JPS5899423A - 細菌性アドヒシンに対するモノクロ−ン抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、原始核細胞と成熟核細胞の相互接着に係わる
細胞表面抗原（アドヒシン）に特定される抗体の製造に
関するものである。多くの病原菌株が線毛、他の蛋白や
グリコプロティン、ホモ重合またはへテロ重合炭水化物
糖衣類の抗原表面構造を有しており、これらにより菌が
成熟核細胞に接輪する。アドヒシンを介しての付着によ
り、病変の発現に先立って侵入をうけた組織内に細胞が
増殖する。アドヒシンを有する病原菌による疾病は多様
であり、下痢、呼吸器性疾患、火傷性感染症等を含む。

本発明は、特に細菌性アドヒシンに対するモノクローン
性抗体の製造に関するものである。モノクローン性抗体
は、アドヒシンを媒体とする病原菌の成熟核細胞への付
！！（ならびに爾後の増殖）を干渉し、従って細菌を運
ぶアドヒシンにより生じる疾病の予防ならびに／又は治
療用の新しい治療剤として使われる。

更に詳しくは、本発明はビリ蛋白ならびにグリコ力リッ
クス多糖類を含むエスケリキア・コリ（Ｅ　５ｈｅｒｌ
ｃｈｌａ　　ｃｏｌｉ）　７ドヒシンに対す８−Ｅ／ク
ローン性抗体の細胞融合ハイブリッドによる製造法に関
するものである。Ｋ−９９、Ｋ−８８，９８７Ｐ１Ｆ４
１、Ｃ−ＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／Ｉ　Ｉならびに他のビリ等
のフィムブリエ表面蛋白は、エスケリキア・コリ（Ｅ、
ｃｏｌｉ）のエンテロトキシン産生菌を含む成る種の腸
内菌の動物ならびに入園の小腸の粘膜状内壁への付着に
関与するアドヒシンである。線維被膜グリコ力すツクス
多糖類は、原始核細胞と成熟核細胞の間の「セメント」
として作用することの出来る賜内菌表面アドヒシンの一
種である。アドヒシンを介する付着ならびにこれに引続
き生じる転移増殖は、医学上、特に獣医学上非常に重要
な疾病である腸内菌性エンテロトキシンにより惹起され
る下痢の前提である。ここに白う重要と言う意味は、こ
れが往々にして新生１牛、１羊、１豚に致死をもたらす
からである。

アドヒシン特異性モノクローン抗体の予防剤、治療剤と
しての用途は、動物や人間のエンテロトキシンによる下
痢性疾患の予防、治療に対する新規なアプローチである
。

本発明によるモノクローン性抗体は、ヒトや動物の医療
、又は診断用、分析用及び／又は精製用目的のために使
用することが出来る。本発明により、医学、Ｆ又は獣医
学上の診断又は微生物学研究・における６度の且つ特定
的なプローブとして使用可能なアドヒシンに対する同一
抗体を大量に繰り返し製造する方法を提供するものであ
る。更に、本発明により、ヒト又は動物において疾病の
原因となる最近のアドヒシンに対抗するモノクローン性
抗体を製造する方法を提供するものである。これらの抗
体の臨床上の潜在的Ｉ！性、特に家畜の免疫予防ならび
に免疫療法に適応した場合に獣医学上の商業的！！要性
は注目すべきものがある。

モノ　ロー゛ モノクローン性抗体の製造テクニックは、１９７０年台
の中頃にケーラー（Ｋ６ｈｌｅｒ　）とミルスタイン（
Ｍ　１ｌｓｔｅｉｎ　）とが骨髄原発性腫瘍の急性細胞
（骨髄ＩＩ）と牌臓リンパ球との融合に始めて成功した
。［Ｃ，ミルスタイン、［サイエンティフィック・アメ
リカン」誌、２４３（４）：６６〜７４（１９８１）］
、該方法により、リンパ球と骨髄腫細胞系両方の特徴を
所有する単一の融合細胞ハイブリッド、又はクローンか
ら生じるハイブリッド細胞系を作り出した。リンパ球（
羊の赤面法を抗原として初回抗原刺激を受けた動物から
採取）と同様に、ハイプリドーマと呼ぶ融合ハイブリッ
ドは、抗原に特異的なノムノグロプリンの単一タイプを
分泌した。更に骨髄腫細胞系と同様に、ハイブリッド細
胞系は不滅である。これら二つの特徴の組み合せにより
、公知の抗血清が現在使用されている研究、医学分野に
おいて多大の影響を与えた。ワクチン摂取をした動物由
来の抗血清は、同一再生をすることが出来ない抗体の様
々な混合体であるのに対して、モノクローン性抗体は、
単一タイプの６度に特異なノムノグ０プリンである。

ハイプリドーマの分泌したイムノグロブリンの単一タイ
プは、複数の抗原決定子を有する複合分子である抗原に
対する唯一の抗原決定子に対して特異的に働く。例えば
、抗原が蛋白である時は、抗原決定子は、総蛋白分子内
の多くのペプチド配列の内の一つであることがある［通
常は、長さ６−７アミノ酸である。（Ｍ、Ｚ、７タシ、
Ｍｏ＋ｅｃ。

Ｃｅ１ｆ　　、　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　　誌、３２：
２１　〜４３（１９８０）］。従って、＃ｌｉ了抗原に
対して発育させたモノクローン性抗体は、その形成を誘
引した決定子によりお互いに識別可能でありうる。その
産生する抗体は全て同一である。更に、ハイプリトーン
細胞系は、無限に再生可能であり、インビトロ又はイン
ビボで容易に増殖でき、非常に高濃度のモノクローン性
抗体を産出する。

七ツクローン性方法は、一般に適用可能であり、ケーラ
ー・ミルスタインの単赤血球細胞以外の抗原抗体の製造
に使用されて来た。例えば、モノクローン抗体を腫瘍細
胞に対して［米国特許第４゜１７２．１２４号］、ビー
ルスに対して［米国特許第４．１９６．２６５号１、グ
ループＢレンサ球菌［Ｒ，ケネット、Ｔ、マツヵーン、
Ｋ、ベクトル編、［モノクローン抗体、ハイプリドーマ
：生物学分析における新しい次元」プレナム、プレス刊
、ニューヨーク（１９８０年）、内のＲ，ボリン［レン
サ球菌抗原に対するモノクローン抗体］１育てた旨の報
告がなされている。これらの抗体は、讐のために育てら
れたそれぞれ個々の抗原に対し特異性を有し、賜内菌ア
ドヒシン又はアドヒシンを担持する腸内菌株に対する特
異性は有しない。本出願人は、本発明以前には、ヒトや
動物体内のエンテロトキシン産生細菌のコロニー化にか
かわる腸内菌アドヒシン抗原に対して特１１＠を有する
モノクローン抗体の製造が行なわれたことはないと信す
る。更に、モノクローン抗体がこれまでに、ヒト又は動
物の下痢を伴う疾患の治療又は予防的＠療に利用された
ことはないと信する。

細菌性アドヒシン 病原論にお１ノる細菌表面構造の役割をコスタ−トン他
が広範囲に論じている。（ＣＲＣＣｒ１ｔ。

Ｒ（！Ｖ、　Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏ１．　、９月号、１９
８１年、３０３−３３８　（１９８１）　）。論評され
た表面構造の多くが、アドヒシンをして働き、侵入をう
けた組織内の病原体の付着とコロニー化を容易にしてい
る。コスタ−トン他が論じたアドヒシンは、本発明のモ
ノクローン抗体を育てる抗原として使うことが出来、ア
ドヒシンを担する病原菌による疾患の予防と治療におけ
る有用な治療剤を提供する。

