FI94489B - Menetelmä ristisuojaavien ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava solulinja - Google Patents

Description

1 94489

Menetelmä ristisuojäävien ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi ja vasta-ainetta tuottava solu-linja 5 Tämä keksintö liittyy immunologisten menetelmien käyttöön uusien materiaalien, jotka ovat käyttökelpoisia bakteeri-infektioiden hoidossa ja diagnosoinnissa, valmistamiseksi ja tarkemmin määriteltynä ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden, joilla on kyky antaa suoja erilaisten 10 bakteerisukujen aiheuttamia infektioita vastaan, tuotantoon. Keksintö koskee myös vasta-ainetta tuottavaa solu-linjaa.

Gram-positiiviset ja -negatiiviset bakteerit voivat aiheuttaa hengenvaarallisen sairauden infektoituneissa po-15 tilaissa. Nämä bakteeri-infektiot aiheuttavat usein merkittävää morbiditeettia ja mortaliteettia. Tällaisia infektioita esiintyy normaalia useammin keskoslapsilla, vanhuspotilailla ja potilailla, joilla on ennestään vakava sairaus tai vamma, kuten palovamma, kirurginen trauma, hi-20 taasti paraneva vamma tai syöpä. Nämä infektiot ovat tyypillisesti nosokomiaalisia (ts sairaalasta saatuja), ja niitä esiintyy erityisesti potilailla, jotka ovat olleet pitkään sairaalahoidossa, johon liittyy kirurgisia toimenpiteitä, verisuontensisäisiä toimenpiteitä tai pitkäaikai-25 siä hoitoja immunosuppressiivisilla lääkkeillä tai antibiooteilla. Lisäksi vastasyntyneet, joilla on epäkypsä immuunijärjestelmä ovat ilmeisesti akuutisti alttiita tiettyjen gram-negatiivisten ja -positiivisten bakteerien aiheuttamalle vastasyntyneen verenmyrkytykselle ja aivokal-30 vontulehdukselle.

Useimmin tavattaviin sairauksia aiheuttaviin gram- negatiivisiin ja gram-positiivisiin bakteereihin kuuluvat Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Serratia marcescens (S. marcescens), Entero-35 bacter aerogenes ja cloacae (E. aerogenes/cloacae), Pseu- 2 94489 domonas aeruginosa (P. aeruginosa), Neisseria meningitidis (N. meningitidis), B-ryhmän streptokokit ja Staphylococcus aureus (S. aureus) [Sonnenwirth, A.C., "The Enteric Bacilli and Similar Gram-Negative Bacteria" teoksessa Microbio-5 logy, 2. p., toim Davis, B. D., Dulbecco, R., Eisen, H.

N., Ginserberg, H. S., Wood, W. B. ja McCarty, M., Harper and Row 1973, s 753-790; McCabe, W. R., "Gram-Negative Bacteremia III. Reassessment of Etiology, Epidemiology, and Ecology on 612 Patients", Am. J. Med. 68 (1980) 332 -10 343; Robbins, J. B. et al., "Escherichia coli K1 Capsular

Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis", New Engl. J. Med. 290 (1974) 1216-1220; ja Hughs, J. M. et al., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982", Morb.

Mort. Weekly Report 32 (1983) 1SS-16SS]. Näiden infektioi-15 den ollessa kyseessä tavallisesti muutamat, mutta eivät kaikki, tiettyjen gramnegatiivisten bakteerien, esimerkiksi E. colin, K. pneumoniaen, E. aerogenes/cloacaen, P. aeruginosan ja S. marcescensin, serotyypit aiheuttavat bakteremiaa aikuisissa. Toisin kuin aikuiset, immunologi-20 sesti epäkypsä vastasyntynyt on erityisen altis septise-mialle ja meningiitille, joita aiheuttavat E. colin, N. meningitidisin (ryhmä B) ja Hemophilus influenzaen (tyyppi B) koteloituneet kannat ja B-ryhmän streptokokkien viisi tyyppikantaa. Vaikka muutkin bakteerit voivat aiheuttaa 25 näitä infektioita, ovat edellä mainitut bakteerit vallitsevia edellä mainittujen veri-infektioiden yhteydessä eristettyjä lajeja.

Antibiootit ovat pitkään olleet tärkein keino gram-positiivisten ja -negatiivisten bakteerien aiheuttamien 30 infektioiden torjumiseksi ja hävittämiseksi. Infektioiden jatkuva esiintyminen ja vakavuus, antibioottiresistenttien bakteerikantojen jatkuva ilmaantuminen ja joidenkin antibioottien luontainen myrkyllisyys rajoittavat kuitenkin antibioottihoitoa. Nämä havainnot ovat rohkaisseet etsi-35 mään vaihtoehtoisia profylaktisia ja terapeuttisia lähes-tymistapoja.

3 94489

Uskotaan laajasti että vasta-aineet, jotka reagoivat elävien bakteerien pinnoilla tavoitettavissa olevien rakenteiden kanssa, voivat saada aikaan bakteerin tuhoutumisen millä tahansa muutamista mekanismeista. Näihin me-5 kanismeihin kuuluvat: (1) bakteerien suora hajotus seerumin komplementin läsnä ollessa, (2) ravintoaineiden vas-taanottoreseptoreiden salpauksen kautta tapahtuva bakte-riostaasi, (3) bakteerien opsonisaatio ja sitä seuraava fagosytoosi seerumin komplementin läsnä tai poissa olles-10 sa, tai (4) bakteerien estäminen tarttumasta isännän kudoksiin (Mims, C. A., "Recovery from Infection" teoksessa The Pathogenesis of Infectious Disease, toim. Mims, C. A., Academic Press 1982, s. 198-222). Bakteerien, joissa on pintahiilihydraattimolekyylejä, kuten lipopolysakkaridia 15 (LPS) ja/tai kapseleita, ollessa kyseessä vasta-aine näyttää vaikuttavan tehokkaimmin opsonisaatiomekanismeilla [Kaijser, B. et ai., "The Protective Effect Against E. coli of 0 and K antibodies of Different Immunoglobulin Classes", Scand. J. Immunol. 1 (1972) 276]. Siten näihin 20 saavutettavissa oleviin hiilihydraattirakenteisiin kohdistuvat vasta-aineet voivat olla tehokas keino bakteerien eliminoimiseksi.

Nisäkkäät, jotka joutuvat kosketukseen taudinaihe-uttajabakteerien kanssa, tuottavat yleensä vasta-aineita, 25 jotka ovat spesifisiä LPS:lie tai kapselille. Nämä antigeenit ovat kemiallisesti monenlaisia rakenteita, jotka koostuvat tiheästi toistuvista oligosakkaridimolekyyleis-tä, ja niiden läsnäolo määrää bakteerikantojen serotyypin. Koska ne ovat usein immunologisesti dominoivia bakteerisi^ antigeenejä, on serotyyppispesifisiä (anti-LPS tai -kapseli) vasta-aineita tutkittu eniten mahdollisesti terapeuttisten vasta-aineiden joukosta. Koska näiden vasta-aineiden ristireaktiivisuus on rajoitettu ja koska patogeenisten gram-positiivisten ja -negatiivisten bakteerien hiili-35 hydraattiantigeenien luonne on ilmeisesti hyvin vaihtele- 4 54489 va, olisi äärimmäisen vaikeaa ja kallista valmistaa terapeuttinen formula, joka sisältää vain serotyyppispesifisiä vasta-aineita [katso esimerkiksi Kaijser, B. ja Ahlstedt, S., "Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia 5 coli 0 and K antigens", Infect. Immun. 17 (1977) 286-292; ja Morrison, D. C. ja Ryan, J. L., "bacterial Endotoxins and Host Immune Responce", Adv. Immunol. 28 (1979) 293-450]. Siitä huolimatta monet raportit ovat herättäneet sellaisia näkymiä, että voitaisiin löytää immunoterapeut-10 tisia lähestymistapoja gram-negatiivisten bakteerien aiheuttaman sairauden hoitoon.

Spesifisiä ja suojaavia infektoivien organismien vasta-aineita sisältävien immunoglobuliinien suhteen rikastettu fraktioitu ihmisplasma on ollut jossain määrin 15 tehokas P. aeruginosa-infektioita vastaan [Collins, M. S. ja Robey, R. E., "Protective Activity of an Intravenous Immune Globulin (Human) Enriched in Antibody Against Lipo-polysaccharide Antigens of pseudonlonas aeruginosa", Amer.

J. Med. 3 (1984) 168-174]. Kaupallisia tuotteita ei kui-20 tenkaan ole ollut vielä helposti saatavilla tiettyjen luontaisten rajoitusten takia, jotka ovat estäneet niiden laajan käytön hengenvaarallisten bakteeritautien hoidossa.

Eräs tällainen immunoglobuliinikoostumuksiin liittyvä rajoitus on se, että ne on koottu suurista määristä 25 yhdistettyjä plasmanäytteitä, jotka on valittu lukumäärältään rajoitettujen kyseessä olevien vasta-aineiden läsnäolon perusteella. Nämä yhdistelmät koostuvat tyypillisesti näytteistä, jotka on saatu vähintään tuhannelta luovuttajalta, joilla joidenkin patogeenisten bakteerien vasta-ai-30, neiden pitoisuudet voivat olla alhaisia. Siten saadaan parhaimmillaankin aikaan vain kohtalainen haluttujen vasta-aineiden pitoisuuden nousu.

Eräs toinen tällainen rajoitus on se, että itse esivalikointiprosessi vaatii hyvin kallista jatkuvaa luo-35 vuttajapopulaation tutkimista tuotteen yhtenäisyyden ta- i * 5 94489 kaamiseksi. Huomattavasta työstä huolimatta tuotteet voivat silti olla erilaisia eri erissä ja eri maantieteellisillä alueilla.

Vielä eräs immunoglobuliinikoostumusten luontainen 5 rajoitus on se, että niitä käytettäessä tulee annetuksi samanaikaisesti suuria määriä ulkopuolisia proteiiniainei-ta (esimerkiksi viruksia), jotka saattavat aineuttaa biologisia haittavaikutuksia. Haluttujen vasta-aineiden pienten pitoisuuksien ja ulkopuolisten aineiden suuren määrän 10 yhdistelmä rajoittaa usein potilaalle annettavissa olevan yhden tai useamman spesifisen ja siten hyödyllisen immuno-globuliinin määrän optimaalista pienemmäksi.

Vuonna 1917 Kohler ja Milstein ilmoittivat, että tiettyjä hiiren solulinjoja voitiin fuusioida hiiren per-15 nasolujen kanssa, jolloin syntyy hybridomia, jotka erittävät puhtaita "monoklonaalisia" vasta-aineita [Kohler, G. ja Milstein, C., "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predetermined Specificity", Nature 256 (1975) 495-497]. Tämän menetelmän keksiminen antoi mahdol-20 lisuuden tuottaa hiiren vasta-aineita mille tahansa antigeenillä olevalle yhdelle tai useammalle determinantille.

Tällä menetelmällä on saatu monoklonaalisia vasta-aineita hiiristä, jotka on immunisoitu Neisseria meningi-tidisistä (ryhmä B) peräisin olevalla polysakkaridilla.

25 Näiden hiiren monoklonaalisten IgM-vasta-aineiden havaittiin sitovan ja opsonisoivan muutamia Kl-positiivisia E. coli-kantoja riippumatta niiden LPS-serotyypistä [Cross, supra, Söderström, supra, ja Cross, A.S. et ai., "The Importance of the K1 Capsule in Invasive Infections Caused 30 by Escherichia coli", J. Inf. Dis. 149 (1984) 184-193]. Monoklonaaliset vasta-aineet antoivat lisäksi hiirille suojan tappavia E. coli K1 ja ryhmän B meningokokkiorga-nismi-infektioita vastaan (Cross, supra ja Sunderstrom, supra). Eräässä toisessa esimerkissä ilmoitettiin tyypin 35 III, ryhmän B streptokokeille spesifisten hiiren monoklo- 6 94489 naalisten vasta-aineiden antavan suojan kokeellisessa hiiren infektiomallissa [Egan, M. L. et ai., "Protection of Mice from Experimental Infection with Type III Group B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies", J. Exp. Med.

5 1 (1983) 1006-1011].

