JPS6172800A - グラム陰性細菌エンドトキシンをブロツクするモノクローナル抗体 - Google Patents
グラム陰性細菌エンドトキシンをブロツクするモノクローナル抗体Info
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- JPS6172800A JPS6172800A JP60194981A JP19498185A JPS6172800A JP S6172800 A JPS6172800 A JP S6172800A JP 60194981 A JP60194981 A JP 60194981A JP 19498185 A JP19498185 A JP 19498185A JP S6172800 A JPS6172800 A JP S6172800A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は生物工学の分野に属し、そして体細胞ハイブ
リダイゼーション及び免疫学に関する。
リダイゼーション及び免疫学に関する。
さらに詳しくは、この発明は、グラム陰性細菌性工／ト
ドキシンに結合し、そしてその生物学的効果をブロック
するモノクローナル抗体、該抗体を生産するハイブリド
ーマセルライン、及び該抗体を用いるグラム陰性菌血症
及び敗血症の処置に関する。
ドキシンに結合し、そしてその生物学的効果をブロック
するモノクローナル抗体、該抗体を生産するハイブリド
ーマセルライン、及び該抗体を用いるグラム陰性菌血症
及び敗血症の処置に関する。
グラム陰性細菌による画面症は、実質的な数の年間死亡
をもたらす主要な公共的健康問題である。
をもたらす主要な公共的健康問題である。
画面症の症状には１発熱、白血球減少症及び低血糖症、
低血圧及びシｌツク、必須器官の環流減少、Ｃ３及び補
体カセットの活性化、血管的凝集、並びに死亡が含まれ
る。
低血圧及びシｌツク、必須器官の環流減少、Ｃ３及び補
体カセットの活性化、血管的凝集、並びに死亡が含まれ
る。
画面症のこれらの効果は感染生物のエンドトキシン〔細
胞壁リポポリサッカライド（ＬＰＳ ） ］に、１
基くものとされる。これらのＬＰＳは３つの領域
、すなわちセロタイプ特異的ポリサッカライド（〇−抗
ぶ）、；アポリサッカライド、及びリピドＡから構成さ
れる。〇−抗原領域はタイプ−特異的／Ｓ！テン決定基
を決定する反復するオリがサツカライドの組み合わせか
ら構成される。コアー領域は、ヘキソース（Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、グルコース、ガラクトース）の外側コ
ア、並びにヘゲドース、エタノールアミン及び２−ケト
−３−デオキシオクトネー） （ＫＤＯ）の内側コアか
ら構成されている。この領域は〇−抗原領域に比べて細
菌種間で不変的であるが、しかし限定された種内及び種
間差を示す。リピドＡはジグルコサミンー４−ホスフェ
ート、長鎖脂肪酸、及びエタノールアミンから構成され
ている。ＫＤＯはリピドＡとコア領域との間のリンクを
形成する。
胞壁リポポリサッカライド（ＬＰＳ ） ］に、１
基くものとされる。これらのＬＰＳは３つの領域
、すなわちセロタイプ特異的ポリサッカライド（〇−抗
ぶ）、；アポリサッカライド、及びリピドＡから構成さ
れる。〇−抗原領域はタイプ−特異的／Ｓ！テン決定基
を決定する反復するオリがサツカライドの組み合わせか
ら構成される。コアー領域は、ヘキソース（Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、グルコース、ガラクトース）の外側コ
ア、並びにヘゲドース、エタノールアミン及び２−ケト
−３−デオキシオクトネー） （ＫＤＯ）の内側コアか
ら構成されている。この領域は〇−抗原領域に比べて細
菌種間で不変的であるが、しかし限定された種内及び種
間差を示す。リピドＡはジグルコサミンー４−ホスフェ
ート、長鎖脂肪酸、及びエタノールアミンから構成され
ている。ＫＤＯはリピドＡとコア領域との間のリンクを
形成する。
Ｏ抗原を欠損したグラム陰性細菌の変異株は、固体培地
上でスムースなコロニーを形成しないため１う７”形、
又は＠Ｒ＃形と称される。変異体ＬＰ８の幾つかのケモ
タイグ（ａｈｅｍｏｔｙｐ＊）、例えばＲｅ ｒ Ｒｈ
＊ Ｒｅ ｔ Ｒｄ及びＲｅが知られている。ケモタ
イ７’Ｒｅにおいては、酵素ＵＤＰ −ｆｆラクトース
−４−エピメラーゼが欠損しておシ、その結果ガラクト
ースではなくグルコースが合成され、そしてコアー中に
導入される。Ｒｅケ七タイプはＯ領域及びコア領域から
ＫＤｏｔでを欠く。Ｚｌａｇｌ＠ｒ 。
上でスムースなコロニーを形成しないため１う７”形、
又は＠Ｒ＃形と称される。変異体ＬＰ８の幾つかのケモ
タイグ（ａｈｅｍｏｔｙｐ＊）、例えばＲｅ ｒ Ｒｈ
＊ Ｒｅ ｔ Ｒｄ及びＲｅが知られている。ケモタ
イ７’Ｒｅにおいては、酵素ＵＤＰ −ｆｆラクトース
−４−エピメラーゼが欠損しておシ、その結果ガラクト
ースではなくグルコースが合成され、そしてコアー中に
導入される。Ｒｅケ七タイプはＯ領域及びコア領域から
ＫＤｏｔでを欠く。Ｚｌａｇｌ＠ｒ 。
１、Ｊ、等、Ｅ、イング、Ｊ、メト（Ｎ、 ＥｎｘＬ
Ｊ、 Ｍａｄ、）（１９８２）３０７：１２２５−１２
３０は、健康な患者を熱殺菌したＪ５によりワクチン処
理することによる、Ｅ、コリＲ（ｌ変異株Ｊ５に対する
ヒト抗血清の調製を記載している。この抗血清は画面症
を処置するために使用され、そしてＬＰＳの生物学的活
性をブロックすることが知られている。
Ｊ、 Ｍａｄ、）（１９８２）３０７：１２２５−１２
３０は、健康な患者を熱殺菌したＪ５によりワクチン処
理することによる、Ｅ、コリＲ（ｌ変異株Ｊ５に対する
ヒト抗血清の調製を記載している。この抗血清は画面症
を処置するために使用され、そしてＬＰＳの生物学的活
性をブロックすることが知られている。
Ｋｏｈｌｅｒ ｅ Ｇ、及びＭｌｌｓｔｏｉｎ ａ Ｃ
−、ネイチェア−（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７５）２５６
．４９５−４９７は、モノクローナル抗体を生産する永
久的ハイツリドーマを作るための体細胞ハイツリダイゼ
ー７ｉＩンの使用に途を開いた。これらの研究はネズミ
由来の形質細胞腫及びリンパ球を使用した。Ｍａｔｈａ
ｒｉａ等、イン７エクシ曹ン・アンド・イムニティ−（
Ｉｎｆｓｃｔ、Ｉｍｍｕｕ、）（１９８４）４５ ：６
３１−６３６：及ヒＮ＠１ｌｅｓ 等、イン７エクシ璽
ン・アンド・イムニテ４ （Ｉｎｆｅａｔ、 Ｉｍｍ
ｕｎ、） （１９８４）４６：６７７−６８１は、ＬＰ
Ｓ交差反応性ネズミーモノクローナル抗体を記載してい
る。
−、ネイチェア−（Ｎａｔｕｒｅ）（１９７５）２５６
．４９５−４９７は、モノクローナル抗体を生産する永
久的ハイツリドーマを作るための体細胞ハイツリダイゼ
ー７ｉＩンの使用に途を開いた。これらの研究はネズミ
由来の形質細胞腫及びリンパ球を使用した。Ｍａｔｈａ
ｒｉａ等、イン７エクシ曹ン・アンド・イムニティ−（
Ｉｎｆｓｃｔ、Ｉｍｍｕｕ、）（１９８４）４５ ：６
３１−６３６：及ヒＮ＠１ｌｅｓ 等、イン７エクシ璽
ン・アンド・イムニテ４ （Ｉｎｆｅａｔ、 Ｉｍｍ
ｕｎ、） （１９８４）４６：６７７−６８１は、ＬＰ
Ｓ交差反応性ネズミーモノクローナル抗体を記載してい
る。
これに続く研究者は、Ｋｏｈｌ＠ｒ及びＭｌｌａｔ＠ｌ
ｎの技法をヒト細胞に適用することを報告している〔例
えば、Ｃｒｏｅｓ ＊ Ｃ，Ｍ、等、ネイチェアー（Ｎ
ａｔｕｒｅ ） （ロンドン）（１９８０）２８８：４
８８：及び０１ｓａｏｎ ｈ Ｌ、及びＫａｐｌａｎ、
Ｈ−Ｆ３０．グロシーデインダス・オプ・デ・ナシ曹ナ
ル・アカデミ−・オツ・サイエンシス・オツ・デ・エナ
イテッド・スティソ・オツ・アメリカ（ＰＮＡｓ（ｕｓ
Ａ） ：Ｉ（１９８０）７７ ： ５４２９）。文献は
種々の抗原に対して向けられたヒト−モノクローナル抗
原の調製を報告している。ＥＰ４４，７２２は、抗原で
感作されたヒト膵臓Ｂ−リンノ臂球との融合の後にモノ
クローナル抗体分泌性ヒト−ヒトモノクローナル抗体を
もたらす変異体骨髄腫セルラインを記載している。さら
に、これは１病原性表面抗原”及び“毒素”に対する抗
体を作ることを示唆している。さらＫ。
ｎの技法をヒト細胞に適用することを報告している〔例
えば、Ｃｒｏｅｓ ＊ Ｃ，Ｍ、等、ネイチェアー（Ｎ
ａｔｕｒｅ ） （ロンドン）（１９８０）２８８：４
８８：及び０１ｓａｏｎ ｈ Ｌ、及びＫａｐｌａｎ、
Ｈ−Ｆ３０．グロシーデインダス・オプ・デ・ナシ曹ナ
ル・アカデミ−・オツ・サイエンシス・オツ・デ・エナ
イテッド・スティソ・オツ・アメリカ（ＰＮＡｓ（ｕｓ
Ａ） ：Ｉ（１９８０）７７ ： ５４２９）。文献は
種々の抗原に対して向けられたヒト−モノクローナル抗
原の調製を報告している。ＥＰ４４，７２２は、抗原で
感作されたヒト膵臓Ｂ−リンノ臂球との融合の後にモノ
クローナル抗体分泌性ヒト−ヒトモノクローナル抗体を
もたらす変異体骨髄腫セルラインを記載している。さら
に、これは１病原性表面抗原”及び“毒素”に対する抗
体を作ることを示唆している。さらＫ。
Ｆｏｕｎｇ等、ジャーナル・オツ・イムノロジカル・エ
ンド（１，Ｉｍｍｕｎ、 Ｍｏｔｈ、 ） （１９８４
）７０ ：８３−９０ｔｉ、ｔ：）−マウスハイツリド
ーマへの融合による、 ＥＢＶ−形質転換Ｂセルライン
からのヒトモノクローナル抗体の生産を開示している。
ンド（１，Ｉｍｍｕｎ、 Ｍｏｔｈ、 ） （１９８４
）７０ ：８３−９０ｔｉ、ｔ：）−マウスハイツリド
ーマへの融合による、 ＥＢＶ−形質転換Ｂセルライン
からのヒトモノクローナル抗体の生産を開示している。
幾つかの融合の相手細胞が、Ｄ−Ｂｕｃｋ等、モノクロ
ーナル・アンチ〆ディーズ・アンド・７アンクシ賃ナル
・編、ブレナム・ノ臂ブリッジング社、１９８４；及び
Ｌａｒｒｉｃｋ及びＢｕａｋ、パイオテクニクスされて
いる。ヨーロッノク特許出願公開４１０７，５２８及び
ＡｌＯ３，８０４は、細菌毒素に対するヒトモノクロー
ナル抗体を生産することができるセルラインを記載して
いる。さらに、ＣＢ２，０８６，９３７；ＢＯ２，１１
３，７１５；ＥＰ５７，１０７：ＩＰ６２，４０９：Ｅ
Ｐ１１８，８９３：ＥＰ１２４．３０１ ；及びＥＰ
１３１，８７８はバイブリド細胞からのヒトモ、１
ツクローナル抗体の製造に関する。さらに、１
９８３年１月１３日出願に係る米国特許出願＆４５７，
７９．５は、ヒトモノクローナル抗体を生産するであろ
うセルラインを記載している。最後に、１９８３年１１
月８日に出願された米国特許出願４５５０．２６１は、
グラム陰性菌血症に対する受動免疫のために有用なグラ
ム陰性細菌のコアーリポポリサッカライドに対して向け
られたヒトモノクローナル抗体を記載している。
ーナル・アンチ〆ディーズ・アンド・７アンクシ賃ナル
・編、ブレナム・ノ臂ブリッジング社、１９８４；及び
Ｌａｒｒｉｃｋ及びＢｕａｋ、パイオテクニクスされて
いる。ヨーロッノク特許出願公開４１０７，５２８及び
ＡｌＯ３，８０４は、細菌毒素に対するヒトモノクロー
ナル抗体を生産することができるセルラインを記載して
いる。さらに、ＣＢ２，０８６，９３７；ＢＯ２，１１
３，７１５；ＥＰ５７，１０７：ＩＰ６２，４０９：Ｅ
Ｐ１１８，８９３：ＥＰ１２４．３０１ ；及びＥＰ
１３１，８７８はバイブリド細胞からのヒトモ、１
ツクローナル抗体の製造に関する。さらに、１
９８３年１月１３日出願に係る米国特許出願＆４５７，
７９．５は、ヒトモノクローナル抗体を生産するであろ
うセルラインを記載している。最後に、１９８３年１１
月８日に出願された米国特許出願４５５０．２６１は、