故にここに６スタートン他の上記文献を本願中に先行文
献をして含めるものである。

■ス　リ　　・コ１の　゛ヒ２゛ 多くのダラム陰性桿菌、例えばエスケリキア・」す（以
下、Ｅ、Ｃ０１１という。）の表面は、ビリ又はフィム
ブリエ（１１毛）と呼ばれる繊維状構造でおおわれてい
る。ビリは主として蛋白（ピリン）から成り、連合炭水
化物と脂質も含んでいる。これらは実験動物に注射する
抗原決定子として作用する。Ｋ−９９，に−８８，９８
７Ｐ、Ｆ４１を含む成る種のビリは、動物の小腸内でＥ
、ｃｏｌｉののコロニー化を司どる。同様に、ＣＦＡ／
ＩとＣＦＡ／Ｉｆビリとはヒトの小腸内のＥ、Ｃｏｌ＋
のコロニー化を媒介する。突然変異又はビリ遺伝子を運
ぶプラスミドの損失のいずれかにより、これらのビリを
欠くので、成る種の細菌の細胞は腸内粘膜をコロニー化
することが出来ない。明らかに、細菌の外表面上のビリ
は、ムコ多糖類との非特異的相互作用又は腸内上皮細胞
リセプターとの特異的相互作用によって腸管壁に付着す
るようである。

成る種のＥ、ｃｏ＋ｔのビリを有しない株は、動物の腸
管壁に付着することが出来る。これは細胞表面上の別の
付着構造の存在の故である。特異的には、Ｅ、Ｃｏ１ｔ
の成る種の株は、非常に整然としており、細胞と緊密な
関係を有して粘着性のある恭躾を形成する多糖体せんい
のマトリックスから成る糖衣により囲まれているか、又
はゆるく細胞と関係を有して、部分的に分離可能な細胞
外多糖体を形成する。糖衣により細胞表面に付着性が与
えられ、細菌は腸内壁のコロニー化が可能となる。

′（Ｊ、Ｗ、］スタートン他：ＣＲＣＣｒ１ｔ。

ＲｅｖｏＭ　１ｃｒｏｂｉｏｌ、　１９８１年９月、３
０３頁）。

アドヒシンを介する固定が、エンテロトキンを分泌する
Ｅ、ｃｏ＋＋の成る種の株に由来する下痢を伴う疾患の
前提となる。（Ｓ、ニーカー他、Ｉｎｆｅｃ、［ｓｍｕ
ｎ、　２５　：　１２１〜１２６ページ、１９７９年）
エンテロトキシン自体は下痢の開始の原因分子ではある
ものの、細菌が消化管内壁でコロニー化しなかった場合
、疾患の誘発に足る量は腸内では製造されないと信じら
れている。従って、細菌付着とこれに引続いておこるコ
ロニー化に対する干渉により、下痢を誘発するに足る量
のエンテロトキシンの生成が妨げられる。本出願人は、
１ンテ【］トキシン産生薗のアドヒシン抗原に対して特
異性を有するモノクローン抗体は、アドヒシンと相互作
用をもち、細胞固定を干渉すると信じる。従って、これ
らは、ヒトや動物におけるエンテロトキシンにより誘発
される下痢性疾患の予防、治療に対して新規且つ有用な
生物学的製剤である。

家　　生　における下痢性疾患 新生仔の１牛、１羊、１豚の可成りがＥ、ｃｏｌｉのエ
ンテロトキシン産生株にＳ染し、エンテロトキシンが誘
発する下痢疾患の結果死亡することが麿度ある。出生後
４８時間から７２時間以内に感染した場合、損害が甚大
となることがある。この期間には、動物は１染病原菌に
対して自然の抵抗力がない。母乳中の抗体により受動免
疫をうけた場合、こらは通常非常にまれであるが、を除
いて、動物は発病用を超えて生存するにたる抵抗力を有
しない。分娩３日後には、新生仔は自然にエンテロトキ
シン産生Ｅ、Ｃ１０１＋により感染症に対する抵抗力を
身につけ、成長した動物と同様に、病原菌に対して感受
性を有しなくなる。この理由は、腸の螺動が十分に発達
し、微生物を腸内から流し出すことが出来るからである
。従って、１牛、１羊、１豚を罹病の危険がある期間保
護して腸の蟻動の発達を持つことが特に重要である。こ
の保護を行うには、分娩直後に感染予防のため病原菌に
対する抗体を経口投与するか、感染症罹患後は、出来る
だけ甲く疾患を緩和させるか、又は消化器系統の発達を
まつあいた発現を遅らせるようにする。

モノクローン抗体は、最もありふれた且つ潜在的尚性を
もつエンテロトキシン産生菌の特異抗原に対して大量に
発育せしめることが出来、又動物を守るため経口投与が
可能であることから、この目的のためには理想的である
。

ヒトにおける下痢を伴う疾患 ヒトの下痢と関連づけられるエンテロトキシン産生Ｅ、
Ｃｏ１１株のアドヒシンは最近発見され、ＣＦＡ／　［
、ＣＦＡ／Ｎと命名された。これらアドヒシンを有する
エンテロトキシン産生株は、旅行者の下、幼児の下痢、
特に発達途上国の幼児の下痢の至要な原因と考えられて
いる。。［Ｗ、　Ｇａａｓｔｒａ及びＦ、　ｄｅ　　Ｇ
ｒａａｆ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　　４６
　（２）：　１２９−１６１・・（１９８２）］。

エンテ０トキシンによる下痢性疾患の予防と治療に・づ
る　　　　アプローチ Ｅ、００１１エンテロトキシン由来の下痢を伴う疾患が
ヒト及び動物の新生仔において、発病率が＾く、結果が
重大であり、死亡を伴うことがあるので、この予防、治
療用薬剤の必要性が痛感されている。伝統的な抗菌性の
アプローチは、１牛、１羊、１豚やヒトの感染するＥ、
ｃｏｌｉのエンテロトキシン産生株の多くが抗生物質や
他の殺菌性化合物に対して耐性が高いので普通的に立た
ない。

［１，ｍｌルニツア他、、　Ｒｅｆ、　Ｖｅｔ、　３６
　：８７−９３　（１９７９年）］。しかしながら、新
生期の下痢性予防と治療のための抗生物質療法に代わる
ものとして、免疫学的アプローチは興味深いものがある
。細菌のビリは元来抗原であり、更に腸管のコロニー化
、これに続く疾病の発現においてＩｌ！要な役割を果す
。コロニー化を干渉することにより、エンテロトキシン
由来の下痢発現を予防し、ビリに対する抗体は宿主を感
染から守るものである。エンテロトキシン産生Ｅ、ｃｏ
ｌｉに感染した宿主にあっては、抗体が腸内における微
生物の増殖を予防することによって、疾病の悪化を防ぐ
役をする。

哺乳中の新生仔は、初乳内の母体の抗体が移転して受動
免疫をうける。しかしながら、成牛、牝羊、牝豚はに−
９９又は他のフィムブリエ蛋白質を相持しているＥ、ｃ
ｏｌｉに対して感性がないが、イれらのビリに特゛異性
を有する抗体価は非常に低いか又は微量である。この問
題について購入かの研究者［Ｓ、、エフレス他１　ｎｆ
ｅｃ、Ｉ　ｗｍｕｎ、　２５　。

１２１〜１２６ページ（１９７９年）、Ｂ、ナギイ　、
　　　Ｉｎｆｅｃ、　　　ｒｓ−ｕｎ、　　２７．　２
１−２４　　＜１９８０年）１が妊娠中の家畜、特に牛
に精製又は一部精製済に一９９ビリのワクチン製剤を皮
下接種して、解決にあたろうとした。分娩後何度が追加
注射を行った後、母体の抗体価は、分娩後まもなくに一
９９ｗＡ性のエンテロトキシン産生ＬＩＣｏｌｉの攻撃
をうけた哺乳中の新生仔の多くを無事に守ることが出来
るに足るだけ高くなった。この方法は技術的には成功し
たが、実施にあたってはいくつかの欠点があり、母体へ
のワクチン接種を複数回行なうため真人な費用がかかる
こと、妊娠中のワクチン摂取を行うべき時期を定めるこ
とが不可能であること、母体の抗体力価の＊異、予防法
としてのみ用途が限られていること、更に獣医学界によ
る受入れがあまりよくないことなどである。

