JPH0659233B2 - グラム陰性細菌エンドトキシンをブロツクするモノクローナル抗体 - Google Patents
グラム陰性細菌エンドトキシンをブロツクするモノクローナル抗体Info
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- JPH0659233B2 JPH0659233B2 JP60194981A JP19498185A JPH0659233B2 JP H0659233 B2 JPH0659233 B2 JP H0659233B2 JP 60194981 A JP60194981 A JP 60194981A JP 19498185 A JP19498185 A JP 19498185A JP H0659233 B2 JPH0659233 B2 JP H0659233B2
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- C07K16/1235—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Salmonella (G)
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- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は生物工学の分野に属し、そして体細胞ハイブ
リダイゼーション及び免疫学に関する。
リダイゼーション及び免疫学に関する。
さらに詳しくは、この発明は、グラム陰性細菌性エンド
トキシンに結合し、そしてその生物学的効果をブロック
するモノクローナル抗体、該抗体を生産するハイブリド
ーマセルライン、及び該抗体を用いるグラム陰性菌血症
及び敗血症の処置に関する。
トキシンに結合し、そしてその生物学的効果をブロック
するモノクローナル抗体、該抗体を生産するハイブリド
ーマセルライン、及び該抗体を用いるグラム陰性菌血症
及び敗血症の処置に関する。
グラム陰性細菌による菌血症は、実質的な数の年間死亡
をもたらす主要な公共的健康問題である。菌血症の症状
には、発熱、白血球減少症及び低血糖症、低血圧及びシ
ョック、必須器官の環流減少、Ｃ３及び補体カセットの
活性化、血管内凝集、並びに死亡が含まれる。
をもたらす主要な公共的健康問題である。菌血症の症状
には、発熱、白血球減少症及び低血糖症、低血圧及びシ
ョック、必須器官の環流減少、Ｃ３及び補体カセットの
活性化、血管内凝集、並びに死亡が含まれる。
菌血症のこれらの効果は感染生物のエンドトキシン〔細
胞壁リポポリサッカライド（LPS）〕に基くものとされ
る。これらのLPSは３つの領域、すなわちセロタイプ特
異的ポリサッカライド（Ｏ−抗原）、コアポリサッカラ
イド、及びリピドＡから構成される。Ｏ−抗原領域はタ
イプ−特異的ハプテン決定基を決定する反復するオリゴ
サッカライドの組み合わせから構成される。コアー領域
は、ヘキソース（Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコー
ス、ガラクトース）の外側コア、並びにヘプトース、エ
タノールアミン及び２−ケト−３−デオキシオクトネー
ト（KDO）の内側コアから構成されている。この領域は
Ｏ−抗原領域に比べて細菌種間で不変的であるが、しか
し限定された種内及び種間差を示す。リピドＡはジグル
コサミン−４−ホスフェート、長鎖脂肪酸、及びエタノ
ールアミンから構成されている。KDOはリピドＡとコア
領域との間のリンクを形成する。
胞壁リポポリサッカライド（LPS）〕に基くものとされ
る。これらのLPSは３つの領域、すなわちセロタイプ特
異的ポリサッカライド（Ｏ−抗原）、コアポリサッカラ
イド、及びリピドＡから構成される。Ｏ−抗原領域はタ
イプ−特異的ハプテン決定基を決定する反復するオリゴ
サッカライドの組み合わせから構成される。コアー領域
は、ヘキソース（Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコー
ス、ガラクトース）の外側コア、並びにヘプトース、エ
タノールアミン及び２−ケト−３−デオキシオクトネー
ト（KDO）の内側コアから構成されている。この領域は
Ｏ−抗原領域に比べて細菌種間で不変的であるが、しか
し限定された種内及び種間差を示す。リピドＡはジグル
コサミン−４−ホスフェート、長鎖脂肪酸、及びエタノ
ールアミンから構成されている。KDOはリピドＡとコア
領域との間のリンクを形成する。
Ｏ抗原を欠損したグラム陰性細菌の変異株は、固体培地
上でスムースなコロニーを形成しないため“ラフ”形、
又は“Ｒ”形と称される。変異体LPSの幾つかのケモタ
イプ（chemotype）、例えばRa,Rb,Rc,Rd及びReが知られ
ている。ケモタイプRcにおいては、酵素UDP−ガラクト
ース−４−エピメラーゼが欠損しており、その結果ガラ
クトースではなくグルコースが合成され、そしてコアー
中に導入される。ReケモタイプはＯ領域及びコア領域か
らKDOまでを欠く。Ziegler、E.J.等、Ｅ．イング．Ｊ．
メド（N.Engl.J.Med.）（１９８２）３０７：１２２５
−１２３０は、健康な患者を熱殺菌したＪ５によりワク
チン処理することによる、Ｅ．コリRc変異株Ｊ５に対す
るヒト抗血清の調製を記載している。この抗血清は菌血
症を処置するために使用され、そしてLPSの生物学的活
性をブロックすることが知られている。
上でスムースなコロニーを形成しないため“ラフ”形、
又は“Ｒ”形と称される。変異体LPSの幾つかのケモタ
イプ（chemotype）、例えばRa,Rb,Rc,Rd及びReが知られ
ている。ケモタイプRcにおいては、酵素UDP−ガラクト
ース−４−エピメラーゼが欠損しており、その結果ガラ
クトースではなくグルコースが合成され、そしてコアー
中に導入される。ReケモタイプはＯ領域及びコア領域か
らKDOまでを欠く。Ziegler、E.J.等、Ｅ．イング．Ｊ．
メド（N.Engl.J.Med.）（１９８２）３０７：１２２５
−１２３０は、健康な患者を熱殺菌したＪ５によりワク
チン処理することによる、Ｅ．コリRc変異株Ｊ５に対す
るヒト抗血清の調製を記載している。この抗血清は菌血
症を処置するために使用され、そしてLPSの生物学的活
性をブロックすることが知られている。
Kohler,G.及びMilstein,C.、ネイチュアー（Nature）
（１９７５）２５６，４９５−４９７は、モノクローナ
ル抗体を生産する永久的ハイブリドーマを作るための体
細胞ハイブリダイゼーションの使用に途を開いた。これ
らの研究はネズミ由来の形質細胞腫及びリンパ球を使用
した。Matharia等、インフェクション・アンド・イムニ
ティー（Infect.Immun.）（１９８４）４５：６３１−
６３６；及びNelles等、インフェクション・アンド・イ
ムニティー（Infect.Immun.）（１９８４）４６：６７
７−６８１は、LPS交差反応性ネズミ−モノクローナル
抗体を記載している。
（１９７５）２５６，４９５−４９７は、モノクローナ
ル抗体を生産する永久的ハイブリドーマを作るための体
細胞ハイブリダイゼーションの使用に途を開いた。これ
らの研究はネズミ由来の形質細胞腫及びリンパ球を使用
した。Matharia等、インフェクション・アンド・イムニ
ティー（Infect.Immun.）（１９８４）４５：６３１−
６３６；及びNelles等、インフェクション・アンド・イ
ムニティー（Infect.Immun.）（１９８４）４６：６７
７−６８１は、LPS交差反応性ネズミ−モノクローナル
抗体を記載している。
これに続く研究者は、Kohler及びMilsteinの技法をヒト
細胞に適用することを報告している〔例えば、Croce,C.
M.等、ネイチュアー（Nature）（ロンドン）（１９８
０）２８８：４８８；及びOlsson,L.及びKaplan.H.S.、
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ〔PNAS(USA)〕（１９８０）７
７：５４２９〕。文献は種々の抗原に対して向けられた
ヒト−モノクローナル抗原の調製を報告している。EP4
4,722は、抗原で感作されたヒト脾臓Ｂ−リンパ球との
融合の後にモノクローナル抗体分泌性ヒト−ヒトモノク
ローナル抗体をもたらす変異体骨髄腫セルラインを記載
している。さらに、これは“病原性表面抗原”及び“毒
素”に対する抗体を作ることを示唆している。さらに、
Foung等、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソド
（Ｉ．Immun.Meth.）（１９８４）７０：８３−９０
は、ヒト−マウスハイブリドーマへの融合による、EBV
−形質転換Ｂセルラインからのヒトモノクローナル抗体
の生産を開示している。幾つかの融合の相手細胞が、D.
Buck等、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・
ファンクショナル・セル・ラインズ（Monoclonal Antib
odies and Fanctional Cell Lines）第１１章、R.kenne
tt編、プレナム・パブリッシング社、１９８４；及びLa
rrick及びBuck、バイオテクニクス（Biotecniques）
（１９８４）２：６−１４に記載されている。ヨーロッ
パ特許出願公開NO.107,528及びNO.105,804は、細菌毒素
に対するヒトモノクローナル抗体を生産することができ
るセルラインを記載している。さらに、GB2,086,937；B
G2,113,715；EP57,107；EP62,409；EP118,893；EP124,3
01；及びEP131,878はハイブリド細胞からのヒトモノク
ローナル抗体の製造に関する。さらに、１９８３年１月
１３日出願に係る米国特許出願NO.457,795は、ヒトモノ
クローナル抗体を生産するであろうセルラインを記載し
ている。
細胞に適用することを報告している〔例えば、Croce,C.
M.等、ネイチュアー（Nature）（ロンドン）（１９８
０）２８８：４８８；及びOlsson,L.及びKaplan.H.S.、
プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ス
テイツ・オブ・アメリカ〔PNAS(USA)〕（１９８０）７
７：５４２９〕。文献は種々の抗原に対して向けられた
ヒト−モノクローナル抗原の調製を報告している。EP4
4,722は、抗原で感作されたヒト脾臓Ｂ−リンパ球との
融合の後にモノクローナル抗体分泌性ヒト−ヒトモノク
ローナル抗体をもたらす変異体骨髄腫セルラインを記載
している。さらに、これは“病原性表面抗原”及び“毒
素”に対する抗体を作ることを示唆している。さらに、
Foung等、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソド
（Ｉ．Immun.Meth.）（１９８４）７０：８３−９０
は、ヒト−マウスハイブリドーマへの融合による、EBV
−形質転換Ｂセルラインからのヒトモノクローナル抗体
の生産を開示している。幾つかの融合の相手細胞が、D.