グラム陰性菌血症に対する受動免疫のために有用なグラ
ム陰性細菌のコアーリポポリサッカライドに対して向け
られたヒトモノクローナル抗体を記載している。
この発明の抗体は、Ｅ、コリ（Ｅ、ｅｏｌｌ ） Ｒｅ
変異株又はサルモネ−ｙ（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ ）Ｒ
ｅ変異株の細胞壁リポポリサッカライド（ＬＰＳ ）の
リピドＡにより規定される決定基に強く結合し；無傷の
ＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ、コＩｊ １６
変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異株リピド
人決定基に結合し、そして、グラム陰性細菌エンドトキ
シンの不都合な生物学的効果をブロックすることを特徴
とする。
変異株又はサルモネ−ｙ（Ｓａｌｍｏｎａｌｌａ ）Ｒ
ｅ変異株の細胞壁リポポリサッカライド（ＬＰＳ ）の
リピドＡにより規定される決定基に強く結合し；無傷の
ＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ、コＩｊ １６
変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異株リピド
人決定基に結合し、そして、グラム陰性細菌エンドトキ
シンの不都合な生物学的効果をブロックすることを特徴
とする。
上記の抗体を生産する安定な永久ノ・イブリドーマセル
フイン及びその子孫、並びにこのよったセルラインを形
成する、そして無血含培地に部分的に適合した特定のマ
ウス×ヒトＢ−！ｊンパ球融合パートナ−がこの発明の
他の観点である。
フイン及びその子孫、並びにこのよったセルラインを形
成する、そして無血含培地に部分的に適合した特定のマ
ウス×ヒトＢ−！ｊンパ球融合パートナ−がこの発明の
他の観点である。
この発明はさらに、上記の抗体の１又は複数の医療的有
効量を含んでなる、画面症又は敗血症を処置するための
組成物〈関する。好ましい組成物は２以上の抗体を含ん
で成シ、そのそれぞれが上記（ｂ）において特定された
ように位置する異る決定基に結合する。このような組成
物の有効量を患者に投与することによりヒト患者におけ
る画面症又は敗血症の処置方法もｔた、この発明の部分
である。
効量を含んでなる、画面症又は敗血症を処置するための
組成物〈関する。好ましい組成物は２以上の抗体を含ん
で成シ、そのそれぞれが上記（ｂ）において特定された
ように位置する異る決定基に結合する。このような組成
物の有効量を患者に投与することによりヒト患者におけ
る画面症又は敗血症の処置方法もｔた、この発明の部分
である。
この発明のこれらの観点及び他の観点を以下に詳細に記
載する。
載する。
この明細書において“セルライン”とは、言及されるセ
ルラインに由来する限りにおいて、個々の細胞、収得さ
れた細胞、及び細胞を含有する倍警物を意味する。
ルラインに由来する限りにおいて、個々の細胞、収得さ
れた細胞、及び細胞を含有する倍警物を意味する。
この明細書に２いてバイブリドセルラインに関して使用
する１子孫”なる語は世代又は核型の同一性に関係なく
、そのセルラインのすべての誘導体、子、及び結果物を
含むことが意図される。
する１子孫”なる語は世代又は核型の同一性に関係なく
、そのセルラインのすべての誘導体、子、及び結果物を
含むことが意図される。
この明細書において“モノクローナル抗体”なる語は、
その集団が実質上均一である、すなわち抗体集団の個々
の抗体が天然に生ずる変異を除き同一である複数の抗体
から選ばれる１つの抗体を言う。
その集団が実質上均一である、すなわち抗体集団の個々
の抗体が天然に生ずる変異を除き同一である複数の抗体
から選ばれる１つの抗体を言う。
所与のモノクローナル抗体に関して１機能的に同等”と
は、言及されているモノクローナル抗体と同一の決定基
を認識し、そして該抗体を交差ブロックするモノクロー
ナル抗体を意味する。同一の又は異なる免疫グロブリン
クラスの抗体、及びモノクローナル抗体の抗原結合断片
〔例えば、Ｆ ａ ｂ 、Ｆ （ａ ｂ’ ） ２、Ｆ
ｖ ）を含むことが意図される。
は、言及されているモノクローナル抗体と同一の決定基
を認識し、そして該抗体を交差ブロックするモノクロー
ナル抗体を意味する。同一の又は異なる免疫グロブリン
クラスの抗体、及びモノクローナル抗体の抗原結合断片
〔例えば、Ｆ ａ ｂ 、Ｆ （ａ ｂ’ ） ２、Ｆ
ｖ ）を含むことが意図される。
抗体を患者に投与することに間して”処置”なる語は“
治療”及び／又は１予防”を意味する。
治療”及び／又は１予防”を意味する。
バイブリドセルラインの特徴付けに関して、′永久”及
び１安定な”なる語は、そのセルラインが長期間、典型
的には６ケ月以上にわたって生存し続け、そして約２５
継代以上にわたって特定のモノクローナル抗体を生産す
る能力を維持することを意味する。
び１安定な”なる語は、そのセルラインが長期間、典型
的には６ケ月以上にわたって生存し続け、そして約２５
継代以上にわたって特定のモノクローナル抗体を生産す
る能力を維持することを意味する。
この明細書において、モノクローナル抗体の特徴付けに
関して“強く結合する”とは、細菌ＥＬＩＳＡにより測
定した場合、ｌｉ：、＝ｚｌＪｌｃ変異株ＬＰＳ又はサ
ルモネラＲｅ変異株ＬＰＳのリピドＡ決定基に対して、
これらの２つの決定基のいずれかに対する米国特許出願
墓５５０，２６１（１９８３年１１月８日出願）の抗体
の親和性よシ相対的に強い結合親和性をそのモノクロー
ナル抗体が示すことを意味する。
関して“強く結合する”とは、細菌ＥＬＩＳＡにより測
定した場合、ｌｉ：、＝ｚｌＪｌｃ変異株ＬＰＳ又はサ
ルモネラＲｅ変異株ＬＰＳのリピドＡ決定基に対して、
これらの２つの決定基のいずれかに対する米国特許出願
墓５５０，２６１（１９８３年１１月８日出願）の抗体
の親和性よシ相対的に強い結合親和性をそのモノクロー
ナル抗体が示すことを意味する。
ＬＰＳを記載することに関して、１無傷の１なる語は、
ＬＰＳが“０”抗原炭水化物を有することを意味する。
ＬＰＳが“０”抗原炭水化物を有することを意味する。
”全体（ｗｈｏｌｅ）グラム陰性細菌″とは、無傷のも
しくはコアＬＰＳ、リピドＡ又はそのラフ変異部分のみ
ではなく、その構成部分のすべてを有する任意のグラム
陰性細菌を意味する。
しくはコアＬＰＳ、リピドＡ又はそのラフ変異部分のみ
ではなく、その構成部分のすべてを有する任意のグラム
陰性細菌を意味する。
この発明の機能的基準Ｃ％異的細菌結合性、工、１
ンドトキシンブロック性）に合致するモノクロー
ナル抗体は、種々の哺乳動物由来の細胞を用いて製造す
ることができる。ラット及びヒトの具体例が行われた。
ンドトキシンブロック性）に合致するモノクロー
ナル抗体は、種々の哺乳動物由来の細胞を用いて製造す
ることができる。ラット及びヒトの具体例が行われた。
抗体は、ＩｇＧ及びＩｇＭを包含する任意のアイソタイ
プでよく、この明細書においてはＩｇＭタイプを特に例
示する。ヒトの具体例は、マウス×ヒト親バイブリドセ
ルライン及びニゲスタイン−パールウィルス（ＫＢＶ
）で形質転換されたヒ） ＰＢＬ又は非免疫化志願者も
しくは入手可能な細菌性ワクチンもしくは不活性化グラ
ム陰性細菌で免疫された志願者からの膵臓細胞を用いる
体細胞ハイツリダイゼー’／ ＊ ；／によって合成さ
れたトリオーマ（ｔｒｔｏｍａ ）の生産物である。所
望により、新鮮なＰＢＬ又は膵臓細胞（形質転換されて
いない）を使用することができる。ラットの具体例は、
ラット骨髄腫セルライン及びＥ、コ１ＪＲｃ変異株で免
疫されたラットからの膵臓細胞を用いる体細胞ノ・イブ
リダイゼー７ｗンによって合成された／Ｓイブリドーマ
の生産物である。
プでよく、この明細書においてはＩｇＭタイプを特に例
示する。ヒトの具体例は、マウス×ヒト親バイブリドセ
ルライン及びニゲスタイン−パールウィルス（ＫＢＶ
）で形質転換されたヒ） ＰＢＬ又は非免疫化志願者も
しくは入手可能な細菌性ワクチンもしくは不活性化グラ
ム陰性細菌で免疫された志願者からの膵臓細胞を用いる
体細胞ハイツリダイゼー’／ ＊ ；／によって合成さ
れたトリオーマ（ｔｒｔｏｍａ ）の生産物である。所
望により、新鮮なＰＢＬ又は膵臓細胞（形質転換されて
いない）を使用することができる。ラットの具体例は、
ラット骨髄腫セルライン及びＥ、コ１ＪＲｃ変異株で免
疫されたラットからの膵臓細胞を用いる体細胞ノ・イブ
リダイゼー７ｗンによって合成された／Ｓイブリドーマ
の生産物である。
この発明の抗体を産生ずるノ・イブリドーマを調製しそ
して同定するための好ましい方法は次の通シである。細
胞（ＰＢＬ 、肺細胞等）を、ＬＰＳをコートされた組
織培養グレート上で決選しく ｐａｎ ）次にＥＢＶ
ｔ−形質転換し、そして腫瘍融合ツク−トナー（マウス
骨髄腫ＸヒトＢ細胞又はラット骨髄腫）Ｋ融合せしめる
。プレート上での決選は、イムノコンピテント細胞の集
団を、対応する抗体でコートされたプラスチック表面上
でインー＃エペートすることを含む。抗原特異的細胞が
付着する。非付着細胞を除去した後、使用された抗原に
対して特異的に濃縮された細胞の集団を得る。これらの
細胞をＥＢＶによって形質転換し、そして照射されたリ
ンパ芽球フィーダー細胞層を用いてミクロタイターウェ
ル当シ１０細胞で培養する。得られたリンパ芽球細胞か
らの上澄液をＥ、コ＋Ｊ Ｒｅ ＬＰＳ及びサルそネラ
Ｒ＠ ＬＰＳに対してＥＩＪＳＡによ多スクリー二／グ
する。Ｒｅ又はＲｅリピドＡ ＬＰＳについて陽性の細
胞を拡げ、そして６−チオグアニン耐性マウス×ヒ）Ｂ
細胞融合パートナ−に融合せしめる。マウス×ヒトＢ細
胞パートナ−を使用する場合、バイブリドをウアバイン
及びアゾセリン中で選択する。Ｒｅ又はＲｅ陽性ノ・イ
ブリドからの上清を、グラム陰性細菌及び精製されたグ
ラム陰性細菌ＬＰＳのスペクトルに対してＥＬＩＳＡに
より測定する。広範囲の活性を示す培養物をインービボ
ＬＰＳ中和活性のために選択する。こうして調製された
すべてではないが多くの抗体がＩｇＭクラスであり、そ
してほとんどが広範囲の精製されたリピドＡ又はラフＬ
ＰＳへの結合を示す。これらの抗体はＥＬＩＳＡにより
種々のスムースＬＰＳ及び一定範凹の臨床分離細株への
結合を示す。
して同定するための好ましい方法は次の通シである。細
胞（ＰＢＬ 、肺細胞等）を、ＬＰＳをコートされた組
織培養グレート上で決選しく ｐａｎ ）次にＥＢＶ
ｔ−形質転換し、そして腫瘍融合ツク−トナー（マウス
骨髄腫ＸヒトＢ細胞又はラット骨髄腫）Ｋ融合せしめる
。プレート上での決選は、イムノコンピテント細胞の集
団を、対応する抗体でコートされたプラスチック表面上
でインー＃エペートすることを含む。抗原特異的細胞が
付着する。非付着細胞を除去した後、使用された抗原に
対して特異的に濃縮された細胞の集団を得る。これらの
細胞をＥＢＶによって形質転換し、そして照射されたリ
ンパ芽球フィーダー細胞層を用いてミクロタイターウェ
ル当シ１０細胞で培養する。得られたリンパ芽球細胞か
らの上澄液をＥ、コ＋Ｊ Ｒｅ ＬＰＳ及びサルそネラ
Ｒ＠ ＬＰＳに対してＥＩＪＳＡによ多スクリー二／グ
する。Ｒｅ又はＲｅリピドＡ ＬＰＳについて陽性の細
胞を拡げ、そして６−チオグアニン耐性マウス×ヒ）Ｂ
細胞融合パートナ−に融合せしめる。マウス×ヒトＢ細
胞パートナ−を使用する場合、バイブリドをウアバイン
及びアゾセリン中で選択する。Ｒｅ又はＲｅ陽性ノ・イ
ブリドからの上清を、グラム陰性細菌及び精製されたグ
ラム陰性細菌ＬＰＳのスペクトルに対してＥＬＩＳＡに
より測定する。広範囲の活性を示す培養物をインービボ