上記の如き問題を避けるため、トイレニンらは［［イム
ノコルによる腸内病原体Ｅ、ｃｏｌｉに対する幼若６牛
の経口免疫」第１１回国際家畜疾病に関するシンポジウ
ムで発表。１９８０年１０月１、エンテロトキシン由来
の下痢疾患の発現を予防するため新生仔に経口投与でき
るに−９９に特異性を有する抗体を含む製品を明らかに
した。この製品により妊娠中の家畜にワクチン接種の必
要がなくなり、抗体を予防的措置以外に治療用としても
支えることになったが、それでもいくつかの欠点があ′
る。こ製品は、Ｋ−９９の陽性Ｊ株の全細菌細胞を接種
した雌牛の血清から順造するので抗に一９９イムノグロ
ブリンの力価を希釈する可能性のる他の特異性との抗体
を含んでおり、従って製剤の効力をも希釈することがあ
る。更に、抗体の製造には雌牛−匹が必要であり、−匹
毎にイムノグロブリンは、抗体スペクトルについての質
的差があり、抗に一９９力価については饅的差がある。

経［１投与が出来るピリ蛋白に対して＾度の特異性を有
する抗体製造にモノクローン性テクニックを適用するこ
とにより、エンテロトキシン由来の下痢疾患の予防、治
療に対する従来の免疫学的アブロ〜チを明らかに改善す
ることが出来る。かかる方法により製造した融合細胞ハ
イブリッドは、この疾病を伝達する抗原に対して特異性
を有する抗体一種を産出する。同一イムノグロブリンの
高ｌＪ価は殆ど無歯ぞうであるが、これは抗体産出ハイ
ブリドーマのインビトロによる培養が無限に可能であり
、又マウスやその他の実験動物中で繁殖可能であるから
である。受動免疫戦略は、高価な母体へのワクチン接種
を必要とし、又は使用前に広範囲に１顎を必要とするか
もしれない非特異性抗血清（成獣の）製剤を得ることに
なる。しかしながら、モノクローン性アプローチは、実
験動物や培地等比較的安価で小規模の生産ユニットを用
いて特異性の高い抗体を大量に四造することが可能とな
る。（動物用として使用する場合は、必要があっても精
製は最低限ですむ。） 本発明以前には、アドヒシンに対して特異性を有する、
家畜又はヒトの皮膚、粘膜組織への細菌の付着とコロニ
ー化の原因となるピリ蛋白又は他の表面抗原に対するモ
ノクローン抗体についての報告は一切行われていない。

病疫の発現にはアドヒシンが伝達するコロニー化が必要
であるため、本発明によるモノクローン抗体は、病原菌
を担じるアドヒシンが感染組織に付着するのを干渉する
ことによりヒト及び動物の下痢性疾患、火傷性感染症を
含むがこれらに限定されない疾病ならびに感染症の予防
または治療の新規な方法を提供するものである。モノク
ローン性抗体は、経口的に、鼻腔内に、局所的に、又は
病原菌性感染の場所により他のルートで投与することが
出来る。

好ましい実施例においては、本発明は下痢疾患の原因と
なる腸内菌のピリ蛋白や他のアドヒシンに対するモノク
ローン抗体産出の方法を提供するものである。モノクロ
ーン抗体は、成人や幼児及び／又は分娩後の抵抗力のな
い牛、羊、豚の新生仔に予防又は治療の目的で軽口投与
することが出来る。動物の予防には、抗アドヒシンモノ
クローン性抗体を初乳又は他経口投与に適した且つ七ツ
ク（コーン性抗体ならびに動物の消化器管と適合する薬
剤担体と混合して、未感染の新生仔に対してエンテロト
キシン産生菌に対する自然の耐性を得るまでりえればよ
い。従来の筋肉又は静脈内経路による抗体投与は通常無
効である。本発明のモノクローン抗体により、動物の予
防的治療を行うことが出来、新生仔の間でエンテロトキ
シン産生菌の発生の疑いが見出されると同時に効力を発
することが出来る。モノクローン抗体投与が直効性であ
ることは、伝統的にとられている免疫上の手段である発
生時に授乳期の母親にワクチン接種を行う方法とくらべ
て顕著な改良を示すものである。

哺乳仔を保１１寸のに充分にだけ母体鳥体力価を高める
には時間的な遅延があるので、授乳中の母親にワクチン
摂取は有効ではない。これに加えて、七ツクローン性抗
体の経口投与により、発生時に授乳中の母親全部にワク
チン接種する必要がはふかれる。抗アドヒシンモノクロ
ーン抗体の更に別の利点は、その治療剤としての潜在的
有用性である。農場で鉤育されている動物にお６プるエ
ンテロトキシン由来の下痢疾患のコントロールに対する
免疫学上のアプローチは、大体において予防的なもので
あるのに対しく例えば、妊娠中の家畜にワクチン接種を
行い、特定の抗体が初乳により、母親から新生仔へと伝
達されるようにした）、本発明は、感染した動物へ直接
投与出来るので、免疫治療剤としても利用でき免疫剤を
提供するものである。治療剤としての利用は感染症の発
現に引続いて始めることが出来、畦乳仔が回復し、抵抗
力がつくまで継続することが出来る。

ヒトでは、治療は下痢疾患の徴候がｍｓされたと同時に
開始できる。子供又は成人が下痢疾患を惹起することが
知られている微生物に暴露した疑いがあるときは、予防
的治療を始めることができる。ヒトの治療には、モノク
ローン抗体とヒトの消化器管と共存可能な適当な薬剤を
担体として使うことができる。

本発明は、更にヒト、獣医学、微生物学研究にとって一
般的暖要性を有するモノクローン抗体製造のｈ法を提供
するものである。抗アドヒシンモノクローン抗体を診断
用プローブとして使用して、例えばエンテロトキシン産
生病原菌を常在菌の間に見出すことが出来る。抗体−抗
原の相互作用による超特異性識別で、素早く診断が可能
となり、予防的又は治療的処置を迅速に行うことが出来
る。

モクローン抗体−抗原相互作用を利用して、従来の抗血
清が利用出来ない抗原連続変位の検出にも使用すること
が出来る。免疫学的相互作用の特異性が＾いことも、抗
アドヒシンモノクローン抗体が、微生物学、細菌学又は
生化学的研究における？ドヒシンの質量分析又は純化の
ための重要な実験手段として使用される一因である。従
ってアト゛ヒシン含有の生物学的サンプルを抗アドヒシ
ン抗体と接触させて、アドヒシンー抗体複合体を形成し
　サンプルから分離することが出来る。アドヒン シン−抗体複合体は、純化アドヒシンを回収するため解
離することが出来る。

抗アドヒシンモノクローン抗体をハイブリドーマ・テク
ニックで製造できるので、本発明は微生物アドヒシンに
対する単一特異性を有する抗体の高力価を常に得ること
の出来る不死の細胞ライン（ｉｍｍｏｒｔａｌ　　ｃｅ
ｌｌ　　１ｉｎｅ）を提供するものである。

これは、従来技術において免疫動物中に抗体を育てて、
その結果得た血清が異なる特異性を有する複数の抗体を
含んでおり、これが免疫接種のたびに各動物につき、更
に動物の固体によってタイプ、力価毎にことなる事実と
くらべて明らかな利点である。