Buck等、モノクローナル・アンチボディーズ・アンド・
ファンクショナル・セル・ラインズ（Monoclonal Antib
odies and Fanctional Cell Lines）第１１章、R.kenne
tt編、プレナム・パブリッシング社、１９８４；及びLa
rrick及びBuck、バイオテクニクス（Biotecniques）
（１９８４）２：６−１４に記載されている。ヨーロッ
パ特許出願公開NO.107,528及びNO.105,804は、細菌毒素
に対するヒトモノクローナル抗体を生産することができ
るセルラインを記載している。さらに、GB2,086,937；B
G2,113,715；EP57,107；EP62,409；EP118,893；EP124,3
01；及びEP131,878はハイブリド細胞からのヒトモノク
ローナル抗体の製造に関する。さらに、１９８３年１月
１３日出願に係る米国特許出願NO.457,795は、ヒトモノ
クローナル抗体を生産するであろうセルラインを記載し
ている。
この発明の抗体は、Ｅ．コリ(E.coli)Rc変異株又はサル
モネラ(Salmonella)Re変異株の細胞壁リポポリサッカラ
イド（LPS）のリピドＡ又はその断片上の決定基に結合
し、Ｅ．コリRc変異株又はサルモネラRe変異株の全細胞
に結合し、ヒト由来であり、そして、グラム陰性細菌エ
ンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロックするこ
とを特徴とする。
モネラ(Salmonella)Re変異株の細胞壁リポポリサッカラ
イド（LPS）のリピドＡ又はその断片上の決定基に結合
し、Ｅ．コリRc変異株又はサルモネラRe変異株の全細胞
に結合し、ヒト由来であり、そして、グラム陰性細菌エ
ンドトキシンの不都合な生物学的効果をブロックするこ
とを特徴とする。
上記の抗体を生産する安定な永久ハイブリドーマセルラ
イン及びその子孫、並びにこのようなセルラインを形成
する、そして無血含培地に部分的に適合した特定のマウ
ス×ヒトＢ−リンパ球融合パートナーがこの発明の他の
観点である。
イン及びその子孫、並びにこのようなセルラインを形成
する、そして無血含培地に部分的に適合した特定のマウ
ス×ヒトＢ−リンパ球融合パートナーがこの発明の他の
観点である。
この発明はさらに、上記の抗体の１又は複数の医療的有
効量を含んでなる、菌血症又は敗血症を処置するための
組成物に関する。好ましい組成物は２以上の抗体を含ん
で成り、そのそれぞれが上記(b)において特定されたよ
うに位置する異なる決定基に結合する。このような組成
物の有効量を患者に投与することによりヒト患者におけ
る菌血症又は敗血症の処置方法もまた、この発明の部分
である。
効量を含んでなる、菌血症又は敗血症を処置するための
組成物に関する。好ましい組成物は２以上の抗体を含ん
で成り、そのそれぞれが上記(b)において特定されたよ
うに位置する異なる決定基に結合する。このような組成
物の有効量を患者に投与することによりヒト患者におけ
る菌血症又は敗血症の処置方法もまた、この発明の部分
である。
この発明のこれらの観点及び他の観点を以下に詳細に記
載する。
載する。
この明細書において“セルライン”とは、言及されるセ
ルラインに由来する限りにおいて、個々の細胞、収得さ
れた細胞、及び細胞を含有する倍養物を意味する。
ルラインに由来する限りにおいて、個々の細胞、収得さ
れた細胞、及び細胞を含有する倍養物を意味する。
この明細書においてハイブリドセルラインに関して使用
する“子孫”なる語は世代又は核型の同一性に関係な
く、そのセルラインのすべての誘導体、子、及び結果物
を含むことが意図される。
する“子孫”なる語は世代又は核型の同一性に関係な
く、そのセルラインのすべての誘導体、子、及び結果物
を含むことが意図される。
この明細書において“モノクローナル抗体”なる語は、
その集団が実質上均一である、すなわち抗体集団の個々
の抗体が天然に生ずる変異を除き同一である複数の抗体
から選ばれる１つの抗体を言う。
その集団が実質上均一である、すなわち抗体集団の個々
の抗体が天然に生ずる変異を除き同一である複数の抗体
から選ばれる１つの抗体を言う。
所与のモノクローナル抗体に関して“機能的に同等”と
は、言及されているモノクローナル抗体と同一の決定基
を認識し、そして該抗体を交差ブロックするモノクロー
ナル抗体を意味する。同一の又は異なる免疫グロブリン
クラスの抗体、及びモノクローナル抗体の抗原結合断片
〔例えば、Fab、F(ab′)2、Fv〕を含むことが意図され
る。
は、言及されているモノクローナル抗体と同一の決定基
を認識し、そして該抗体を交差ブロックするモノクロー
ナル抗体を意味する。同一の又は異なる免疫グロブリン
クラスの抗体、及びモノクローナル抗体の抗原結合断片
〔例えば、Fab、F(ab′)2、Fv〕を含むことが意図され
る。
抗体を患者に投与することに関して“処置”なる語は
“治療”及び／又は“予防”を意味する。
“治療”及び／又は“予防”を意味する。
ハイブリドセルラインの特徴付けに関して、“永久”及
び“安定な”なる語は、そのセルラインが長期間、典型
的には６ケ月以上にわたって生存し続け、そして約２５
継代以上にわたって特定のモノクローナル抗体を生産す
る能力を維持することを意味する。
び“安定な”なる語は、そのセルラインが長期間、典型
的には６ケ月以上にわたって生存し続け、そして約２５
継代以上にわたって特定のモノクローナル抗体を生産す
る能力を維持することを意味する。
LPSを記載することに関して、“インタクト”の（「int
act」又は「無傷の」）なる語は、LPSが“Ｏ”抗原炭水
化物を有することを意味する。
act」又は「無傷の」）なる語は、LPSが“Ｏ”抗原炭水
化物を有することを意味する。
“全（whole）グラム陰性細菌”とは、インタクト（int
act）のもしくはコアLPS、リピドＡ又はそのラフ変異部
分のみではなく、その構成部分のすべてを有する任意の
グラム陰性細菌を意味する。
act）のもしくはコアLPS、リピドＡ又はそのラフ変異部
分のみではなく、その構成部分のすべてを有する任意の
グラム陰性細菌を意味する。
この発明の機能的基準（特異的細菌結合性、エンドトキ
シンブロック性）に合致するモノクローナル抗体は、種
々の哺乳動物由来の細胞を用いて製造することができ
る。ラット及びヒトの具体例が行われた。抗体は、IgG
及びIgMを包含する任意のアイソタイプでよく、この明
細書においてはIgMタイプを特に例示する。ヒトの具体
例は、マウス×ヒト親ハイブリドセルライン及びエプス
タイン−バールウイルス（EBV）で形質転換されたヒトP
BL又は非免疫化志願者もしくは入手可能な細菌性ワクチ
ンもしくは不活性化グラム陰性細菌で免疫された志願者
からの脾臓細胞を用いる体細胞ハイブリダイゼーション
によって合成されたトリオーマ（trioma）の生産物であ
る。所望により、新鮮なPBL又は脾臓細胞（形質転換さ
れていない）を使用することができる。ラットの具体例
は、ラット骨髄腫セルライン及びＥ．コリRc変異株で免
疫されたラットからの脾臓細胞を用いる体細胞ハイブリ
ダイゼーションによって合成されたハイブリドーマの生
産物である。
シンブロック性）に合致するモノクローナル抗体は、種
々の哺乳動物由来の細胞を用いて製造することができ
る。ラット及びヒトの具体例が行われた。抗体は、IgG
及びIgMを包含する任意のアイソタイプでよく、この明
細書においてはIgMタイプを特に例示する。ヒトの具体
例は、マウス×ヒト親ハイブリドセルライン及びエプス
タイン−バールウイルス（EBV）で形質転換されたヒトP
BL又は非免疫化志願者もしくは入手可能な細菌性ワクチ
ンもしくは不活性化グラム陰性細菌で免疫された志願者
からの脾臓細胞を用いる体細胞ハイブリダイゼーション
によって合成されたトリオーマ（trioma）の生産物であ
る。所望により、新鮮なPBL又は脾臓細胞（形質転換さ
れていない）を使用することができる。ラットの具体例
は、ラット骨髄腫セルライン及びＥ．コリRc変異株で免
疫されたラットからの脾臓細胞を用いる体細胞ハイブリ
ダイゼーションによって合成されたハイブリドーマの生
産物である。
この発明の抗体を産生するハイブリドーマを調製しそし
て固定するための好ましい方法は次の通りである。細胞
（PBL、脾細胞等）を、LPSをコートされた組織培養プレ
ート上で洗選し（pan）次にEBVを形質転換し、そして腫
瘍融合パートナー（マウス骨髄腫×ヒトＢ細胞又はラッ
ト骨髄腫）に融合せしめる。プレート上での洗選は、イ
ムノコンピテント細胞の集団を、対応する抗体でコート
されたプラスチック表面上でインキュベートすることを
含む。抗原特異的細胞が付着する。非付着細胞を除去し
た後、使用された抗原に対して特異的に濃縮された細胞
の集団を得る。これらの細胞をEBVによって形質転換
し、そして照射されたリンパ芽球フィーダー細胞層を用
いてミクロタイターウエル当り１０３細胞で培養する。
得られたリンパ芽球細胞からの上澄液をＥ．コリRe LPS
及びサルモネラRe LPSに対してELISAによりスクリーニ
ングする。Rc又はReリピドＡ LPSについて陽性の細胞
を拡げ、そして６−チオグアニン耐性マウス×ヒトＢ細
胞融合パートナーに融合せしめる。マウス×ヒトＢ細胞
パートナーを使用する場合、ハイブリドをウアバイン及
びアザセリン中で選択する。Rc又はRe陽性ハイブリドか
らの上清を、グラム陰性細菌及び精製されたグラム陰性
細菌LPSのスペクトルに対してELISAにより測定する。広
範囲の活性を示す培養物をイン−ビボLPS中和活性のた
めに選択する。こうして調製されたすべてではないが多
くの抗体がIgMクラスであり、そしてほとんどが広範囲
の精製されたリピドＡ又はラフLPSへの結合を示す。こ
れらの抗体はELISAにより種々のスムースLPS及び一定範
囲の臨床分離細株への結合を示す。
て固定するための好ましい方法は次の通りである。細胞
（PBL、脾細胞等）を、LPSをコートされた組織培養プレ
ート上で洗選し（pan）次にEBVを形質転換し、そして腫
瘍融合パートナー（マウス骨髄腫×ヒトＢ細胞又はラッ
ト骨髄腫）に融合せしめる。プレート上での洗選は、イ
ムノコンピテント細胞の集団を、対応する抗体でコート
されたプラスチック表面上でインキュベートすることを
含む。抗原特異的細胞が付着する。非付着細胞を除去し
た後、使用された抗原に対して特異的に濃縮された細胞
の集団を得る。これらの細胞をEBVによって形質転換
し、そして照射されたリンパ芽球フィーダー細胞層を用
いてミクロタイターウエル当り１０３細胞で培養する。
得られたリンパ芽球細胞からの上澄液をＥ．コリRe LPS
及びサルモネラRe LPSに対してELISAによりスクリーニ
ングする。Rc又はReリピドＡ LPSについて陽性の細胞
を拡げ、そして６−チオグアニン耐性マウス×ヒトＢ細
胞融合パートナーに融合せしめる。マウス×ヒトＢ細胞
パートナーを使用する場合、ハイブリドをウアバイン及
びアザセリン中で選択する。Rc又はRe陽性ハイブリドか
らの上清を、グラム陰性細菌及び精製されたグラム陰性
細菌LPSのスペクトルに対してELISAにより測定する。広
範囲の活性を示す培養物をイン−ビボLPS中和活性のた
めに選択する。こうして調製されたすべてではないが多
くの抗体がIgMクラスであり、そしてほとんどが広範囲
の精製されたリピドＡ又はラフLPSへの結合を示す。こ
れらの抗体はELISAにより種々のスムースLPS及び一定範
囲の臨床分離細株への結合を示す。
この明細書において“中和する”なる語は、グラム陰性
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をイン−ビ
トロで又は哺乳動物中でブロックする抗体の能力を意味
し、関与する特定の機作にはかかわらない。抗体が、エ
ンドトキシンの生物学的活性に対してそれに結合するこ
とにより影響を与え、エンドトキシンを分解せしめ、又
はその浄化の速度及び／又は部位を変化させてエンドト
キシンの活性に影響を与える機作を含むと意図される
が、これに限定されない。中和活性はネズミのモデルを