Vaikka hiiren monoklonaalinen vasta-aine on käyttökelpoinen hiirten hoitoon, on sillä suuria epäkohtia ihmiskäyttöä ajatellen. Ihmisen immuunijärjestelmällä on kyky tunnistaa mikä tahansa hiiren monoklonaalinen vasta-10 aine vieraaksi proteiiniksi. Tämä saattaa johtaa vasta-aineen kiihtyneeseen poistoon ja siten sen farmakologisen vaikutuksen estämiseen [Levy, R. ja Miller, R. A. et ai., "Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies", Fed. Proc. 42 (1983) 2650-2656]. Vakavampaa on se, että tämä saattaa 15 mahdollisesti johtaa "seerumitaudin" kanssa analogisten allergisten reaktioiden aiheuttamaan shokkiin tai jopa kuolemaan. Kliininen kokemus on osoittanut, että antihii-ri-immunoglobuliinireaktiot ovat rajoittaneet näiden vasta-aineiden käyttökelpoisuutta suunnilleen puolella poti-20 laista, jotka ovat saaneet hiiren monoklonaalisia vasta-aineita erilaisten kasvainten hoitoon [Sears, H. F. et ai., "Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in Treatment of Gastrointestinal Tumor", Lancet 1 (1982) 762-764; ja Miller, R. A. et al., "Monoclonal Antibody 25 Therapeutic Trials on Seven Patients with T-Cell Lymphoma", Blood 62 (1983) 988-995].

Siten on olemassa tarve saada aikaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, jotka antavat suojan gram-nega-tiivisten ja -positiivisten bakteerien aiheuttamia sai-30 rauksia vastaan. Gram-positiivisten ja -negatiivisten tau- dinaiheuttajabakteerien vaihteleva antigeenisyys viittaa kuitenkin vahvasti siihen, että serotyyppispesifisten mo-noklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen kullekin näistä monista tärkeistä patogeenisistä bakteereista olisi epä-35 käytännöllistä.

il ' a«'t «Iti l.i *« : J

7 94489

Gram-negatiivisten bakteerien vaihtelevan antigee-nisyyden aineuttavat lipopolysakkaridin (LPS:n), gram-ne-gatiivisten organismien ulkokalvoon liittyvän molekyylin, eri alueet. LPS-molekyylin katsotaan yleisesti koostuvan 5 kolmesta rakenteellisesta alueesta. Ulkokalvoa lähinnä oleva alue on niin kutsuttu LPS:n lipidi A-osa. Gram-nega-tiivisiin bakteereinin liittyvä endotoksinen aktiivisuus esiintyy tällä rakenteellisesti säilyneellä alueella. Toinen rakenteellinen alue, jota kutsutaan ytimeksi, liittyy 10 lipidi A:hän usein 2-deto-3-deoksi-D-manno-oktonaattiryh-män (KDO) kautta eikä, kuten ei lipidi A-aluekaan, ole tavallisesti vasta-aineen saavutettavissa LPS:n kolmannen, uloimman alueen ollessa läsnä. Vaikka tämä alue on osittain säilynyt joidenkin gram-negatiivisten bakteerilajien 15 joukossa, on Enterobacteriaceae-heimon jäsenten joukossa havaittu monia keskinäisiä poikkeamia tarkasteltaessa koko ydintä. LPS-molekyylin uloin alue koostuu toistuvista oli-gosakkaridiyksiköistä, ja siitä käytetään nimitystä 0-spe-sifinen sivuketju. Näissä oligosakkaridiyksiköissä olevat 20 sokerit muodostavat molekyylikokonaisuuksia, joissa esiintyy serotyyppispesifistä rakenteellista antigeenistä vaihtelua. Siten itse sokerit, niin järjestys ja niiden väliset sidokset määräävät O-sivuketjun antigeenisyyden terti-aarirakenteensa kautta. Näiden 0-ryhmien vasta-aineiden on 25 havaittu olevan yleensä serotyyppispesifisiä. Serotyypit määritellään tyypillisesti sen mukaan, miten ne reagoivat monospesifisten antiseerumien kanssa, jotka sitoutuvat vain yhteen tiettyyn antigeenideterminanttiin. Katso yleisesitys julkaisussa Mayer et ai., Meths. Microbiology 30 18 (1985) 157-201.

Yritettäessä osoittaa suojausvaikutus gram-negatii-vista infektiota vastaan on tuotettu antiseerumeja LPS:n ydin ja lipidi A-alueita vastaan [Sakulramrung ja Domin-gue, J. Inf. Dis. 151 (1985) 995-1104; McCabe et ai., J.

35 Infect. Dis. 1365 (1985) 516; ja Mullan et ai., Infect. 10 8 94489 (1974) 1195-1201]. Myöhemmin on tuotettu säilyneiden alueiden kanssa reagoivia hiiren ja ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita. Vaikka nämä vasta-aineet ovat joskus olleet osittain tehokkaita in vivo varta vasten suunnitelluissa 5 mallijärjestelmissä [Teng et ai., Proc. Natl. Acad. Sri.

USA 82 (1985) 1790; ja Bogard ja Kung, patenttihakemus nro W085/01659], eivät muut laboratoriot ole pystyneet osoittamaan samanlaisia vaikutuksia. Katso Elkins ja Metcalf, Infect. Immun. 48 (1985) 597; ja Gigliotti ja Sheap, J.

10 Inf. Dis. 151 (1985) 1005-1011. Nämä vasta-aineet eivät lisäksi yleensä reagoi kokonaisten, elävien gram-negatii-visten bakteerien eivätkä puhdistettujen LPS-molekyylien kanssa (sitoudu niihin). Nämä havainnot viittaavat siihen, että on epäilyksenalaista, ovatko luonnollisessa ja infek-15 toivassa tilassa olevilla bakteereilla esiintyvien LPS-molekyylien ydin tai lipidi A-alueet vasta-aineen saavutettavissa. On myös yleisesti tunnustettua, etteivät anti-ydin eivätkä anti-lipidi A-vasta-aineet reagoi gram-posi-tiivisten bakteerien kanssa, koska näissä ei ole LPS;ää.

20 Näiden havaintojen valossa on epätodennäköistä, että monoklonaaliset vasta-aineet LPS:n säilyneille ydin- tai lipidi A-alueille ovat tehokkaita gram-negatiivisten, ja etenkin gram-positiivisten, bakteerien ihmisissä aiheuttamien tautien hoidossa.

25 Siten on edelleen olemassa suuri tarve saada aikaan monoklonaalisia ihmisvasta-aineita, jotka ovat laajasti (lajien välisesti) ristisuojaavia gram-positiivisten ja -negatiivisten bakteerien aiheuttamia sairauksia vastaan, samoin kuin menetelmiä tällaisten vasta-aineiden tuottami-30 seksi käytännössä ja menetelmiä niiden käyttämiseksi. Tämä keksintö tyydyttää nämä tarpeet.

Keksintö koskee jatkuvasti viljeltävissä olevia uusia solulinjoja, jotka tuottavat ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on kyky ristireagoida spesifisesti 35 useiden bakteerilajien kanssa sitoutumalla saavutettavissa 9 94489 olevaan epitooppiin, joka on vähintään kahdella eri bak-teerilajilla esiintyvä ei-ydinhiilihydraattiryhmä. Keksinnön mukaiselle solulinjalle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 9 esitetään.

5 Keksintö koskee edelleen menetelmää bakteeri-infek tion ennalta ehkäisyyn ja/tai hoitoon käyttökelpoisten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi, jotka vasta-aineet pystyvät reagoimaan spesifisesti vähintään kahteen eri 10 sukuun kuuluvan kahden eri bakteerilajin vähintään kahdelle serotyypille ja vähintään yhden lajin useille serotyy-peille yhteisen ei-ydinhiilihydraattiepitoopin kanssa, jolloin vasta-aineet reagoivat ainakin yhden kanssa seu-raavista bakteerilaj iyhdistelmistä: 15 (a) Escherichia coli, Serratia marcescens ja Enterobacter aerogenes, (b) Escherichia coli ja Neisseria meningitidis, (c) Escherichia coli, Enterobacter cloacae ja Streptococcus agalactiae, ryhmä B, 20 (d) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens ja Entero bacter aerogenes, (e) Klebsiella pneumoniae ja Serratia marcescens, (f) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes ja Enterobacter cloacae, 2Γ> (g) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobac ter aerogenes ja Pseudomonas aeruginosa tai (h) Escherichia coli, Serratia marcescens ja Pseudomonas aeruginosa. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

30 Tässä kuvataan uusia soluja, joilla on kyky tuot taa ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, ja tällaisia vasta-aineita sisältäviä koostumuksia, joilla on kyky selektiivisesti reagoida useiden bakteerisukujen kanssa, jotka aiheuttavat sairaala-, vastasyntyneiden tai muita 35 infektioita, jolloin, yksittäiset vasta-aineet reagoivat 94489 10 tyypillisesti useilla bakteerisuvuilla esiintyvien ei-ydinhiilihydraattiepitooppien kanssa. Kyseessä olevissa soluissa on identifioitavissa olevia kromosomeja, joissa niistä tai esiastesoluista peräisin oleva iturata-DNA on 5 järjestynyt koodaamaan vasta-ainetta tai sen sitoutuvaa fragmenttia, jossa on sitoutumiskohta kahden tai useamman bakteerisolusuvun ainakin joillakin serotyypeillä esiintyville hiilihydraattimoleleille yhteiselle antigeenideter-minantille (epitoopille). Näitä monoklonaalisia ihmisvas-10 ta-aineita voidaan käyttää monin erilaisin tavoin bakteeritaudin diagnosointi, ennaltaehkäisy ja hoito mukaan luettuina.

Tämän keksinnön mukaiset solut ovat tyypillisesti soluja, jotka pystyvät viljelmässä tuottamaan jatkuvasti 15 ihmis-vasta-ainetta, erityisesti immortalisoituja (jatkuvasti kasvavia) ihmislymfosyyttejä, jotka tuottavat suo-jaavia monoklonaalisia ihmisvasta-aineita vähintään kahdelle bakteerilajille yhteisillä saavutettavissa olevilla molekyyleillä esiintyville ei-ydinhiilihydraattidetermi-20 nanteille. "Saavutettavissa olevalla" tarkoitetaan sitä, että ei-ydinhiilihydraattideterminantit ovat fysikaalisesti käytettävissä käyttöympäristössään suoraan vuorovaikutukseen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa. Siten aikaansaadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat käyttökelpoi-25 siä monien erilaisten bakteeri-infektioiden aiheuttamien vakavien sairauksien hoitoon. Lisäksi ne ei-ydinhiilihyd-raattimolekyylit, jotka vapautuvat ympäristöön, ovat myös vapaita olemaan vuorovaikutuksessa vasta-ainemolekyylien kanssa ja eliminoitumaan retikuloendoteelijärjestelmän 30 kautta.

Tässä kuvatut monoklonaalisia vastaaineita sisältävät koostumukset ovat tyypillisesti käyttökelpoisia sairaala-, vastasyntyneiden ja muiden infektioiden terapeuttiseen ja profylaktiseen hoitoon. Koska nosokomiaalisia 35 infektioita aiheuttavat tyypillisesti bakteerit Esche- 11 94489 richia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marces-cens ja Streptococcus agalactiae, ryhmä B, olisivat edullisia vasta-ainekoostumukset, jotka antavat suojan kahta, 5 kolmea, neljää tai useampaa tällaista bakteeria vastaan. Käytettäessä vasta-aineita vastasyntyneille, kuten vastasyntyneen verenmyrkytyksen ja aivokalvontulehduksen hoitoon, ovat ne edullisesti spesifisiä kahdelle tai useammalle seuraavista bakteereista: Escherichia coli Kl, Neis-10 seria meningitidis, ryhmä B, Streptococcus agalactiae, ryhmä B ja Hemophilus influenzae, tyyppi B. Muita yleisiä infektoivia bakteereja ovat mm: Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, 15 Pseudomonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Providen-cia morganii, Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, Aci-netobacter herellea, Pasturella multocida ja Klebsiella oxytoca. Muita alan ammattimiesten tuntemia merkityksellisiä patogeenisiä bakteereja kuvataan julkaisussa Hughs, J.

20 M. et ai., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982",

Morb. Mort. Weekly Report 32 (1983) 1SS-16SS, ja yleisesti teoksessa Microbiology, 3. p., toim. Davis, B. D., Dulbec-co, R., Eisen, H. N., Ginserberg, H. S., Wood, W. B. ja McCarty, M., Harper and Row 1980, jotka molemmat julkaisut 25 mainitaan tässä viitteinä. Monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat kyseessä olevan bakteerilajin yksittäisten tai kaikkien jäsenten kanssa, jolloin jäsenet voidaan erottaa toisistaan pintaepitooppiensa, erityisesti LPS- tai kapse-likohtiensa, esimerkiksi serotyyppiensä mukaan.