本発明は、ハイブリドーマ・テクニックを他の細菌性ア
ドヒシンや他の宿主種におけるコロニー化の原因となる
表面抗原に対するモノクローン抗体の産生に適用するこ
とを目的とする。更に本発明は、各々違った細菌株のア
ドヒシン抗原に意図されるいくつかのモノクローン抗体
を含有する薬剤を目的とする。

ｈ−」Ｌ 病原菌細胞の外表面は、いくつかの疾患の原因に介在す
ることがある。この介在についての研究によれば、ビリ
や他の蛋白、糖タンパク質、グリコ力リックス多糖類を
含む成る種の抗原アドヒシンが動物やヒトの粘膜表面組
織内に増殖する細菌の付着とコロニー化に関係している
。

エンテロトキシン産生性細胞の付着、特に哺乳類の腸内
粘膜にエンテロトキシン産生エスケリキア・」す（Ｅ−
ＴＥＣ＞が付着するのを媒介する抗原ビリ蛋白がいくつ
かある。これらの中には、牛、羊、豚のＥＴＥＣに付着
するに一９９抗原、牛のＥＴＥＣに付着するＦ４１抗原
、豚のＥＴＥＣに付着するいわゆるコロニー化因子抗原
（ＣＦＡ／１、ＣＦＡ／ＩＩ）を含む。所望の抗体によ
り、これらの血清学上顕著なビリ蛋白又は他のアドヒシ
ンの内いずれもが、マウスのごとき動物に与えて融合の
ため抗体産生体細胞を得るための抗原として適当である
。換言すれば、動物からの抗体産生体細胞を採取する前
に数週間にわたってアドヒシン注射を１回又は連続して
数回（初回と１回又は複数回のブースター注射）行うこ
とにより動物に対して対抗原免疫を与えることができる
。抗原は、アドヒシンを担持する原細菌（Ｕ−）又はそ
のアドヒシンを担持する一部分のごとき未精製な形で又
は精製アドヒシンとして、又はその免疫原性を有するフ
ラグメントとして、投与することができる。本件の例で
は、標準テクニック［Ｒ，アイザツクソン、ｌ　ｎｆｅ
ｃ、　　■ｇｉｓｕｎ、誌、１５：２７２−２７９　（
１９７７年）］を使用してｌ：、ｃｏｌｉ株１４７４か
らＩｌ報したに一９９抗原の顎剤を使用した。Ｅ、ｃｏ
ｌｉ株８４１，８４２．８４４を含む他のＥ、ｃｏｌｉ
のエンテロトキシン産生株も、モノクローン抗体を育て
るのに利用できる抗原の供給源として支えるビリを担持
している。

Ｅ、ｃｏｌｔ以外の他のビリも免疫原性があり、アドヒ
シンとして作用する。例えば緑膿菌（ｐ　ｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ　　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のビリである。そ
の他にも、ビリ以外の蛋白で原始細胞が成熟細胞へ付着
するのに介在するものがある。例えば、グループＡスト
レプトコッカスのＭ蛋白は抗原としても作用するアドヒ
シンである。又細菌性グリコ力リックスも、アクチノマ
イセス（Ａ　ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）　、バクテ０イテ
ス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）　、ヘモフィラス（）ｌ
ｅｅｏｐｈｉｌｕｓ　）　、シュードモナス（ｐ　５ｅ
ｕｄｏｓｏｎａｓ）、サルｔネラ（６ａ１ｇｉｏｎｅｌ
ｌａ　）　、ストレプトコッカス（Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ）　、ブドウ球菌（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ　）　、やその他多数（コスタ−トン他、１掲
）の病原菌の発病因子であることが立証されている。

これらの病原菌の内いずれかによっておこる疾患は、細
菌が産生じたグリコ力リックスを一因とする粘膜のコロ
ニー化の結果みられるものである。

グリコ力リックス炭水化物は、抗原としての使用に適し
ている。

休　　細　　胞 抗体産生能力のある体細胞、特にＢ細胞はＢ細胞骨髄腫
系との融合に適している。これらの有糸分裂を行う抗体
産生細胞は、選択的に融合する。

投与をうけた動物のリンパ腺と牌は便宜的な供給源であ
る。特定の融合系で最適な活動を呈するリンパ器官なら
どれでも使用することが最善であるが、但し融合最適化
を左右する因子については殆ど知られていない。一度投
与をうけた又は高度免疫をうけた動物は、抗体産生リン
パ球の供給源として利用できる。マウスとラットのリン
パ球は、以下に述べるマウスと骨ｌｌＩ腫系との安定融
合の割合が高い。しかしながら、兎、ヒト、蛙の細胞も
可能である。好ましい実施例においては、高度免疫をう
けたマウスの牌臓の細胞を利用して融合細胞ハイブリッ
ドを産生ずる。

１１１ｉ 特殊骨髄腫細胞系をリンパ鰻腫瘍からとってハイブリド
ーマ産生融合処理に利用している。［Ｇ。

ケーラー＆Ｃ，ミルスタイン、Ｅ　ｕｒｏｌｌ、　Ｊ　
、　　Ｉ　ａｍｕｎｏｌ、誌、６：５１１−５１９　＜
１９７６年）：Ｍ、シュルマン他、Ｎ　ａｔｕｒｅ誌、
　ＬＬＬ：　２６９−２７０　（１９７８年）］細胞系
の開発には少くとも三つの理由がある。第１には、非融
合の且つ類似の無限に自己増殖を続ける骨髄腫細胞の中
からの融合ハイブリドーマの選択を容易にするためであ
る。通常これを行うには、酵素欠乏性骨髄腫を使ってハ
イブリドーマの成長を支える成る種の選択的媒体内での
成長を止めることにより行う。

第２の理由は、リンパ腺細胞の自分の抗体を産生ずる固
有の能力から由来する。モノクローン・テクニックを利
用する目的は、ハイブリドーマの体細胞成分により遺伝
子的に指令をうける所望の単一特異性を有する抗体を産
生ずる不滅の融合ハイブリッド細胞系を得ることにある
。ハイブリドーマが腫瘍ａｍ抗体の産生を行うことを妨
げるためには、イムノグロブリンのＬ鎖又はＨ鎖の産生
が不能な骨髄細胞系又は抗体分泌桟構欠乏性のものを使
用する。細胞系選択の第３の理由はその適性と、融合効
果の良いことである。

Ｐ３／ＸＡＱ　８．Ｐ３／ＮＳ　Ｉ／１−ＡＱ　　４−
１．Ｓｐ　２１０−Ａｏ　１４．８１９４１５．ＸＸ０
−ＢＵ、１．を含む融合細胞ハイブリッドの産生にいく
つかの骨髄腫細胞ラインを使用することができる。Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ３とＰ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１１１
胞系についてはケーラーとミルスタインが報告した。［
Ｅ　ｕｒｏｐ、　Ｊ　、　　［ｇｖｕｎｏｌ、誌、６：
５１１−５１９　（１９７６年）］。

シュルマン等はＥ　Ｎ　ａｔｕｒｅ誌、　ＬＬＬ：　２
６９−２７０、（１９７８年）］にＳｐ　２１０−Ａｇ
１４骨髄腫系を開発した。８１９４１５．ＸＸＯ。

ＢＬＪ、１骨勅腫系についてはドロウブリッジ［Ｊ　。

Ｅｘｐ、Ｍａｄ、１４８：３１３　（１９７９年）］。

の報告がある。本発明の実施例ではＰ３／Ｘ６３−Ａｏ
　８　（ＢＡＬＢ／Ｃマウス由来）の非分泌型突然変異
体であるＰ３／ＮＳ　［／１−Ａａ　４−１を好ましい
細胞系としている。