用いてイン−ビボで測定することができる。例えば、３
７℃にて飼育したBalb/cマウスに、５０％のマウスが死
亡する量（LD50）（約１〜１０μｇ）のLPSをip又はiv
注射する。LPSの注射の前又は後に、0.2〜２０mg/kgの
抗体をip又はiv注射することができる。中和効果は試験
マウスの死亡率を対照マウス（すなわち、抗体を与えら
れなかったマウス、非結合抗体を与えられたマウス等）
のそれと比較することによって決定される。
細菌エンドトキシンの不都合な生物学的効果をイン−ビ
トロで又は哺乳動物中でブロックする抗体の能力を意味
し、関与する特定の機作にはかかわらない。抗体が、エ
ンドトキシンの生物学的活性に対してそれに結合するこ
とにより影響を与え、エンドトキシンを分解せしめ、又
はその浄化の速度及び／又は部位を変化させてエンドト
キシンの活性に影響を与える機作を含むと意図される
が、これに限定されない。中和活性はネズミのモデルを
用いてイン−ビボで測定することができる。例えば、３
７℃にて飼育したBalb/cマウスに、５０％のマウスが死
亡する量（LD50）（約１〜１０μｇ）のLPSをip又はiv
注射する。LPSの注射の前又は後に、0.2〜２０mg/kgの
抗体をip又はiv注射することができる。中和効果は試験
マウスの死亡率を対照マウス（すなわち、抗体を与えら
れなかったマウス、非結合抗体を与えられたマウス等）
のそれと比較することによって決定される。
この発明の抗体を生産するハイブリドーマは、適当な培
地、例えばイスコベ培地もしくはRPMI−１６４０培地
（ギブコ，グランドアイランド，ニューヨーク）中で、
又は免疫不全実験動物中でイン−ビボ増殖せしめること
ができる。所望により、抗体を培地又は体液から常用技
法により、例えば硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動、マイクロフィルトレーション、及び限外
過により分離することができる。
地、例えばイスコベ培地もしくはRPMI−１６４０培地
（ギブコ，グランドアイランド，ニューヨーク）中で、
又は免疫不全実験動物中でイン−ビボ増殖せしめること
ができる。所望により、抗体を培地又は体液から常用技
法により、例えば硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ
ー、電気泳動、マイクロフィルトレーション、及び限外
過により分離することができる。
この発明のモノクローナル抗体は、菌血症もしくは敗血
症に罹患している個体、又は細菌感染の危険のある個体
を受動免疫するために使用することができる。好ましく
は、それぞれがコア領域の内部に位置する細胞壁LPSの
異る決定基を認識しそしてそれに結合する多数の異るモ
ノクローナル抗体が使用される。このような処置におい
て１又は複数の抗体が、一般には非経腸的に（例えば、
静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に）、好ましく
は静脈内に投与されるであろう。投与量及び投与方法
は、１又は複数の抗体が治療目的で投与されるか予防目
的で投与されるか、患者及び患者の病歴に依存して異る
であろう。１投与当りに適用される抗体の合計量は典型
的には0.1〜２０mg/kg体重、好ましくは0.1〜１０mg/kg
体重の範囲である。
症に罹患している個体、又は細菌感染の危険のある個体
を受動免疫するために使用することができる。好ましく
は、それぞれがコア領域の内部に位置する細胞壁LPSの
異る決定基を認識しそしてそれに結合する多数の異るモ
ノクローナル抗体が使用される。このような処置におい
て１又は複数の抗体が、一般には非経腸的に（例えば、
静脈内に、動脈内に、筋肉内に、腹腔内に）、好ましく
は静脈内に投与されるであろう。投与量及び投与方法
は、１又は複数の抗体が治療目的で投与されるか予防目
的で投与されるか、患者及び患者の病歴に依存して異る
であろう。１投与当りに適用される抗体の合計量は典型
的には0.1〜２０mg/kg体重、好ましくは0.1〜１０mg/kg
体重の範囲である。
非経腸投与のため、１又は複数の抗体が医薬として許容
される非経腸的担体と共に注射可能な単位投与形（溶
液、懸濁液、乳剤）に製剤化されるであろう。このよう
な担体は本来的に非毒性であり、そして非医療的であ
る。このような担体の例として水、食塩水、リンゲル
液、グルコース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙
げられる。非水担体、例えば不揮発油及びオレイン酸エ
チルを使用することもできる。担体としてリポゾームを
使用することができる。担体は少量の添加剤、例えば等
張性及び化学的安定性を保持する物質、例えば緩衝液及
び防腐剤を含有することができる。抗体は典型的にはこ
のような担体中に、約1.0mg/ml〜１００mg/mlの濃度で
製剤することができる。
される非経腸的担体と共に注射可能な単位投与形（溶
液、懸濁液、乳剤）に製剤化されるであろう。このよう
な担体は本来的に非毒性であり、そして非医療的であ
る。このような担体の例として水、食塩水、リンゲル
液、グルコース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙
げられる。非水担体、例えば不揮発油及びオレイン酸エ
チルを使用することもできる。担体としてリポゾームを
使用することができる。担体は少量の添加剤、例えば等
張性及び化学的安定性を保持する物質、例えば緩衝液及
び防腐剤を含有することができる。抗体は典型的にはこ
のような担体中に、約1.0mg/ml〜１００mg/mlの濃度で
製剤することができる。
次の例によりこの発明の種々の観点をさらに記載する。
これらの例はこの発明の範囲を限定するものではない。
例においてすべての温度は℃で示す。
これらの例はこの発明の範囲を限定するものではない。
例においてすべての温度は℃で示す。
融合のパートナー すべてのセルラインは、１０％ウシ胎児血清(FBS)、２m
Mグルタシン及び５×10-5Ｍ ２−メルカプトエタノー
ルを補充したイスコベDME培地中に維持した。セルライ
ンはマイコプラズマの存在に関して日常的に点検した。
ヒト−モノクローナル抗体の大規模製造のため、セルラ
インを、HL-1培地（ベントレックスラブス、ポートラン
ド、ME）、及びHB104培地（ハナバイオケミカルス、バ
ークレイ、カリホルニア）中で無血清培養に適合させ
た。
Mグルタシン及び５×10-5Ｍ ２−メルカプトエタノー
ルを補充したイスコベDME培地中に維持した。セルライ
ンはマイコプラズマの存在に関して日常的に点検した。
ヒト−モノクローナル抗体の大規模製造のため、セルラ
インを、HL-1培地（ベントレックスラブス、ポートラン
ド、ME）、及びHB104培地（ハナバイオケミカルス、バ
ークレイ、カリホルニア）中で無血清培養に適合させ
た。
Ａ．ヒトＢ−リンパ球 Ｅ．コリJ5もしくはＳ．ミネソタ（S.minnesota）R595
コアグリコリピドに対する自然に獲得した高力価血清抗
体を有する志願者、又は高いLPS抗体価を得るために標
準的な入手可能なチフス注射によりワクチン処理された
志願者を末梢血リンパ球の入手源として用いた。５０ml
の静脈血を５日及び７日目に志願者から採取した。血液
を遠心分離し、バフィーコートを集め、そして集められ
たバフィコートをFicoll/Hypaqueを用いてグラジエント
遠心してリンパ球を分離した。１のFicoll/Hypaqueを
調製するために、６４ｇのFicoll（シグマ）を６００ml
の蒸留水に低速の攪拌棒ローターを用いて溶解し、そし
て９９ｇのジアトリゾエートナトリウム（スターリング
ドラグ、ニューヨーク）を加えた。両物質が溶解した
後、追加の水を加えて１とし、さらに0.7ｇのNaClを
加えた。Ｔ細胞を、アミノエチルチオウロニウム処理さ
れたヒツジ赤血球細胞(AET-SRBC)ロゼット形成により、
Madsen及びJohnsen，ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソズ（J.Immunol.Meth）（１９７９）２７：６１
−７４に記載されている方法を用いて除去した。残りの
Ｂ細胞富化リンパ球集団をエプスタイン−バールウイル
スにより、Foung等、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソズ（J.Immunol.Meth）（１９８４）７０：８３
−９０に記載されている方法を用いて形質転換した。但
し、一般に、細胞を９６−ウエル培養プレート中で103
〜104細胞／ウエルにおいて培養した。
コアグリコリピドに対する自然に獲得した高力価血清抗
体を有する志願者、又は高いLPS抗体価を得るために標
準的な入手可能なチフス注射によりワクチン処理された
志願者を末梢血リンパ球の入手源として用いた。５０ml
の静脈血を５日及び７日目に志願者から採取した。血液
を遠心分離し、バフィーコートを集め、そして集められ
たバフィコートをFicoll/Hypaqueを用いてグラジエント
遠心してリンパ球を分離した。１のFicoll/Hypaqueを
調製するために、６４ｇのFicoll（シグマ）を６００ml
の蒸留水に低速の攪拌棒ローターを用いて溶解し、そし
て９９ｇのジアトリゾエートナトリウム（スターリング
ドラグ、ニューヨーク）を加えた。両物質が溶解した
後、追加の水を加えて１とし、さらに0.7ｇのNaClを
加えた。Ｔ細胞を、アミノエチルチオウロニウム処理さ
れたヒツジ赤血球細胞(AET-SRBC)ロゼット形成により、
Madsen及びJohnsen，ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソズ（J.Immunol.Meth）（１９７９）２７：６１
−７４に記載されている方法を用いて除去した。残りの
Ｂ細胞富化リンパ球集団をエプスタイン−バールウイル
スにより、Foung等、ジャーナル・オブ・イムノロジカ
ル・メソズ（J.Immunol.Meth）（１９８４）７０：８３
−９０に記載されている方法を用いて形質転換した。但
し、一般に、細胞を９６−ウエル培養プレート中で103
〜104細胞／ウエルにおいて培養した。
培養物は、２０日後にELISAによりＥ．コリJ5を抗原と
して用いて測定した（下記）。高抗体価を示す１ウエル
中の細胞を１０００細胞／ウエルでそして次に５００細
胞／ウエルでサブカルチュアーし、そしてコア特異的抗
体分泌細胞を含有する陽性培養物をプールした。
して用いて測定した（下記）。高抗体価を示す１ウエル
中の細胞を１０００細胞／ウエルでそして次に５００細
胞／ウエルでサブカルチュアーし、そしてコア特異的抗
体分泌細胞を含有する陽性培養物をプールした。
他の好ましい態様において、単核細胞を末梢血から単離
し、そしてプラスチック上で培養してプラスチック付着
性単核球を涸渇させた。残った細胞（Ｔ及びＢ細胞）
を、Ｓ．ミネソタRe R595のLPS（リビ・イムノケモリサ
ーチ社）により被覆したプレート上で洗選した。次に付
着細胞をEBVにより形質転換し、そして培養物中に維持
し、又はミクロタイタープレート上で培養しそしてRe L
PSについて陽性の細胞をスクリーニングした。培養物中
に維持された細胞を、１０日後に再び、Ｅ．コリのLPS
（リビ製）上で洗選した。付着細胞を集め、そしてセル
ソーターによりγ−陽性細胞について選択した。これら
のγ−選択された細胞を増殖せしめ、そしてIgG生産に
ついて陽性であるがRe LPS反応について陰性であるもの
を試験した。潜在的なRe−陽性細胞を選択するため、こ
の集団をセルソーターによりミクロタイタープレートに
区分けした。
し、そしてプラスチック上で培養してプラスチック付着
性単核球を涸渇させた。残った細胞（Ｔ及びＢ細胞）
を、Ｓ．ミネソタRe R595のLPS（リビ・イムノケモリサ
ーチ社）により被覆したプレート上で洗選した。次に付
着細胞をEBVにより形質転換し、そして培養物中に維持
し、又はミクロタイタープレート上で培養しそしてRe L