30 Se odottamaton havainto, että monoklonaalinen vas ta-aine ristireagoi erilaisten bakteerilajien, edellä luetellut kliinisesti tärkeät lajit mukaan luettuina, kesken antaa uuden terapeuttisen ja profylaktisen hoitokeinon. Käyttämällä yhdistettyinä ennalta valittuja ristireagoivia 35 vasta-aineita, voidaan tuottaa muutaman vasta-aineen seos 12 94489 lukuisten erilaisten infektoivien bakteerilajien vastaiseen hoitoon.

Rajoittamattomana esimerkkinä mainittakoon, että kahden monoklonaalisen vasta-aineen seos, joista vasta-ai-5 neista toinen ristireagoi vähintään kahden kliinisesti merkittävän bakteerilajin kanssa ja toinen vähintään kahden tai kolmen eri lajin kanssa, on käyttökelpoinen neljän, viiden, kuuden tai useamman eri lajin vastaiseen hoitoon. Kolmannen tai neljännen vasta-aineen, joista kukin 10 on ristireaktiivinen vähintään kahden kliinisesti tärkeän lajin kanssa - vaikka yksi tai useampi näistä lajeista olisi sama kuin ensimmäisen ja/tai toisen vasta-aineen tunnistama -, lisääminen lisää käyttökelpoisuutta 5-10 tai useampaa lajia vastaan. Voi luonnollisesti olla vält-15 tämätöntä lisätä myös yhtä tai useampaa monoklonaalista vasta-ainetta, joista kukin on spesifinen vain yhdelle ennalta valitulle bakteerilajille, esimerkiksi silloin kun tämän lajin kanssa ristireagoivia monoklonaalisia vasta-aineita ei ole saatavissa.

20 Tämä keksintö tarjoaa mahdollisuuden käyttää uusia menetelmiä bakteeri-infektioiden hoitamiseksi. Esimerkkinä mainittakoon eräs uusi menetelmä, jolla hoidetaan potilasta, jonka epäillään saaneen tai olevan vaarassa saada tietyn bakteerilajien aiheuttama bakteeri-infektio. Hoidossa 25 annetaan koostumusta, joka sisältää infektion aiheuttajaksi epäillyn bakteeri]ajin kanssa reagoivaa monoklonaalista vasta-ainetta, joka on alunperin karakterisoitu eri bakteerilaj in kanssa reagoivaksi.

Eräs toinen esimerkki on menetelmä bakteeri-infek-30 tioiden hoitamiseksi antamalla koostumusta, joka sisältää useita monoklonaalisia vasta-aineita, jotka reagoivat merkittävän osan kanssa (ts yli 50 %:n, edullisesti vähintään 60 - 80 %:n ja edullisimmin noin 90 %:n kanssa) ennaltava-lituista, kliinisesti merkityksellisistä bakteerilajeista, 35 jolloin vasta-aineiden lukumäärä on vähintään kahta pie- 13 94489 nempi kuin bakteerilajien lukumäärä. Jos "n" merkitsee bakteerilajien lukumäärää, koostumus sisältää tyypillisesti noin n-2 vasta-ainetta, tyypillisemmin noin n-4:stä n-8:aan tai vähemmän vasta-aineita korkeintaan noin 15 -5 20 bakteerilajin hoitoa varten. Silloin kun halutaan hyvin monenlaisten (esim. 25 - 50 tai useamman) bakteerilajin vastaista hoitoa, sisältää koostumus tyypillisesti vasta-aineita n-10:stä n-20:een tai vähemmän.

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa 10 tekemällä jatkuvaksi nukleiinihapposekvenssien, jotka koo- daavat monilla bakteerilajeilla esiintyvälle ei-ydinhiili-nydraattiepitoopille spesifisiä vasta-aineita tai niiden sitoutuvia fragmentteja, ilmentyminen. Monoklonaalisia vasta-aineita tuotetaan tyypillisesti transformoimalla 15 soluohjatusti Epstein-Barr-viruksella (EBV) lymfosyytit, jotka on saatu ihmisluovuttajilta, jotka ovat tai ovat olleet vastaavien gram-negatiivisten bakteerien vaikutuksen alaisina. Siten saatuja vasta-ainetta erittäviä solu-linjoja luonnehditaan jatkuvasti kasvaviksi lymfoblas-20 toidisoluiksi, joilla on diploidinen karyotyyppi, jotka ovat Epstein-Barr-tuma-antigeenipositiivisia (EBNA-posi-tiivisia) ja jotka erittävät vasta-ainetta, joka on IgG-,

IgM-, IgA tai IgD-isotyyppiä. Itse soluohjattu transfor-mointi-menetelmä on Genetic Systems Corporationin nimissä 23 oleva keksintö, ja sitä kuvataan yksityiskohtaisesti US-patenttijulkaisussa 4 464 465, joka mainitaan tässä viitteenä. Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää kokonaisina tai fragmentteinaan, kuten Fv:nä, Fab:nä tai Fab' )2:na, tavallisesti kuitenkin kokonaisina.

30 Vasta-aineita tuottavia solulinjoja voitaisiin va ihtoehtoisesti tuottaa tekemällä solufuusio sopivasti lääkeaineella leimattujen ihmisen myelooma-, hiiren myelooma tai ihmisen lymfoblastoidisolujen ja ihmisen B-lymfosyyt-tien välillä, jolloin saadaan hydridisolulinjoja.

14 94489 Tässä esitetyille solulinjoille saattaa löytyä muutakin käyttöä kuin ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tuotanto. Solulinjoja voidaan fuusioida muiden solujen (kuten sopivasti lääkeaineella leimattujen ihmisen myeloo-5 ma-, hiiren myelooma- tai ihmisen lymfoblastoidisolujen) kanssa, jolloin syntyy hybridoomia ja saadaan siten aikaan inmisen monoklonaalisia vasta-aineita koodaavien geenien siirto. Solulinjoja voidaan vaihtoehtoisesti käyttää im-munoglobuliineja koodaavan DNA:n lähteenä, joka DNA voi-10 daan eristää ja siirtää soluihin muilla menetelmillä kuin fuusion kautta. Lisäksi monoklonaalisia vasta-aineita koo-daavia geenejä voidaan eristää ja käyttää yhdistelmä-DNA-menetelmien mukaisesti spesifisen immunoglobuliinin tuottamiseen erilaisissa isännissä. Erityisesti valmistamalla 15 lähetti-RNA:sta cDNA-kirjastoja voidaan eristää yksi cDNA- klooni, joka koodaa immunoglobuliinia eikä sisällä intro-neja, ja sijoittaa tämän sopiviin prokaryoottisiin tai eukaryoottisiin ilmentymisvektoreihin, joilla voidaan sitten transformoida isäntä lopullista massatuotantoa varten.

20 Lymfoblastoidi- tai hybridisolulinjoja voidaan kloonata ja tutkia tavanomaisin menetelmin käyttämällä vasta-aineita, joilla on kyky sitoutua solujen supernatan-teissa havaittujen eri bakteerisukujen epitooppeihin.

Keksinnön mukaisesti valmistetut monoklonaaliset 21 vasta-aineet ovat erityisen käyttökelpoisia komponentteina farmaseuttisissa koostumuksissa, jotka sisältävät terapeuttisen tai profylaktisen määrän vähintään yhtä keksinnön mukaisesti valmistettua monoklonaalista vasta-ainetta yhdessä farmaseuttisesti käyttökelpoisen kantajan kanssa.

30 Farmaseuttinen kantaja voi olla mikä tahansa yhteensopiva myrkytön aine, joka soveltuu monoklonaalisten vasta-aineiden viemiseen potilaaseen. Kantaja voi olla steriili vesi, alkoholi, rasva, vaha tai inertti kiinteä aine. Farmaseuttiseen koostumukseen voidaan sisällyttää farmaseuttisesti 35 hyväksyttäviä apuaineita (puskureita, dispergointiainei- « tl i tl l III «h 114 4» < 15 94489 ta). Tällaiset koostumukset voivat sisältää yhtä monoklo-naalista vasta-ainetta, joka risti-reagoi kahdelle tai useammalle bakteerilajille, joka aiheuttaa esimerkiksi sairaala- ja vastasyntyneiden infektioita (esim. verenmyr-5 kytystä tai aivokalvontulehdusta), yhteisen ei-ydinhiili-hydraattiepitooppien kanssa. Farmaseuttinen koostumus voi vaihtoentoisesti sisältää kahta tai useampaa monoklonaa-lista vasta-ainetta, jolloin muodostuu "cocktail". Cocktail, joka sisältää ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita, 10 joista kukin antaa suojan kahta tai useampaa ihmisellä in-fektoita aiheuttavaa gram-negatiivista bakteerilajia vastaan, tehoaisi esimerkiksi hyvin suureen osaan yleisistä kliinisesti eritetyistä kannoista. Haluttaessa voitaisiin valita yksi tai useampi monoklonaalinen vasta-aine, joka 15 on ristireaktirvinen myös gram-positiivisten bakteerien kanssa, jolloin tuotteen käyttömahdollisuudet laajenisivat entisestään.

Kiinnostuksen kohteena ovat profylaktiset ja/tai terapeuttiset monoklonaalisia vasta-aineita sisältävät 20 koostumukset, joilla on kyky reagoida kolmelle tai useammalle, tavallisesti vähintään viidelle ja tavallisemmin vähintään kymmenelle ja jopa 15:lie tai useammalle baktee-riserotyypille yhteisten ei-ydinhiilihydraattideterminant-tien kanssa, mikä merkitsee reagointia vähintään kahden, 25 tavallisesti vähintään kolmen, tavallisemmin vähintään viiden ja tavallisesti alle kymmenen bakteerisuvun kanssa.

Erityisen kiintoisia ovat monoklonaalisia vastaai-neita sisältävät koostumukset, jotka reagoivat vähintään noin kolmen, edullisesti vähintään noin viiden ja jopa jo-30 kaisen seuraavassa luetellun yleisen nosokomiaalisia infektioita aiheuttavan bakteerin kanssa: Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobac-ter aerogenes/cloacae, Serratia marcescens ja Streptococcus agalactiae, ryhmä B. Vastasyntyneiden infektioiden 35 hoitamiseksi on toivottavaa, että koostumukset reagoivat • · 16 94489 vähintään kahden, tavallisesti vähintään kolmen ja tavallisemmin vähintään neljän ja jopa jokaisen seuraavassa luetellun infektoivan bakteerisuvun kanssa: Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis, ryhmä B, Streptococcus 5 agalactiae, ryhmä B, Hemophilus influenzae, tyyppi B, Staphylococcus aureus ja Staphylococcus epidermidis. Kukin koostumus sisältää vähintään kahta, tavallisesti vänintään kolmea-viittä ja tavallisemmin kuutta-kymmentä monoklonaa-lista ihmisvasta-ainetta, jolloin vähintään yksi vasta-ai-10 ne reagoi kahdelle tai useammalle bakteerisuvulle yhteisen (esimerkiksi LPS-molekyylien) ei-ydinhiilihydraattiepitoo-pin kanssa, ja saa aikaan suojauksen. On tyypillistä, ettei vasta-aine sitoudu kunkin bakteerin kaikkiin serotyyp-peihin, mutta se voi sitoutua kahteen, kolmeen tai useam-15 paan serotyyppiin. On toivottavaa, että läsnä on ainakin yksi monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoutuu vähintään kahden gram-negatiivisen bakteerisuvun saavutettavissa olevaan ei-ydinhiilihydraattiryhmään, ja vähintään yhtä monoklonaalista vasta-ainetta, joka sitoutuu jonkin gram-20 negatiivisen bakteerin ja jonkin gram-positiivisen bakteerin saavutettavissa olevaan hiilihydraattiryhmään.

Eri monoklonaalisten vasta-ainekomponenttien väliset moolisuhteet eroavat yleensä toisistaan korkeintaan kymmenkertaisesti, tavallisemmin korkeintaan viisinkertai-25 sesti, ja yleensä vasta-ainekomponentin ja kunkin muun vasta-ainekomponentin välinen moolisuhde on noin 1:1 - 1:2.

Inmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös yksitellen, erityisesti silloin kun patogeeni on 30 tunnistettu tai se rajoittuu kapealle patogeenialueelle, joka on kyseessä olevan vasta-aineen sitoutumisspektrin sisällä.

Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää myös yhdessä 35 muiden monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa samoin kuin il . m anti i 11 M ’ i 17 94489 jo olemassa olevien veriplasmatuotteiden, kuten myynnissä olevien gammaglobuliini- ja immunoglobuliinituotteiden, joita käytetään ihmisten bakteerisairauksien profylkati-seen tai terapeuttiseen hoitoon, kanssa. Immunoglobulii-5 nien saamiseksi plasmaa otetaan edullisesti ihmisluovut-tajilta, joilla erilaisten infektoivien bakteerisukujen kanssa reagoivien immunoglobuliinien pitoisuudet ovat koholla. Katso yleisesitys julkaisussa "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med. 76(3a) 10 (30.3.1984) 1-231, joka mainitaan tässä viitteenä.

Tämän keksinnön mukaisia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää erikseen annettavina koostumuksina, joita annetaan antibioottien tai mikrobien vastaisten aineiden yhteydessä. Mikrobien vastainen aine voi tyypilli-15 sesti olla penisilliini tai kefalosporiini (esimerkiksi karbenisilliini, penisilliini G tai vastaava) yhdessä ami-noglykosidin (esimerkiksi gentamisiinin, tobramysiinin, jne) kanssa, mutta lukuisia muitakin, alan ammattimiesten hyvin tuntemia aineita (esimerkiksi kefalosporiineja, sul-20 falääkkeitä jne) voidaan käyttää.

Tässä esitetyt, ihmisen monoklonaaliset vasta-aineet ja niitä sisältävät farmaseuttiset koostumukset ovat erityisen käyttökelpoisia oraalisesti tai parenteraalises-ti annettaviksi. Farmaseuttisia koostumuksia voidaan edul-25 lisesti antaa parenteraalisesti, ts ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai laskimonsisäisesti. Siten tämä keksintö tarjoaa käytettäväksi parenteraalisesti annettavia koostumuksia, jotka sisältävät monoklonaalista ihmisvasta-aineen tai sellaisten seoksen liuosta hyväksyttävässä, edullises-.. 30 ti vesipohjaisessa, kantajassa. Voidaan käyttää erilaisia vesipohjaisia kantajia, esimerkiksi vettä, puskuroitua vettä, 0,4 %:sta suolaliuosta, 0,3 %:sta glysiiniliuosta tms. Nämä liuokset ovat steriilejä eivätkä yleensä sisällä hiukkasmaista ainesta. Nämä koostumukset voidaan steriloi-35 da tavanomaisin, hyvin tunnetuin sterilointimenetelmin.

18 94489

Koostumukset voivat sisältää farmaseuttisesti hyväksyttäviä apuaineita, joita voidaan tarvita fysiologisten olosuhteiden jäljittelyyn, kuten pH:n säätö- ja puskuriainei-ta, myrkyllisyyttä säätäviä aineita tms, esim, natriumklo-5 ridia, kaliumkloridia, kalsiumkloridia, natriumlaktaattia jne. Vasta-aineen pitoisuus näissä formuloissa voi vaihdella suuresti, ts alle noin 0,5 paino-%:sta, tavallisesti vähintään noin 1 paino-%:sta jopa 15 tai 20 paino-%:iin, ja se valitaan pääasiassa nestetilavuuksien, viskositeet-10 tien jne mukaan kyseessä olevan valitun antomuodon mukaisesti.

Siten tyypillinen lihaksensisäisesti ruiskutettava farmaseuttinen koostumus voisi sisältää 1 ml:n steriiliä puskuroitua vettä ja 50 mg monoklonaalista vasta-ainetta.

15 Tyypillinen laskimoon infusoitava koostumus voisi sisältää 250 ml steriiliä Ringerin liuosta ja 150 mg monoklonaalista vasta-ainetta. Käytännön menetelmät parenteraalisesti annettavissa olevien koostumusten valmistamiseksi ovat alan ammattimiehille tuttuja, ja niitä kuvataan yksityis-20 kohtaisemmin esimerkiksi teoksessa Remington's Pharmaceutical Science, 15. p., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 1980, joka mainitaan tässä viitteenä.

Tämän keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet voidaan kylmäkuivata varastointia varten ja sekoittaa *· 25 takaisin soveltuvaan kantajaan ennen käyttöä. Tämä menetelmä on havaittu tehokkaaksi tavanomaisten immunoglobu-liinien yhteydessä, ja voidaan käyttää alalla tunnettuja kylmäkuivaus- ja takaisinsekoitus voivat johtaa vaihtele-vanasteiseen vasta-aineen aktiivisuushäviöön (esim. ta-.. 30 vanomaisten immunoglobuliinien kohdalla IgM-vasta-aineilla on taipumus suurempaan aktiivisuushäviöön kuin IgG-vasta-aineilla), ja käytettäviä määriä saatetaan joutua säätämään tämän häviön kompensoimiseksi.

Keksinnön mukaisesti valmistettuja ihmisen mono-35 klonaalisia vasta-aineita tai niiden seosta sisältäviä 19 94489 koostumuksia voidaan antaa bakteeri-infektioiden profylaktiseen ja/tai terapeuttiseen hoitoon. Terapeuttisessa käytössä koostumuksia annetaan jo infektoituneelle potilaalle infektion ja sen komplikaatioiden parantamiseen tai aina-5 kin osittaiseen pysäyttämiseen riittävä määrä. Tämän aikaansaantiin riittävä määrä määritellään "terapeuttisesti vaikuttavaksi annokseksi". Tähän käyttötarkoitukseen tehokkaat määrät riippuvat infektion vakavuudesta ja potilaan oman immuunijärjestelmän yleistilasta, mutta annos on 10 yleensä suunnilleen alueella 1 - 200 mg vasta-ainetta painokiloa kohden, tavallisemmin 5-25 mg/kg. Tulee pitää mielessä, että tässä kuvattuja materiaaleja saatetaan yleisesti käyttää vakavissa sairaustiloissa, ts hengenvaarallisissa tai mahdollisesti hengenvaarallisissa tilan-15 teissä, erityisesti bakteremiassa ja endotoksemiassa. Tällaisissa tapauksissa, kun otetaan huomioon ulkopuolisten aineiden ja "vierasaine"-hylkimisten poissaolo, jotka saavutetaan keksinnön mukaisesti valmistetuilla ihmisen mono-klonaalisilla vastaaineilla, on mahdollista ja hoitavan 20 lääkärin mielestä ehkä toivottavaa antaa näitä vasta-aineita merkittäviä ylimääriä.

Profylaktisissa käyttötarkoituksissa esitettyä vasta-ainetta tai niiden seosta sisältäviä koostumuksia annetaan potilaalle, joka ei vielä ole kyseessä olevan baktee-25 rin infektoima, potilaan vastustuskyvyn parantamiseksi tällaista mahdollista infektiota vastaan. Tällainen määrä määritellään "profylaktisesti vaikuttavaksi annokseksi". Tämänkin käyttötarkoituksen yhteydessä täsmälliset määrät riippuvat potilaan terveydentilasta ja yleisestä immuni-30 teettitasosta, mutta se on yleensä alueella 0,1 - 25 ms/kg, erityisesti 0,5 - 2,5 mg/kg.

Koostumuksia voidaan antaa kerran tai useita kertoja, ja hoitava lääkäri valitsee annostasot ja ohjelman. Farmaseuttisten formuloiden mukana tulisi joka tapauksessa 35 saada riittävä määrä keksinnön mukaisesti valmistettua • · 20 94489 yhtä tai useampaa vasta-ainetta potilaan hoitamiseksi tehokkaasti .

Keksinnön mukaisesti valmistetut monoklonaaliset vasta-aineet voivat lisäksi olla hyvin monella tavalla 5 käyttökelpoisia in vitro. Esimerkkeinä mainittakoon, että monoklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää bakteerien tyypitykseen, tiettyjen bakteerikantoien tai niiden fragmenttien eristämiseen, rokotteiden valmistamiseen tms.

Diagnostisiin tarkoituksiin käytettävät monoklonaa-10 liset vasta-aineet voivat olla joko leimattuja tai leimaa-mattomia. Diagnostisissa määrityksissä detektoidaan tyypillisesti monoklonaalisen vasta-aineen ja organismin LPS:n välisessä sitoutumisreaktiossa syntyvän kompleksin muodostuminen. Vasta-aineita voidaan käyttää leimaamatto-15 minä agglutinaatiomäärityksiin. Leimaamattomia vasta-ai neita voidaan lisäksi käyttää yhdessä muiden, leimattujen vasta-aineiden (toisten vasta-aineiden) kanssa, jotka reagoivat monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, kuten ihmisen immunoglobuliinille spesifiset vasta-aineet tekevät. Mono-20 klonaaliset vasta-aineet voidaan vaihtoehtoisesti leimata suoraan. Voidaan käyttää monia erilaisia merkkiaineita, kuten radionuklideja, fluoresoivia aineita, entsyymejä, entsyymien substraatteja, entsyymien kofaktoreita, entsyymi -inhibiottorei ta, ligandeja (erityisesti hapteeneja) 25 jne. On käytettävissä lukuisia immuunimääritystyyppejä, ja esimerkkinä mainittakoon, että joitakin määrityksiä kuvataan US-patenttijulkaisuissa 3 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; 4 098 876; jotka kaikki mainitaan tässä viitteinä.

30 Keksinnön mukaisesti valmistettuja monoklonaalisia vasta-aineita käytetään tavallisesti entsyymi-immuunimää-rityksissä, joissa näitä vasta-aineita tai eri lajista peräisin olevia toisia vasta-aineita liitetään entsyymiin.

Kun näyte, kuten ihmisveri tai sen lysaatti, joka sisältää 35 yhtä tai useampaa tietyn lajin tai serotyypin bakteeria, « · 21 94489 yhdistetään tässä esitettyihin vasta-aineisiin, tapahtuu sitoutuminen vasta-aineiden ja valittuja epitooppeja sisältävien molekyylien välillä. Tällaiset solut voidaan erottaa sitoutumattomista reagensseista ja lisätä toinen 5 (entsyymillä leimattu) vasta-aine. Sen jälkeen määritetään soluihin spesifisesti sitoutuneen vasta-aine-entsyymikon-jugaatin läsnäolo. Voidaan käyttää myös muita, alan ammattimiesten hyvin tuntemia tavanomaisia menetelmiä.

Voidaan myös toimittaa välineistöjä käytettäviksi 10 keksinnön mukaisesti valmistettujen vasta-aineiden yhteydessä bakteeriinfektion tai valitun antigeenin läsnäolon toteamisessa. Niissä voi olla mainittuja monoklonaalisia vastaaineita sisältävää koostumusta, tavallisesti kylmäkuivattuna säiliössä, joko yksinään tai yhdistettynä mui-15 hin, muille gram-negatiivisille bakteereille spesifisiin vastaaineisiin. Vasta-aineet, jotka voivat olla konjugoi-tuina merkkiaineen kanssa tai konjugoimattomia, sisällytetään välineistöihin yhdessä puskurien, kuten Trisin, fosfaatin, karbonaatin jne, stabilointiaineiden, biosidien, 20 inerttien proteiinien, esimerkiksi naudan seerumialbumii-nin, tms kanssa. Näitä materiaaleja on yleensä läsnä a]le noin 5 paino-% aktiivisen vasta-aineen määrästä, ja tavallisesti niiden kokonaismäärä on vähintään noin 0,001 paino-% vastaainemäärästä. Usein on toivottavaa sisällyt-25 tää joukkoon inerttiä jatke-ainetta aktiivisten aineosien laimentamiseksi, jolloin jatkeaineen osuus voi olla noin 1 - 99 paino-% koko koostumuksesta. Jos käytetään monoklo-naalisen vastaaineen kanssa sitoutumaan kykenevää toista vasta-ainetta, se on yleensä erillisessä pullossa. Toinen .. 30 vasta-aine liitetään yleensä merkkiaineeseen ja formuloidaan samalla tavalla kuin edellä kuvatut vasta-aineformu-lat.

Seuraavat koetulokset ja tiedot annetaan esimerkinomaisesti .