に釦 抗体産生牌又はリンパ腺細胞と骨髄腫細胞とのハイブリ
ッド生成の方法は、通常体細胞と骨髄腫細胞とを１０＝
１の割合で（但し割合は２０：１から１：１にわたって
変更可）、各々細胞膜の融合を促進する一種又はそれ以
上の物質の存在下に混合することから成る。融合処理で
使用する体細胞と骨髄腫細胞は、同じ種の動物から採る
のが好ましい。融合の方法は、ケーラーとミルスタイン
［Ｎ　ａｔｕｒｅ誌、２５６：４９５〜４９７　（１９
７５年）　、Ｅｕｒ、　Ｊ　、　　［ｓｍｕｎｏｌ、誌
、６：５１１−５１９　（１９７６年）］、ゲゲッター
［Ｓｏｇｉａｔ＋ｅＣｅｌ　ｌ　　　Ｇ　ｅｎｅｔ、　
β−：　２３１−２３６　（１９７７譚）］による。上
記研究者の使用した融合促進剤は、各々センダイ・ウィ
ルスとポリエチレン・グリフール（ＰＥＧ）であった。

本発明の実施例における融合処理はゲッター等の方法［
１掲］を修正したものであり、ＰＥＧの他に、細胞膜を
左右する別の物質であるジメチルサルフオキサイド（Ｄ
ＭＳＯ）をマウスの牌と骨髄細胞混合物に添加して融合
細胞ハイブリッド、即ちハイブリドーマの形成を促進す
る。

クローンの分離と抗体の検出 融合処理により、非常に低い頻度で可変ハイブリッドを
産生ずるので（例えば、牌臓から体細胞を採る場合は、
約２×１０５　牌臓細胞当り唯一つのハイブリッドしか
入手出来ない）、残りの非融合細胞より、特に非融合骨
髄腫細胞より、融合細胞ハイブリッドを選択するための
手段をもつことが大切である。他の融合細胞ハイブリッ
ドの中で所望の抗体産生ハイブリドーマを検出する手段
も必要となる。

通常、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドーマ
の成長を助けるが、通常は無限に分割し続【プる骨髄腫
の成長を妨げる培地内で細胞を培養することにより行わ
れる。（融合に使用した体細胞はインビトロ培地で生育
することが出来ず、従って問題とはならない。）。本発
明の例では、ヒボキサンチンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（ＨＰＲＴ）　ヲ欠＜ｆｆＨＡｍｍｆｌｌ’ｌ
：使用シた。これらの細胞は、融合細胞ハイブリッドが
牌細胞のＨＰＲＴ−陽性遺伝子型の故で生存可能な培地
であるハイポキサンチン／アミノプテリン／デミディン
（ＨＡＴ）培地に対して選択した。相異なる遺伝子型欠
乏を有する骨髄腫細胞（例えば他の酵素欠乏、薬物過敏
性等）で、遺伝子タイプ上受容能力のあるハイブリッド
の成長を支える培地に対して選択の出来る細胞の使用も
可能である。

融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するには数週間必
要である。この期間の初めに、所望の抗体を産生ずるハ
イブリッドを識別して、その後でりＤ−ニゲ、増殖でき
るようにすることが必要である。通常は、得られたハイ
ブリッドの約１０バー〔ントが所望の抗体を産出するの
であるが、１〜３０％の範囲も珍しくない。抗体産生ハ
イブリッドの検出はいくつかの標準アッセイ法の内いず
れを使ってもよく、この中には酵素結合イムノアッセイ
やラジオイムノアッセイ法等文献に発表されたものも含
まれる。［Ｒ，ケネット、王、マクカ〜ン、Ｋ、ベクト
ル（編）モノクローン抗体、バイブリド−７：生物学的
分析における新しい次元、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　、　ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：ａ　
　ｎｅｗ　　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　　ｉｎ　　ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　ａｎａｌｙｓｅｓ、、ｌ）ｐ　３７６
−３８４．ブレナム・フレス、ニューヨーク（１９８０
年）１゜本発明の実施例に使用される検出方法は、ベロ
キシグーセー結合体マウスイムノグロブリンを使用した
酵素結合イムノアッセイであった。

ｌＪ−増１Ｌζ五」１【ニー 所望の融合細胞ハイブリッドを選択し、個々の抗体産生
細胞系へクローニングをした後では、各細胞系は二つの
標準方法のいずれかにより増殖を行うことが出来る。ハ
イブリドーマのサンプルを最初の融合のための体細胞と
骨動ＭＩＩＪ胞を採るのに使ったタイプのｍｓｉ＋適合
性を有する動物に注射する。注射をされた動物は、融合
細胞ハイブリッドの産出した特異なモノクローン抗体を
分泌する腫瘍を発生する。血清や腹水等の動物の体液を
採取し、高濃度のモノクローン抗体を得ることが出来る
。これに代えて、個々の細胞系を実験室の培地容器内で
インビトロで増殖してもよく、高濃度の単一特異モノク
ローン抗体を含む培地を傾斜、濾過又は遠沈により回収
することが出来る。

コロニー化を伝達するアドヒシンに対しモノクローン抗
体を臨床的に使用して、アドヒシンを担持する病原菌を
原因とする疾患の予防又は治療に用いることが出来る。

例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ等のエンラロトキシン産生菌の表
面ビリに特異性を有するモノクローン抗体を臨床的に使
って、６牛、６羊、６豚を含む新生期動物とヒトの成人
、子供における工Ｏテロトキシン由来の下痢疾患の予防
ならびに／又は治療に用いることが出来る。これらのモ
ノクローン抗体の投与の方法は、口腔経由であることが
好ましい。モノクローン抗体は、いくつかの適当な液体
の伝播体の内のいずれかに懸濁又は溶解して、いくつか
の経口ルートの内の一つを使っＣ新生仔に投与すること
が出来る。動物の腹水又は抗体産生クローンを増殖した
インビトロ培地は、薬剤学的に使用可能な液体担体であ
り、精製又は濃縮なしに直接使用可能であるが但し消Ｑ
が好ましいこともある。在る場合には、又特にヒトの治
療の場合には、精製が好ましい場合もあり、又政府規則
により必要とさ気ることがある。単クローン抗体が薬理
学的に有効な用量だけ存在している・ことを条件として
、抗体と・・初乳の混合物、抗体とスキ１１ミルク、及
び又は抗体と牛の血清アルブミン（アルブミン濃度が１
〜２０儀Ｑ／ＩＩのもの）を含む他の液体成分も薬剤学
的には適当である。

動物では、これらの抗ビリ液体モノクローン抗体相成を
挿管法、びん又はカプセル等で経口投与プることが出来
る。予防措置として、抗体成分の投与は分娩直後又は数
時間後に開始し、動物が感染性病原菌に対する自分自身
の防御を得るまで継続するものとする。又は抗体の投与
は、家畜の一群中にエンテロトキシン産生菌の発生があ
った場合にのみ、感染した家畜の治療と、疾患が他の動
物に拡がるのを防ぐために行うことがある。

ヒトでは、モノクローン抗体組成は好ましくはカプセル
の形で投与するのがよいが、他の適当な担体を使ってパ
もよい。

アドヒシンに対して特異性をもつモノクローン抗体は医
学やその他研究目的のためにも有用である。例えば、こ
れらのモノクローン抗体を診断のため使用して、常在菌
中にアドヒシンを担持する株の存在を＾い精度で検出す
ることができる。その他の用途としては、アドヒシンに
対して特異性を有するモノクローン抗体をアフイニテイ
・クロマトグラフィー・システムに使ってアドヒシンの
超選択的Ｒ製を行うことや、アッセイ・システムに使っ
てアドヒシンの定量測定に使うことが出来る。