PSについて陽性の細胞をスクリーニングした。培養物中
に維持された細胞を、１０日後に再び、Ｅ．コリのLPS
（リビ製）上で洗選した。付着細胞を集め、そしてセル
ソーターによりγ−陽性細胞について選択した。これら
のγ−選択された細胞を増殖せしめ、そしてIgG生産に
ついて陽性であるがRe LPS反応について陰性であるもの
を試験した。潜在的なRe−陽性細胞を選択するため、こ
の集団をセルソーターによりミクロタイタープレートに
区分けした。
特異抗原上での洗選は、回収可能な抗原性細胞の数を２
倍以上にすることができ、そして抗体の選択率を改良す
ることができる。
倍以上にすることができ、そして抗体の選択率を改良す
ることができる。
Ｂ．ラット脾細胞 塩水中109細胞／mlのＥ．コリRc変異株を抗原として使
用した。ラットに0.5mlの細菌懸濁液及び0.5mlの完全フ
ロインドアジュバント(CFA)をip及びsq注射した。この
ラットを、２５日目に同じ注射により、そして２９日目
に0.2mlの細菌懸濁液注射(iv)により、追加免疫した。
３２日目に脾臓摘出を行った。
用した。ラットに0.5mlの細菌懸濁液及び0.5mlの完全フ
ロインドアジュバント(CFA)をip及びsq注射した。この
ラットを、２５日目に同じ注射により、そして２９日目
に0.2mlの細菌懸濁液注射(iv)により、追加免疫した。
３２日目に脾臓摘出を行った。
Ｃ．F3B6（マウス×ヒトライン） F3B6と称するマウス−ヒトヘテロハイブリド融合ハート
ナー（９９％無血清培血に適合されており、そして１９
８５年４月１８日にATCC NO.HB 8785としてATCCに寄託
されている）を、血液銀行から得られたヒト末梢血リン
パ球(PBL)Ｂ細胞とATCC NO.TIB18(P3/NS1/1-AG4-1)とし
てATCCから得られたネズミ形質細胞腫セルラインNS1と
の融合により造成した。ランダムパフィーコートからの
PBL細胞を５０ml遠心管に移し、そして３０mlのハンク
平衡塩溶液（Ca2+−不含／Mg2+−不含）HBSS-/-）で稀
釈した。次に、１０mlのFicoll/Hypaqueを加え、そして
この混合物を１５００rpm、室温にて１５分間遠心し
た。界面を取り出し、そしてこの混合物をHBSS-/-で洗
浄し、そしてHBSS-/-に再懸濁した。細胞を計数した。
ナー（９９％無血清培血に適合されており、そして１９
８５年４月１８日にATCC NO.HB 8785としてATCCに寄託
されている）を、血液銀行から得られたヒト末梢血リン
パ球(PBL)Ｂ細胞とATCC NO.TIB18(P3/NS1/1-AG4-1)とし
てATCCから得られたネズミ形質細胞腫セルラインNS1と
の融合により造成した。ランダムパフィーコートからの
PBL細胞を５０ml遠心管に移し、そして３０mlのハンク
平衡塩溶液（Ca2+−不含／Mg2+−不含）HBSS-/-）で稀
釈した。次に、１０mlのFicoll/Hypaqueを加え、そして
この混合物を１５００rpm、室温にて１５分間遠心し
た。界面を取り出し、そしてこの混合物をHBSS-/-で洗
浄し、そしてHBSS-/-に再懸濁した。細胞を計数した。
NS-1細胞をT74フラスコ４本中に増殖せしめ、そして集
め、HBSS-/-で洗浄し、そしてHBSS-/-中に再懸濁した。
細胞を計数した。融合のため、約５×107個のＢ−細胞
及び2.5×107個のNS-1細胞（比率２：１）を５−５０ml
の遠心チューブの各々に加えた。この混合物を１２００
rpmにて８分間、室温において遠心し、密なペレットを
形成した。すべての上清を除去し、そしてチューブを３
７℃に保持してさらに操作した。５０％の分子量１５４
０のポリエチレングリコール（PEG１５４０）（BOHケミ
カルス、プール、イングランド）合計１mlを１分間にわ
たり、１mlのピペットを用いて加えた。PECを添加しな
がら、ピペットのチップによって細胞ペレットをおだや
かに攪拌した。次に、１mlのHBSS-/-を３７℃にて１分
間にわたって添加することによりPEGを徐々に稀釈し
た。細胞をHBSS-/-により２回洗浄し、そして数本のＴ
１５０フラスコ中のイスコベ培地に再懸濁した。
め、HBSS-/-で洗浄し、そしてHBSS-/-中に再懸濁した。
細胞を計数した。融合のため、約５×107個のＢ−細胞
及び2.5×107個のNS-1細胞（比率２：１）を５−５０ml
の遠心チューブの各々に加えた。この混合物を１２００
rpmにて８分間、室温において遠心し、密なペレットを
形成した。すべての上清を除去し、そしてチューブを３
７℃に保持してさらに操作した。５０％の分子量１５４
０のポリエチレングリコール（PEG１５４０）（BOHケミ
カルス、プール、イングランド）合計１mlを１分間にわ
たり、１mlのピペットを用いて加えた。PECを添加しな
がら、ピペットのチップによって細胞ペレットをおだや
かに攪拌した。次に、１mlのHBSS-/-を３７℃にて１分
間にわたって添加することによりPEGを徐々に稀釈し
た。細胞をHBSS-/-により２回洗浄し、そして数本のＴ
１５０フラスコ中のイスコベ培地に再懸濁した。
２日目に、５０mlの遠心チューブ中のHBSS-/-中で洗浄
した。このチューブに合計１０mlのFicoll-Hypaqueを加
えた。このチューブを、１５００rpmにて１５分間、室
温において遠心しそして界面の生細胞を取り出した。ペ
レットをPRMI-1640（ギブコ）で２回洗浄し、そして１
００mMヒポキサンチン（シグマ）、５μg/mlアザセリン
（シグマ）及びイスコベ培地（ギブコ）、１０％NCTC
（M.A.バイオロジカルス）、２０％熱不活性化FBSから
成る濃縮されたヒポキサンチン／アザセリン選択培地
（EHA）に再懸濁した。濃度を2.5×104細胞／ml培地に
調整した。
した。このチューブに合計１０mlのFicoll-Hypaqueを加
えた。このチューブを、１５００rpmにて１５分間、室
温において遠心しそして界面の生細胞を取り出した。ペ
レットをPRMI-1640（ギブコ）で２回洗浄し、そして１
００mMヒポキサンチン（シグマ）、５μg/mlアザセリン
（シグマ）及びイスコベ培地（ギブコ）、１０％NCTC
（M.A.バイオロジカルス）、２０％熱不活性化FBSから
成る濃縮されたヒポキサンチン／アザセリン選択培地
（EHA）に再懸濁した。濃度を2.5×104細胞／ml培地に
調整した。
５日目に、懸濁液をHBSS-/-で２回洗浄し、そして１０m
lのイスコベ培地に洗浄した。上記のようにしてFicoll-
Hypaque密度勾配遠心により生細胞を分離した。細胞をR
PMI-1640＋２０％FBSにより２回洗浄し、そして次に９
６−ウエルプレートに106細胞／mlでプレートした。７
日，９日及び１２日目に、前記のEHA選択培地を各時に
加えた。１５日及び１８日目に、ヒポキサンチン、メト
トレキセート及びチミジンを含有するEHMT培地を補給し
た。上清をIgの分泌について測定し、そしてIg分泌ハイ
ブリド細胞を、Ｕ底９６ウエルプレート中での限界稀釈
によりクローン化した。
lのイスコベ培地に洗浄した。上記のようにしてFicoll-
Hypaque密度勾配遠心により生細胞を分離した。細胞をR
PMI-1640＋２０％FBSにより２回洗浄し、そして次に９
６−ウエルプレートに106細胞／mlでプレートした。７
日，９日及び１２日目に、前記のEHA選択培地を各時に
加えた。１５日及び１８日目に、ヒポキサンチン、メト
トレキセート及びチミジンを含有するEHMT培地を補給し
た。上清をIgの分泌について測定し、そしてIg分泌ハイ
ブリド細胞を、Ｕ底９６ウエルプレート中での限界稀釈
によりクローン化した。
６−チオグアニン選択についてウエルF3B6を選択した。
F3B6の数本のローラービンを増殖条件においた。２日、
５日及び７日目に、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心により
死細胞を除去した。６−チオグアニン耐性クローンが増
殖した。試験融合を行い、そしてセルラインをウアバイ
ン耐性について試験した。
F3B6の数本のローラービンを増殖条件においた。２日、
５日及び７日目に、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心により
死細胞を除去した。６−チオグアニン耐性クローンが増
殖した。試験融合を行い、そしてセルラインをウアバイ
ン耐性について試験した。
一層再現性ある製造のため、次の多段法により、前記の
ようにして得られたセルラインを９９％血清不含培地及
び１％FBS中での増殖及び維持に適合せしめた。
ようにして得られたセルラインを９９％血清不含培地及
び１％FBS中での増殖及び維持に適合せしめた。
１．サブカルキュアー２日前に、それらが増殖している
培地中５０％量のFBS（条件調節培地）、及びベントレ
ックスから供給される粉末から自家調製した５０重量％
の無血清培地HL-1を供給した。
培地中５０％量のFBS（条件調節培地）、及びベントレ
ックスから供給される粉末から自家調製した５０重量％
の無血清培地HL-1を供給した。
２．２日後、又はハイブリドーマ細胞が８×105〜１×1
06細胞／mlの濃度に達した時、５０％のイスコベDME培
地及び５０％の無血清培地によりサブカルチュアーしそ
して植えた。２００×ｇにて５分間遠心分離することに
より後者の培地から細胞を取り出した。イスコベのDME
培地を５０％の無血清培地と混合して５０：５０混合物
を形成し、これに細胞ペレットを懸濁し、そして計数し
た。適当量の細胞懸濁液を５０％イスコベDME及び５０
％無血清培地を有する容器中に植えた。植えられた細胞
の濃度は好ましくは５×104細胞／mlより低くなくそし
て１×105細胞／mlを超えない。
06細胞／mlの濃度に達した時、５０％のイスコベDME培
地及び５０％の無血清培地によりサブカルチュアーしそ
して植えた。２００×ｇにて５分間遠心分離することに
より後者の培地から細胞を取り出した。イスコベのDME
培地を５０％の無血清培地と混合して５０：５０混合物
を形成し、これに細胞ペレットを懸濁し、そして計数し
た。適当量の細胞懸濁液を５０％イスコベDME及び５０
％無血清培地を有する容器中に植えた。植えられた細胞
の濃度は好ましくは５×104細胞／mlより低くなくそし
て１×105細胞／mlを超えない。
３．植えて２〜３日後、又は細胞濃度が８×105〜１×1
06細胞／mlに達した後、細胞に５０％イスコベDMA及び
５０％無血清培地を供給した。
06細胞／mlに達した後、細胞に５０％イスコベDMA及び
５０％無血清培地を供給した。
４．段階３を他の継代のために反復した。
５．培養中２〜３日の後、又は細胞濃度が８×105〜１
×106細胞／mlに達し、そして生存が約８５％となった
とき、細胞を無血清培地のみに培養した。細胞がはじめ
て無血清培地に移植された後、細胞濃度は１×105〜８
−９×105細胞／mlであった。最終培地として１％FBSを
含むHL-1を使用した。
×106細胞／mlに達し、そして生存が約８５％となった
とき、細胞を無血清培地のみに培養した。細胞がはじめ
て無血清培地に移植された後、細胞濃度は１×105〜８
−９×105細胞／mlであった。最終培地として１％FBSを
含むHL-1を使用した。
Ｄ．ラット腫瘍ライン 入手可能なラット腫瘍ラインを用いた。
融合方法 融合混合物は、ハンク平衡溶液(HBSC)-/+（Ca2+不含，2
mMMgSO4）中に４０w/v％のポリエチレングリコール(PE
G)４０００ml，１０v/v％のジメチルスルホキシド(DMS
O)、及び５μg/mlのポリ−１−アルギニンを含む。４０
ｇのPEG４０００を１０mlのDMSO及び５０mlのHBSS-/+と
混合した。混合物を２５分間オートクレーブ処理した。
使用前に融合混合物のpHを無菌の0.1N NaOHにより7.5〜
8.5に調整した。
mMMgSO4）中に４０w/v％のポリエチレングリコール(PE
G)４０００ml，１０v/v％のジメチルスルホキシド(DMS
O)、及び５μg/mlのポリ−１−アルギニンを含む。４０
