマの増殖は２４穴プラスチツクプレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ■、カタログ番号３８４７　）を用いた。またＥＬ
ＩＳＡ法に用いる第２抗体はパーオキシダーゼ標識抗ウ
サギ免疫グロブリン抗体を用いた。

実施例３ ＳＬＥあるいはＲＡ恵者から得られた末梢血から、フィ
コールパック■（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて常法
通りリンパ球（単核球）を調製した後、ｌＸｌ０’／ゴ
の濃度に懸濁した。

培地は１０％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ　１６４０培地を用（
・、使用時に、さらに２＝メルカプトエタノール及びＰ
ＷＭをそれぞれ５Ｘ１０−’Ｍ、及び３０Ａｆ／ｍｌの
濃度に含有させて使用した。

続いてマールプルツク型培養瓶（Ｌａｎｃｅｔ、　２巻
、１２７９頁、１９６７年）の内筒にｌ　Ｘ　Ｉ　Ｑ’
　／ｍｌの濃度のリンパ球懸濁液をｌ　ｍｌ、外筒にＰ
ＷＭを含まない培地ＩＱｍｌをそれぞれ加え、内筒液と
外筒液の境界に透析チューブを張った。

ＧＡ、は内円らの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔ−ｒｙｓ８７巻、１８４３頁、１９８０
年）に準じて作製した卵黄レシチン及びコレステロール
から構成されるリポソームに取り込ませ５μｆ　／　ｍ
ｌのＧＡ、の濃度で培養瓶の内筒に加えた。

かくしてリンパ球をＧＡ、と共に５％炭酸ガス、３７℃
の条件下で６日間培養した。続いて実施例１に記載され
たものと同様な方法でＭＳ−１との細胞融合及びクロー
ニング等を行ない、単クローン性抗体（ＳＬＥ患者のリ
ンパ球からはＨＳＬＥ−１、ＨＳＬＥ−２、ＨＳＬＥ−
３、及びＲＡ患者のリンパ球からはＨＲＡ−１、ＨＲＡ
−２）を得た。

尚、本実施例の場合、ＥＬＩＳＡ法における２次抗体は
パーオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を用い
た。

試験例１　（免疫グロブリンのクラス）実施例１で得ら
れた単りローン性抗ＧＡ、抗体ＭＷ−１，ＭＷ−２、Ｍ
Ｗ−３及びＭＷ−４の免疫グロブリンのクラスをＥＬＩ
ＳＡ法により決定した。即ち抗原である該単りローン性
抗ＧＡ、抗体にパーオキシダーゼで標識されたマウス免
疫グロブリンの各クラスに対する抗体を反応させた。続
いてオルトフェニレンジアミンを基質としたパーオキシ
ダーゼの酵素反応による発色を行なわせた。

結果はＭＷ−１、ＭＷ−２、ＭＷ−３及びＭＷ−４のい
ずれもがＩｇＭに属するものと判明した。

試験例２ ＧＡ、に構造上類縁のＧｌｃＣｅｒ　、　ＬａｃＣｅｒ
　１Ｇｂ３、Ｇｂ、、ＧＡ、、ＧＭ、、０Ｍ２、ＧＭ、
ａ　　ＧＤ＋ａ、及びＧＤ＋ｂ　　（構造は末尾の第４
表に示す）の各糖脂質に対する実施例１で得られたＭＷ
−１、ＭＷ−２、ＭＷ−３及びＭＷ−４の抗体価を実施
例１に記載したＥＬＩＳＡ法に準じて検討した。各糖脂
質に対する該抗ＧＡ、抗体の抗体価は、発色が肉眼で認
められる最大の希釈倍数（以下２の累乗の形で表わす）
で示した。

その結果は下記の第１表に示されているようにＭＷ−１
、ＭＷ−２、ＭＷ−３及びＭＷ−４のいずれもがＧＡ、
とＧＡ２１Ｃ対して高い抗体価を示した。

しかしながらその他の糖脂質に対してはいずれの抗体も
反応しなかった（抗体価はすべて２４以下）。

また、第２表から明らかな通りＧＡ、とＧＡ２との比較
ではＧＡ、に対して、より高い抗体価を示した。

第１表 試験例３ ウサギに免疫して作製した多クローン性抗ＧＡ。

抗体は、マウスのナチュラルキラー（以下ＮＫと略記す
る）細胞を補体の存在下で傷害することが知られている
（　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｒｒ
ｍｕｎｏＪｏｇｙ　。

１０巻、１７５頁、１９８０年）。

そこで、本発明の単りローン性ＧＡ、抗体も同様な効果
をもたらすか否かについて検討した。

まず、Ｃ，７ＢＬ／６マウスの牌細胞をＭＷ−１、ＭＷ
−２、ＭＷ−３、あるいはＭＷ−４の１０倍希釈液に懸
濁し４°Ｃで３０分間放置した。牌細胞をよ（洗滌の後
、補体として用いたモルモット血清に懸濁し、３７℃で
４０分間保温した。かくして得られた肺虫細胞５　Ｘ　
１０’個と５１　Ｃｒで標識したＹＡＣ−１リンパ腫細
胞ｌＸｌ０’個を１０％ＦＣ８添加ＲＰＭＩ　１６４０
培地０．２　ｒｕｌ中に混合し、３７℃、５％炭酸ガス
の条件下で保温した。４時間後に上清Ｑ、　ｌ　ｍｌを
採取し、その中に含まれる５１　Ｃｒの放射能をガンマ
−カウンターで測定した。

ＮＫ活性は常法通り下式を用いて算出した。尚、式中、
自然遊離のカウント及び最大遊離のカウントは、それぞ
れＹＡＣ−１細胞のみの場合のカウント、及び０．５Ｎ
塩酸存在下でのカウントを示す。