ＬＰＳ中和活性のために選択する。こうして調製された
すべてではないが多くの抗体がＩｇＭクラスであり、そ
してほとんどが広範囲の精製されたリピドＡ又はラフＬ
ＰＳへの結合を示す。これらの抗体はＥＬＩＳＡにより
種々のスムースＬＰＳ及び一定範凹の臨床分離細株への
結合を示す。
この明細書において１中和する”なる語は、グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をイン−ビ
トロで又は哨乳動物中でブロックする抗体の能力を意味
し、関与する特定の機作にはかかわらない。抗体が、エ
ンドトキシンの生物学的活性に対してそれに結合するこ
とにより影響を与え、エンドトキシンを分解せしめ、又
はその浄化の速度及び／又は部位を変化させてエンドト
キシンの活性に影響を与える機作を含むと意図されるが
、これに限定されない。中和活性はネズミのモデルを用
いてインーピざで測定することができる。例えば、３７
℃にて飼育したＢａ１ｂ／ｃマウスに、５０チのマウス
が死亡するｉ （ＬＤ５ｏ） （約１〜１０μＩ）のＩ
、ＰＳを１ｐ又は１マ注射する。ＬＰＳの注射の前又は
後に、０．２〜２０１１ν（の抗体をｉｐ又はｉマ注射
することができる。中和効果は試験マウスの死亡率を対
照マウス（すなわち、抗体を与えられなかったマウス、
非結合抗体を与えられたマウス等）のそれと比較するこ
とによって決定される。
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をイン−ビ
トロで又は哨乳動物中でブロックする抗体の能力を意味
し、関与する特定の機作にはかかわらない。抗体が、エ
ンドトキシンの生物学的活性に対してそれに結合するこ
とにより影響を与え、エンドトキシンを分解せしめ、又
はその浄化の速度及び／又は部位を変化させてエンドト
キシンの活性に影響を与える機作を含むと意図されるが
、これに限定されない。中和活性はネズミのモデルを用
いてインーピざで測定することができる。例えば、３７
℃にて飼育したＢａ１ｂ／ｃマウスに、５０チのマウス
が死亡するｉ （ＬＤ５ｏ） （約１〜１０μＩ）のＩ
、ＰＳを１ｐ又は１マ注射する。ＬＰＳの注射の前又は
後に、０．２〜２０１１ν（の抗体をｉｐ又はｉマ注射
することができる。中和効果は試験マウスの死亡率を対
照マウス（すなわち、抗体を与えられなかったマウス、
非結合抗体を与えられたマウス等）のそれと比較するこ
とによって決定される。
この発明の抗体を生産するハイツリドーマは、適当な培
地、例えばイスコベ培地もしくはＲＰＭＩ −１６４０
培地（ギプコ、グランドアイランド、ニューヨーク）中
で、又は免疫不全実験動物中でインービボ増殖せしめる
ことができる。所望により、抗体を培地又は体液から常
用技法により、例えばΦ 硫酸アンＬウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、マイク
ロフィルトレージ璽ン、及び限外戸１ 過に
より分離することができる。
地、例えばイスコベ培地もしくはＲＰＭＩ −１６４０
培地（ギプコ、グランドアイランド、ニューヨーク）中
で、又は免疫不全実験動物中でインービボ増殖せしめる
ことができる。所望により、抗体を培地又は体液から常
用技法により、例えばΦ 硫酸アンＬウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、マイク
ロフィルトレージ璽ン、及び限外戸１ 過に
より分離することができる。
以下余白
この発明のモノクローナル抗体は、画面症もしくは敗血
症に罹患している個体、又は細菌感染の危険のある個体
を受動免疫するために使用することができる。好ましく
は、それぞれがコア領域の内部に位置する細胞壁ＬＰＳ
の異る決定基を認識しそしてそれに結合する多数の異る
モノクローナル抗体が使用される。このような処置にお
いて１又は複数の抗体が、一般には非経腸的に（例えば
、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に）、好まし
くは静脈内に投与されるであろう。投与量及び投与方法
は、ｌ又は複数の抗体が治療目的で投与されるか予防目
的で投与されるか、患者及び患者の病歴に依存して異る
であろう。１投与当シに適用される抗体の合計量は典型
的には０．１〜２０号勺体重、好ましくは０．１〜ｘｏ
ｑＡｇ体重の範囲である。
症に罹患している個体、又は細菌感染の危険のある個体
を受動免疫するために使用することができる。好ましく
は、それぞれがコア領域の内部に位置する細胞壁ＬＰＳ
の異る決定基を認識しそしてそれに結合する多数の異る
モノクローナル抗体が使用される。このような処置にお
いて１又は複数の抗体が、一般には非経腸的に（例えば
、静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に）、好まし
くは静脈内に投与されるであろう。投与量及び投与方法
は、ｌ又は複数の抗体が治療目的で投与されるか予防目
的で投与されるか、患者及び患者の病歴に依存して異る
であろう。１投与当シに適用される抗体の合計量は典型
的には０．１〜２０号勺体重、好ましくは０．１〜ｘｏ
ｑＡｇ体重の範囲である。
非経腸投与のため、１又は複数の抗体が医薬として許容
される非経腸的担体と共に注射可能な単位投与形（溶液
、懸濁液、乳剤）に製剤化されるであろう。この上うな
担体は本来的に非毒性であり、そして非医療的である。
される非経腸的担体と共に注射可能な単位投与形（溶液
、懸濁液、乳剤）に製剤化されるであろう。この上うな
担体は本来的に非毒性であり、そして非医療的である。
このような担体の例として水、食塩水、リングル液、グ
ルコース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられ
る。非水担体、例えば不揮発油及びオレイン酸エチルを
使用することもできる。担体としてリポゾームを使用す
ることができる。担体は少量の添加剤、例えば等張性及
び化学的安定性を保持する物質、例えば緩衝液及び防腐
剤を含有することができる。抗体は典呈的にはこのよう
な担体中に、約１．０ ｑ／ｄ〜１００ダ／−の濃度で
製剤することができる。
ルコース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられ
る。非水担体、例えば不揮発油及びオレイン酸エチルを
使用することもできる。担体としてリポゾームを使用す
ることができる。担体は少量の添加剤、例えば等張性及
び化学的安定性を保持する物質、例えば緩衝液及び防腐
剤を含有することができる。抗体は典呈的にはこのよう
な担体中に、約１．０ ｑ／ｄ〜１００ダ／−の濃度で
製剤することができる。
次の例によりこの発明の種々の観点をさらに記載する。
これらの例はこの発明の範囲を限定するものではない。
例においてすべての温度は℃で示すＯ
すべてのセルラインは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）
、２ｍＭグルタシン及び５Ｘ１０ Ｍ ２−メルカ
プトエタノールを補充したイスコベＤＭＥ培地中に維持
した。セルラインはマイコプラズマの存在に関して日常
的に点検した。ヒト−モノクローナル抗体の大規模製造
のため、セルラインを、ＨＬ−１培地（ペントレックス
ラプス、ボートランド、ＭＥ ） 、及びＨＢ１０４培
地（ハナバイオケミカルス、バークレイ、カリホルニア
）中で無血清培養に適合させた。
、２ｍＭグルタシン及び５Ｘ１０ Ｍ ２−メルカ
プトエタノールを補充したイスコベＤＭＥ培地中に維持
した。セルラインはマイコプラズマの存在に関して日常
的に点検した。ヒト−モノクローナル抗体の大規模製造
のため、セルラインを、ＨＬ−１培地（ペントレックス
ラプス、ボートランド、ＭＥ ） 、及びＨＢ１０４培
地（ハナバイオケミカルス、バークレイ、カリホルニア
）中で無血清培養に適合させた。
Ａ、ヒトＢ−リンノ母球
Ｅ、コリＪ５もしくはＳ、ミネソタ（Ｓ、 ｍ１ｎｎｅ
ａｏｔａ）Ｒ５９５コアグリコリピドに対する自然に獲
得した高力価血清抗体を有する志願者、又は高いＬＰＳ
抗体価を得るために標準的な入手可能なチフス注射によ
りワクチン処理された志願者を末梢血リンパ球の入手源
として用すた。５０−の静脈血を５日及び７日目に志願
者から採取した。血液を遠心分離し、バフィーコートを
集め、そして集められたバフィーコートをＦｉａｏｌｌ
／Ｈｙｐａｑｕｅ ｔ−用いてグラジェント遠心してリ
ン／ぐ球を分離した。ｌ！のＦｌｃｏｌ １／Ｈｙｐａ
ｑｕｅを調製するために、６４．ＦのＦｉｃｏｌｌ （
シグマ）を６００−の蒸留水に低速の攪拌棒ローターを
用いて溶解し、そして９９ＩＩのジアドリゾエートナト
リウム（スターリングドラグ、ニューヨーク）を加えた
。両物質が溶解した後、追加の水を加えて１にとし、さ
らＶＣｏ、７１のＮａＣ１を加えた。Ｔ細胞を、アミノ
エチルチオクロニウム処理されたヒツジ赤血球細胞（Ａ
ＥＴ−８ＲＢＣ）ロゼツト形成により、Ｍａｄｓｅｎ及
びＪｏｈｎｓｅｎ、ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メンズ（Ｊ、 ｉｍｍｕｎｏｌ。
ａｏｔａ）Ｒ５９５コアグリコリピドに対する自然に獲
得した高力価血清抗体を有する志願者、又は高いＬＰＳ
抗体価を得るために標準的な入手可能なチフス注射によ
りワクチン処理された志願者を末梢血リンパ球の入手源
として用すた。５０−の静脈血を５日及び７日目に志願
者から採取した。血液を遠心分離し、バフィーコートを
集め、そして集められたバフィーコートをＦｉａｏｌｌ
／Ｈｙｐａｑｕｅ ｔ−用いてグラジェント遠心してリ
ン／ぐ球を分離した。ｌ！のＦｌｃｏｌ １／Ｈｙｐａ
ｑｕｅを調製するために、６４．ＦのＦｉｃｏｌｌ （
シグマ）を６００−の蒸留水に低速の攪拌棒ローターを
用いて溶解し、そして９９ＩＩのジアドリゾエートナト
リウム（スターリングドラグ、ニューヨーク）を加えた
。両物質が溶解した後、追加の水を加えて１にとし、さ
らＶＣｏ、７１のＮａＣ１を加えた。Ｔ細胞を、アミノ
エチルチオクロニウム処理されたヒツジ赤血球細胞（Ａ
ＥＴ−８ＲＢＣ）ロゼツト形成により、Ｍａｄｓｅｎ及
びＪｏｈｎｓｅｎ、ジャーナル・オブ・イムノロジカル
・メンズ（Ｊ、 ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈ）（１９７９）２７：６］−７４に記載されて
いる方法を用いて除去した。残シのＢ細胞富化リンノ４
球集団をエプスタイン−バールウィルスにより、Ｆｏｕ
ｎｇ 等、ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メンズ
（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍａｔｈ−）（１９８４） ７
０ ： ８３−９０に記載されている方法を用いて形質
転換した。
いる方法を用いて除去した。残シのＢ細胞富化リンノ４
球集団をエプスタイン−バールウィルスにより、Ｆｏｕ
ｎｇ 等、ジャーナル・オプ・イムノロジカル・メンズ
（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍａｔｈ−）（１９８４） ７
０ ： ８３−９０に記載されている方法を用いて形質
転換した。
但し、一般に、細胞を９６−ウェル培養プレート中で１
０３〜１０’細胞／ウエルにおいて培養した。
０３〜１０’細胞／ウエルにおいて培養した。
培養物は、２０日後にＥＬＩ ＳＡによりＥ、コリＪ５
を抗原として用いて測定した（下記）。高抗体価、ｌ