ｇのPEG４０００を１０mlのDMSO及び５０mlのHBSS-/+と
混合した。混合物を２５分間オートクレーブ処理した。
使用前に融合混合物のpHを無菌の0.1N NaOHにより7.5〜
8.5に調整した。
プレート（６−ウエルクラスター，ウエル直径３５mm）
を次のようにして調製した。２mlのHBSS-/+及び過滅
菌した２０〜１００μg/mlのピーナツアグルチニン（PN
A，シグマ）５０μｌを各ウエルに加えた。使用に先立
ってプレートを少なくとも１時間３７℃にてインキュベ
ートした。PNAストックを凍結貯蔵し、そして新たに解
凍したアリコートを使用して融合細胞をコートした。細
胞数が限定されている場合には一層小サイズのウエルを
使用した。
を次のようにして調製した。２mlのHBSS-/+及び過滅
菌した２０〜１００μg/mlのピーナツアグルチニン（PN
A，シグマ）５０μｌを各ウエルに加えた。使用に先立
ってプレートを少なくとも１時間３７℃にてインキュベ
ートした。PNAストックを凍結貯蔵し、そして新たに解
凍したアリコートを使用して融合細胞をコートした。細
胞数が限定されている場合には一層小サイズのウエルを
使用した。
Ficoll-Hypaque中親細胞をHBSS-/+中で２回室温にて洗
浄し、そして次に再懸濁し、そして５：１〜１：１の比
率で、３７℃に加温されたHBSS-/+中リンパ球−脾細胞
融合パートナーと混合した。２mlの混合された細胞懸濁
液（３×107細胞／ウエル）を、１μg/ml PNAコート溶
液を含む前処理された各ウエルに加えた。ウエルを３７
℃にて１時間インキュベートした。プレートを４００〜
５００×ｇにて、室温において５分間回転せしめて細胞
の単層を形成した。次に、上清をプレートから吸引除去
し、細胞の付着層を残した。
浄し、そして次に再懸濁し、そして５：１〜１：１の比
率で、３７℃に加温されたHBSS-/+中リンパ球−脾細胞
融合パートナーと混合した。２mlの混合された細胞懸濁
液（３×107細胞／ウエル）を、１μg/ml PNAコート溶
液を含む前処理された各ウエルに加えた。ウエルを３７
℃にて１時間インキュベートした。プレートを４００〜
５００×ｇにて、室温において５分間回転せしめて細胞
の単層を形成した。次に、上清をプレートから吸引除去
し、細胞の付着層を残した。
上記のPEG融合混合物を３７℃に加温し、融合セルの側
面にそって注意深く加えた。１分間の後、次の２〜３分
間にわたり、５％DMSO（シグマ）HBSS-/+（３７℃に加
温しそして過滅菌したもの）の融合稀釈混合物(FDM)
を２ml／分（１５秒ごとに0.5ml）の速度で加える（４
〜６ml）ことにより上記PEG溶液を稀釈した。次の２分
間、混合しながら４ml／分の速度でFDMを加えた。FDMを
常にウエルの側面にそって加えることにより単層を混乱
させないようにし、そして最適混合を保証するためにプ
レートを常に渦動させた。
面にそって注意深く加えた。１分間の後、次の２〜３分
間にわたり、５％DMSO（シグマ）HBSS-/+（３７℃に加
温しそして過滅菌したもの）の融合稀釈混合物(FDM)
を２ml／分（１５秒ごとに0.5ml）の速度で加える（４
〜６ml）ことにより上記PEG溶液を稀釈した。次の２分
間、混合しながら４ml／分の速度でFDMを加えた。FDMを
常にウエルの側面にそって加えることにより単層を混乱
させないようにし、そして最適混合を保証するためにプ
レートを常に渦動させた。
上記２分間の終りにおいて、ウエルを吸引して稀釈され
たPEG融合混合物を除去した。PEG混合物の残留フィルム
を、温FDMを２ml／分の速度にて１〜２分間にわたり加
えることにより稀釈した。再びプレートを一定速度で渦
動させた。0.25〜２分間にわたり渦動させた後、３７℃
に加温したHBSS-/+5mlを１ml／１５分の速度で融合ウエ
ルに加えた。次にウエルをHBSS-/+により満たし、そし
てすべての上清を単層から吸引した。最後に、各融合ウ
エルを５〜１０mlの温HBSS-/+により１〜２回洗浄し、
そして吸引し、そして約５mlのHBSS-/+で再び洗浄しそ
して吸引した。５mlの温イスコベ完全培地及び１５〜２
０％のFBSを各ウエルに加え、そしてプレートを３７℃
にて２４時間インキュベートした。融合の次の日、細胞
を、アザセリン（２μg/ml）、ヒポキサンチン（１００
μＭ）及びウアバイン（１μＭ）を含有するEHA培地に1
05細胞／mlの濃度に再懸濁し、そして９６−ウエルプレ
ートに0.1ml／ウエルプレートした。次いで、培養物に
３日ごとに供給した。増殖するハイブリドは１０日まで
に可視化された。
たPEG融合混合物を除去した。PEG混合物の残留フィルム
を、温FDMを２ml／分の速度にて１〜２分間にわたり加
えることにより稀釈した。再びプレートを一定速度で渦
動させた。0.25〜２分間にわたり渦動させた後、３７℃
に加温したHBSS-/+5mlを１ml／１５分の速度で融合ウエ
ルに加えた。次にウエルをHBSS-/+により満たし、そし
てすべての上清を単層から吸引した。最後に、各融合ウ
エルを５〜１０mlの温HBSS-/+により１〜２回洗浄し、
そして吸引し、そして約５mlのHBSS-/+で再び洗浄しそ
して吸引した。５mlの温イスコベ完全培地及び１５〜２
０％のFBSを各ウエルに加え、そしてプレートを３７℃
にて２４時間インキュベートした。融合の次の日、細胞
を、アザセリン（２μg/ml）、ヒポキサンチン（１００
μＭ）及びウアバイン（１μＭ）を含有するEHA培地に1
05細胞／mlの濃度に再懸濁し、そして９６−ウエルプレ
ートに0.1ml／ウエルプレートした。次いで、培養物に
３日ごとに供給した。増殖するハイブリドは１０日まで
に可視化された。
ELISA Ａ．細菌 脱イオン水中0.5〜1.0％のグルタルアルデヒド（シグ
マ）５００μｌを平底ミクロタイタープレート（ダイナ
テック）上にコートした。室温にて１〜４時間インキュ
ベートした後、ウエルを吸引し又は蒸留水で２回洗浄し
た。細菌を塩溶液中で洗浄し、そして0.25v/v％に再調
整した。この細菌懸濁液６００μｌを各ウエルに加え、
プレートを２０００rpmにて２０分間回転せしめた。こ
の懸濁液を一夜、又は少なくとも２時間インキュベート
した。次に、プレートを、0.1g/のMgSO4及び0.1g/
のCaCl2(PBS２)、0.05％トウィーン２０界面活性剤
（シグマ）、並びに好ましくは0.01％チメロサル及び１
％ウシ血清アルブミン(BSA)（シグマ）を含有するリン
酸緩衝化塩溶液１００μｌで洗浄した。上清液を室温に
て９０分間インキュベートし、そしてPBS 、トウィー
ン２０及びチメロサールにより３回洗浄した。次に場合
によってはプレートの底をソフトティッシュによって吸
い取った。ホースラディッシュパーオキシターゼ接合ヤ
ギ抗ヒトIgG（タゴ社）又はホースラディッシュパーオ
キシダーゼ接合ヤギ抗ヒトIgM（ジャクソンラズス）５
００μｌを各ウエルに加えた。ウエルを室温又は４０℃
にて３０分間インキュベートし、そしてPBS ，0.05％
トウイーン２０及び0.01％チメロサールにより５回洗浄
し、そして場合によっては吸い取った。次に、２００μ
ｌのABTS基質を各ウエルに加えた。この基質は、0.1Ｍ
クエン酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）により１：１００
０稀釈された５５mg/mlのABTS水性ストック溶液に、使
用直前に１：１０００の３０％H2O2を加えたものであ
る。各ウエルを３７℃にて３０分間暗中でインキュベー
トした。ウエルの内容物を透明プレートに移し、そして
ELISAリーダーにより４０５nmにて読み取った。読み値
は１〜１０のスケールで得られた。ここで、１＝0.2(O
D)、１０＝2.0(OD)である。
マ）５００μｌを平底ミクロタイタープレート（ダイナ
テック）上にコートした。室温にて１〜４時間インキュ
ベートした後、ウエルを吸引し又は蒸留水で２回洗浄し
た。細菌を塩溶液中で洗浄し、そして0.25v/v％に再調
整した。この細菌懸濁液６００μｌを各ウエルに加え、
プレートを２０００rpmにて２０分間回転せしめた。こ
の懸濁液を一夜、又は少なくとも２時間インキュベート
した。次に、プレートを、0.1g/のMgSO4及び0.1g/
のCaCl2(PBS２)、0.05％トウィーン２０界面活性剤
（シグマ）、並びに好ましくは0.01％チメロサル及び１
％ウシ血清アルブミン(BSA)（シグマ）を含有するリン
酸緩衝化塩溶液１００μｌで洗浄した。上清液を室温に
て９０分間インキュベートし、そしてPBS 、トウィー
ン２０及びチメロサールにより３回洗浄した。次に場合
によってはプレートの底をソフトティッシュによって吸
い取った。ホースラディッシュパーオキシターゼ接合ヤ
ギ抗ヒトIgG（タゴ社）又はホースラディッシュパーオ
キシダーゼ接合ヤギ抗ヒトIgM（ジャクソンラズス）５
００μｌを各ウエルに加えた。ウエルを室温又は４０℃
にて３０分間インキュベートし、そしてPBS ，0.05％
トウイーン２０及び0.01％チメロサールにより５回洗浄
し、そして場合によっては吸い取った。次に、２００μ
ｌのABTS基質を各ウエルに加えた。この基質は、0.1Ｍ
クエン酸ナトリウム緩衝液（pH4.5）により１：１００
０稀釈された５５mg/mlのABTS水性ストック溶液に、使
用直前に１：１０００の３０％H2O2を加えたものであ
る。各ウエルを３７℃にて３０分間暗中でインキュベー
トした。ウエルの内容物を透明プレートに移し、そして
ELISAリーダーにより４０５nmにて読み取った。読み値
は１〜１０のスケールで得られた。ここで、１＝0.2(O
D)、１０＝2.0(OD)である。
Ｂ．LPS 平底ミクロタイタープレートを、0.05mM炭酸水素ナトリ
ウム（pH9.6）中５０μg/mlの超音波処理LPSの標品５０
μｌにより一夜コートした。プレートを、0.05％トウイ
ーン２０（シグマ）及び好ましくは0.01％チメロサール
を含有するPBS により、浸漬により又は自動プレート
洗浄機を用いて、５回まで洗浄した。次に、１％BSA、
0.05％トウイーン２０及び好ましくは0.01％チメロサー
ルを含むPBS １００μｌを各ウエルに加え、次に１０
０μｌの試験上清を加えた。上清を４℃〜室温にて３０
分間インキュベートし、そして次にPBS ／トウイーン
／チメロサール混合物により５回まで洗浄した。次に、
BSA、トウイーン２０及びチメロサールを含むPBS 中に
稀釈されたパーオキシダーゼ接合ヤギ抗−ヒトIgM（タ
ゴ）を加え、そして混合物を室温又は４０℃にて３０分
間インキュベートし、そして５回まで洗浄した。次に、
細菌ELISAについて記載したABTSパーオキシダーゼ基質
２００μｌををウエルに加えそして各ウエルを３７℃に
て３０分間暗中でインキュベートした。ウエルの内容物
をプレートELISAリーダー上で４０５nmにて読み取っ
た。
ウム（pH9.6）中５０μg/mlの超音波処理LPSの標品５０
μｌにより一夜コートした。プレートを、0.05％トウイ
ーン２０（シグマ）及び好ましくは0.01％チメロサール
を含有するPBS により、浸漬により又は自動プレート
洗浄機を用いて、５回まで洗浄した。次に、１％BSA、
0.05％トウイーン２０及び好ましくは0.01％チメロサー
ルを含むPBS １００μｌを各ウエルに加え、次に１０
０μｌの試験上清を加えた。上清を４℃〜室温にて３０
分間インキュベートし、そして次にPBS ／トウイーン
／チメロサール混合物により５回まで洗浄した。次に、
BSA、トウイーン２０及びチメロサールを含むPBS 中に
稀釈されたパーオキシダーゼ接合ヤギ抗−ヒトIgM（タ
ゴ）を加え、そして混合物を室温又は４０℃にて３０分
間インキュベートし、そして５回まで洗浄した。次に、
細菌ELISAについて記載したABTSパーオキシダーゼ基質
２００μｌををウエルに加えそして各ウエルを３７℃に
て３０分間暗中でインキュベートした。ウエルの内容物
をプレートELISAリーダー上で４０５nmにて読み取っ
た。
Ｃ．IgM イムロンII平底ミクロタイタープレートを、５０mM炭酸