ＮＫ活性（％） （最大遊離のカウント）−（自然遊離のカウント）下記
第２表に示すようにいずれの単クローン性抗体も、ウサ
ギの多クローン性抗体と同様マウスＮＫ細胞を傷害した
。この結果もＭＷ−１、ＭＷ−２、ＭＷ−３、及びＭＷ
−４がＧＡ、に特異的な抗体であることを示すものであ
る。

１）補体単独処理群の値を１００とした。

試験例４ 薄層クロマトグラフィーで分画した糖脂質を酵素免疫染
色することにより、実施例１で得られたＭＷ−１、ＭＷ
−２、ＭＷ−３あるし・はＭＷ−４の認識抗原部位特異
性を検討した。

まず、松本らの方法（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔ−ｒｙｌ　９５巻、１５１７頁、１９８４年
）に準じてＧＡ。

を含む各精製糖脂質をシリカゲルの薄層プレート（マツ
ヘライ番ナーゲル社製、ポリグラム・シルＧ）にスポッ
トした。

クロロホルム−メタノール−０，２５％塩化カリウム（
体積比５０：４：１０）を溶媒として約２５分間の展開
を行なりた。展開後の各糖脂質のスポットの位置をオル
シノール反応により決定し、さらに各スポットのＲｆ値
を求めた。

またオルシノール反応用と平行して酵素免疫染色用の薄
層クロマトグラフィーを同時に行なわせ、以下の方法で
染色した。即ち展開後の薄層のプレートに１次抗体とし
て実施例１のＭＷ−１、ＭＷ−２、ＭＷ−３あるいはＭ
Ｗ−４を反応させ、さらに２次抗体としてパーオキシダ
ーゼ標識抗マウスグロブリン抗体を反応させた。パーオ
キシダーゼの基質として４−クロロ−１−ナフトールを
用いて各スポットで酵素反応による発色を行なわせた。

また、Ｇａｌβ１−３　Ｇａ１ＮＡｃを特異的に認識す
る（　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
、　　５１巻、１０７頁、１９７６年）ことが知られて
いるビーナツツ凝集素（以下ＰＮＡと略記する）も対照
に用いた。その場合、２次抗体としてはパーオキシダー
ゼ標識抗ＰＮＡ抗体を用いた。

第３表に示した如く、用いた糖脂質はそれぞれに特有の
Ｒｆ値を示した。また、酵素免疫染色で調べたところ、
ＭＷ−１、ＭＷ−２、ＭＷ−３、ＭＷ−４のいずれもが
ＧＡ、及びＧＡ、に相当するスポットにのみ反応した。

また、ＰＮＡはＧＡ、とＧＡ、に相当するスポットのみ
反応した。

第３表 以上の結果から実施例１で得られた４つのクローンの単
りローン性抗ＧＡ、抗体ＭＷ−１、ＭＷ−２、ＭＷ−３
及びＭＷ−４はいずれも、Ｇａ７β１→３ＧａＪＮＡｃ
β１−＋４０ａｌβ１−＋４Ｇｌｃ、もしくはＧａｌβ
１→３ＧａｌＮＡｃβ１→４　Ｇａｌ　　の糖構造を認
識するものと推定される。

試験例５　（癌患者血中ＧＡ、の定量）実施例１で得ら
れたＭＷ−１を使用したＥＬＩＳＡ法により癌患者の血
中ＧＡ、濃度を測定した。

まず、ＭＷ−１の適宜希釈液と被験血清を混ぜ合わせ２
時間室温に放置した。その混液にＧＡ、を吸着させたポ
リスチレンポールを加え３７℃で４時間保温した。スチ
レンポールをよく洗滌し、パーオキシダーゼ標識ウサギ
多クローン性゛抗ＧＡ、抗体の適宜希釈液を加え４℃で
１晩反応させた。続いてオルトフェニレンジアミンを基
質とした酵素反応を行なわせ４１４　ｎｍでの発色を読
みとった。

標準曲線はウサギ抗ＧＡ、抗体を用いてＧＡ、を充分吸
収した健常人の血清にＧＡ、を必要濃度に含有させたも
のを用いて作成し、それに基いて各被験血清のＧＡ、濃
度を求めた。

その結果は、図面に示す通り、癌患者においては癌の種
類に関係なく、健常人（はぼ１０ｎｇ／ｒｎｔ以下）と
比較して高い血中ＧＡ、値を示した。

即ち、本発明の単りローン性抗ＧＡ、抗体は、ヒトの癌
の診断に極めて有用なものである。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明抗体ＭＡ、を用いたＥＬＩＳＡ法により求
めた各種癌患者血中のＧＡ、濃度（ｎｇ／ｍｌ）の個々
の値を示すものである。 特許出願人　三井東圧化学株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和６０年特許願第１６６６９３号 ２、発明の名称 単りローン性抗アシアロＧＭ、抗体 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 〒　１００ 住　所　東京都千代田区霞が関３−２−５４、補正命令
の日付（発送日） 昭和６０年１０月２９日 ｊ〉 ５、補正の対象 明細書（１頁） ６、補正の内容 願書に最初に添付した明細書（第１頁）の浄書・別紙の
とおり（内容）に変更なし。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 糖脂質アシアロＧＭ＿１（以下ＧＡ＿１と略す）で免疫
   した哺乳動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合によ
   って得られるハイブリドーマより産生され（１）ＧＡ＿
   １及び糖脂質アシアロＧＭ＿２（以下ＧＡ＿２と略すに
   反応し、 （２）糖脂質ＧＭ＿１及びＧＭ＿２のいづれにも反応し
   ないことを特徴とする単クローン性抗体。