実　　施　　例 高度免疫スケジュール 精１１１に一９９ビリ蛋白に対する抗体を産生ずる碑細
胞を得るため、ＢＡＬＢ／Ｃマウスを二通りのスケジュ
ールにより抗原（６牛由来のエンテロトキシン産生Ｅ、
ｃｏｌｉ株１４７４から得た抗原）で高度免疫を与えた
。但し伯の免疫スケジュールを使っても同様に良い結果
が得られる。一つのスケジュールでは、抗原（５０μｇ
１μＱ−マイクログラム）とフロイント完全補助液（１
：１）０゜５１をマウスの背中に皮下注射した。初回抗
原刺激後約１２週目に、マウスに抗原を各々１ｉｅＩ内
注射と静脈内注射によりブースタ投与を行った。ブース
ター投与は２遍間の間隔をあけ、０，５１のＴＳＥＩＩ
！ｌｉ液（Ｔｒｉｓ　−８・ａｌｔ　−ＥＤＴＡであっ
て、１０ｉＶＴＲＩＳ、１５０ｍＭ塩化ストリウム、Ｉ
ＩＭエチレンジアミンテトラア・セテイツク酸を各々含
む）に抗原（５０μ０、好ましくは１０〜５０μｇ）を
含ませた。第２回目のブースター投与３日後、マウスを
殺して、ｐＩｉＩを第６．２節に記載のように用いた。

別の実施例では、上記と同様にＢＡＩＢ／Ｃマウスに初
回抗原刺激を行った。１２週目に、ＴＳＦ緩衝液０．５
１中に抗原（５μＱ）をいれたブースター液を腹腔内注
側を行った。これを約２週間後にくり返した。ブースタ
ー注射後３臼目にマウスから牌臓をとり出し、下記に記
す方法で処理した。

脛１０［ 高度免疫を与えたＢＡＬＢ／Ｃマウスの牌臓を滅菌状態
で取り出し、ＤＭＥＭ　（ダルベツコの最小必須培地）
の血清を含まない培地（ギブコグランド・アイランド・
ニューヨーク）で洗浄した。

牌臓を金属製スクリーン上で浸軟し、その後で細胞をＤ
ＭＥＭ培地（１０ｓｌ／牌臓）内に再び懸濁し、遠沈し
た。上澄留分を除去し、牌細胞を血清を含まないＤＭＥ
Ｍ培地に二度懸濁した。細胞の数を、畳語腫細胞と混合
する前に顕微鏡で直接数えた（牌臓と骨髄細胞を融合し
てハイブリッドを産生ずる方法の項参照）。

’ｌｌ［！ ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ３／ＮＳ　Ｉ／１−Ａａ４−１
細胞系リンパ球腫瘍細胞（突然変異株、８−アザグアニ
ン耐性、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ３由来の非分泌系）を、５
〜１５％ＦＣ８（牛胎児血清）と１５μｇ／ｌ　８−ア
ザグアニンを含み、１００Ｕ／ｍｌベニリンと１００μ
（Ｊ／ｍｌストレプトマイシンを追加したＤＭＥＭ培地
中に、５〜１０％二酸化炭素雰囲気内で保持した。骨髄
腫細胞は対数期（細胞密度が絶対に約２　Ｘ　１０’　
細胞／ＩＩを−Ｆまわらない）で保持した。細胞融合処
理（第６゜４節）の前に、骨髄腫細胞を血清を含まない
ＤＭＥＭ培地で遠心分離により洗浄し、同培地に再懸濁
し、顕微鏡で数えた。

と　　　　　　　　４してハ　　１ツ゛１弘り先 牌臓と骨髄腫細胞をＤＭＥＭ血清を含まない培地で洗浄
して後、カウントし、底部が円形のプラスチック製管で
１０：１の割合で混合した。細胞懸濁液を室温で５分間
２５０Ｘ（Ｊで遠心分離にかけた。上澄留分を全て注意
深く吸引して、細胞ベレットを３５〜４０％（Ｖ／Ｖ）
ＰＥＧ、１５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳｏ、４５〜５０％（Ｖ
／Ｖ）　血清を含有しないＤＭＥＭ培地を含む溶液０．
２〜２、Ｏａｔに１〜２分間そっと再懸濁した。細胞懸
濁液に対して、・血清を含有しないＤＭＥＭ培地１８／
２０＋ｅｌを管を攪拌しつつ徐々に滴下する。

（この処理は４分〜８分かかった）。懸濁液は上記の通
り遠心分離した。細胞ペレットを２０％馬面清又は１５
％牛脂児面清のいずれかを含むＤＭＥＭ５０ｍｌ内に再
懸濁した。これにペニシリン、ストレプトマイシン、Ｈ
ＡＴ成分（１２園Ｍヒボキサンチン、９ｕＭアミノプテ
リン、８−Ｍチミディン）をサブルメントとして加えた
。融合細胞はＴＯ２４ミクロタイター・プレート（コス
タ−社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の穴へ入
れた。この培地は融合細胞に対して選択的である。従っ
て、ハイブリッドは成育し、非融合の牌臓と骨髄腫細胞
は培地で死滅する。

１色１１匹ｌＫ 舶項に述べた融合処理の次に２〜４週間の培養期間を設
けて、ハイブリッド細胞を成長させた。

必要に応じて、マクロタイター・プレートの穴のＨＡ　
Ｔ培地の約半分を除去し、新しいＨＡＴ培地を加えた。

約２〜３週間後、細胞にあたえる培地のタイプをＨＡ　
Ｔ培地からＨＡＴなしの培地へと変更した。スクリーニ
ングは、つぎの項に記した融合後２週間目に開始した。

抗体産生ハイブリッドのスクリーニング酵素結合イムノ
アッセイを用いて、抗体産生のための融合細胞をスクリ
ーンした。ミクロタイター・プレートの穴（９６穴、フ
フルユン）をに−９９ビリ蛋白抗原（６０ｓ＋Ｍ炭酸ナ
トリウム内で５０μｇ　／−１、Ｆ）Ｈ９，６）０．　
１ｍｌで、　３７℃、１５〜３０分で被覆した。液体を
除去して、プレートをトウィーン２０（ポリオキシエチ
レン・ソルビタン・モノラウレート）緩衝液で３度洗浄
した。［Ｈ，フリートマン（編）　Ｍａｎｕａｌ　　ｃ
ｌｉｎｉｃａｔ　　１ｓｕｅｕｎｏ１０１１１Ｖ−ｐＨ
５０６−５１２（１９７６）］。洗浄後、融合細胞を選
択したマクロタイター・プレートの穴から０．１１１の
培地０．１１をとり、ミクロタイター・プレートの穴へ
入れに０プレートは室温で３０分間培養し、その後トウ
ィーン緩衝液で３度洗浄した。その次にペロキシダーゼ
結原抗マウスＩａ　Ｇ　（Ｌ鎖、Ｈ鎖特異）イムノグロ
ブリン（カベル・ラボラドリース顎、コクランビル、ペ
ンシルバニア）０．１ｍｌをトウィーン緩衝液で１　：
　１．０００に希釈し、ミクロタイター穴へ添加した。

プレートを往復振盪機上で室温で３０分間振盪させ、そ
の後トウィーン緩衝液で３度洗浄した。酵素が抗に一９
９抗体のいずれにも結合しているので、基質液［ＯＰＤ
緩衝液、ｐ　１−１５゜０：２５ｍＭクエン酸塩と過酸
化水素（４０μｍ３０％　８２０２１１００ｍ１緩衝液
）を含む５０ｍＭ燐酸ナトリウム］０．１１１を穴へ添
加し、プレートを室温で１５分間振盪させた。１５分後
に比色定量Ｍ東反応を停めるため２．５Ｍ硫酸を添加し
たトで、プレートの写真をとり、陽性の穴を調べた。か
かる陽性の穴内で形成された細胞を２８Ｄ４Ｅ４と命名
した。その後、初回の選択マクロタイター・プレート内
の対応する融合細胞をクローニング処理した。