水素ナトリウム緩衝液（pH9.6）中に１：１００稀釈し
たヤギ抗−ヒトIgM（タゴ）により、１００μｌ／ウエ
ルでコートした。３７℃にて９０分間置いた後、プレー
トを、0.05％トウイーン２０及び好ましくは0.01％チメ
ロサールを含むPBS により浸漬によって又は自動プレ
ート洗浄機を用いて、５回まで洗浄した。次に好ましく
は、１％BSA、0.05％トウイーン２０及び0.01％チメロ
サールを含むPBS １００μｌを各ウエルに加えた。合
計１００μｌの試験上清を第１ウエルに加え、そして好
ましくは２倍稀釈を２回行った。好ましくは、１つのウ
エルは対照として残した。プレートを２２℃にて３０分
間インキュベートし、そして前記のようにして５回まで
洗浄した。次に、BSA、トウイーン２０及びチメロサー
ルを含むPBS 中に稀釈されたパーオキシダーゼ接合ヤ
ギ抗−ヒトIgM抗体（タゴ）合計５０〜１００μｌを加
え、そしてこの混合物を室温又は４０℃にて３０分間イ
ンキュベートしそして５回まで洗浄した。次に、細菌EL
ISAについて記載したABTSパーオキシダーゼ基質合計２
００μｌを各ウエルに加えた。混合物を３７℃にて３０
分間暗中でインキュベートし、そしてタゴのスタンダー
ドに対してあらかじめ標準化したプールされたヒト−骨
髄腫（チャペル）をIgMスタンダードとして用いて、ELI
SAプレートリーダー（OD405）上で読み取った。
水素ナトリウム緩衝液（pH9.6）中に１：１００稀釈し
たヤギ抗−ヒトIgM（タゴ）により、１００μｌ／ウエ
ルでコートした。３７℃にて９０分間置いた後、プレー
トを、0.05％トウイーン２０及び好ましくは0.01％チメ
ロサールを含むPBS により浸漬によって又は自動プレ
ート洗浄機を用いて、５回まで洗浄した。次に好ましく
は、１％BSA、0.05％トウイーン２０及び0.01％チメロ
サールを含むPBS １００μｌを各ウエルに加えた。合
計１００μｌの試験上清を第１ウエルに加え、そして好
ましくは２倍稀釈を２回行った。好ましくは、１つのウ
エルは対照として残した。プレートを２２℃にて３０分
間インキュベートし、そして前記のようにして５回まで
洗浄した。次に、BSA、トウイーン２０及びチメロサー
ルを含むPBS 中に稀釈されたパーオキシダーゼ接合ヤ
ギ抗−ヒトIgM抗体（タゴ）合計５０〜１００μｌを加
え、そしてこの混合物を室温又は４０℃にて３０分間イ
ンキュベートしそして５回まで洗浄した。次に、細菌EL
ISAについて記載したABTSパーオキシダーゼ基質合計２
００μｌを各ウエルに加えた。混合物を３７℃にて３０
分間暗中でインキュベートし、そしてタゴのスタンダー
ドに対してあらかじめ標準化したプールされたヒト−骨
髄腫（チャペル）をIgMスタンダードとして用いて、ELI
SAプレートリーダー（OD405）上で読み取った。
ハイブリドのスクリーニング Ａ．Ｂリンパ球×F3B6 市販のＥ．コリJ5及びＳ．ミネソタRe595のLPS（リスト
バイオロジカルス社又はリビイムノケムリサーチ社から
入手される）を用いて上記のようにしてELISAにより培
養上清を測定した。陽性クローンを軟寒天中で又は限界
稀釈によりサブクローニングし、そしておよそ２週間後
に再測定した。限界稀釈クローニングは、９６ウエルＵ
底プレート中、２０％FBSを含むイスコベDME培地中で行
った。軟寒天クローニングのため、２０％ウシ胎児血清
を含むイスコベDME培地中に調製された0.33％アガロー
ス（FMC社）１ml中１０００細胞を、６０mmの培養皿中
４mlのアガロース（0.4％）のベッド上にプレートし
た。
バイオロジカルス社又はリビイムノケムリサーチ社から
入手される）を用いて上記のようにしてELISAにより培
養上清を測定した。陽性クローンを軟寒天中で又は限界
稀釈によりサブクローニングし、そしておよそ２週間後
に再測定した。限界稀釈クローニングは、９６ウエルＵ
底プレート中、２０％FBSを含むイスコベDME培地中で行
った。軟寒天クローニングのため、２０％ウシ胎児血清
を含むイスコベDME培地中に調製された0.33％アガロー
ス（FMC社）１ml中１０００細胞を、６０mmの培養皿中
４mlのアガロース（0.4％）のベッド上にプレートし
た。
非生産性親セルライン又は高生産性ハイブリドとの選択
はリバーズ−プラーク法（reverse-plaque technique）
を用いて行った。グロノビック等、ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）（１９
７６）６：５８８−５９０の方法に従って軟寒天の上層
に、プロテインＡをコートしたヒツジ赤血球（1.0％）
を加えた。
はリバーズ−プラーク法（reverse-plaque technique）
を用いて行った。グロノビック等、ヨーロピアン・ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.）（１９
７６）６：５８８−５９０の方法に従って軟寒天の上層
に、プロテインＡをコートしたヒツジ赤血球（1.0％）
を加えた。
拡張するために抗−Re及び抗−J5抗体の力価に基いて１
６個のハイブリドを選択し、そしてさらに試験した。
６個のハイブリドを選択し、そしてさらに試験した。
これらのハイブリドから生産された１６のヒトモノクロ
ーナル抗体を上記のIgM ELISAを用いてタイプ分けし
た。すべてがIgMクラスであった。すべてのハイブリド
をクローン化した。これらはスペント培地ml当り１０μ
ｇより多くの抗体を安定に生産する。第１表は、リビイ
ムノケムリサーチ社から市販されている種々の精製され
たコア−リポポリサッカライドに結合するこれらの抗−
LPSモノクローナル抗体のELISAの結果を示す。Ｄ２５３
は、LPSに結合しないがしかしＰ．アエルギノーサ（P.a
eruginosa）トキシンＡとは結合するネガティブ対照ヒ
トモノクローナル抗体である。第２表は、リビイムノチ
ムリサーチ社から市販されている種々のラフ変異細菌へ
のこれらのモノクローナル抗体の結合を示す。第３表
は、種々の菌血症性グラム陰性臨床分離株へのこれら同
じ抗体の結合を示す。この一連の１６種類の抗体は多数
の異る結合パターンを示す。
ーナル抗体を上記のIgM ELISAを用いてタイプ分けし
た。すべてがIgMクラスであった。すべてのハイブリド
をクローン化した。これらはスペント培地ml当り１０μ
ｇより多くの抗体を安定に生産する。第１表は、リビイ
ムノケムリサーチ社から市販されている種々の精製され
たコア−リポポリサッカライドに結合するこれらの抗−
LPSモノクローナル抗体のELISAの結果を示す。Ｄ２５３
は、LPSに結合しないがしかしＰ．アエルギノーサ（P.a
eruginosa）トキシンＡとは結合するネガティブ対照ヒ
トモノクローナル抗体である。第２表は、リビイムノチ
ムリサーチ社から市販されている種々のラフ変異細菌へ
のこれらのモノクローナル抗体の結合を示す。第３表
は、種々の菌血症性グラム陰性臨床分離株へのこれら同
じ抗体の結合を示す。この一連の１６種類の抗体は多数
の異る結合パターンを示す。
１．幾つかの抗体はコア抗原決定基のみを認識し； ２．幾つかはコア抗原決定基、及び幾つかのスムースリ
ポポリサッカライド分子上に存在する決定基を認識し；
そして、 ３．幾つかの抗体はコア抗原決定基に対してのみならず
全細胞（whole cell）上に存在するＯ−抗原決定基に対
して広い交差反応性を示す。
ポポリサッカライド分子上に存在する決定基を認識し；
そして、 ３．幾つかの抗体はコア抗原決定基に対してのみならず
全細胞（whole cell）上に存在するＯ−抗原決定基に対
して広い交差反応性を示す。
抗体D250はJ5Ｅ．コリ（Rc）コア決定基にのみ結合し、
他のコア−リポポリサッカライド及びラフ変異細菌に対
する結合は最小である。この抗体はＥ．コリの臨床分離
株にスポット状に結合する。抗体D244はＥ．コリJ5及び
サルモネラ・ミネソタR595のLPS並びにこれらの細菌に
結合するが、他のいずれの細菌又はリポポリサッカライ
ドにも結合しない。抗体D234及びD267はラフ−リポポリ
サッカライド及びリピドＡに対するかなりの結合を示
し、臨床分離株にスポット状に結合する。“Ｌ”シリー
ズ及び“Ｗ”シリーズの抗体は、結合パターンにわずか
な“ホール”を伴って、ラフ−リポポリサッカライドに
対する高い結合性を示す。“Ｌ”シリーズ内の抗体は一
層高い親和性をもって一層多くの臨床分離株に結合す
る。一般に、最も高いコアLPS又はラフ細菌結合性を示
すモノクローナル抗体は、臨床分離株に対する最大の交
差反応性を示す。
他のコア−リポポリサッカライド及びラフ変異細菌に対
する結合は最小である。この抗体はＥ．コリの臨床分離
株にスポット状に結合する。抗体D244はＥ．コリJ5及び
サルモネラ・ミネソタR595のLPS並びにこれらの細菌に
結合するが、他のいずれの細菌又はリポポリサッカライ
ドにも結合しない。抗体D234及びD267はラフ−リポポリ
サッカライド及びリピドＡに対するかなりの結合を示
し、臨床分離株にスポット状に結合する。“Ｌ”シリー
ズ及び“Ｗ”シリーズの抗体は、結合パターンにわずか
な“ホール”を伴って、ラフ−リポポリサッカライドに
対する高い結合性を示す。“Ｌ”シリーズ内の抗体は一
層高い親和性をもって一層多くの臨床分離株に結合す
る。一般に、最も高いコアLPS又はラフ細菌結合性を示
すモノクローナル抗体は、臨床分離株に対する最大の交
差反応性を示す。
他の試験において、幾つかの“Ｌ”及び“Ｄ”シリーズ
の抗体クローン、D253クローン対照、並びにグラム陰性
細菌のコアーリポポリサッカライドに対するモノクロー
ナル抗体S261を、精製されたコアLPS又は全細胞へのそ
れらの結合性について、前記の細菌ELISA試験を用いて
評価した。精製されたコアLPS及び全細胞を用いる評価
の結果を、精製されたLPSについては第４表及び第５表
に、そして全細胞については第６表に示す。
の抗体クローン、D253クローン対照、並びにグラム陰性
細菌のコアーリポポリサッカライドに対するモノクロー
ナル抗体S261を、精製されたコアLPS又は全細胞へのそ
れらの結合性について、前記の細菌ELISA試験を用いて
評価した。精製されたコアLPS及び全細胞を用いる評価
の結果を、精製されたLPSについては第４表及び第５表
に、そして全細胞については第６表に示す。
他の実験において、抗体D234及び比較抗体S261を種々の
精製されたコアLPSに対して試験した。結果を第５表に
示す。
精製されたコアLPSに対して試験した。結果を第５表に
示す。
上記の細菌ELISA試験を用いて、Ｅ．コリJ5及びＳ．ミ
ネソタRe595の全細胞に対して抗体D234及びS261を試験
した。結果を第６表に示す。
ネソタRe595の全細胞に対して抗体D234及びS261を試験
した。結果を第６表に示す。
第１表〜第６表の結果は、この発明に従って製造される
モノクローナル抗体のすべて（L116-2-4を除く；この抗
体はその性質の観点から本発明の部分ではない）がこの
発明において定義される結合標準に合致することを示し
ている。これらはＥ．コリRc及び／又はＳ．ミネソタの
ReのLPSの精製されたリピドＡ抗原決定基に強く結合し
（第１表、第４表及び第５表）、そしてこれらはインタ
クト(intact)のLPS（第３表）及び全細胞中（第６表）
のこれらの決定基に結合する。これに対して、第４表及
び第５表は、S261比較抗体がＥ．コリRe及び／又はＳ．
ミネソタReの精製されたリピドＡ決定基に結合せず、又
は非常に弱く（D234の強さの７分の１）結合することを
示している。
モノクローナル抗体のすべて（L116-2-4を除く；この抗
体はその性質の観点から本発明の部分ではない）がこの
発明において定義される結合標準に合致することを示し
ている。これらはＥ．コリRc及び／又はＳ．ミネソタの
ReのLPSの精製されたリピドＡ抗原決定基に強く結合し
（第１表、第４表及び第５表）、そしてこれらはインタ
クト(intact)のLPS（第３表）及び全細胞中（第６表）
のこれらの決定基に結合する。これに対して、第４表及