を示す１ウエル中の細胞を１０００細胞／ウエル
でそして次に５００細胞／ウエルでサブカルテニア−し
、そしてコア特異的抗体分泌細胞を含有する陽性培養物
をプールした。
を抗原として用いて測定した（下記）。高抗体価、ｌ
を示す１ウエル中の細胞を１０００細胞／ウエル
でそして次に５００細胞／ウエルでサブカルテニア−し
、そしてコア特異的抗体分泌細胞を含有する陽性培養物
をプールした。
他の好ましい態様において、単核細胞を末梢血から単離
し、そしてプラスチック上で培養してプラスチック付着
性単核球を涸渇させた。残った細胞（Ｔ及びＢ細胞）を
、ＳミネソタＲｅ Ｒ５９５のＬＰＳ （リド・イムノ
ケモリサーチ社）により被覆したプレート上で決選した
。次に付着細胞をＥＢＶにより形質転換し、そして培養
物中に維持し、又はミクロタイタープレート上で培養し
そしてＲｅＬＰＳＫ：ついて陽性の細胞をスクリーニン
グした。
し、そしてプラスチック上で培養してプラスチック付着
性単核球を涸渇させた。残った細胞（Ｔ及びＢ細胞）を
、ＳミネソタＲｅ Ｒ５９５のＬＰＳ （リド・イムノ
ケモリサーチ社）により被覆したプレート上で決選した
。次に付着細胞をＥＢＶにより形質転換し、そして培養
物中に維持し、又はミクロタイタープレート上で培養し
そしてＲｅＬＰＳＫ：ついて陽性の細胞をスクリーニン
グした。
培養物中に維持された細胞を、１０日後に再び、Ｅ、コ
リのＬＰＳ （ＩＪビ製）上で決選した。付着細胞を集
め、そしてセルソーターによりγ−陽性絽胞について選
択した。これらのγ−選択された細胞を増殖せしめ、そ
してＩｇＧ生産について陽性であるがＲｅ ＬＰＳ反応
について陰性であるものを試験した。潜在的なＲｅ−陽
性細胞を選択するため、この集団をセルソーターにより
ミクロタイタープレートに区分けした。
リのＬＰＳ （ＩＪビ製）上で決選した。付着細胞を集
め、そしてセルソーターによりγ−陽性絽胞について選
択した。これらのγ−選択された細胞を増殖せしめ、そ
してＩｇＧ生産について陽性であるがＲｅ ＬＰＳ反応
について陰性であるものを試験した。潜在的なＲｅ−陽
性細胞を選択するため、この集団をセルソーターにより
ミクロタイタープレートに区分けした。
特異抗原上での決選は、回収可能な抗原性細胞の数を２
倍以上にすることができ、そして抗体の選択率を改良す
ることができる。
倍以上にすることができ、そして抗体の選択率を改良す
ることができる。
Ｂ、ラット牌細胞
塩水中】０９細胞／ｆｎｔのＥ、コ１ＪＲｃ変異株を抗
原として使用した。ラットに０．５−の細菌懸濁液注射
０．５ ｍｔの完全７０インドアジユバント（ｃＦＡ）
をｉｐ及び！Ｉｑ注射した。このう、トを、２５日目に
同じ注射により、そして２９日目に０．２ｍｌの細菌懸
濁液注射（１ｖ）により、追加免疫した。３２日目に膵
臓摘出を行った。
原として使用した。ラットに０．５−の細菌懸濁液注射
０．５ ｍｔの完全７０インドアジユバント（ｃＦＡ）
をｉｐ及び！Ｉｑ注射した。このう、トを、２５日目に
同じ注射により、そして２９日目に０．２ｍｌの細菌懸
濁液注射（１ｖ）により、追加免疫した。３２日目に膵
臓摘出を行った。
Ｃ，Ｆ３Ｂ６ （マウス×ヒトライン）Ｆ３Ｂ６と称す
るマウス−ヒトヘテロバイブリド融合ハードナー（９９
％無血清培地に適合されており、“そして１９８５年４
月１８日にＡＴＣＣ）伍ＨＢ８７８５としてＡＴＣＣに
寄託されている）を、血液銀行から得られたヒト末梢血
リンパ球（ＰＢＬ） Ｂ細胞とＡＴＣＣ扁ＴｌＢ１８
（Ｐ３ＡＳ１／１−ＡＣ３−１）としてＡＴＣＣから得
られたネズミ形質細胞腫セルラインＮＳＩとの融合によ
り造成した。ランダムバフィーコートからのＰＢＬ細胞
を５０ゴ遠心管に移し、そして３０−のバンク平衡塩溶
液（ｃａ”−不含／Ｍｇ”−不含） （ＨＢＳＳ−／−
）で稀釈した。次に、１０ゴのＦｉｃｏｌ ｌ ／Ｈｙ
ｐａｑｕａを加え、そしてこの混合物を１５００ｒｐｍ
、室温にて１５分間遠心した。界面を取）出し、そして
この混合物をＨＢＳＳ−／−で洗浄し、そしてＨＢＳＳ
−／−に再懸濁した。細胞を計数した。
るマウス−ヒトヘテロバイブリド融合ハードナー（９９
％無血清培地に適合されており、“そして１９８５年４
月１８日にＡＴＣＣ）伍ＨＢ８７８５としてＡＴＣＣに
寄託されている）を、血液銀行から得られたヒト末梢血
リンパ球（ＰＢＬ） Ｂ細胞とＡＴＣＣ扁ＴｌＢ１８
（Ｐ３ＡＳ１／１−ＡＣ３−１）としてＡＴＣＣから得
られたネズミ形質細胞腫セルラインＮＳＩとの融合によ
り造成した。ランダムバフィーコートからのＰＢＬ細胞
を５０ゴ遠心管に移し、そして３０−のバンク平衡塩溶
液（ｃａ”−不含／Ｍｇ”−不含） （ＨＢＳＳ−／−
）で稀釈した。次に、１０ゴのＦｉｃｏｌ ｌ ／Ｈｙ
ｐａｑｕａを加え、そしてこの混合物を１５００ｒｐｍ
、室温にて１５分間遠心した。界面を取）出し、そして
この混合物をＨＢＳＳ−／−で洗浄し、そしてＨＢＳＳ
−／−に再懸濁した。細胞を計数した。
Ｎ５−１細胞Ｉ Ｔ７４フラスコ４本中に増殖せしめ、
そして集め、ＨＢ Ｓ Ｓ−／−で洗浄し、そしてＨＢ
ＳＳ−／−中に再懸濁した。細胞を計数した。融合のた
め、約５ Ｘ １０’個のＢ−細胞及び２．５Ｘ１０７
個のＭＳ−１細胞（比率２：１）を５−５０−の遠心チ
ーープの各々に加えた。この混合物を１２０ Ｏｒｐｍ
にて８分間、室温において遠心し、密なベレットを形成
した。すべての上清を除去し、そしてチーープを３７℃
に保持してさらに操作した。５０％の分子ｔ１５４００
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５４０）（ＢＯＨケ
ミカルス、プール、イングランド）合計１−を１分間に
わたシ、１−のピペットを用いて加えた。ＰＥＣを添加
しながら、ピペットのチップによって細胞ペレットをお
だやかに攪拌した。次に、１−のＨＢＳＳ−／−を３７
℃にて１分間にわたって添加することによりＰＥＧを徐
々に稀釈した。細胞をＨＢＳＳ−／−により２回洗浄し
、そして数本のＴ１５０フラスコ中のイスコペ培地に再
懸濁した。
そして集め、ＨＢ Ｓ Ｓ−／−で洗浄し、そしてＨＢ
ＳＳ−／−中に再懸濁した。細胞を計数した。融合のた
め、約５ Ｘ １０’個のＢ−細胞及び２．５Ｘ１０７
個のＭＳ−１細胞（比率２：１）を５−５０−の遠心チ
ーープの各々に加えた。この混合物を１２０ Ｏｒｐｍ
にて８分間、室温において遠心し、密なベレットを形成
した。すべての上清を除去し、そしてチーープを３７℃
に保持してさらに操作した。５０％の分子ｔ１５４００
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５４０）（ＢＯＨケ
ミカルス、プール、イングランド）合計１−を１分間に
わたシ、１−のピペットを用いて加えた。ＰＥＣを添加
しながら、ピペットのチップによって細胞ペレットをお
だやかに攪拌した。次に、１−のＨＢＳＳ−／−を３７
℃にて１分間にわたって添加することによりＰＥＧを徐
々に稀釈した。細胞をＨＢＳＳ−／−により２回洗浄し
、そして数本のＴ１５０フラスコ中のイスコペ培地に再
懸濁した。
２日目に、５０−の遠心チューブ中のＨＢＳＳ−／−中
で洗浄した。このチューブに合計】〇−のＦｉｃｏｌ
１−Ｈｙｐａｑｕｅを加えた。このチューブを、］ ５
００ ｒｐｍにて１５分間、室温において遠心しそして
界面の生細胞を取り出した。ベレットをＰ瓢打−１６４
０（ギブコ）で２回洗浄し、そして１１００ｒｎヒボキ
サンチン（シグマ）、５μＩ／ｌｎｌアゾセリン（シグ
マ）及びイスコベ培地（ギブニア）、ＩＱ％ＮＣＴＣ（
Ｍ、Ａ、バイオロジカルス）、２０チ熱不活性化ＦＢＳ
から成る濃縮されたヒポキサンチン／了デセリン選択培
地（ＥＨＡ ）に再懸濁した。濃度１ を２
．５Ｘ１０’細胞／−培地に調整した。
で洗浄した。このチューブに合計】〇−のＦｉｃｏｌ
１−Ｈｙｐａｑｕｅを加えた。このチューブを、］ ５
００ ｒｐｍにて１５分間、室温において遠心しそして
界面の生細胞を取り出した。ベレットをＰ瓢打−１６４
０（ギブコ）で２回洗浄し、そして１１００ｒｎヒボキ
サンチン（シグマ）、５μＩ／ｌｎｌアゾセリン（シグ
マ）及びイスコベ培地（ギブニア）、ＩＱ％ＮＣＴＣ（
Ｍ、Ａ、バイオロジカルス）、２０チ熱不活性化ＦＢＳ
から成る濃縮されたヒポキサンチン／了デセリン選択培
地（ＥＨＡ ）に再懸濁した。濃度１ を２
．５Ｘ１０’細胞／−培地に調整した。
５日目に、懸濁液をＨＥＳＳ−／−で２回洗浄し、そし
て１０ゴのイスコベ培地に洗浄した。上記のようにして
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心により生細
胞を分離した。細胞をＲＰＭＩ−１６４０＋ ２０チＦ
ＢＳにより２回洗浄し、そして次に９６−ウェルプレー
トに１０６細胞／−でプレートした。７日。
て１０ゴのイスコベ培地に洗浄した。上記のようにして
Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心により生細
胞を分離した。細胞をＲＰＭＩ−１６４０＋ ２０チＦ
ＢＳにより２回洗浄し、そして次に９６−ウェルプレー
トに１０６細胞／−でプレートした。７日。
９日及び１２２日目、前記のＥＲＡ選択培地を告時に加
えた。１５日及び１８８日目、ヒポキサンチン、メトト
レキセート及びチミジンを含有するＥＩ（ＭＴ培地を補
給した。上清をｒｇの分泌につｈて測定し、そしてＩｇ
分泌バイブリド細胞を、Ｕ底９６ウエルプレート中での
限界稀釈によりフローン化した。
えた。１５日及び１８８日目、ヒポキサンチン、メトト
レキセート及びチミジンを含有するＥＩ（ＭＴ培地を補
給した。上清をｒｇの分泌につｈて測定し、そしてＩｇ
分泌バイブリド細胞を、Ｕ底９６ウエルプレート中での
限界稀釈によりフローン化した。
６−チオグアニン選択についてウェルＦ３Ｂ６を選択し
た。Ｆ３Ｂ６の数本のローラーピンを増殖条件においた
。２日、５日及び７日目に、Ｆｉｃｏｌｌ−）（ｙｐａ
ｑｕ＠密度勾配遠心により死細胞を除去した。
た。Ｆ３Ｂ６の数本のローラーピンを増殖条件においた
。２日、５日及び７日目に、Ｆｉｃｏｌｌ−）（ｙｐａ
ｑｕ＠密度勾配遠心により死細胞を除去した。
６−チオグアニン耐性クローンが増殖した。試験融合を
行い、そしてセルラインをウアバイン耐性について試験
した。
行い、そしてセルラインをウアバイン耐性について試験
した。
一層再現性ある製造のため、次の多段法により、前記の
ようにして得られたセルラインを９９％血清不含培地及
び１ ％ ＦＢＳ中での増殖及び維持に適合せしめた。
ようにして得られたセルラインを９９％血清不含培地及
び１ ％ ＦＢＳ中での増殖及び維持に適合せしめた。
１、サブカルキュアーの２日前に、蝿巾尋−４４ｂ地Ｈ
Ｌ−１を供給した＠ ２．２日後、又はハイブリドーマ細胞が８刈０５〜Ｉ
Ｘ １０’細胞／−の濃度に達した時、５０係のイスコ
ペＤＭＥ培地及び５０％の無血清培地によりサブカルキ
ュアーしそして植えた。２００ＸＦにて５分間遠心分離
することにより後者の培地から細胞を取９出した。イス
コペのＤＭＥ培地を５０％の無血清培地と混合して５０
：５０混合物を形成し、これに細胞ペレットを懸濁し、
そして計数した。
Ｌ−１を供給した＠ ２．２日後、又はハイブリドーマ細胞が８刈０５〜Ｉ
Ｘ １０’細胞／−の濃度に達した時、５０係のイスコ
ペＤＭＥ培地及び５０％の無血清培地によりサブカルキ
ュアーしそして植えた。２００ＸＦにて５分間遠心分離
することにより後者の培地から細胞を取９出した。イス
コペのＤＭＥ培地を５０％の無血清培地と混合して５０
：５０混合物を形成し、これに細胞ペレットを懸濁し、
そして計数した。
適当量の細胞懸濁液を５０チイスコベＤＭＥ及び５０％