限界希釈クローニング クローニングの約１２時間前に、非免疫マウスの牌のフ
ィーダー細胞を浸軟し、２０％馬向清又は１５％牛脂児
血清のいずれかに細胞を懸濁して、最終濃度３　Ｘ　１
０’　細胞／１を得た。ミクロタイター・プレートの穴
内に牌臓細胞０．１１を添加した。このシーディング処
理により融合細胞ハイブリッドの成育に適した環境が得
られた。

クローニングは、融合細胞の選択の項に記載のハイブリ
ッド選択に使用したマクロタイター・プレートの穴の中
の融合細胞を数え、これを補充した０ＭＭ培地内でミク
ロタイター・プレートの第一番目の大全てが一個のｅｔ
ｔ＋ｍを受ける濃度にまで希釈し、更に希釈したミクロ
タイターの穴へ添加することによって行う。培養を２〜
３週園行って後、（その間に培地を定期的に補充し、シ
ードした請細胞が生存能力を失った）ハイブリッド・ク
ローンが増殖前にミクロタイターの穴に現われた（つき
の項を参照）。クローンは酵素結合イムノアッセイ・シ
ステムを用いて抗体産生のため再スクリーニングを行っ
た。

ハイプリツ゛　　の増殖と抗体産生 クローンがミクロタイター・プレート内で融合するまで
成長した後、マクロタイター・プレートへ移し、マウス
へ注射するのに適当な細胞密度（−注射当り１０６　細
胞）に達するまで培養した。

同遺伝子型マウスに個々のクローンの量を違えて注射し
た。腹水の量が顕著になった後で、マウスを穿刺した。

腹水は通常抗に−９９モノクローン抗体を含み、その濃
度は、１０ｓ〜１０６倍に希釈しても酵素結合イムノア
ッセイ・システム内に陽性反応を得ることの出来る濃度
であった。

１船ム人に 妊娠１１５日目の普通の牝豚から帝王切開により仔豚１
０匹を得た。新生仔には初乳を与えず（従って母体の抗
体が新生仔に移らなかった）、病原菌のない環境に２〜
３時間おいた。その後で、仔豚に挿管し、Ｋ−９９陽性
Ｅ、ｃｏｌｉを含むトリプシン・ソイ・ブロースの規定
鏝を与えて、それから表１に成分を示す希釈液に特定量
のモノクローン抗体（遠心分離により清澄した腹水から
採取）を溶解したものを与えた。ｆ、、−ｃｏｌｉと抗
体を投与した後、管内に少量の空気を吹きこんだ。仔豚
は、同一の室内で、別個のケージに入れ、５ＰＥ−ラッ
ク・ソウ・ミルク・リブレーサー（豚用代用乳）しボー
デン１（コロンバス・オハイオ州＞　：ｓｐＦは［持具
病原菌を含まない」という意味である］仔豚には全く母
乳を与えなかった。研究は６日間にわたって続けられ、
この間に仔豚の生活係は、コンロールと実験用動物との
差を知らされなかった。

ｆｉｌ　　　Ｋ−９９に対するモノクローン抗体の仔豚
数　　　　　　　　２　２　２　４トリプシン・ソイ・ プロ　−　ス　　　　　　　　　　　＋　　　　　十十
十に一９９陽性Ｌ２姐比　−十＋＋ 希釈剤（２０１Ｍ　　Ｔｒｉｓ 牛血清アルブミン２０■Ｑ／１゜ １）８７．２）　　　　　　　　　　　　　十　　　　
　十　　　　　＋　　　　　　＋無関係モノクローン 抗体　　　　　　−−一十 に−９９モノクローン 抗体　　　　　　１°　０　　０　　３”６日後の生存
数 ０　第１群の仔豚１匹が死亡したが、これはに−９９Ｍ
性Ｅ、ｃｏｌｉＴ痢疾患の故ではない。

＠Ｈ４匹中１匹かに一９９陽性Ｅ、Ｃｏ１ｔ下痢疾患で
死亡 臨床テストで使用したに一９９陽性Ｅ、ｃｏｌｉ株Ｂ４
’ｌは、ｌ１ｌｉ準方法によりＭｉｎｃａプレート上テ
成育させた。［Ｐ、Ａ、Ｍ、、ｖニー等、　、　　Ｉ　
ｎｆｅｃ。

夏　ｍａｕｎ、　　１　５　　（２）　　：　　６７６
〜６７８．　　　（１９７７年〉１゜プレート培地をこ
そげとり、グリエロール含有の培養基に再懸濁し、部分
標本内で凍結させた。Ｋ−９９抗原の存在を調べるため
Ｅ、Ｃｏ柱をスライド・グルティネーション・テストに
よりヂエックした。約１．３Ｘ１０　　Ｅ、Ｃｏ１ｔ（
ブレ−ト・カウントで測定）を各動物に与えた。従って
、各仔豚は、抗原（Ｋ−９９陽性Ｅ、ｃｏｌｉ）を１回
量、抗体（モノクローンに−９９）を１回量この順序で
投与をうけた。

表１に臨床テストの結果を示す。モノクローン抗体が下
痢疾患の発現、そのｉ後の死亡の予防に有効であること
は「テスト」欄に明らかに示されている。Ｋ−９９陽性
ｆ＝　ｃｏｌｉの投与をうけた後で、抗に−９９ビリ蛋
白モノクローン抗体の投与を受けた仔豚４匹の内３匹が
６日間生残った。

本明細書に記載した２ＢＤ４Ｅ４なる細胞系は、メリー
ランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクシ」ンに寄託し、アクセツション・ナンバーＡ
ＴＣＣ第８８８１７８月が付された。ここに記載し、特
許の請求を行った発明は、この寄託を行った細胞系に限
られるものではない。というのも寄託した実施例は、発
明の一局面を示す一例としてのみ意図され、機能的に同
等のモノクローン抗体を産生ずる同等の細胞系であれば
如何なるものであっても、本発明の範囲内にある。上記
に示し、説明した本発明の変更例の他にも、多様な変更
が可能であることは、前記の説明から当該分野の専門家
には自明であろう。かかる変更例は、添付の特許請求の
範囲項の範囲内に入るものである。

特許出願人　　モレキュラー、ジｌネティックス、手舵
にンｉ１３正御■（方式） ％式％ 昭和ｂ７ｓ＋　　特ム１願　第１８２．２６０号３、補
１〜を４る石 ルン　ロード　イースト−，１０３２０名　称　　しレ
キコラ−、ジュネ゛ｊイツクス、インニ１−ボレーｊツ
ド 代表者　　チャールス、シー、マスコブラット国　籍　
　アメリカ合衆国 ６、補正の対象 （１）明細書の浄書く内容に変更なし）（２）願書の「
特許出願人の代表賃氏名」の欄（３）委任状 （４）法人国籍証明占 ７、補正の内容 （１）別紙添付浄書しＩこ明細書のどおり。