び第５表は、S261比較抗体がＥ．コリRe及び／又はＳ．
ミネソタReの精製されたリピドＡ決定基に結合せず、又
は非常に弱く（D234の強さの７分の１）結合することを
示している。
中和実験において、上記のネガティブ対照抗体D-253又
はこの発明の抗体D250のハイブリドーマ培養上清の１：
１稀釈物0.2mlをマウスに静脈内注射した。４時間後、
マウスに、Ｅ．コリJ5コアLPS細菌の７，１０倍稀釈物
をipによりチャレンジした。１稀釈当り５匹のマウスを
使用した。この方法においては、生理食塩水中５％のブ
タ胃ムチンの液0.5ml中に細菌を懸濁し、これに１５mg
のＤ−ガラクトサミンを加えた。第７表は結果を示す。
表中、LD50はマウスの５０％が死ぬLPS細菌の致死量で
ある。
はこの発明の抗体D250のハイブリドーマ培養上清の１：
１稀釈物0.2mlをマウスに静脈内注射した。４時間後、
マウスに、Ｅ．コリJ5コアLPS細菌の７，１０倍稀釈物
をipによりチャレンジした。１稀釈当り５匹のマウスを
使用した。この方法においては、生理食塩水中５％のブ
タ胃ムチンの液0.5ml中に細菌を懸濁し、これに１５mg
のＤ−ガラクトサミンを加えた。第７表は結果を示す。
表中、LD50はマウスの５０％が死ぬLPS細菌の致死量で
ある。
この結果は、この発明のD250抗体が、マウスにおいて、
Ｅ．コリJ5のエンドトキシンコア決定基に対して、ネガ
ティブ対照抗体D253に比較して統計的に有意に高い保護
活性を有することを示しており、この発明の抗体の中和
又はブロッキング性を示している。
Ｅ．コリJ5のエンドトキシンコア決定基に対して、ネガ
ティブ対照抗体D253に比較して統計的に有意に高い保護
活性を有することを示しており、この発明の抗体の中和
又はブロッキング性を示している。
２つのハイブリドーマ（D234及び267）を、モノクロー
ナル抗体の大規模な一層再現性のある攪拌培養生産のた
めに無血清培地中で増殖及び維持できるように適合させ
た。次の段階的方法を用いた。
ナル抗体の大規模な一層再現性のある攪拌培養生産のた
めに無血清培地中で増殖及び維持できるように適合させ
た。次の段階的方法を用いた。
１．サブカルチュアーの２日前に、細胞にそれらが増殖
しているイスコベDMEの混合物、それらが増殖している
培地中５０％量のFBS、及び５０重量％のベントレック
スから供給される無血清培地HL-1又はハラバイオケミカ
ルスから供給されるHB104を供給した。
しているイスコベDMEの混合物、それらが増殖している
培地中５０％量のFBS、及び５０重量％のベントレック
スから供給される無血清培地HL-1又はハラバイオケミカ
ルスから供給されるHB104を供給した。
２．２日後、又はハイブリドーマ細胞が８×105〜１×1
06細胞／mlの濃度に達した時、５０％のイスコベDME培
地及び５０％無血清培地によりサブカルチュアーしそし
て植えた。２００×ｇにて５分間遠心分離することによ
り後者の培地から細胞を取り出した。イスコベのDME培
地を５０％の無血清培地と混合して５０：５０混合物を
形成し、これに細胞ペレットを懸濁しそして計数した。
適当量の細胞懸濁液を５０％イスコベDME及び５０％無
血清培地を有する容器中に植えた。植えられた細胞の濃
度は好ましくは５×104細胞／mlより低くなくそして１
×105細胞／mlを超えない。
06細胞／mlの濃度に達した時、５０％のイスコベDME培
地及び５０％無血清培地によりサブカルチュアーしそし
て植えた。２００×ｇにて５分間遠心分離することによ
り後者の培地から細胞を取り出した。イスコベのDME培
地を５０％の無血清培地と混合して５０：５０混合物を
形成し、これに細胞ペレットを懸濁しそして計数した。
適当量の細胞懸濁液を５０％イスコベDME及び５０％無
血清培地を有する容器中に植えた。植えられた細胞の濃
度は好ましくは５×104細胞／mlより低くなくそして１
×105細胞／mlを超えない。
３．植えて２〜３日後、又は細胞濃度が８×105〜１×1
06細胞／mlに達した後、細胞に５０％イスコベDMA及び
５０％無血清培地を供給した。
06細胞／mlに達した後、細胞に５０％イスコベDMA及び
５０％無血清培地を供給した。
４．段階３を他の継代のために反復した。
５．培養中２〜３日の後、又は細胞濃度が８×105〜１
×106細胞／mlに達し、そして生存が約８５％となった
とき、細胞を無血清培地のみに培養した。細胞がはじめ
て無血清培地に移植された後、細胞濃度は１×105〜８
−９×105細胞／mlであった。
×106細胞／mlに達し、そして生存が約８５％となった
とき、細胞を無血清培地のみに培養した。細胞がはじめ
て無血清培地に移植された後、細胞濃度は１×105〜８
−９×105細胞／mlであった。
第１図は無血清培地HL-1（ベントレックス）中でのD-23
4の増殖曲線を示す。第２図は、無血清培地HB104（ハナ
バイオケミカルス）中でのD-267細胞の増殖曲線を示
す。これらの条件下で、５０〜７５μg/mlという多量の
特異的モノクローナル抗体が製造された。
4の増殖曲線を示す。第２図は、無血清培地HB104（ハナ
バイオケミカルス）中でのD-267細胞の増殖曲線を示
す。これらの条件下で、５０〜７５μg/mlという多量の
特異的モノクローナル抗体が製造された。
Nelles及びNiswanderの先行研究（１９８４）インフェ
クション・アンド・イムニティー（Infect.Immun.）４
６：６７７−６８１、並びにMutharia等（１９８４）イ
ンフェクション・アンド・イムニティー（Infect・Immu
n.）４５：６３１−６３６は、Ｅ．コリのRc-J5変異株
と反応性のマウスモノクローナル抗体が他のグラム陰性
細菌種との顕著な交差反応性を有することを示した。こ
の発明の研究は、LPSコア領域の交差反応性決定基（生
物学的に反応性のリピドＡ成分に関連するものを包含す
る）と反応するヒトモノクローナル抗体を生成せしめる
ことが可能であることを示す。これらの抗体の１つ又は
複数がグラム陰性敗血症における新規な療法剤として有
用であろう。
クション・アンド・イムニティー（Infect.Immun.）４
６：６７７−６８１、並びにMutharia等（１９８４）イ
ンフェクション・アンド・イムニティー（Infect・Immu
n.）４５：６３１−６３６は、Ｅ．コリのRc-J5変異株
と反応性のマウスモノクローナル抗体が他のグラム陰性
細菌種との顕著な交差反応性を有することを示した。こ
の発明の研究は、LPSコア領域の交差反応性決定基（生
物学的に反応性のリピドＡ成分に関連するものを包含す
る）と反応するヒトモノクローナル抗体を生成せしめる
ことが可能であることを示す。これらの抗体の１つ又は
複数がグラム陰性敗血症における新規な療法剤として有
用であろう。
１６種類のハイブリドの内D234，D267、及び“Ｗ”シリ
ーズから生産された抗体が最良であると考えられたた
め、アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション
（ATCC),12301パークラウンドライブ、ロックビル、メ
リーランド、USAに寄託された。寄託日及び番号は次の
通りである。
ーズから生産された抗体が最良であると考えられたた
め、アメリカン・タイプ・カルチュアー・コレクション
（ATCC),12301パークラウンドライブ、ロックビル、メ
リーランド、USAに寄託された。寄託日及び番号は次の
通りである。
さらに、これらのハイブリドーマのもとであるマウス×
ヒト融合パートナーF3B6（９９％無血清培地に適合され
ている）をATCCに寄託した。寄託日及び番号は次の通り
である。
ヒト融合パートナーF3B6（９９％無血清培地に適合され
ている）をATCCに寄託した。寄託日及び番号は次の通り
である。
これらの寄託はATCCと本出願の出願人であるシタス・コ
ーポレーションとの契約により行われた。ATCCとの契約
は、これらのセルラインの子孫の入手可能性を、いずれ
が先に到来するにしろ、該寄託を記載しそして特定して
いる米国特許が与えられた後又は米国もしくは外国の特
許出願が公衆に対して公告又は公開された後、公衆に対
して与え、そしてこれらのセルラインの子孫の入手可能
性を、３５USC§１２２及びこれに基く長官規則（８８
６ OG ６３８への特別の言及を伴う３７CFR§１１４
を含む）に基いて米国特許商標局長官により決定された
者に与える。この特許出願の出願人は、寄託されている
セルラインが適切な条件下で培養された場合に死滅しも
しくは失われ又は破壊されたなら、それらは通知の後速
やかに同じセルラインの生存培養物で置き換えられるで
あろうことを承諾する。
ーポレーションとの契約により行われた。ATCCとの契約
は、これらのセルラインの子孫の入手可能性を、いずれ
が先に到来するにしろ、該寄託を記載しそして特定して
いる米国特許が与えられた後又は米国もしくは外国の特
許出願が公衆に対して公告又は公開された後、公衆に対
して与え、そしてこれらのセルラインの子孫の入手可能
性を、３５USC§１２２及びこれに基く長官規則（８８
６ OG ６３８への特別の言及を伴う３７CFR§１１４
を含む）に基いて米国特許商標局長官により決定された
者に与える。この特許出願の出願人は、寄託されている
セルラインが適切な条件下で培養された場合に死滅しも
しくは失われ又は破壊されたなら、それらは通知の後速
やかに同じセルラインの生存培養物で置き換えられるで
あろうことを承諾する。
第１図は、無血清培地HL-1（ベントレックスラブス、ポ
ートランド、Me）攪拌培養におけるD-234細胞の増殖曲
線を示す。 第２図は、無血清培地HB104（ハナバイオケミカルス、
バークレー、カリホルニア）攪拌培養におけるD-267細
胞の増殖曲線を示す。
ートランド、Me）攪拌培養におけるD-234細胞の増殖曲
線を示す。 第２図は、無血清培地HB104（ハナバイオケミカルス、
バークレー、カリホルニア）攪拌培養におけるD-267細
胞の増殖曲線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特表 昭61−500355（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕ ｎｉｔｙ，45（３）．631−636（1984) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，17 （６），1050−1053，（1983)
Claims (5)
- 【請求項１】（ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ(E.coli)Rc変異株又はサルモネラ(Salmo
nella)Re変異株の細胞壁リポポリサッカライド(LPS)の
リピドＡ又はその断片上の決定基に結合し； （ｃ）Ｅ．コリRc変異株又はサルモネラRe変異株の全細
胞に結合し；そして、 （ｄ）グラム陰性細菌エンドトキシンの不都合な生物学
的効果をブロックする； ことを特徴とするヒト由来の抗体。 - 【請求項２】IgMであることを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の抗体。 - 【請求項３】ハイブリドーマATCC HB8598,ATCC HB8607,
ATCC HB8735,ATCC HB8733,ATCC HB8736もしくはATCC HB
8734により生産されたヒト由来の抗体又はその機能的同
等物であることを特徴とする特許請求の範囲第１項又は
第２項記載の抗体。 - 【請求項４】菌血症又は敗血症を処置するための組成物
であって、次の性質すなわち、 （ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ(E.coli)Rc変異株又はサルモネラ(Salmo
nella)Re変異株の細胞壁リポポリサッカライド(LPS)の
リピドＡ又はその断片上の決定基に結合し； （ｃ）Ｅ．コリRc変異株又はサルモネラRe変異株の全細
胞に結合し；そして、 （ｄ）グラム陰性細菌エンドトキシンの不都合な生物学