無血清培地を有する容器中に植えた。植えられた細胞の
濃度は好ましくは５Ｘ］０’細胞／−よシ低くなくモし
て】×１０５細胞／ｒｎｔを超えない。
無血清培地を有する容器中に植えた。植えられた細胞の
濃度は好ましくは５Ｘ］０’細胞／−よシ低くなくモし
て】×１０５細胞／ｒｎｔを超えない。
３、植えて２〜３日後、又は細胞濃度が８×１０５〜３
ｘｌＯ’！胞／ｄＶｃ達した後、細胞に５０チイスコペ
ＤＭＡ及び５０チ無血清培地を供給したＧ４、段階３を
他の継代のために反復した。
ｘｌＯ’！胞／ｄＶｃ達した後、細胞に５０チイスコペ
ＤＭＡ及び５０チ無血清培地を供給したＧ４、段階３を
他の継代のために反復した。
５、培養中２〜３日の後、又は細胞濃度が８×１０５〜
ｌＸｌ０’細胞／−に達し、そして生存が約８５％とな
ったとき、細胞を無血清培地のみに培養した。細胞がは
じめて無血清培地に移植された後、細胞濃度は１×１０
５〜８−９Ｘ１０５細胞／−であった。最終培地として
１ ’Ｉ ＦＢＳ ｔ−含む）ＬＴ、−１を使用した。
ｌＸｌ０’細胞／−に達し、そして生存が約８５％とな
ったとき、細胞を無血清培地のみに培養した。細胞がは
じめて無血清培地に移植された後、細胞濃度は１×１０
５〜８−９Ｘ１０５細胞／−であった。最終培地として
１ ’Ｉ ＦＢＳ ｔ−含む）ＬＴ、−１を使用した。
Ｄ、ラット腫瘍ライン
入手可能なラット腫瘍ラインを用−１た。
融合方法
融合混合物は、バンク平衡溶液（ＨＢＳＣ）−／＋（ｃ
ａ２＋不含、 ２ ｍＭＭｇｓｏ４）中に４０ ｗ／ｖ
％のポリエｆＬ／７７す：ｘ−ル（ＰＥＧ）４０００
．１０ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
、及び５μｍ１／ｍｌの、ｊ？ＩＪ−１−アルギニンを
含む。４ＯＮのＰＥＧ４０００を１０ＷＬｔのＤＭＳＯ
及び５０ｆＩＬｔのＨＢＳＳ−／＋と混合した。混合物
を２５分間オートクレーブ処理した。使用前に融合混合
物の−を無菌の０．１ ＮＮａＯＨによりフ、５〜８．
５に調整した。
ａ２＋不含、 ２ ｍＭＭｇｓｏ４）中に４０ ｗ／ｖ
％のポリエｆＬ／７７す：ｘ−ル（ＰＥＧ）４０００
．１０ｖ／ｖ％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
、及び５μｍ１／ｍｌの、ｊ？ＩＪ−１−アルギニンを
含む。４ＯＮのＰＥＧ４０００を１０ＷＬｔのＤＭＳＯ
及び５０ｆＩＬｔのＨＢＳＳ−／＋と混合した。混合物
を２５分間オートクレーブ処理した。使用前に融合混合
物の−を無菌の０．１ ＮＮａＯＨによりフ、５〜８．
５に調整した。
プレート（６−ウェルクラスター、ウェル直径３５ ｔ
ａｘ ）を次のよりにして調製した。２−のＨＢ Ｓ
Ｓ−／十及び−過滅菌した２ ０〜１００ ｐｇ／ｍｌ
のピーナツアグルチニン（ＰＮＡ、シグマ）５０μ！ヲ
各ウエルに加えた。使用に先立ってプレートを少なくと
も１時間３７℃にてインキュベートした。
ａｘ ）を次のよりにして調製した。２−のＨＢ Ｓ
Ｓ−／十及び−過滅菌した２ ０〜１００ ｐｇ／ｍｌ
のピーナツアグルチニン（ＰＮＡ、シグマ）５０μ！ヲ
各ウエルに加えた。使用に先立ってプレートを少なくと
も１時間３７℃にてインキュベートした。
ＰＮＡストックを凍結貯蔵し、そして新たに解凍した了
りコートを使用して融合細胞をコートした。
りコートを使用して融合細胞をコートした。
細胞数が限定されている場合には一層小サイズのウェル
を使用した。
を使用した。
Ｆ ［ｃｏ ｌ １− Ｈｙｐａｑｕｓ中親細胞をＨＢ
ＳＳ−μ中で２回室温にて洗浄し、そして次に再懸濁し
、そして５：１〜１：１の比率で、３７℃に加温された
ＨＢＳＳ−／十中リン・ぐ球−牌細胞融合・や−トナー
と混合した。２−の混合された細胞懸濁液（３Ｘ１０’
・’ ａ胞／ウェル）を、１μＩＡＩ ＰＮ
Ａコート溶液を含む前処理され之各ウェルに加えた。ウ
ェルを３７℃にて１時間インキュベートした。プレート
を４００〜５００Ｘ／にて、室温において５分間回転せ
しめて細胞の単層を形成した。次に、上清をプレートか
ら吸引除去し、細胞の付着層を残した。
ＳＳ−μ中で２回室温にて洗浄し、そして次に再懸濁し
、そして５：１〜１：１の比率で、３７℃に加温された
ＨＢＳＳ−／十中リン・ぐ球−牌細胞融合・や−トナー
と混合した。２−の混合された細胞懸濁液（３Ｘ１０’
・’ ａ胞／ウェル）を、１μＩＡＩ ＰＮ
Ａコート溶液を含む前処理され之各ウェルに加えた。ウ
ェルを３７℃にて１時間インキュベートした。プレート
を４００〜５００Ｘ／にて、室温において５分間回転せ
しめて細胞の単層を形成した。次に、上清をプレートか
ら吸引除去し、細胞の付着層を残した。
上記のＰＥＧ融合混合物を３７℃に加温し、融合セルの
側面にそって注意深く加えた。１分間の後、次の２〜３
分間にわたシ、５％ＤＭＳＯ（シグマ）ＨＢＳＳ −／
＋ （３７℃に加温しそしてｐ過滅菌したもの）の融合
稀釈混合物（ＦＤＭ）を２ゴ／分（１５秒ごとに０．５
ｒｎｔ）の速度で加える（４〜６ｒｎｔ）ことにより
上記ＰＥＧ溶液を稀釈した。次の２分間、混合しながら
４−７分の速度でＦＤＭを加えた。
側面にそって注意深く加えた。１分間の後、次の２〜３
分間にわたシ、５％ＤＭＳＯ（シグマ）ＨＢＳＳ −／
＋ （３７℃に加温しそしてｐ過滅菌したもの）の融合
稀釈混合物（ＦＤＭ）を２ゴ／分（１５秒ごとに０．５
ｒｎｔ）の速度で加える（４〜６ｒｎｔ）ことにより
上記ＰＥＧ溶液を稀釈した。次の２分間、混合しながら
４−７分の速度でＦＤＭを加えた。
ＦＤＭを常にウェルの側面にそって加えることにより単
層を混乱させないようにし、そして最適混合を保証する
ためにプレートを常に渦動させた。
層を混乱させないようにし、そして最適混合を保証する
ためにプレートを常に渦動させた。
上記２分間の終シにおいて、ウェルを吸引して稀釈され
たＰＥＧ融合混合物を除去した。ＰＥＧ混合物の残留フ
ィルムを、温ＦＤＭを２ゴ／分の速度にて１〜２分間に
わたり加えることにより稀釈した。
たＰＥＧ融合混合物を除去した。ＰＥＧ混合物の残留フ
ィルムを、温ＦＤＭを２ゴ／分の速度にて１〜２分間に
わたり加えることにより稀釈した。
再びプレートを一定速度で渦動させた。０．２５〜２分
間にわｆｃシ渦動させた後、３７℃に加温したＨＢＳＳ
−／＋５ ｍｌを１ｍｌ／１５分の速度で融合ウェルに
加えた。次にウェルをＨＢＳＳ−／＋により満た 、し
、そしてすべての上溝を単層から吸引した。最後に、各
融合ウェルを５〜１０−の温ＨＢＳＳ−／＋により１〜
２回洗浄し、そして吸引し、そして約５−のＨＢＳＳ−
／＋で再び洗浄しそして吸引した。
間にわｆｃシ渦動させた後、３７℃に加温したＨＢＳＳ
−／＋５ ｍｌを１ｍｌ／１５分の速度で融合ウェルに
加えた。次にウェルをＨＢＳＳ−／＋により満た 、し
、そしてすべての上溝を単層から吸引した。最後に、各
融合ウェルを５〜１０−の温ＨＢＳＳ−／＋により１〜
２回洗浄し、そして吸引し、そして約５−のＨＢＳＳ−
／＋で再び洗浄しそして吸引した。
５ｄの温イスコベ完全培地及び１５〜２０係のＦＢＳを
各ウェルに加え、そしてプレートを３７℃にて２４時間
インキ−ベートした。融合の次の日、細胞を、アゾセリ
ン（２μｍ１７ｍ１）、ヒノキサンチン（１００μＭ）
及びウアバイン（１μＭ）を含有するＥＩ（Ａ培地に１
０５ａ胞／１ＩＬｔの濃度に再懸濁し、そレテ９６−
ウェルプレートに０．１ｍｊ／ウェルでプレートシた。
各ウェルに加え、そしてプレートを３７℃にて２４時間
インキ−ベートした。融合の次の日、細胞を、アゾセリ
ン（２μｍ１７ｍ１）、ヒノキサンチン（１００μＭ）
及びウアバイン（１μＭ）を含有するＥＩ（Ａ培地に１
０５ａ胞／１ＩＬｔの濃度に再懸濁し、そレテ９６−
ウェルプレートに０．１ｍｊ／ウェルでプレートシた。
次いで、培養物に３日ごとに供給した。
増殖するバイブリドは１０日までに可視化された。
ＬＩＳＡ
Ａ、細菌
脱イオン水中０．５〜１．０％のグルタルアルデヒド（
シグマ）５００μｂを平底ミクロタイタープレート（グ
イナテ、り）上にコートした。室温にて１〜４時間イン
キュベートした後、ウェルを吸引し又は蒸留水で２回洗
浄した。細菌を塩溶液中で洗浄し、そして０．２５ ｖ
／ｖチに再調整した。この細菌懸濁液６００μ！を各ウ
ェルに加え、プレートを２０００ ｒｐｍにて２００分
間回転しめた。この懸濁液を一夜、又は少なくとも２時
間インキュベートシた。次に、プレートを、０．１１／
ＡのＭｇＳＯ４及び０．１１／ＪのＣａＣ！−２（ＰＢ
Ｓ ” ）、０．０５４トウイ一ン２０界面活性剤（
シグマ）、並びに好ましくは０．０１＊チメロサル及び
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） （シグマ）を含有
するリン酸緩衝化塩溶液１００μ！で洗浄した。上溝液
を室温にて９０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ＋
＋、トウィーン２０及びチメロサールにより３回洗浄し
た。矢に場合によってはプレートの底をン７トティッシ
ュによって吸い取った。ホースラｆ４ッシュパーオキシ
ターゼ接合ヤギ抗ヒトエｇＧ（タブ社）又はホースラデ
ィツシュパーオキシダーゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ジャ
クンンラズス）５００μ！を各ウェルに加えた。ウェル
を室温又は４０″Ｃにて３０分間インキ−ベートし、そ
してＰＢＳ＋＋、 ０．０５チトウイーン２０及び０．
０１’ｌチメロサールによ９５回洗浄し、そして場合に
よっては吸い取った。次に、２００μにのＡＢＴＳ基質
を各ウェルに加えた。この基質は、０．１ Ｍクエン酸
ナトリウム緩衝液（ＰＨ４，５）ニ、１：す１： １ｏ
ｏｏｍ釈すり、ｆｃ ｓ ５ｍｑ／ｒｎｔ。
シグマ）５００μｂを平底ミクロタイタープレート（グ
イナテ、り）上にコートした。室温にて１〜４時間イン
キュベートした後、ウェルを吸引し又は蒸留水で２回洗
浄した。細菌を塩溶液中で洗浄し、そして０．２５ ｖ
／ｖチに再調整した。この細菌懸濁液６００μ！を各ウ
ェルに加え、プレートを２０００ ｒｐｍにて２００分
間回転しめた。この懸濁液を一夜、又は少なくとも２時
間インキュベートシた。次に、プレートを、０．１１／
ＡのＭｇＳＯ４及び０．１１／ＪのＣａＣ！−２（ＰＢ
Ｓ ” ）、０．０５４トウイ一ン２０界面活性剤（
シグマ）、並びに好ましくは０．０１＊チメロサル及び
１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） （シグマ）を含有
するリン酸緩衝化塩溶液１００μ！で洗浄した。上溝液
を室温にて９０分間インキュベートし、そしてＰＢＳ＋
＋、トウィーン２０及びチメロサールにより３回洗浄し
た。矢に場合によってはプレートの底をン７トティッシ
ュによって吸い取った。ホースラｆ４ッシュパーオキシ
ターゼ接合ヤギ抗ヒトエｇＧ（タブ社）又はホースラデ
ィツシュパーオキシダーゼ接合ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ジャ
クンンラズス）５００μ！を各ウェルに加えた。ウェル
を室温又は４０″Ｃにて３０分間インキ−ベートし、そ
してＰＢＳ＋＋、 ０．０５チトウイーン２０及び０．
０１’ｌチメロサールによ９５回洗浄し、そして場合に
よっては吸い取った。次に、２００μにのＡＢＴＳ基質
を各ウェルに加えた。この基質は、０．１ Ｍクエン酸
ナトリウム緩衝液（ＰＨ４，５）ニ、１：す１： １ｏ
ｏｏｍ釈すり、ｆｃ ｓ ５ｍｑ／ｒｎｔ。
ＡＢＴＳ水性ストック溶液に、使用亘前［１：１０００
の３０％ｆ（２０゜を加えたものである。各ウェルを３