22 94489

Esimerkki I

Tämä esimerkki kuvaa menetelmiä ihmisen monoklonaa-lisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka vasta-aine risti-reagoi sukujen välisesti sukujen Escherichia coli (E. co-5 li), Serratia marcescens (S. marcescens), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) ja Enterobacter aerogenes (E. aero-genes) jäseniä vastaan. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa mainitun vasta-aineen suojaavan aktiivisuuden in vivo homologisilla (ristireagoivilla) E. coli ja E. aerogenes-se-10 rotyypeillä tehtyä tappavaa infektointia vastaan.

A. Soveltuvien ihmissolujen saaminen

Soveltuvia ihmisen B-soluja (lymfosyyttejä) saatiin henkilön, jonka tiedettiin sairastaneen kystistä fibroo-sia, ääreisverestä. Yksitumaiset solut erotettiin ääreis-15 verestä tavanomaisella Ficoll-Paque-sentrifugoinnilla [Boyum, A., "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood". Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 (1968) täydennysosa 97, 77-89] ja pestiin kahdesti kalsiumia ja magnesiumia sisältämättömällä fosfaattipuskuroi-20 dulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS:llä) ennen sus- pendointia 1 ml:aan naudan sikiöseerumin (FBS:n) (90 %) ja dimetyylisulfoksidin (10 %) seosta ja pakastamista neste-typessä (lämpötila -196 °C).

Kun yksitumaiset solut oli määrä transformoida, su-25 latettiin nopeasti lämpötilassa 37 eC ampulli, joka sisälsi 5 x 107 solua. Solususpensio lisättiin 10 ml:aan Iscoven alusta, joka sisälsi 15 % FBS:ää, ja sentrifugoitiin 10 min huoneen lämpötilassa kiihtyvyydellä 250 x g. Yksitumaiset solut vapautettiin T-soluista (lymfosyyteistä) 30 käyttämällä muunnettua E-rosettimenettelyä. Lyhyesti ku vattuna solut suspendoitiin uudelleen pitoisuudeksi 1 x 107 solua/ml PBS:ään, joka sisälsi 20 % FCS:ää, lämpötilassa 4 °C. 1 ml tätä suspensiota laitettiin pyöreäpohjaiseen polystyreeniputkeen (17 x 100 mm), johon lisättiin 1 x 109 35 2-aminoetyyli-isotiouroniumbromidilla (ART:11a) käsiteltyä 23 94489 lampaan punasolua 10-tilavuusprosenttisesta liuoksesta Iscoven alustassa [Madsen, M. ja Johnson, H.E. "A Methodological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells", J.Immun.Methods 27 (1979) 61-74].

5 Suspensiota sekoitettiin voimakkaasti 5-10 min lämpötilassa 4 °C, ja E-rosetoituneet solut poistettiin sentri-fugoimalla Ficoll-Paquen läpi 8 min kiihtyvyydellä 2500 x g lämpötilassa 4 °C. E-rosettinegatiiviset ääreisveren yksitumaiset solut (E-PMBC), jotka muodostivat vyöhykkeen 10 rajapintaan, pestiin kerran Iscoven alustalla ja suspen-doitiin takaisin samaan alustaan, joka sisälsi FBS (0,15 g/ml), L-glutamiinia (2 mmol/1), natriumpyruvaattia (1 mmol/1), penisilliiniä (100 ky/ml), streptomysiiniä (100 yg/ml), hypoksantiinia (1 x 10‘4 mol/1) ja tymidiiniä (1,6 15 x 10_s mol/1). Tästä alustasta käytetään tästedes nimitystä HAT-alusta.

B. Ääreisveren yksitumaisten solujen soluohjattu transformointi E~PBMC:den soluohjattu transformointi tehtiin vil-20 jelemällä E~PBMC:tä yhdessä transformoivan solulinjan kanssa. Transformoiva solulinja oli EBNA-positiivinen ih-mislymfoblastoidisolulinjan, joka oli johdettu etyylime-taanisulfonaattimutageneesillä GM 1500-lymfoblastoidisolu-linjasta. Tekemällä valikointi 6-tioguaniinin (30 pg/ml) 25 läsnäollessa saatiin hypoksantiiniguaniinifosforibosyyli- transferaasittomia ja siten HAT-herkkiä soluja. Tälle so-lulinjalle on annettu nimeksi lA2-solulinja, ja se on talletettu the American Type Culture Collectioniin (ATCC) 29. maaliskuuta 1982 ATCC-numerolla CRL 8119. Logaritmisessa 30 kasvuvaiheessa olevat lA2-solut suspendoitiin HAT-alustaan ja yhdistettiin E-PBMC:hin suhteessa 30 lA2-solua/l E~PBMC-solu. Soluseos siirrostettiin kymmenelle pyöreäpoh-jaiselle 96-syvennyksiselle mikrotitrauslevylle pitoisuudeksi 62000 solua/syvennys tilavuuden ollessa 200 μΐ/sy-35 vennys, ja viljelmää inkuboitiin lämpötilassa 37 °C kostu- 24 94489 tetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 6 % C02:a. Viljelmille annettiin lisäravintoa 5 vrk:n kuluttua transformoinnista korvaamalla puolet supernatantista tuoreella HAT-alustal-la. Syvennyksiä tarkasteltiin joka toinen päivä inversio-5 mikroskoopilla merkkien havaitsemiseksi so]ujen prolife-raatiosta. 10 vrk:n kuluttua siirrostuksesta ja lA2-solu-jen kuoltua HAT-alustan vaikutuksesta, syvennyksiin vaihdettiin uusi alustaformula, joka oli muuten samanlainen kuin HAT-alusta, mutta siitä puuttui aminopteriinikompo-10 nentti. 15 vrk:n kuluttua siirrostuksesta havaittiin, että kaikki syvennykset sisälsivät lisääntyviä soluja ja että useimmissa syvennyksissä solutiheys oli riittävä superna-tanttien poistamiseksi ja anti-E. coli tai anti-S. marces-cens-vasta-aineen tutkimiseksi niistä.

15 C. Spesifistä vasta-ainetta erittävien solujen de- tektointi

Supernatanteista tutkittiin anti-E. coli tai anti-S. marcescens-vasta-aineiden läsnäolo käyttämällä ELISA-menetelmää (enzyme-linked immunosorgent assay) [Engvall, 20 E., "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology", Med.Biol. 55(1977) 193-200]. Antigeenilevyt koostuivat sarjasta tasapohjaisia 96-syvennyksisiä Immun-lon 2-mikro-titrauslevyjä, joiden syvennykset sisälsivät joko elävien E. coli tai S. marcescens-serotyyppien seosta * 25 kiinnitettynä syvennyksen pintoihin poly-L-lysiinillä (PLL). Lyhyesti kuvattuna 50 μΐ seosta, joka sisälsi 1 pg/ml PLL:ää PBS:ssa, pidettiin kussakin syvennyksessä 30 min huoneen lämpötilassa (RT). Levyt pestiin kolmesti PBS:llä, ja kuhunkin syvennykseen lisättiin joko PBS:ää . 30 tai 50 μΐ bakteeriseossuspensiota, jonka OD660 (optinen tiheys aallonpituudella 66a nm) oli 0,2. Levyjä inkuboitiin lämpötilassa 37 °C 60 min, ja ne pestiin kolmesti fysiologisella suolaliuoksella, joka sisälsi 0,02 % Tween 20, (suolaliuos/T:llä) kiinnittymättömien bakteerien poista-35 miseksi. Kokeessa käytettyjä erilaisia antigeenilevyjä olivat: 25 94489 1) E. coli-serotyyppien 01 (ATCC-nro 23499) ja 04 (ATCC-nro 12791)? seos 2) S. marcescens-serotyyppien 07, 015, 016 ja 018 seos (kaikki referenssi-tyyppikannat saatiin Communicable 5 Disease Centeristä (CDC), Atlanta, GA); ja 3) bakteeriton mikrotitrauslevy.

Tutkittavat syvennykset suojattiin ELISA-menettelyä varten ensin 20 piillä seosta, joka sisälsi 5 % (paino/-tilavuus) rasvatonta kuivamaitoa, 0,0001 % Foam A:ta ja 10 0,01 % (paino/tilavuus) Thimerosalia 500 ml:ssa PBS:ää, proteiinien epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi. Kun levyjä oli inkuboitu 1 h DTtssa, ne pestiin kolmesti suo-laliuos/T:llä (200 μΐ/syvennys/pesukerta). Kuhunkin syvennykseen lisättiin 50 μΐ seosta, joka sisälsi 0,1 % Tween 15 20 ja 0,2 % naudan seerumialbumiinia PBSissä, (PTB). Vil- jelmälevyn syvennysten supernatantit replikasiirrostettiin antigeeni- ja vertailulevyjen vastaaviin syvennyksiin (50 μΐ/syvennys), ja levyjä inkuboitiin huoneen lämpötilassa (RT), 30 min. Sitten supernatantit poistettiin, levyt pes-20 tiin viidesti suolaliuos/T:llä, ja 50 μΐ biotinyloitua vuohen anti-ihmisimmunoglobuliinia (Ig) (TAGO # 9303040 laimennettuna PTB:llä suhteessa 1:250) lisättiin kuhunkin syvennykseen. Kun oli inkuboitu 30 min RT:ssa, biotinyloi-tu reagenssi poistettiin, syvennykset pestiin viidesti 25 suolaliuos/T:llä, ja lisättiin kuhunkin syvennykseen 50 μΐ ennalta muodostettua avidiinin ja biotinyloidun piparjuu-riperoksidaasin kompleksia (Vectastain ABD Kit, Vector Laboratories). Kun levyjä oli pidetty 30 min RTtssa, Vectastain ABC-reagenssi poistettiin, syvennykset pestiin vii-.. 30 desti suolaliuos/T:llä, ja lisättiin kuhunkin syvennykseen 100 μΐ substraattia (0,8 mg/ml orto-fenyleenidiamiinidi-hydrokloridia 100 mM sitraattipuskurissa, pH 5,0 + 0,03 % H202 deionisoidussa vedessä, sekoitetaan yhtä suuret tilavuudet juuri ennen käyttöä). Kun oli inkuboitu 30 min pi-35 meässä, lisättiin kuhunkin syvennykseen 50 μΐ 3N H2S04 26 94489 reaktion pysäyttämiseksi. Viljelmäsupernatantit, jotka sisälsivät bakteereilla päällystettyjen levyjen kanssa reagoivaa vasta-ainetta, detektoitiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 490 nm Dynatech MR 580 micro-ELISA-lait-5 teella.

Kuudesta transformoinnista saadut viljelmäsupernatantit analysoitiin edellä mainitulla menetelmällä, jolloin identifioiduksi tuli yksi syvennys (7D7), joka oli aktiivinen E. coli ja S. marcescens-serotyyppilevyjen, 10 mutta ei vertailulevyjen, kanssa. Myöhemmissä ELISA-ko- keissa, jotka tehtiin käyttämällä yksittäisiä E. coli-se-rotyyppejä, todettiin, että tämä syvennys sisälsi vasta-ainetta, joka reagoi ainakin seuraavien E. coli-serotyyppien kanssa: 08 (ATCC-nro 23504) ja 075 (ATCC-nro 12798), 15 mutta ei serotyyppien 04, 06:K2, 08:K8, 09:K9) eikä 022:K13 (ATCC-nrot 12791, 19138, 23501, 23505 ja vastaavasti 23517) kanssa. Lisäksi tämä syvennys sisälsi vasta-ainetta, joka reagoi S. marcescens-serotyyppien 012, 013 ja 015 kanssa, mutta ei minkään muun kanssa 20 tunnetusta 20 S. marcescens-LPS-serotyypistä.

D. Spesifistä vasta-ainetta tuottavien solujen kloonaus

Syvennyksen 7D7 soluille tehtiin muutamia (4) kloonauksia, kunnes kaikkien kloonien supernatantit edellä 25 mainitulla ELlSA-menettelyllä analysoituina antoivat tu lokseksi positiivisen reaktion E. coli-serotyyppien 08 ja 075 ja S. marcescens-serotyyppien 012, 013 ja 015 kanssa. Yhdenkään kloonisupernatantin ei kertaakaan havaittu osoittavan erottelua reaktiivisuusmallissaan, mikä viittaa . 30 siihen, että syvennyksen 7D7 viljelmäsupernatantti oli todella sukujen välisesti ristireaktiivinen esitettyjen E. coli ja S. marcescens-serotyyppien kanssa eikä sisältänyt enempää kuin yhden solulinjan (joista kullakin on yksilöllinen serotyyppireaktiivisuus). Solut kloonattiin rajalai-35 mennusmenetelmällä pyöreäpohjäisillä 96-syvennyksisillä 27 94489 levyillä syöttäjäsolujen poissa ollessa. Alusta koostui Iscoven alustasta, joka sisälsi FBS:ää (15 tilavuus-%), L-glutamiinia (2 mmol/1), natriumpyruvaattia (1 mmol/1), penisilliiniä (100 ky/ml) ja streptomysiiniä (100 pg/ml).