（２）別紙添付訂正願書のとおり。

（３）別＠１添付委任状およびその訳文のと４３す。

（４）別紙添付法人国籍証明書およびイの訳文のとＪ３
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）抗アドヒシン抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合
   して融合細胞ハイブリッドを得、該ハイブリッドを増殖
   させ、抗アドヒシン抗体を回収することを特徴とする抗
   アドヒシン抗体製造方法。 （２）該アドヒシンが細菌性蛋白アドヒシンである特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）該アドヒシンが細菌性ピリである特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 （４）該アドヒシンが細菌性グリコ力リックス多糖類で
   ある特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （５）該ハイブリッドがインビトロで増殖をうける特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 （６）該ハイブリッドがインビボで増殖をうける特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 （７）該抗アドヒシン抗体産生細胞が碑細胞およびリン
   パ球細胞よりなる群から選ばれてなる特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。 （８）該碑ぞうがマウスの碑ぞうであり、該骨髄腫がマ
   ウスの骨髄腫である特許請求の範囲第７項に記載の方法
   。 （９）該抗アドヒシン抗体産生細胞が細菌のアドヒシン
   抗原による免疫をうけた動物から得られたものである特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 （１０）該抗アドヒシン抗体産出細胞が細菌性グリコ力
   リックス又はその免疫原性フラグメントによる免疫をう
   けた動物から得られたものである特許請求の範囲第１項
   に記載の方法。 （１１）ｌｌｌｉがエスケリキア・コアである特許請求
   の範囲第９項に記載の方法。 （１２）細菌がシュードモナス・アエルギノサである特
   許請求の範囲第９項に記載の方法。 （・１３）ビリかに−９９、Ｋ−８８，９８７Ｐ１Ｆ４
   １、ＣＦＡ／ＩおよびＣＦＡ／ＩＩよりなる群から選ば
   れたものである特許請求の範囲第９項に記載の方法。 （１４）ビリかに一９９ビリである特許請求の範囲第９
   項に記載の方法。 （１５）ＢＡＬＢ／Ｃマウスに細菌性ビリを注射して該
   マウスの抗細菌ビリ抗体産生細胞の形成を誘発し、該抗
   ビリ抗体産生細胞をＰ３／ＮＳＩ／１−Ａａ４−１骨髄
   腫細胞の融合細胞ハイブリッドを形成し、該ハイブリッ
   ドを選択的ＨＡＴ媒体内でインビトロで培養して該ハイ
   ブリッドを分離し、該分離ハイブリッドを増殖し、産生
   じた抗体を回収することを特徴とする抗ビリ抗体を製造
   する方法。 （１６）該ハイブリッドがインビトＯで増殖される特許
   請求の範囲第１５項に記載の方法。 （１７）該ハイブリッドがインビボで増殖される特許請
   求の範囲第１５項に記載の方法。 （１８）該ビリかに一９９ビリである特許請求の範囲第
   １５項に記載の方法。 （１９）抗アドヒシン抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合
   細胞ハイブリッドからなる抗アドヒシン抗体を産生する
   連続細胞系。 （２０）該アドヒシンが細菌性ビリである特許請求の範
   囲第１９項に記載の細胞系。 （２１）該アドヒシンかに一９９ビリである特許請求の
   範囲第１９項に記載の細胞系。 （２２）細胞系２ＢＤ４Ｅ４゜ （２３）該アドヒシンが細菌性蛋白アドヒシンである特
   許請求の範囲第１９項に記載の細胞系。 （２４）該アドヒシンが細菌性グリコ力リツクス多糖類
   である特許請求の範囲第１９項に記載の細胞系。 （２、特許請求の範囲第１項に記載の方法で製造した抗
   アドヒシン抗体。 （２、特許請求の範囲第２２項に記載の細胞系で産生し
   た抗精菌性ビリ抗体。 （２、特許請求の範囲第１項に記載の方法により産生さ
   れた抗アドヒシン抗体と製薬的担体とから成る製薬的組
   成物。 （２８）アドヒシンが細菌性ビリである特許請求の範囲
   第２７項に記載の製薬的組成物。 （２９）該アドヒシンが細菌性蛋白アドヒシンである特
   許請求の範囲第２７項に記載の製薬的組成物。 （３０）該アドヒシンが細菌性グリコ力リックス多糖類
   である特許請求の範囲第２７項に記載の製薬的組成物。 （３１）製薬的担体が動物への経口投与に適している特
   許請求の範囲第２７項に記載の製薬的組成物。 （３２）製薬的担体が動物への経口投与に記載している
   特許請求の範囲第２８項に記載のＩＩ的組成物。 （３３）該担体が、母体の初乳である特許請求の範囲第
   ３１項又は第３２項に記載の製薬的組成物。 （３４）該担体が牛面清アルブミンを含むＴｒｉｓＭ衝
   剤である特許請求の範囲第３１項又は第３２項に記載の
   製薬的組成物。 （３５）該担体がスキムミルクである特許請求の範囲第
   ３１項又は第３２項に記載の製薬的組成物。 （３６）該動物が仔牛、仔羊、仔豚から成るグループか
   ら選ばれる特許請求の範囲第３１項に記載の製薬的組成
   物。 （３７）製薬的担体が宿主の局所投与に適当である特許
   請求の範囲第２７項に記載の製薬的組成物。 （３８）製薬的担体が宿主の気道への投与に適している
   特許請求の範囲第２７項に記載の製薬的組成物。 （３９）未感染の動物に対して特許請求の範囲第１項に
   記載の方法により製造した抗アドヒシン抗体の予防的に
   効果ある量を投与することからなる動物における細菌由
   来の疾病を予防する方法。 （４０）未感染の動物に対して特許請求の範囲第１項に
   記載の方法により製造した抗アドヒシン抗体の予防的に
   効果のある量を投与することがら成る動物における細菌
   由来の下痢性疾患を予防する方法。 （４１）アドヒシンが細菌性ビリである特許請求の範囲
   第４０項に記載の方法。 （４２）細菌感染をうけた動物に対して特許請求の範囲
   第１項に記載の方法で製造した抗アドヒシン抗体を治療
   上効果のある量を投与することがら成る細菌感染をうけ
   た動物の治療の方法。 （４３）エンテロトキシン産生菌に感染した動物に対し
   特許請求の範囲第１項に記載の方法で製造した抗アドヒ
   シン抗体を治療上効果のある量投与することから成るエ
   ンテロトキシン産生菌に感染した動物の治療方法。 （４４）アドヒシンが細菌性ビリである特許請求の範囲
   第４３項に記載の方法。 （４５）該動物が１豚である特許請求の範囲第４０項又
   は第４３項に記載の方法。 （４６）該動物が１牛である特許請求の範囲第４０項又
   は第４３項に記載の方法。 （４７）該動物が１羊である特許請求の範囲第４０項又
   は第４３項に記載の方法。 （４８）該細菌がエスケリキア・コリである特許請求の
   範囲第４０項又は第４３項に記載の方法。 （４９）該ｍ１ｌｌｌｌｉ性ビリかに−９９、Ｋ−９８
   ７Ｐ。 Ｆ４１、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／Ｉ　Ｉビリから成るグル
   ープから選ばれる特許請求の範囲第４１項又は第４４項
   に記載の方法。 （５０）ｌｌｉｌｉ内菌ビリかに一９９ビリである特許
   請求の範囲第４１項又は第４４項に記載の方法。 （５１）特許請求の範囲第１項に記載の方法で製造した
   抗アドヒシン抗体を細菌と混合し、該抗体と細菌の相互
   作用を検出することから成るアドヒシン陽性細菌の診断
   テスト用の方法。 （５２）該アドヒシンが細菌性ビリである特許請求の範
   囲第５１項に記載の方法。 （５３）該ビリかに一９９ビリである特許請求の範囲第
   ５２項に記載の方法。 （５４）アドヒシンを含有する生物学的サンプルを特許
   請求の範囲第１項の方法により製造した該アドヒシンに
   対して親和性を有する抗体と接触させて抗体−アドヒシ
   ン複合体を生物学的サンプルから分離することから成る
   アドヒシンを生物学的サンプルを分離する方法。 （５５）抗体−アドヒシン蛋白複合体を解離させて精報
   アドヒシンを得ることからも成る特許請求の範囲第５４
   項に記載の方法。 （５６）未感染のヒトに特許請求の範囲第１項に記載の
   方法で製造した抗アドヒシン抗体の予防的に効果のある
   量を投与することから成るヒトにおける細菌担持アドヒ
   シン由来の疾病を予防する方法。 （５７）腸内菌感染症に罹患したヒトに特ＦＦｇｌ求の
   範囲第１項に記載の方法で製造した抗アドヒシン抗体の
   治療的に効果のある量を投与することからなる細菌担持
   アドヒシン感染症に罹患したヒトを治療する方法。