７°Ｃにて３０分間暗中でインキュベートした。
の３０％ｆ（２０゜を加えたものである。各ウェルを３
７°Ｃにて３０分間暗中でインキュベートした。
ウェルの内容物を透明プレートに移し、そしてＥＬＩ
ＳＡリーダーにより４ Ｑ ５ ｎｍにて読み取った。
ＳＡリーダーにより４ Ｑ ５ ｎｍにて読み取った。
読み値は１〜ＩＯのスケールで得られた。ここで、１＝
０．２（ＯＤ）、１０；２．０（ＯＤ）である。
０．２（ＯＤ）、１０；２．０（ＯＤ）である。
Ｂ、ＬＰＳ
平底ミクロタイタープレートを、０．０５ｒｎＭ炭酸水
素ナトリウム（ｐＨ９，６）中５０μ１Ａｎｔの超音波
処理ＬＰＳの標品５０μ！により一夜コートした。デ（
レートを、０．０５チトウイーン２０（シグマ）及び好
ましくは０．０１チチメロサールを含有するＰＢＳ＋に
よυ、浸漬により又は自動プレート洗浄機を用いて、５
回まで洗浄した。次に、１％ＢＳＡ。
素ナトリウム（ｐＨ９，６）中５０μ１Ａｎｔの超音波
処理ＬＰＳの標品５０μ！により一夜コートした。デ（
レートを、０．０５チトウイーン２０（シグマ）及び好
ましくは０．０１チチメロサールを含有するＰＢＳ＋に
よυ、浸漬により又は自動プレート洗浄機を用いて、５
回まで洗浄した。次に、１％ＢＳＡ。
０．０５％トウイーン２０及び好ましくは０．０１％チ
メロサールを含むＰｕｓ １００ ｔＪを各ウェルに
加え、次に１００μｊの試験上清を加えた。上清を４℃
〜室温にて３０分間インキュベートし、そして次にＰＢ
Ｓ／トウィーン／チメロサール混合物によ９５回まで洗
浄した。次に、ＢＳＡ、 ）ウィーン２０及びチメロ
サールを含むＰＢＳ＋中に稀釈されたパーオキシダーゼ
接合ヤギ抗−ヒトエｇＭ （りが）を加え、そして混合
物を室温又は４０”Ｃにて３０分間インキュベートし、
そして５回まで洗浄した。次に、ａ菌ＥＬＩＳＡについ
て記載したＡＢＴＳノ４−オキシダーゼ基質２００μ！
ををウェルに加えそして各ウェルを３７℃にて３０分間
暗中でインキュベートした。ウェルの内容物をプレート
ＥＬＩＳＡリーダー上で４−０５ ｎｍにて読み取った
。
メロサールを含むＰｕｓ １００ ｔＪを各ウェルに
加え、次に１００μｊの試験上清を加えた。上清を４℃
〜室温にて３０分間インキュベートし、そして次にＰＢ
Ｓ／トウィーン／チメロサール混合物によ９５回まで洗
浄した。次に、ＢＳＡ、 ）ウィーン２０及びチメロ
サールを含むＰＢＳ＋中に稀釈されたパーオキシダーゼ
接合ヤギ抗−ヒトエｇＭ （りが）を加え、そして混合
物を室温又は４０”Ｃにて３０分間インキュベートし、
そして５回まで洗浄した。次に、ａ菌ＥＬＩＳＡについ
て記載したＡＢＴＳノ４−オキシダーゼ基質２００μ！
ををウェルに加えそして各ウェルを３７℃にて３０分間
暗中でインキュベートした。ウェルの内容物をプレート
ＥＬＩＳＡリーダー上で４−０５ ｎｍにて読み取った
。
Ｃ，ＩｇＭ
イムロン■平底ミクロタイタープレートを、５０ｍＭ炭
酸水素ナトＩＪクム緩衝液（ｐＨ９，６）中に１：１０
（ｌ釈したヤギ抗−ヒ）ＩｇＭ（りが）により、１００
Ａ！／ウエルでコートした。３７℃にて９０分分間−た
後、プレートを、０．０５％トウイーン２０及び好まし
くは０．０１％チメロサールを含むＰＢＳ により、
浸漬によって又は自動プレート洗浄機を用いて、５回ま
で洗浄した。次に好ましくは、１１ ＢＳＡ、 ０．０
５％トウィーン２０及び０．０１チチメロサールを含む
ＰＢＳ＋ｉ ｏ ｏμ！を各ウェルに加えた。合計１０
０μ！の試験上滑を第１ウエルに加え、そして好ましく
は２倍稀釈を２回行った。好ましくは、１つのウェルは
対照として残した。プレートを２２℃にて３０分間イン
キエベートし、そして前記のようにして５回まで洗浄し
た。次に、ＢＳＡ、 トウイーン２０及びチメロサール
を含むＰＢＳ 中に稀釈されたパーオキシダーゼ接合
ヤギ抗−ヒ）ＩｇＭ抗体（りが〕合計５０〜１００μ！
を加え、そじてこの混合物を室温又は４０℃にて３０分
間インキュベートしそして５回まで洗浄した。次に、細
菌ＥＬＩＳＡについて記載したＡＢＴＳパーオキシダー
ゼ基質合計２００μ！を各ウェルに加えた。混合物を３
７℃にて３０分間暗中でインキュベートシ、そしてタボ
のスタンダー１′に対してららかしめ標準化したプール
されたヒト−骨髄腫（チャペル）をＩｇＭスタンダード
として用いて、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＯＤ４ｏ
５）上で読み取った。
酸水素ナトＩＪクム緩衝液（ｐＨ９，６）中に１：１０
（ｌ釈したヤギ抗−ヒ）ＩｇＭ（りが）により、１００
Ａ！／ウエルでコートした。３７℃にて９０分分間−た
後、プレートを、０．０５％トウイーン２０及び好まし
くは０．０１％チメロサールを含むＰＢＳ により、
浸漬によって又は自動プレート洗浄機を用いて、５回ま
で洗浄した。次に好ましくは、１１ ＢＳＡ、 ０．０
５％トウィーン２０及び０．０１チチメロサールを含む
ＰＢＳ＋ｉ ｏ ｏμ！を各ウェルに加えた。合計１０
０μ！の試験上滑を第１ウエルに加え、そして好ましく
は２倍稀釈を２回行った。好ましくは、１つのウェルは
対照として残した。プレートを２２℃にて３０分間イン
キエベートし、そして前記のようにして５回まで洗浄し
た。次に、ＢＳＡ、 トウイーン２０及びチメロサール
を含むＰＢＳ 中に稀釈されたパーオキシダーゼ接合
ヤギ抗−ヒ）ＩｇＭ抗体（りが〕合計５０〜１００μ！
を加え、そじてこの混合物を室温又は４０℃にて３０分
間インキュベートしそして５回まで洗浄した。次に、細
菌ＥＬＩＳＡについて記載したＡＢＴＳパーオキシダー
ゼ基質合計２００μ！を各ウェルに加えた。混合物を３
７℃にて３０分間暗中でインキュベートシ、そしてタボ
のスタンダー１′に対してららかしめ標準化したプール
されたヒト−骨髄腫（チャペル）をＩｇＭスタンダード
として用いて、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＯＤ４ｏ
５）上で読み取った。
市販のＥ、コリＪ５及びＳ、ミネソタＲｅ５９５のＬＰ
Ｓ（リストバイオロゾカルス社又はリピイムノケムリサ
ーチ社から入手される）を用いて上記のようにしてＥＬ
ＩＳＡにより培養上清を測定した。陽性クローンを軟寒
天中で又は限界稀釈によりサブクローニングし、そして
およそ２週間後に再測定した。
Ｓ（リストバイオロゾカルス社又はリピイムノケムリサ
ーチ社から入手される）を用いて上記のようにしてＥＬ
ＩＳＡにより培養上清を測定した。陽性クローンを軟寒
天中で又は限界稀釈によりサブクローニングし、そして
およそ２週間後に再測定した。
限界稀釈クローニングは、９６ウエルＵ底プレート中、
２０ ％ ＦＢＳを含むイスコベＤＭＥ培地中で行った
。軟寒天クローニングのため、２０チウシ胎児血清を含
むイスコベＤＭＥ培地中に調製された０、３３係アガロ
ース（ＦＭＣ社）１−中１０００細胞を、６０ｍの培養
皿中４−のアガロース（０，４％）のベッド上にプレー
トした。
２０ ％ ＦＢＳを含むイスコベＤＭＥ培地中で行った
。軟寒天クローニングのため、２０チウシ胎児血清を含
むイスコベＤＭＥ培地中に調製された０、３３係アガロ
ース（ＦＭＣ社）１−中１０００細胞を、６０ｍの培養
皿中４−のアガロース（０，４％）のベッド上にプレー
トした。
非生産性期セルライン又は高生産性ノ・イブリドの選択
はリバーズーデシーク法（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｌａｑｕ
＠ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）を用いて行った。グロノピッ
ク等、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ一
方法に従って軟寒天の上層に、プロティンＡをコートし
たヒツジ赤血球（１，０係）を加えた。
はリバーズーデシーク法（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｐｌａｑｕ
＠ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ）を用いて行った。グロノピッ
ク等、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジ一
方法に従って軟寒天の上層に、プロティンＡをコートし
たヒツジ赤血球（１，０係）を加えた。
拡張するために抗−Ｒｅ及び抗−５５抗体の力価に基い
て１６個のバイブリドを選択し、そしてさらに試験した
。
て１６個のバイブリドを選択し、そしてさらに試験した
。
これらのバイブリドから生産された１６のヒトモノクロ
ーナル抗体を上記のＩｇＭ ＥＬＩ ＳＡを用いてタイ
プ分けした。すべてがＩｇＭクラスであった。
ーナル抗体を上記のＩｇＭ ＥＬＩ ＳＡを用いてタイ
プ分けした。すべてがＩｇＭクラスであった。
すべてのバイブリドをクローン化した。これらはスペン
ト培地−当Ｆ）１０１１１よシ多くの抗体を安定に生産
する。第１表は、リビイムノケムリサーチ社から市販さ
れている種々の精製されたコアーリは、ＬＰＳに結合し
ないがしかしＰ、アエルギノーサ（Ｐ、 ａｅｒｕｇｉ
ｎｏｓａ） ）キシンＡとは結合するネガティブ対照ヒ
トモノクローナル抗体である。第２表は、リビイムノチ
ムリサーチ社から市販されている程々のラフ変異細菌へ
のこれらのモノクローナル抗体の結合を示す。第３表は
、種々の画面症性グラム陰性臨床分離株へのこれら同じ
抗体の結合を示す。この一連の１６種類の抗体は多数の
異る結合ノぐターンを示す。
ト培地−当Ｆ）１０１１１よシ多くの抗体を安定に生産
する。第１表は、リビイムノケムリサーチ社から市販さ
れている種々の精製されたコアーリは、ＬＰＳに結合し
ないがしかしＰ、アエルギノーサ（Ｐ、 ａｅｒｕｇｉ
ｎｏｓａ） ）キシンＡとは結合するネガティブ対照ヒ
トモノクローナル抗体である。第２表は、リビイムノチ
ムリサーチ社から市販されている程々のラフ変異細菌へ
のこれらのモノクローナル抗体の結合を示す。第３表は
、種々の画面症性グラム陰性臨床分離株へのこれら同じ
抗体の結合を示す。この一連の１６種類の抗体は多数の
異る結合ノぐターンを示す。
１、幾つかの抗体はコア抗原決定基のみを認識し：
２、幾つかはコア抗原決定基、及び幾つかのスムースリ
ポポリサッカライド分子上に存在する決定基を認識し：
そして、 ３、幾つかの抗体はコア抗原決定基に対してのみならず
全体細菌（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）上に存在する〇−抗
原決定基に対して広い交差反応性を示す。
ポポリサッカライド分子上に存在する決定基を認識し：
そして、 ３、幾つかの抗体はコア抗原決定基に対してのみならず
全体細菌（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）上に存在する〇−抗
原決定基に対して広い交差反応性を示す。
以下余白
抗＃Ｄ２５０はＪ５ Ｅ、コリ（ＲＣ）コア決定基忙の
み結合し、他のコアーリポポリサッカライド及びラフ変
異測音に対する結合は最小である。この抗体はＥ、コリ
の臨床分離株にスポット状に結合する。抗体Ｄ２４４は
Ｅ、コ１ＪＪ５及びサルモネラ・ミネソタＲ５９５のＬ
ＰＳ並びＫこれらの細菌に結合するが、他のいずｎの細
菌又はリポポリサッカライドにも結合しない。抗体Ｄ２
３４及びＤ２６７はラフ−リポポリサッカライド及びリ
ピドＡに対するかなりの結合を示し、臨床分離株にス／
、ト状に結合する。“Ｌ”シリーズ及び”Ｗ”シリーズ
の抗体は、結合パターンにわずかな１ホール″を伴って
