RU2003682C1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS L. - продуцент моноклональных антител к @ -легким цеп м иммуноглобулинов человека - Google Patents

Abstract

Использование: биотехнологи  иммунологи , медицина. Сущность изобретени : гибридный штамм, продуцирующий моноклональные антитепа к X -легким цеп м иммуноглобулинов чеповекэ, получен при гибридазации клеток спезенки мышей BALB/C, иммунизированных препаратом IgG человека , с клетками миеломной линии Sp2/OAg14 Штамм обозначен Е5 и хранитс  под номером ВСКК(П) М564Д Продуктивность штамма составл ет 5-10 мкг/мп антител в культуральной жидкости и 5 мг/мп в асцитической. Моноклональные антитела специфически св зываютс  с Л -легкими цеп ми иммуноглобулинов человека.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и может быть использовано дл  структурных и функциональных исследований иммуноглобулина человека, клинической диагностики р да патологических состо ний , св занных с моноклональной протеи- немией и протеинурией. Получение больших количеств таких антител возможно только с помощью гибридомной технологии . В литературе имеютс  сообщени  о получении мышиных моноклональных антител к Я-цеп м иммуноглобулинов человека. Но кажда  вновь слита  гибридома  вл етс  новой пс определению, так как синтезируемые ею моноклональные антитела индивидуальны по первичной структуре, специфичности по отношению к данной детерминанте , аффинности, цитотоксичности, гемагглютинирующим и другим свойствам. Получение набора антител к разным антигенным детерминантам иммуноглобулинов расшир ет возможности иммунологических методов исследований.

Целью изобретени   вл етс  получение гибридомного штамма , продуцируемого моноклональные антитела к А -легким цеп м иммуноглобулинов человека, пригодные дл  использовани  в различных видах биохимических и иммунологических исследований .

Происхождение штамма. Дл  иммунизации использовали мышей BALB/C. Антиген - IgG (выделенный из сыворотки крови больного аденокарциномой желудка методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-трисакриле М) вводили внутрибрюшинно в количестве 100 мкг в забуференном физрастворе с полным адъю- взнтом Фрейнда. Иммунизацию проводили через мес ц таким же количеством антигена , но без адыованта. Через 4 недели после второй иммунизации мышам вводили 100 мкг препарата внутривенно. Через З.дн  у животных определ лс  титр антител к антигену , используемому дл  иммунизации, методом иммуноферментного анализа, Мышь с лучшим иммунным ответом использовали дл  получени  гибридомы. Дл  этого 10 клеток селезенки иммунной мыши гибриди- зовали с 4 107 клеток миеломы Sp 2/0 Ад 14 в присутствии 50%-ного раствора по- лиэтиленгликол  с мол. мае. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевали в 96-луначные планшеты по 105 клеток на лунку. В качестве питающего сло  использовали перитонеальные макрофаги мыши, которые высевали по 10 клеток на лунку за сутки до гибридизации. Дл  культивировани  и селекции гибридомы использовали

среду RPMJ-1540 с добавлением 20% фе- тальной бычьей сыворотки, 10 М гипоксан- тина, 4 М аминоптерина и 1,6 М тимидина. Гибридому клонировали 2 раза

методом лимитирующего разведени  (из расчета 1 клетка на 3 лунки 96-луночного планшета). После второго клонировани  более 90% полученных субклонов продуцировали антитела к легким - цеп м

иммуноглобулинов человека. Продукци  антител сохран лась в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных. Среда дл  культивировани  - среда RPMJ-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки . 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Посевна  доза 10 клеток в 1 мл. Через 2-3 дн  концентраци  антитела в культуральной жидкости достигала примерно 40 мкг/мл,

Контаминации бактери ми, грибками и микроплазмами на обнаружено.

Дл  длительного хранени  гибридом- ные клетки могут быть заморожены в фетальной бычьей сыворотке с добавлением

ю% диметилсульфоксида. Способ криокон- сервировани  -сутки при -70°С, затем клетки перенос тс  в жидкий азот. Размораживают клетки, перенос  ампулу жидкого азота в вод ную баню на 37°С.

Дл  выращивани  гибридомы в асцит- ной форме клетки вводили в брюшную полость мышей BALB/c (предварительно обработанных внутрибрюшинно тетраме- тилпентадеканом) в количестве 107 клеток

на мышь. Опухоли развивались у мышей через 10-14 дней. Секреци  антител клетками гибридомы, выращиваемой в асцитной форме , сохран лась в течение 25 пассажей на животных.

Гибридома получила условное название Е5. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом Е5, относ тс  к первому подклассу мышиных IgG и взаимодействуют с легкими А - цеп ми иммуноглобулинов человека . Принадлежность к подклассу определ ли при помощи преципитирующих антисывороток к мышиным IgG разных подклассов (Sigma, США) методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Взаимодействи  антител с легкими А -цеп ми иммуноглобулинов человека определ ли методом иммуноферментного анализа.

Пример. Гибридомные клетки помещали в пластиковый флакон площадью 25

см2 по5 10% клетокв5млсредыРРМи-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сывороткой , 2 мМ глутамина. 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивировали 3-4 дн  при 37°С в

атмосфере, содержащей 5% С02- Культу- ральную среду собирали, центрифугировали 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий моноклональные антитела к легким - цеп м иммуноглобулинов человека, использовали в иммуноферментном анализе . В качестве антигенов вносили белки Бенс-Джонса (выделенные из мочи больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) и различные монокло- нальные иммуноглобулины с известным типом легких цепей (выделенные из крови больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) в концентрации 10 мкг/мл бикарбонатном буферном растворе по 50 мкл в лунку на 96-луночном пластиковом планшете. Инкубировали в течение 60 мин при 37°С, затем сливали и вносили по ЮОмкл в лунку 1 % раствор бычьего сывороточного альбумина на 60 мин при 37°С. После окончани  инкубации раствор альбумина сливали, планшет промывали холодной водой и забуференным физраствором м 0,05% твином (PBST), вносили супернатант культуральной среды по 50 мл в лунку и инкубировали при 37°С. Через 60 мин все сливали, промывали холодной водой и PBST, добавл ли по 50 мкл коньюгата

антител к IgG мыши с пероксидэзой в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубировали при 37°С 60 мин. После тщательной промывки в лунки вносили субстрат - 2,2- аэино-ди- 3-этилбензитиаэолинсульфонат /б/ (ABTS) в 0,05 М цитратном буфере с добавлением перекиси водорода и инкубировали на шейкере при комнатной температуре (21°С) в течение 30 мин, после чего оценивали результат на спектрофотометре Multlskan (Flow, Великобритани ) при длине волны 405 нм.

Получены следующие данные, выраженные в процентах от максимальной экс- тинкции (1,0 - 100%): легкие Я- цепи иммуноглобулинов человека 100: легкие А- цепи иммуноглобулинов человека 0.

Таким образом, было показано, что гиб- ридома Е5 продуцирует моноклональные антитела, взаимодействующие с легкими А- цеп ми иммуноглобулинов человека. Получен новый по определению, патентоспособный штамм клеток.

(56)Пивень Н.8.,Вигдорович И.П. 1-й Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи, но брь , 1989).Тез. докл. 1989. т.1, с. 167.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК (П)

   30

   М564Д - продуцент моноклональных антител к А - легким цеп м иммуноглобулинов человека.