的効果をブロックする； を有するヒト由来の抗体の治療的有効量を医薬として許
容される非経腸的担体と共に含んで成る組成物。 - 【請求項５】菌血症又は敗血症を処置するための組成物
であって、次の性質すなわち、 （ａ）その集団が実質上均一であり； （ｂ）Ｅ．コリ(E.coli)Rc変異株又はサルモネラ(Salmo
nella)Re変異株の細胞壁リポポリサッカライド(LPS)の
リピドＡ又はその断片上の決定基に結合し； （ｃ）Ｅ．コリRc変異株又はサルモネラRe変異株の全細
胞に結合し；そして、 （ｄ）グラム陰性細菌エンドトキシンの不都合な生物学
的効果をブロックする；を有する複数のヒト由来の抗体
であってそのそれぞれが異る決定基に結合するものの治
療的有効量を医薬として許容される非経腸的担体と共に
含んでなる組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US64761184A | 1984-09-05 | 1984-09-05 | |
| US647611 | 1984-09-05 | ||
| US72782185A | 1985-04-26 | 1985-04-26 | |
| US727821 | 1985-04-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6172800A JPS6172800A (ja) | 1986-04-14 |
| JPH0659233B2 true JPH0659233B2 (ja) | 1994-08-10 |
Family
ID=27095206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60194981A Expired - Lifetime JPH0659233B2 (ja) | 1984-09-05 | 1985-09-05 | グラム陰性細菌エンドトキシンをブロツクするモノクローナル抗体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0174204B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0659233B2 (ja) |
| DE (1) | DE3584705D1 (ja) |
| DK (1) | DK405785A (ja) |
| FI (1) | FI853395L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08324578A (ja) * | 1995-06-02 | 1996-12-10 | Atena Shoji Kk | 往復通信用封筒 |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5179018A (en) * | 1983-10-14 | 1993-01-12 | Centocor, Inc. | Mamalian monoclonal antibodies against endotoxin of gram-negative bacteria |
| US4844894A (en) * | 1984-07-12 | 1989-07-04 | Ribi Immunochem Research Inc. | Method of inhibiting the onset of septicemia and endotoxemia |
| US4918163A (en) * | 1985-09-27 | 1990-04-17 | Pfizer Inc. | Monoclonal antibodies specific for lipid-A determinants of gram negative bacteria |
| US4777136A (en) * | 1985-09-27 | 1988-10-11 | The Regents Of The University Of California | Monoclonal antibody reactive with Pseudomonas Aeruginosa |
| US5179001A (en) * | 1985-09-27 | 1993-01-12 | The Regents Of The University Of California | Detection and monitoring of chronic and gram-negative infection |
| ES2009365A6 (es) * | 1986-04-24 | 1989-09-16 | Univ California | Procedimiento de otencion de anticuerpos monoclonales para bacterias gram-negativas. |
| EP0256713A3 (en) * | 1986-08-06 | 1989-02-15 | Merck & Co. Inc. | Therapeutic human antipseudomonas aeruginosa antibodies |
| US5001065A (en) * | 1987-05-27 | 1991-03-19 | Cetus Corporation | Human cell line and triomas, antibodies, and transformants derived therefrom |
| WO1990003186A1 (en) * | 1988-09-19 | 1990-04-05 | Cetus Corporation | Gram-negative bacterial endotoxin blocking monoclonal antibodies |
| CA1341375C (en) * | 1988-10-12 | 2002-07-09 | Baxter International Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of gram-negative bacterial infections |
| DE3843784A1 (de) * | 1988-12-24 | 1990-06-28 | Battelle Institut E V | Verfahren zum nachweis von gramnegativen mikroorganismen sowie hierfuer geeignete dna-proben und antikoerper |
| US6586222B1 (en) | 1989-08-16 | 2003-07-01 | Chiron Corporation | Recombinant PR-3 and compositions thereof |
| US5843693A (en) * | 1989-08-16 | 1998-12-01 | Chiron Corporation | Assay method for screening for inhibitors of proTNF conversion |
| US5998378A (en) * | 1989-08-16 | 1999-12-07 | Chiron Corporation | Compositions for the inhibition of TNF hormone formation and uses thereof |
| JP2930713B2 (ja) | 1989-08-16 | 1999-08-03 | カイロン コーポレイション | タンパク質ホルモン形成の抑制用の組成物およびその使用法 |
| JPH10504441A (ja) | 1994-03-07 | 1998-05-06 | カイロン コーポレイション | Ｔｎｆ形成阻害のための組成物およびその使用 |
| US6790661B1 (en) | 1999-07-16 | 2004-09-14 | Verax Biomedical, Inc. | System for detecting bacteria in blood, blood products, and fluids of tissues |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1262238C (en) * | 1982-09-30 | 1989-10-10 | HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST BACTERIAL TOXINS | |
| DE3484773D1 (de) * | 1983-05-06 | 1991-08-08 | Velos Group | Mit endotoxinkern reaktionsfaehige monoklonale antikoerper. |
| US5179018A (en) * | 1983-10-14 | 1993-01-12 | Centocor, Inc. | Mamalian monoclonal antibodies against endotoxin of gram-negative bacteria |
| WO1985002685A1 (en) * | 1983-12-12 | 1985-06-20 | Meru, Inc. | Method and materials for the identification of lipopolysaccharide producing microorganisms |
-
1985
- 1985-09-04 FI FI853395A patent/FI853395L/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-09-05 DE DE8585306329T patent/DE3584705D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-09-05 JP JP60194981A patent/JPH0659233B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-05 DK DK405785A patent/DK405785A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-09-05 EP EP85306329A patent/EP0174204B1/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，４５（３）．６３１−６３６（１９８４） |
| ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７（６），１０５０−１０５３，（１９８３） |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08324578A (ja) * | 1995-06-02 | 1996-12-10 | Atena Shoji Kk | 往復通信用封筒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK405785D0 (da) | 1985-09-05 |
| DK405785A (da) | 1986-03-06 |
| FI853395A0 (fi) | 1985-09-04 |
| JPS6172800A (ja) | 1986-04-14 |
| EP0174204B1 (en) | 1991-11-21 |
| EP0174204A3 (en) | 1986-06-18 |
| FI853395L (fi) | 1986-03-06 |
| EP0174204A2 (en) | 1986-03-12 |
| DE3584705D1 (de) | 1992-01-02 |
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