、ラフ−リポポリサッカライドに対する高い結合性を示
す。“Ｌ ’ ７１Ｊ−ズ内の抗体は一層高い親和性を
もって一層多くの臨床分離株に結合する。一般に、最も
高いコアＬＰＳ又はラフ細菌結合性を示１ す
モノクローナル抗体は、臨床分離株に対する最大の交差
反応性を示す。
み結合し、他のコアーリポポリサッカライド及びラフ変
異測音に対する結合は最小である。この抗体はＥ、コリ
の臨床分離株にスポット状に結合する。抗体Ｄ２４４は
Ｅ、コ１ＪＪ５及びサルモネラ・ミネソタＲ５９５のＬ
ＰＳ並びＫこれらの細菌に結合するが、他のいずｎの細
菌又はリポポリサッカライドにも結合しない。抗体Ｄ２
３４及びＤ２６７はラフ−リポポリサッカライド及びリ
ピドＡに対するかなりの結合を示し、臨床分離株にス／
、ト状に結合する。“Ｌ”シリーズ及び”Ｗ”シリーズ
の抗体は、結合パターンにわずかな１ホール″を伴って
、ラフ−リポポリサッカライドに対する高い結合性を示
す。“Ｌ ’ ７１Ｊ−ズ内の抗体は一層高い親和性を
もって一層多くの臨床分離株に結合する。一般に、最も
高いコアＬＰＳ又はラフ細菌結合性を示１ す
モノクローナル抗体は、臨床分離株に対する最大の交差
反応性を示す。
他の試験において、幾つかの′″Ｌ”及び＠Ｄ“シリー
ズの抗体クローン、０２５３クローン対照、並びに１９
８３年１１月８目出願の米国特許出願屋５５０．２６１
の代表的な抗体５２６１を精製さｎたコアＬＰＳが全体
細胞へのそ几らの結合性について、前記の細菌ＥＬＩＳ
Ａ試験を用いて評価した。精製さｎたコアＬＰＳ及び全
体細胞を用いる評価の結果を、精製さｎｆｃｒ、ｐｓに
ついては第４表及び第５表に、そして全体細胞について
は第６表に示す。
ズの抗体クローン、０２５３クローン対照、並びに１９
８３年１１月８目出願の米国特許出願屋５５０．２６１
の代表的な抗体５２６１を精製さｎたコアＬＰＳが全体
細胞へのそ几らの結合性について、前記の細菌ＥＬＩＳ
Ａ試験を用いて評価した。精製さｎたコアＬＰＳ及び全
体細胞を用いる評価の結果を、精製さｎｆｃｒ、ｐｓに
ついては第４表及び第５表に、そして全体細胞について
は第６表に示す。
以下、１７白
他の実験において、抗体Ｄ２３４及び比較抗体８２６１
ｔ１″種々のｆｉ製さｎたコアＬＰＳ Ｋ対して試験し
た。結果を第５表に示す。
ｔ１″種々のｆｉ製さｎたコアＬＰＳ Ｋ対して試験し
た。結果を第５表に示す。
第５表
コアーリポポリサッカライド
抗体 Ｅ、コリ Ｓ、ミネンタ Ｅ、コリ Ｓ
、ミネンタＲｅＬＰＳ ＲｅＬＰＳ Ｒｅリピ
ドＡ ＲｅリピドＡＤ２３４ ７
−” 本：数値はモノクローナル抗体結合性を示す。
、ミネンタＲｅＬＰＳ ＲｅＬＰＳ Ｒｅリピ
ドＡ ＲｅリピドＡＤ２３４ ７
−” 本：数値はモノクローナル抗体結合性を示す。
−はスケール上で９を超える最も強い結合を示す。
上記の細菌ＥＬＩＳＡ試験を用いて、全体細菌Ｅ、コリ
Ｊ５及びＳ、ミネ７りＲｅ５９５ Ｋ対して抗体Ｄ２３
４．１１ 及び５２６１を試験した。結果を
第６表に示す。
Ｊ５及びＳ、ミネ７りＲｅ５９５ Ｋ対して抗体Ｄ２３
４．１１ 及び５２６１を試験した。結果を
第６表に示す。
以下余白
第６表
全体細菌
抗 体 Ｅ、コリ Ｓ、ミネンタＲ
ｅＬＰ８ ＲｅＬＰＳ Ｄ２３４ −＊ −＊：第
５表を参照のこと。
ｅＬＰ８ ＲｅＬＰＳ Ｄ２３４ −＊ −＊：第
５表を参照のこと。
第１表〜第６表の結果は、この発明に従って製造さｎる
モノクローナル抗体のすべて（Ｌｌ１６−２−４を除く
；この抗体はその性質の観点から本発明の部分ではない
）がこの発明において定義される結合標準に合致するこ
とを示している。こ几らｈｇ。
モノクローナル抗体のすべて（Ｌｌ１６−２−４を除く
；この抗体はその性質の観点から本発明の部分ではない
）がこの発明において定義される結合標準に合致するこ
とを示している。こ几らｈｇ。
コリＲｃ及び／又はＳ、ミネソタのＲｅのＬＰＳの精製
されたリピドＡ抗原決定基に強く結合しく第１表、第４
表及び第５表）、そしてこルらは無傷のＬＰＳ （第３
表）及び全体細胞中（第６表）のこれらの決定基に結合
する。こｎに対して、第４表及び第５表は、８２６１比
較抗体がＥ、コＩＪＲｃ及び／又はＳ、ミネンタＲｅの
ｆｉ＃製さ几たリビト９Ａ決定基に結合せず、又は非常
に弱（（Ｄ２３４の強さの７分の１９結合することを示
している。
されたリピドＡ抗原決定基に強く結合しく第１表、第４
表及び第５表）、そしてこルらは無傷のＬＰＳ （第３
表）及び全体細胞中（第６表）のこれらの決定基に結合
する。こｎに対して、第４表及び第５表は、８２６１比
較抗体がＥ、コＩＪＲｃ及び／又はＳ、ミネンタＲｅの
ｆｉ＃製さ几たリビト９Ａ決定基に結合せず、又は非常
に弱（（Ｄ２３４の強さの７分の１９結合することを示
している。
中和実験において、上記のネガティブ対照抗体Ｄ−２５
３又はこの発明の抗体Ｄ２５０の〕・イブリドーマ培養
上清の１：ｌ稀釈物０．２１１１／をマクスに静脈内注
射した。４時間後、マクスに、Ｅ、コリＪ５コアＬＰＳ
細菌の７．１０倍稀釈物をｔｐによりチャレンジした。
３又はこの発明の抗体Ｄ２５０の〕・イブリドーマ培養
上清の１：ｌ稀釈物０．２１１１／をマクスに静脈内注
射した。４時間後、マクスに、Ｅ、コリＪ５コアＬＰＳ
細菌の７．１０倍稀釈物をｔｐによりチャレンジした。
ｌ稀釈当Ｉ）５匹のマクスを使用した。
この方法においては、生理食塩水中５％のブタ胃ムチン
の液０．５Ｉｎｌ中に細菌を懸濁し、これに１５ダのＤ
−ガラクトサミンを加えた。第７表は結果を示す。表中
、ＬＤ５Ｑはマクスの５０係が死ぬＬＰＳ細菌の致死量
である。
の液０．５Ｉｎｌ中に細菌を懸濁し、これに１５ダのＤ
−ガラクトサミンを加えた。第７表は結果を示す。表中
、ＬＤ５Ｑはマクスの５０係が死ぬＬＰＳ細菌の致死量
である。
第７表
モノクローナル抗体 ＬＤｓｏ 対照と比較した
場合のＬＤ５０の倍数 ０２５３（対照） ９．８ｘ１０’Ｄ２５０
２．５刈０６２に の結果は、この発明のＤ２５０抗体が、マクスにおいて
、Ｅ、コリＪ５のエンドトキシンコア決定基に対して、
ネガティブ対照抗体Ｄ２５３に比較して統計的に有意に
高い保護活性を有することを示しておシ、この発明の抗
体の中和又はブロッキング性を示している。
場合のＬＤ５０の倍数 ０２５３（対照） ９．８ｘ１０’Ｄ２５０
２．５刈０６２に の結果は、この発明のＤ２５０抗体が、マクスにおいて
、Ｅ、コリＪ５のエンドトキシンコア決定基に対して、
ネガティブ対照抗体Ｄ２５３に比較して統計的に有意に
高い保護活性を有することを示しておシ、この発明の抗
体の中和又はブロッキング性を示している。
２つのハイブリドーマ（Ｄ２３４及び２６７）ｔ−、モ
ノクローナル抗体の大規模な一層再現性のある撹拌培養
生産のために無血清培地中で増殖及び維持できるように
適合させた。次の段階的方法を用いた。
ノクローナル抗体の大規模な一層再現性のある撹拌培養
生産のために無血清培地中で増殖及び維持できるように
適合させた。次の段階的方法を用いた。
１、サブカルテ為アーの２日前に、細胞にそｎらが増殖
しているイスコペＤＭＥの混合物、それらが増殖してい
る培地中５０％量のＦＢＳ 、及び５０重量％のペント
レックスから供給さｎる無血清培地ｆ（Ｌ−１又はハラ
バイオケミカルスから供給さｎるＨＢ１０４を供給した
。
しているイスコペＤＭＥの混合物、それらが増殖してい
る培地中５０％量のＦＢＳ 、及び５０重量％のペント
レックスから供給さｎる無血清培地ｆ（Ｌ−１又はハラ
バイオケミカルスから供給さｎるＨＢ１０４を供給した
。
２．２日後、又は・・イブリドーマ細胞が８×１０５〜
ｌ Ｘ １０’細胞／ｄの濃度に達した時、５０チのイ
スコペｍ培地及び５０％の無血清培地によりサプカルテ
為γ〜しそして植えｆｃ、２０ｐＸ、ＦＫて５分間遠心
分離することＫよシ後者の培地から細胞を取シ出した。
ｌ Ｘ １０’細胞／ｄの濃度に達した時、５０チのイ
スコペｍ培地及び５０％の無血清培地によりサプカルテ
為γ〜しそして植えｆｃ、２０ｐＸ、ＦＫて５分間遠心
分離することＫよシ後者の培地から細胞を取シ出した。
イスコペの閲培地を５０俤の無血清培地と混合して５０
二５０混合物を形成し、これに細胞ペレットを懸濁し
そして計数した。適当量の細胞懸濁液を５０係イスコベ
菫及び５０チ無血清培地を有する容器中に植えた。植え
らルた細胞の濃度は好ましくは５ＸＩＯ’！胞／プよシ
低くなくセしてｌ×１０５ａ胞／ｄを超えない。
二５０混合物を形成し、これに細胞ペレットを懸濁し
そして計数した。適当量の細胞懸濁液を５０係イスコベ
菫及び５０チ無血清培地を有する容器中に植えた。植え
らルた細胞の濃度は好ましくは５ＸＩＯ’！胞／プよシ
低くなくセしてｌ×１０５ａ胞／ｄを超えない。
３、植えて２〜３日後、又は細胞濃度が８×１０５〜Ｉ
Ｘ １０’細胞／ｄに達した後、細胞に５０係イスコ
ペＤＭＡ及び５０チ無血清培知を供給した。
Ｘ １０’細胞／ｄに達した後、細胞に５０係イスコ
ペＤＭＡ及び５０チ無血清培知を供給した。
４、段階３ｔ−他の継代のために反復した。
５、培養中２〜３日の後、又は細胞濃度が８×、１
１０〜ｌＸ１０細胞／ｄに達し、そして生存が約８
５チとなったとき、細胞を無血清培地のみに培養した。
１０〜ｌＸ１０細胞／ｄに達し、そして生存が約８
５チとなったとき、細胞を無血清培地のみに培養した。
細胞がはじめて無血清培地に移植さｎた後、細胞濃度は
ＩＸＩ Ｏ〜８−９ＸｌＯ細胞／１ｒＬｌであった。
ＩＸＩ Ｏ〜８−９ＸｌＯ細胞／１ｒＬｌであった。
第゛１図は無血清培地ＨＬ−１（ペントレックス〕中で
のＤ−２３４の増殖曲線を示す。第２図は、無血清培地
）ＩＢ１０４（ハナバイオケミカルス）中でのＤ−２６
７細胞の増殖曲線を示す。こｎらの条件下で、５０〜７
５μＩ／ＩＩＬＩという多量の特異的モノクローナル抗
体が製造さｎた。
のＤ−２３４の増殖曲線を示す。第２図は、無血清培地
）ＩＢ１０４（ハナバイオケミカルス）中でのＤ−２６
７細胞の増殖曲線を示す。こｎらの条件下で、５０〜７
５μＩ／ＩＩＬＩという多量の特異的モノクローナル抗
体が製造さｎた。
Ｎｅ１ｌｅ＋ｓ及びＮｌｓｗａｎｄｅｒの先行研究（１
９８４）インフェクン、ン・アンド・イムニティー（Ｉ
ｎｆｅｃｔ。
９８４）インフェクン、ン・アンド・イムニティー（Ｉ
ｎｆｅｃｔ。
Ｉｍｍｕｎ、）４６ ：６７７−６８１．並びにＭｕｔ
ｈａｒｌａ等（１９８４）インフェクシ、７・７：／ド
・イムニティ＝ （Ｉｎｆｅｃｔ−Ｉｍｍｕｎ、 ）
４５ ： ６３１−６３６は、Ｅ、コリのＲｅ−Ｊ５変
異株と反応性のマウスモノクローナル抗体が他のグラム
陰性細菌種との顕著な交差反応性を有することを示した
。
ｈａｒｌａ等（１９８４）インフェクシ、７・７：／ド
・イムニティ＝ （Ｉｎｆｅｃｔ−Ｉｍｍｕｎ、 ）
４５ ： ６３１−６３６は、Ｅ、コリのＲｅ−Ｊ５変
異株と反応性のマウスモノクローナル抗体が他のグラム
陰性細菌種との顕著な交差反応性を有することを示した
。
この発明の研究は、ＬＰＳコア領域の交差反応性決定基
（生物学的に反応性のリピドＡ成分に関連するものを包
含する）と反応するヒトモノクローナル抗体を生成せし
めることが可能であることを示す。こｎらの抗体の１つ
又は複数がグラム陰性敗血症における新規な療法剤とし
て有用であろう。
（生物学的に反応性のリピドＡ成分に関連するものを包
含する）と反応するヒトモノクローナル抗体を生成せし
めることが可能であることを示す。こｎらの抗体の１つ
又は複数がグラム陰性敗血症における新規な療法剤とし
て有用であろう。
１６種類のバイブリドの内Ｄ２３４ 、 Ｄ２６７、及
び“Ｗ″シリーズら生産された抗体が最良であると考え