5 Viljelmille annettiin joka kolmantena päivänä lisäravintoa korvaamalla puolet supernatantista tuoreella alustalla. Syvennysten lymfoblastoidisolutiheys oli yleensä 2-3 viikon kuluttua riittävä anti-E. coli ja anti-S. marces-cens- serotyyppispesifisyyden analysoimiseksi.

10 Siten tässä kokeessa saatiin aikaan yksi transfor moitu ihmissolulinja, joka on jatkuva (immortaalinen) ja erittää ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta esitettyjen E. coli ja S. marcescens-serotyyppien pinnalla olevalle determinantille.

15 Ennen tämän patenttihakemuksen jättämistä 7D7:ksi identifioitu jatkuva transformoitu ihmissolulinja on talletettu the American Type Culture Collectioniin, Rockville, MD, ATCC-nro:11a CRL 9009.

E. Sukujen välisen ristireaktiivisuuden tarkempi 20 karakterisointi

Kloonatusta 7D7-solulinjasta saadun vasta-aineen sukujen välistä ristireaktiivisuutta tutkittiin edelleen tavanomaisen immuunitäplämenetelmän muunnoksella. Erityisesti tutkittiin ristireaktiivisuutta bakteerien K. pneu-25 moniae, E. aerogenes ja E. cloacae kanssa laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosa-paperikiekolle, antamalla bakteereja sisältävän kiekon reagoida mainitun vasta-aineen kanssa ja kehittämällä vas-taainereaktiot alkalinen fosfataasi/nitrosinitetratsolium-,, 30 entsyymisysteemillä. Lyhyesti kuvattuna laitettiin täpläksi 1,0 μΐ bakteereja (OD660=0,4) ristikon aukkoa kohden nit-roselluloosapaperikiekolle (Schleicher and Schuell, 37 mm: n nitroselluloosakiekko, ristikolla varustettu, 0,45 pm). Kuhunkin kiekkoon voidaan helposti laittaa 60 eri-35 laista bakteerinäytettä. Kiekot, joille täplät oli laitet- 28 94489 tu, kuivattiin ilmassa, kiinnitettiin pitämällä 30 min 25-tilavuusprosenttisessa isopropanolissa ja suojattiin 10 min rasvatonta kuivamaitoa sisältävässä reagenssissa ELISA-menetelmän yhteydessä kuvatulla tavalla. Suojattuja 5 kiekkoja pestiin kolmesti 5 min kerrallaan PBS/Tween 20:-ssä, ja ne siirrettiin kudosviljelymaljojen (35 x 10 mm) kansiin. Vasta-ainetta sisältävää supernatanttia (1,0 ml) lisättiin kanteen, ja inkuboitiin RT:ssa 60 min. Pestiin kolmesti 5 min PBS/Tween 20:llä ja lisättiin 1 - 2 ml suh-10 teessä 1:1000 PBS:llä laimennettua alkaliseen fosfataasiin konjugoitua vuohen anti-ihmisimmunoglobuliinia (TAGO, Burlingame, CA), jonka annettiin vaikuttaa 60 min RT:ssa. Kiekot pestiin edellä kuvatulla tavalla ja upotettiin 1 -2 ml:aan tuoretta substraattia, joka valmistettiin seuraa-15 vasti: 16,5 mg bromikloori-indolyylifosfaattia ja 8,5 mg nitrosinitetratsolium liuotettiin 50 ml:aan alkalinen fos-fataasi-puskuria (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, joka sisältää 0,1 mol/1 NaCl ja 5 mmol/1 MgCl2), liuos pidettiin pimeässä ja suodatettiin välittömästi ennen käyttöä. Kun oli tapah-20 tunut asianmukainen värin kehittyminen (10 - 15 min), reaktio pysäytettiin huuhtomalla kiekkoa muutamalla erällä tislattua vettä. Kehitettyjä kiekkoja voidaan säilyttää kuivauksen jälkeen.

Kiekot sisälsivät 50 kapselityypitettyä K. pneu-25 moniae referenssikantaa, jotka saatiin tri George Kenneyl-tä, University of Washington, Department of Pathobiology, Seattle, WA, ja the American Type Culture Collectionista, 4 kliinisestä verestä eristettyä E. aerogenes-näytettä ja 6 kliinisestä verestä eristettyä E. cloacae-näytettä (ve-30 restä eristetyt näytteet luovutti Harborview Hospital,

Seattle, WA). Enterobacter-näytteet tyypitettiin käyttämällä 23 standardisoitua biokemiallista testiä sisältävää API 2oE System-järjestelmää (API Analytab Products, Plain-view, NY). Tällä menetelmällä saadaan identifioiduksi 35 gramm-negatiivisten bakteerien suku ja laji, mutta ei se- • a 29 94489 lia, S. marcescensia ja K. pneuraoniaeta, ei identifioida serotyypin, vaan ainoastaan suvun ja lajin suhteen.

Näiden kokeiden perusteella havaittiin, että 7D7-vasta-aineella on enemmänkin sukujen välistä ristireaktii-5 visuutta. Tämä vasta-aine reagoi seuraavien serotyyppien kanssa: K. pneumoniae E. coli_S. marcescens_E. aeroaenes K14, 57, 60 08, 75 012, 13, 15 kliinisiä isolaatteja 10 Siten ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen 7D7 havaittiin ristireagoivan sukujen välisesti lajeihin E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes kuuluvien bakteerien, mutta ei E. cloacaen, kanssa.

F. Monoklonaalisten vasta-aineiden karakterisointi 15 Se havainto, että monoklonaalinen vasta-aine risti- reagoi muutaman eri bakteerisuvun kanssa, viittasi siihen, että vasta-aine suuntautui yhteistä proteiinia tai hiilihydraattia vastaan. Näiden kahden molekyylispesieksen on osoitettu vastaavan sukujen sisäisistä ristireaktioista 20 [Mutharia, L. ja Hancock, R. E. W., "Characterization of Two Surface-Localized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa"; Canadian J. of Microbiol. 31 (1385) 381-386; Orskov, F. ja Orskov, I., "Serotyping of , Escherichia coli" teoksessa Methods in Microbiology, vol.

* 25 14, toim. Bergan, T., Academic Press, Orlando, FL 1984, s.

43-112].

7D7-vasta-aineen tunnistaman molekyylispesieksen biokemiallinen karakterisointi tehtiin immuunitäpläanalyy-sillä. Lyhyesti kuvattuna pestyt bakteerit, jotka saatiin . 30 20 ml:sta yön yli kasvatettua liemiviljelmää (E. coli, S.

marcescens ja E. aerogenes-serotyypit) tai yön yli kasvatetuilta maljaviljelmiltä (K. pneumoniae), siirrettiin 1,0 ml:aan liuosta, joka sisälsi 64 ml 50 mM Tris-puskuria pH

7,6, 30 ml glyserolia, 0,3 g deoksikolaattia (natriumsuo-35 lana), 0,14 ml beta-merkaptoetanolia ja 6 ml deionisoitua 30 94489 vettä [Schlechter, I. ja Block, K., "Solubilization and Purification of trans-Formesyl Pyrophosphate-Squalene Synthetase", J. Biol. Chem. 246 (1971) 7690-7696]. Kun suspensiota oli inkuboitu 18 tuntia lämpötilassa 4 °C, 5 sitä sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 10 min. Supernatantti poistettiin, ja proteiini määritettiin kvantitatiivisesti käyttämällä Bio-Rad Protein Assay-menetel-mää (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA). Kustakin bakteerista saadulle proteiinille (100 - 1000 ng, vaihtelee bak-10 teeriuutteen mukaan) tehtiin erikseen natriumdodekyylisul-faatti-(SDS)-polyakryyliamidigeelielektroforeesi[Kusecek, B. et ai., "Lipopolysaccharide, Capsulel and fimbriae as Virulence Factors Among 01, 07/ 016, 018 or 0,75 och Kl, K5 or K100 Escherichia coli", Infection and Immunity 43 15 (1384) 368-379]. Erottuneet molekyylispesiekset siirret tiin geelistä nitroselluloosakalvoon (NCM) kirjallisuudessa kuvatulla tavalla [Towbin, H. et ai., "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications", Proc.

20 Natl. Acad. Sci. 76 (1979) 4350-4352], ja NCM-täplä suojattiin pitämällä kalvoa tunti PBS-Tweenissä [Batteiger, B. et ai., "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins Transferred to Nitrocellulose Membranes", J. Immunol. Meth. 55 (1982) 297- 25 307]. Täplää inkuboitiin 1 tunti RT:ssa 10 mlrssa 7D7-vil- jelmästä saatua käytettyä supernatanttia. Täplää huuhdottiin neljästi 5 min PBS-Tweenissä, inkuboitiin alkaliseen fosfataasiin konjugoidussa vuohen anti-ihmis-Ig:ssä ja kehitettiin edellä bakteeri-nitroselluloosakiekkomäärityksen : 30 yhteydessä kuvatulla tavalla. Havaittiin positiivisia reaktioita kaikilla kaistoilla, jotka sisälsivät tässä kuvattujen bakteerien deoksikolaattiuutteita. Näillä kaistoilla 7D7-vasta-aine tunnisti sarjan säännöllisin välein sijoittuneita molekyyliyksiköitä, jolloin immuunitäplälle 35 muodostui tikapuumainen kuvio. Tämä kuvio vastasi täysin

Il «ti t *lii I I J ** . . I

31 94489 kuviota, joka havaitaan LPS:n polyakryyliamidigeelielekt-roforeesissa SDS:n läsnä ollessa, jonka yhteydessä on osoitettu, että vyöhykkeiden muodostama heterogeeninen koko-kuvio johtuu LPS-molekyylipopulaatiosta, jossa molekyylien 5 painoerot vastaavat molekyylissä läsnäolevien O-antigee-nisten oligosakkaridisivuketjuyksiköiden lukumääräeroa [Palva, E.T. ja Mäkelä, P.H., "Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Sodium Dode-cyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Eur. J.

10 Biochem. 107 (1980) 137-143, ja Goldman, R.C. ja Leive, L., "Heterogeneity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli Olli and Salmonella typhimurium LT2, Eur. J. Biochem. 107 (1980) 143-154], Nämä tulokset osoittavat, että monoklonaalinen vasta-aine 15 7D7 suuntautuu joillakin E. coli, S. marcescens, K. pneu moniae ja E. aerogenes-serotyypeillä esiintyville LPS-mo-lekyyleille yhteistä antigeenideterminanttia vastaan.

Antigeenin molekyyliluonteen määrittämiseksi tarkemmin deoksikolaattiuutteet käsiteltiin ennen elektrofo-20 reesia proteolyyttisellä entsyymillä Proteinase K

[Eberling, W. et ai , "Proteinase K from Tritirachium album Limber", Eur. J. Biochem. 47 (1974) 91-97]. Näytteen valmistamiseksi 10 pg proteinase K:ta lisättiin 50 pg:aan näyteproteiinia ja seosta pidettiin lämpötilassa 65 °C 60 25 min. Näytteille tehtiin elektroforeesi ja niistä tehtiin immuunitäpläanalyysi edellä kuvatulla tavalla. Proteinase K-käsittelyn jälkeen havaitut immuunitäpläkuviot olivat identtisiä ilman käsittelyä saatujen kuvioiden kanssa ja viittaavat siten siihen, että 7D7-vasta-aineen kanssa rea-; 30 goiva antigeeni ei ole luonteeltaan proteiini.

Jotta saataisiin tarkemmin todetuksi, reagoiko 7D7 hiilinydraattiepitoopin kanssa, elektroforeettisesti siirretylle deoksikolaattinäytteelle tehtiin perjodaattihape-tus miedoissa olosuhteissa ennen nitroselluloosapaperin 35 saattamista reagoimaan vasta-aineen kanssa. Tämä reaktio 32 94489 on osoitettu tuhoavan hiilihydraattideterminantit ja siten niiden myöhemmän reaktiivisuuden vasta-aineen kanssa muuttamatta proteiini- tai lipidiepitooppeja [Woodward, M.P. et ai., "Detection of Monoclonal Antibodies Specific for 5 Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation", J. of Immunol. Methods 78 (1985) 143-153]. Lyhyesti kuvattuna elektroforeettisesti käsitellyn näytteen sisältävä nit-roselluloosapaperi, jolle täplät oli siirretty elektroforeettisesti, suojattiin PBS-Tweenillä edellä kuvatulla ta-10 valla ja huuhdottiin 50 mM etikkahappo-natriumasetaatti-puskurilla, pH 4,5. Nitroselluloosapaperia inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi 50 mmol/1 perjodihappoa liuotettuna etikkahappopuskuriin, 60 min pimeässä RT:ssa. Käsitelty paperi huundottiin kolmesti PBS-Tweenillä, ja sen 15 annettiin reagoida vasta-aineen kanssa edellä kuvatulla tavalla. Tällä tavalla käsitellyt elektroforeettisesti siirretyt deoksikolaattiuutteet eivät enää reagoineet mo-noklonaalisen vasta-aineen 7D7 kanssa. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että tämän vasta-aineen tunnistama 20 epitooppi on hiilihydraatti, joka esiintyy edellä kuvattujen bakteerien LPS-molekyylillä.

Monoklonaalisen 7D7-vasta-aineen isotyyppi määritettiin muuten samanlaisella ELISA-menettelyllä kuin edellä spesifisyystestien yhteydessä, mutta käytettiin bioti-25 nyloitua vuohen anti-ihmis-IgG:tä (gammaketjuspesifinen, TAGO) tai biotinyloitua vuohen anti-ihmis-IgM (mu-ketju-spesifinen, TAGO) toisen vaiheen reagenssina laajemmin reagoivan biotinyloidun vuohen anti-ihmis-Ig:n sijasta). Kumpaakin reagenssia käytettiin laimennettuna suhteessa : 30 1:500, ja antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen E.

coli 08 ja 075-kantojen yhdistelmiä. Monoklonaalisen 7D7-vasta-aineen positiivinen reaktio E. colikantojen kanssa havaittiin vain anti-IgM-reagenssia käytettäessä, mikä osoittaa monoklonaalisen vasta-aineen olevan IgM-isotyyp-35 piä. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos edellä esi- 11 lii t Hl·tl I I ( M ? 33 94489 tetty menettely toistettaisiin muutamia kertoja ja määritettäisiin siten saatujen sukujen välisesti risti-reagoivien monoklonaalisten vasta-aineiden isotyypit, löydettäisiin lisää esimerkiksi IgM- ja IgG-isotyyppejä [Frosch, M.

5 et ai., "NZB Mouse System For Production of Monoclonal

Antibodies to Weak Bacterial Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli K1 and Group Meningocci", Proc. Natl. Acad. Sci. 82 (1985) 1194-1198].

10 G. Aktiivisuus in vitro

Monoklonaalisen 7D7-vasta-aineen toiminnallista aktiivisuutta in vitro tutkittiin in vitro-opsonofagosytoo-simäärityksellä, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisi-distä aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmi-15 sen komplementin läsnä ja poissa ollessa.

Bakteerit valmistettiin joko inokuloimalla 10 ml trypsiinikäsiteltyä soijalientä (TSB) 50 pl:lla yön yli kasvatettua liemiviljelmää (E. coli, S. marcescens ja E. aerogenes) tai tekemällä sivelysiirrostus Worfel-20 Ferguson-agaria sisältävälle petrimaljalle (K. pneumo niae). Liemiviljelmien ollessa kyseessä putkia inkuboitiin lämpötilassa 37 °C ravistimella 3 tuntia, minkä jälkeen 1,5 ml viljelmää sentrifugoitiin 1 min kiihtyvyydellä 10 000 x g, heitettiin pois käytetty alusta ja suspendoitiin 25 pelletti 3,5 ml:aan Hankin tasapainotettua suolaliuosta, joka sisälsi 0,1 % gelatiinia ja 5 mmol/1 HEPES:iä (HBSS/-geeli). Agarmaljalla kasvatettujen pesäkkeiden ollessa kyseessä pesäkkeet kaavittiin maljalta steriiliin HBSS/-geeliin. Molemmissa olosuhteissa kasvatettujen bakteerien : 30 pitoisuus säädettiin arvoon 3 x 103 bakteeria/ml mittaamal la OD660 ja laimentamalla sopivasti (noin 1:50 000). Ihmisen neutrofiilit eristettiin van Furthin ja Van Zwetin menetelmällä ("In Vitro Determination of Phagocytosis and Int-rocellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear 35 Phagocytes" teoksessa Hancdbook of Experimental Immunolo- 34 94489 gy, voi 2, 2. p., toim. D. M. Weir, Blackwell Sientific Publications, Oxford 1973, s 36.1-36.24), johon tehtiin muutamia muutoksia. Heparinisoidusta verestä (10 ml) saatu nahanvärinen kate laitettiin Ficoll-Paquen päälle ja sent-5 rifugoitiin. Punasolupelletti (RBC-pelletti) pestiin kerran RPMI 1640-alustalla ja suspendoitiin takaisin yhtä suureen tilavuuteen PBS:ää lämpötilassa 37 °C. 3 ml tätä suspensiota lisättiin 6 ml:aan 2 %:sta dekstraaniliuosta (PBSrssä), ja sisältö sekoitettiin varovasti mutta perus-10 teellisesti kääntämällä putkea ylösalaisin. Kun oli inku-boitu 20 min 37 °C:ssa punasolujen sedimentoimiseksi, su-pernatantti (joka sisälsi neutrofiilejä) poistettiin, pestiin kahdesti 4 °C:n PBSillä, kerran HBSS/geelillä ja sus-pensoitiin jälkimmäiseen liuokseen pitoisuudeksi 5 x 107 15 neutrofiiliä/ml. E. colin ja S. marcescensin yhteydessä käytetyn komplementtilänteen saamiseksi ihmisseerumiin absorboitiin kahdesti elävien bakteerien yndistelmiä [Bjornson, A.B. ja Michael, J.G., "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Inte-20 raction of Opsonins with the Bacterium", J. of Inf. Dis.

139 (1974) täydennyssivut S119-S126], jotka vastasivat kokeessa käytettyjä organismeja. Tähän seerumiin adsorboitiin lisäksi keitettyä Zymosania (Bjornson, supra) prope-ridiiniseerumikomponentin, vaihtoehtoisen komplementtitien • 25 aktivoitumiselle välttämättömän molekyylin, poistamiseksi.

Opsonofagosyyttisissä kokeissa, joissa käytettiin K. pneu-moniaeta ja E. aerogenesia, komplementtilähteenä oli ad-sorboimaton normaali ihmisseerumi jota käytettiin loppupi-toisuutena 1 %.

: 30 Elossa olevien/tuhoutuneiden bakteerien kvantita tiiviseen määrittämiseen käytettyjen levyjen valmistus aloitettiin lämmittämällä 24-syvennyksisiä maljoja 37 °C: ssa 3-5 tuntia. Agaroosin 0,4-%:nen liuos TSBcssä valmistettiin autoklavoimalla seosta 5 min ja antamalla sen 35 jäähtyä 50 °C:seen vesihauteessa. Noin 15 min ennen op- 35 94489 sonofagosytoosimäärityksen lopullisen inkubointijakson loppumista 24-syvennyksinen malja poistettiin 37 °C:n in-kubaattorista, laitettiin lämpölevylle, jonka lämpötila oli 42 °C, ja lisättiin kuhunkin syvennykseen 0,4 ml TSB/-5 agaroosia. Malja laitettiin välittömästi takaisin inku-baattoriin lämpötilaan 37 °C, niin ettei agaroosi missään vaiheessa jäähtynyt alle 37 °C:n.

Määritystä varten 25 μΐ 7D7-viljelmän supernatant-tia ja 25 μΐ asianmukaista bakteerikantaa laitettiin kah-10 tena rinnakkaisnäytteenä 96-syvennyksisiin pyöreäpohjai-siin mikromaljoihin, ja inkuboitiin RTrssa 30 min. Tämän jälkeen lisättiin 15 μΐ ihmisen komplementtia, 15 μΐ ihmisen neutrofiilejä (5 x 106/ml) ja 70 μΐ HBSS/geeliä. Maljan koko pinta pyyhittiin steriilillä puuvillavanulla, laitet-15 tiin päälle tarttuva muovikansi, joka peitti tarkasti koko maljan ja syvennysten väliset alueet, ja pyöritettiin maljaa 37 °C:ssa 1 tunti. Inkuboinnin jälkeen levyä sentrifu-goitiin 5 min kiihtyvyydellä 100 x g, poistettiin kansi varovasti, ja kuivattiin maljan pinta steriilillä puuvil-20 lavanulla, joka oli kostutettu 70 %:sella etanolilla. Kustakin syvennyksestä poistettiin 50 μΐ seosta, ja lisättiin kukin annos yksitellen 24-syvennyksisiin laskentamaljoihin, jotka sisälsivät ennalta 0,4 ml/syvennys sulatettua (38 - 40 °C) 0,4-%:sta TSB/agaroosia. Näitä levyjä käsi-25 teltiin tasapohjaisella ravistimella 1 min kierrosnopeu-della 150 min-1, ja agaroosin annettiin kovettua 15 min RT:ssa. Lopuksi kuhunkin syvennykseen laitettiin pintakerrokseksi 0,4 ml TSB/agaroosia ja annettiin kovettua 15 min lämpötilassa 4 °C, minkä jälkeen levyjä inkuboitiin yön : 30 yli 37 °C:ssa. Pesäkkeet laskettiin 18 tunnin kuluttua, ja tulokset ilmoitettiin pesäkkeenmuodostusyksikköinä (CFU:-na) kukinlaisissa olosuhteissa.

Tässä käytetyt bakteeriserotyypit, K. pneumoniaeta lukuun ottamatta, inaktivoituivat vain monoklonaalisen 35 vasta-aineen 7D7, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmi- 36 94489 sen neutrofiilien läsnäollessa (taulukko 1). Kun tämä koe toistettiin useilla 7D7:n kanssa reagoimattomilla baktee-riserotyypeillä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä), mikä osoittaa monoklonaalisen 5 vasta-aineen 7D7 funktionaalisen spesifisyyden ja sen kyvyn opsonisoida bakteereja ja edistää niiden fagosytoosia.

Koska opsoniinien (spesifisten vasta-aineiden) ja polymor-fonukleaaristen leukosyyttien (neutrofiilien) yhteisvaikutus osoittautui päämekanismiksi, jolla immuniteetti näille 10 bakteerikannoille muodostuu, viittasivat nämä tulokset siihen, että vasta-aine 7D7 antaisi sopivasti annettuna suojan tässä kuvattujen bakteeriserotyyppien aiheuttamia tappavia infektioita vastaan.

Il ·« < »Ml ( « * · 37 94489

Taulukko 1

Tuhoutumis-% 5 Bakteerit Neutro- Vasta- fiilit aine Komple- Lisätyt ___mentti bakteerit E.coli 08 ja 075 + 7D7 -a 0 E.coli 08 ja 075 + 6Fllb + 0 E.coli 08 ja 075 - 7D7 + 0 E.coli 08 ja 075 + 7D7 + 85 % S.marcescens 15 012 ja 015 + 7D7 - 0 S.marcescens 012 ja 015 + 6F11 + 0 S.marcescens 012 ja 015 - 7D7 + 0 S.marcescens 20 012 ja 015 + 7D7 + 85 % E.aeroqenes erist.näytt. (2) + 7D7 - 0 E.aeroqenes erist.näytt. (2) + 6F11 + 0 E.aeroqenes 25 erist.näytt. (2) - 7D7 + 0 A.aeroqenes erist.näytt. (2) +__7D7__+_ 85 % 30 a(-) = lämmöllä inaktivoitu (56 °C 30 min) ihmisen komplementti b(6Fll) = viljelmäsupernatantti, joka sisältää ihmisen mo-noklonaalista IgM-vasta-ainetta Pseudomonas aeruginosa-Fisher-tyypille 2.