ら几たため、アメリカン・タイプ・カルチエアー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）、 １２３０１ノ９−クラクンド
ライブ、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡに寄託され
た。寄託日及び番号は次の通シである。
び“Ｗ″シリーズら生産された抗体が最良であると考え
ら几たため、アメリカン・タイプ・カルチエアー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）、 １２３０１ノ９−クラクンド
ライブ、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡに寄託され
た。寄託日及び番号は次の通シである。
ハイブリドーマ 寄 託 日 番 号２３４
−４−２７−８ １９８４年８月ｌＯ日 ＨＢ ８
５９８２６７−２２−４９ １９８４年８月２３日
ＨＢ ８６０７ＷＩ−３Ａ １９８５年２
月２８日 ＨＢ ８７３５ＷＩ−４Ａ １
９８５年２月２８日 ＨＢ ８７３３ＷＩ−５Ａ
１９８５年２月２８日 ＨＢ ８７３６ＷＩ
−６Ｄ １９８５年２月２８日 ＨＢ ８
７３４さらに、こｎらのハイプリド−マのもとであるマ
クス×ヒト融合・９−トナーＦ３Ｂ６ （９９チ無血清
培地に適合されている） ｉ ＡＴＣＣＫ寄託した。
−４−２７−８ １９８４年８月ｌＯ日 ＨＢ ８
５９８２６７−２２−４９ １９８４年８月２３日
ＨＢ ８６０７ＷＩ−３Ａ １９８５年２
月２８日 ＨＢ ８７３５ＷＩ−４Ａ １
９８５年２月２８日 ＨＢ ８７３３ＷＩ−５Ａ
１９８５年２月２８日 ＨＢ ８７３６ＷＩ
−６Ｄ １９８５年２月２８日 ＨＢ ８
７３４さらに、こｎらのハイプリド−マのもとであるマ
クス×ヒト融合・９−トナーＦ３Ｂ６ （９９チ無血清
培地に適合されている） ｉ ＡＴＣＣＫ寄託した。
寄託日及び番号は次の通シである。
融合パートナ−寄 託 日 番 号Ｆ３Ｂ６
１９８５年４月１８日 ＨＢ ８７８５
これらの寄託はＡＴＣＣと本出願の出願人でろるシタス
・コーＩレーションとの契約により行われた。ＡＴＣＣ
との契約は、これらのセルラインの子孫の入手可能性を
、いずれが先に到来するにしろ、該寄託を記載しそして
特定している米国特許が与えられた後又は米国もしくは
外国の特許出願が公衆に対して公告又は公開された後、
公衆に対して与え、そしてこれらのセルラインの子孫の
入手可能性を、３５ＵＳＣ１ｌ ２２及びこれに基く長
官規則（８８６０Ｇ ６３８への特別の言及を伴う３
７ＣＦＲ１１１４ｔ−含む）に基いて米国特許商標局長
官により決定された者に与える。この特許出願の出願人
は、寄託されているセルラインが適切な条件下で培養さ
れた場合に死滅しもしくは失われ又は破壊されたなら、
それらは通知の俊速やかに同じセルラインの生存培養物
で置き換えられるであろうことを承諾する。
１９８５年４月１８日 ＨＢ ８７８５
これらの寄託はＡＴＣＣと本出願の出願人でろるシタス
・コーＩレーションとの契約により行われた。ＡＴＣＣ
との契約は、これらのセルラインの子孫の入手可能性を
、いずれが先に到来するにしろ、該寄託を記載しそして
特定している米国特許が与えられた後又は米国もしくは
外国の特許出願が公衆に対して公告又は公開された後、
公衆に対して与え、そしてこれらのセルラインの子孫の
入手可能性を、３５ＵＳＣ１ｌ ２２及びこれに基く長
官規則（８８６０Ｇ ６３８への特別の言及を伴う３
７ＣＦＲ１１１４ｔ−含む）に基いて米国特許商標局長
官により決定された者に与える。この特許出願の出願人
は、寄託されているセルラインが適切な条件下で培養さ
れた場合に死滅しもしくは失われ又は破壊されたなら、
それらは通知の俊速やかに同じセルラインの生存培養物
で置き換えられるであろうことを承諾する。
第１図は、無血清培地ＨＬ −１（ペントレックスラプ
ス、ポートランド、Ｍ＠）攪拌培養におけるＤ−２３４
細胞の増殖曲線を示す。 第２図は、無血清培地ＨＢ１０４ （ハナバイオケミカ
ルス、パークレー、カリホルニア）攪拌培養におけるＤ
−２６７ｍ胞の増殖曲線を示す。
ス、ポートランド、Ｍ＠）攪拌培養におけるＤ−２３４
細胞の増殖曲線を示す。 第２図は、無血清培地ＨＢ１０４ （ハナバイオケミカ
ルス、パークレー、カリホルニア）攪拌培養におけるＤ
−２６７ｍ胞の増殖曲線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｃ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基を強く結合し； （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する； ことを特徴とする抗体。 ２、ＩｇＭであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の抗体。 ３、ヒト又はラットに由来することを特徴とする特許請
求の範囲第１項又は第２項記載の抗体。 ４、ハイブリドーマＨＢ８５９８、ＨＢ８６０７、ＨＢ
８７３５、ＨＢ８７３３、ＨＢ８７３６もしくはＨＢ８
７３４により生産されたヒト由来の抗体又はその機能的
同等物であることを特徴とする特許請求の範囲第１項又
は第２項記載の抗体。 ５、（ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｃ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基に強く結合し、 （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する；抗体を生産することを特徴とする安定な永久的ハ
イブリドーマセルライン。 ６、ＨＢ８５９８、ＨＢ８６０７、ＨＢ８７３５、ＨＢ
８７３３、ＨＢ８７３６又はＨＢ８７３４であることを
特徴とする請求の範囲第５項記載のハイブリドーマセル
ライン及びその子孫。 ７、菌血症又は敗血症を処置するための組成物であって
、次の性質すなわち、 （ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｃ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基に強く結合し； （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する；を有する抗体の治療的有効量を医薬として許容さ
れる非経腸的担体と共に含んで成る組成物。 ８、菌血症又は敗血症を処置するための組成物であって
、次の性質すなわち、 （ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｃ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基に強く結合し； （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する；を有する多数の個々の抗体であってそのそれぞれ
が異る決定基に結合するものの治療的有効量を医薬とし
て許容される非経腸的担体と共に含んでなる組成物。 ９、グラム陰性菌血症又は敗血症の哺乳動物患者の処置
方法であって、次の性質すなわち、（ａ）その集団が実
質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｅ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基に強く結合し； （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する；を有する抗体の有効量を該患者に非経腸的に投与
することを特徴とする方法。 １０、グラム陰性菌血症又は敗血症の哺乳動物患者の処
置方法であって、次の性質すなわち、（ａ）その集団が
実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｃ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基に強く結合し； （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する；を有する抗体の治療的有効量を医薬として許容さ
れる非経腸的担体と共に含んで成る組成物の有効量を前
記患者に非経腸的に投与することを特徴とする方法。 １１、グラム陰性菌血症又は敗血症の哺乳動物患者の処
置方法であって、次の性質すなわち、（ａ）その集団が
実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｒｃ変異株又はサルモ
ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｒｅ変異株の細胞壁リポ
ポリサッカライド（ＬＰＳ）のリピドＡにより規定され
る決定基に強く結合し； （ｃ）無傷のＬＰＳ中又は全体グラム陰性細菌中のＥ．
コリＲｃ変異株リピドＡ決定基又はサルモネラＲｅ変異
株リピドＡ決定基に結合し；そして、（ｄ）グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロック
する；を有する多数の個々の抗体であってそのそれぞれ
が異る決定基に結合するものの治療的有効量を医薬とし
て許容される非経腸的担体と共に含んでなる組成物の有
効果を前記患者に非経口的に投与することを特徴とする
方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64761184A | 1984-09-05 | 1984-09-05 | |
| US72782185A | 1985-04-26 | 1985-04-26 | |
| US727821 | 1985-04-26 | ||
| US647611 | 1985-04-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6172800A true JPS6172800A (ja) | 1986-04-14 |
| JPH0659233B2 JPH0659233B2 (ja) | 1994-08-10 |
Family
ID=27095206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60194981A Expired - Lifetime JPH0659233B2 (ja) | 1984-09-05 | 1985-09-05 | グラム陰性細菌エンドトキシンをブロツクするモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0174204B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0659233B2 (ja) |
| DE (1) | DE3584705D1 (ja) |
| DK (1) | DK405785A (ja) |
| FI (1) | FI853395L (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5179018A (en) * | 1983-10-14 | 1993-01-12 | Centocor, Inc. | Mamalian monoclonal antibodies against endotoxin of gram-negative bacteria |
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