O w 38 94489 H. Aktiivisuus in vivo

Edellä esitetyn hypoteesin testaamiseksi tehtiin eläinkokeita käyttämällä 7D7-vasta-ainetta ja vähintään yhtä tässä kuvattuihin E. coli ja E. aerogenes-lajeihin 5 kuuluvaa organismia. Ensin konsentroitiin 7D7:ää ja negatiivista vertailuainetta (6F11, ihmisen monoklonaalinen IgM- vasta-aine, joka on spesifinen Pseudomonas aeruginosa Fisher-immunotyypille 2) käytetyistä viljelmäsupernatan-teista seostamalla kiinteällä ammoniumsulfaatilla (loppu-10 pitoisuus 50 %) (Good A.J. et ai., "Purification of Immunoglobulins and Theri Fragments" teoksessa Selected Methods in Cellular Immunology, toim. Mishell, B.B. ja Shiigi, S.M., W.H. Freeman and Company, San Francisco, CA 1980, s. 279-286). Seostettu materiaali sekoitettiin ta-15 kaisin steriiliin veteen ja dialysoitiin perusteellisesti PBS:ää vastaan.

Ammoniumsulfaattisakan sisältämä IgM-vasta-aine puhdistettiin affiniteettikromatografiällä käyttämällä kolonnia, joka sisälsi hiiren monoklonaalista anti-ihmis-20 IgM-vasta-ainetta. Tämä kolonni valmistettiin sekoittamalla 1 g kuivattua syanogeenibromidilla aktivoitua Sepharose 4B:tä (Pharmacia) 15 ml:aan jääkylmää tislattua vettä, joka sisälsi 1 mmol/1 HCl:a. Kostunut geeli pestiin 30 milliä liittämispuskuria (0,1 mol/1 karbonaattia (NaHC03) 0,5 ‘25 M NaCl-liuoksessa, pH 8,2), valutettiin, jolloin muodostui kostea kakku, ja yhdistettiin ammoniumsuolasakkaan, joka oli liuotettu 1-3 ml:aan liittämispuskuria. Geelisuspen-sio sekoitettiin kääntelemällä putkea 2 tuntia RT:ssa, ja sentrifugoitiin sitten 5 min kiihtyvyydellä 200 x g. Vielä : 30 käytettävissä olevien reaktiivisten kohtien salpaamiseksi supernatantti poistettiin, lisättiin geeliin 10 ml 1 M etanoliamiiniliuosta, ja jatkettiin sekoitusta edellä kuvatulla tavalla. Suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 200 x g 5 min, ja supernatantti heitettiin pois. Geeli 35 preparoitiin käyttökuntoon pesemällä kerran 0,1 M asetaat- 39 94489 ti/suola-puskurilla (6,8 g natriumasetaattitrihydraattia ja 14,6 g NaCl liuotettiin 500 ml:aan tislattua vettä, joka sisälsi 2,9 ml jääetikkaa, pH 4,0), kahdesti liittä-mispuskurilla ja kerran PBS:llä. Geeli kaadettiin Pharma-5 cia C10/10-kolonniin ja säilytettiin 4 °C:ssa käyttöön asti.

Immunoglobuliinin puhdistamiseksi 0,5 ml suolalla fraktioitua materiaalia laimennettiin 2 ml:ksi PBS:lla ja lisättiin affiniteettikolonniin. Kun näyte oli saatu ko-10 lonniin, kolonnia huuhdottiin PBS:llä (pH 8), kunnes ab-sorbanssimonitori osoitti, ettei effluentti enää sisältänyt proteiinia. Sitoutunut vasta-aine eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 2 mol/1 MgCl2 PBSissä, määritettiin kunkin fraktion proteiinipitoisuus mittaamalla OD280, ja yhdistet-15 tiin piikkejä vastaavat fraktiot. Vasta-ainetta sisältä västä fraktiosta poistettiin suolat G-25 Sephadex-kolon-nilla, ja väkevöitiin tarvittaessa mikrokonsentrointisent-rifugoinnilla (Centricon 30, Amicon Corp., Danver, MA) pitoisuuteen 1-2 mg/ml. Lopputuotteen puhtaus testattiin 20 SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, jonka jälkeen tehtiin proteiinien hopeanitraattivärjäys [Morrissey, J.H., "Silver Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels: A Modified Procedure with Enhanced Uniform Sensitivity".

Anal. Biochem. 117 (1981) 307-310], ja vasta-aineaktiivi-‘ 25 suus ELISA:11a edellä kuvatulla tavalla.

Kullakin bakteerilla tehtävää infektointia varten etäissiitetyt Swiss-Webster-naarashiiret, joiden paino oli 20 - 22 g, jaettiin kolmeen kymmenen hiiren ryhmään. Eräs tyypillinen koe tehtiin seuraavasti: : 30 Ryhmä_Bakteeri_Vasta-aine A E.coli 08 7D7 B E.coli 08 6F11 C S.marcescens 014 7D7

Kuhunkin vasta-ainetta saavaan ryhmään injektoitiin 35 laskimonsisäisesti 200 μΐ steriiliä PBS:ää, joka sisälsi « 40 94489 25 pg puhdistettua vasta-ainetta. Kaikki eläimet infektoi-tiin 2 tunnin kuluttua intraperitoneaalisesti 300 piillä eläviä bakteereja, joka määrä sisälsi 3 x LD50-annoksen vastaavaa bakteerikantaa. Bakteerisuspensio oli valmistet-5 tu logaritmisessa kasvuvaiheessa olevasta liemiviljelmästä, josta bakteerit erotettiin sentrifugoimalla, pestiin ne kahdesti PBSillä ja suspensoitiin takaisin sopivaksi pitoisuudeksi PBS:ään. Eläimiä tarkkailtiin 5 vrk. Kaikki ryhmän B (irrelevantti vasta-aine) ja ryhmän C (irrele-10 vantti organismi) eläimet kuolivat 1-2 vrk:n aikana. 7D7-vasta-ainetta saaneet eläimet (ryhmä A) olivat sitä vastoin elossa ja oireettomia.

Tätä eläinten suojaus-mallia käytettiin osoittamaan 7D7-vasta-aineen terapeuttinen vaikutus tässä mainittuinin 15 kolmeen sukuun kuuluvien organismien aiheuttamia bakteeri-infektioita vastaan. Näistä tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 2.

Taulukko 2 20 Infektoiva Eloonjäänti/ Infek- Eloonjäänti bakteeri__vasta-aine__toiduista__(%)_ E.coli 08 7D7 10/10 100 E.coli 08 6Flla 0/10 0 S.marces- . 25 cens 014b 7D7_ 0/10_ 0_ a6Fll-vasta-aine on spesifinen Pseudomonas aeruginosa Fisher-immunotyypille 2 ja toimii negatiivisena vertailu-vasta-aineena.

30 bS. marcescens 014 ei reagoi 7D7-vasta-aineen kanssa ja • toimii epäspesifisenä vertailu-organismina.

41 94489

Taulukko 2a __Eloonjäanti (%)_

Vasta-aine__Päivä ___ 5__0__1__2__3__4_ 6F11 12 2 2 1 1 7D7__12 10__6__4__4 10 CLD50- ja suojaustutkimukset tehtiin niirillä, jotka oli tehty neutropeenisiksi injektoimalla syklofosfamidia seuraavasti: päivänä 0,150 mg/kg ja päivänä 2,50 mg/kg. Päivänä 4 hiiret saivat vasta-ainetta ja bakteereja edellä kuvatulla tavalla.

15 Nämä tulokset osoittavat, että ihmisen monoklonaa- linen vasta-aine 7D7 pystyy suojaamaan hiiriä kolmeen eri gram-negatiiviseen bakteerilajiin kuuluvien bakteerien aiheuttamilta tappavilta bakteeri-infektioilta. Koska 7D7 reagoi LPS:llä olevan hiilihydraattiepitoopin kanssa ja K.

20 pneumoniaen LPS-molekyylit ovat vaikeammin saavutettavissa (Orskov, I. ja Orskov, F., "Serotyping of Klebsiella" teoksessa Methods in Microbiology, voi. 14, toim. Bergan, T., Academic Press, Orlando, FL 1984, s 143-146), ei havaittu 7D7:n suojaavaa vaikutusta K. pneumoniae-infektioi-* 25 ta vastaan (tuloksia ei esitetä tässä). Joka tapauksessa sukujen välisesti ristireagoiva ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 7D7 pystyi antamaan suojan gram-negatiivisiin bakteerilajeihin E. coli ja E. aerogenes kuuluvien organismien aiheuttamaa infektiota vastaan käytettäessä 25 pg ; 30 puhdistettua vasta-ainetta.

Esimerkki II

Esimerkissä II esitetään menetelmiä ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen, joka ristireagoi sukujen välisesti lajien Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae ja 35 Enterobacter aerogenes jäseniä vastaan, tuottamiseksi ja 42 94489 valikoimiseksi. Tässä esimerkissä osoitetaan lisäksi mainitun vasta-aineen opsonoiva aktiivisuus in vitro homologisia S. marcescens, K. pneumoniae ja E. aerogenes-sero-tyyppejä vastaan. Toimittiin esimerkin I (suurin piirtein 5 kohtien A - G) mukaisesti, jolloin saatiin ihmisen mono-klonaalista vasta-ainetta, joka oli ristisuojaava tässä kuvattujen bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan, paitsi että oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvatun vasta-aineen karakterisoimiseksi 10 ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään tutkimusmenettelyi-hin tehdyt muutokset ja tässä kuvatulla monoklonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

1. Kuudesta transformaatiosta saadut viljelmäsuper-natantit tutkittiin edellä esitetyllä menetelmällä, jol- 15 loin saatiin identifioiduksi yksi syvennys (4F10), jossa esiintyi aktiivisuutta S. marcescens-serotyyppilevyn, mutta ei E. coli- eikä vertailulevyn, suhteen. Myöhemmissä ELISA-määrityksissä, joissa käytettiin yksittäisiä S. marcescens -serotyyppejä, määritettiin, että tämä syvennys si-20 sälsi vasta-ainetta, joka reagoi S. marcescens-serotyyppi-en 015 ja 018 kanssa, mutta ei minkään muun kanssa 20 tunnetusta S. marcescens-LPS-serotyypistä.

Ennen tämän patenttihakemuksen jättämistä jatkuva transformoitu, 4F10:ksi identifioitu, ihmissolulinja tal- ‘ 25 letettiin the American Type Culture Collectioniin,

Rockville, MDI ATCC-nro:lla CRL 9007.

2. Kloonatusta 4F10-solulinjasta saadusta vastaai-neesta tutkittiin muu sukujen välinen ristireaktiivisuus käyttämällä tavanomaisen immuunitäplämenetelmän muunnosta.

, 30 Tarkemmin ilmaistuna ristireaktiivisuus bakteerien K.

pneumoniae, E. aerogenes ja E. cloacae kanssa tutkittiin laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosapaperikiekolle, antamalla bakteerit sisältävän kiekon reagoida mainitun vasta-aineen kanssa ja ke-35 liittämällä vasta-ainereaktiot alkalinen fosfataasi/nitro-sinitetratsoliumentsyymij ärj estelmällä.

« 43 94489 Näissä kokeissa havaittiin, että 4F10:llä on sukujen välistä lisäristireaktiivisuutta. Tämä vasta-aine reagoi seuraavien serotyyppien kanssa: K. pneumoniae S. mar-cescens E. aerogenes 5 K. pneumoniae_S. marcescens E. aerogenes K3, 12, 29, 31, 68, 72 015, 18 kliinisiä iso- laattej a

Ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 4F10 ristireagoi siten sukujen välisesti lajeihin S. marcescens, K. penumoniae 10 ja E. aerogenes kuuluvien bakteerien kanssa.

3. Käytettäessä immuunitäplämenetelmää havaittiin positiivisia reaktioita kaikilla kaistoilla, jotka sisälsivät edellä kuvattujen bakteerien deoksikolaattiuutteita.

Näillä kaistoilla vasta-aine 4F10 tunnisti joko leveän 15 komponenttivyöhykkeen tai sarjan säännöllisin välein esiintyviä molekyyliyksiköitä, jolloin muodostui tikapuu-mainen kuvio. Tämä kuvio oli täysin yhdenmukainen sen kanssa, joka havaitaan tehtäessä polyakryyliamidiqeeli-elektroforeesianalyysejä hiilihydraattiryhmittymistä, 20 joissa esiintyy laajaa molekyylipainon heterogeenisyyttä joko usein toistuvan tietyn sokerisekvenssin takia tai siitä syystä, että niissä on LPS-molekyylejä, joiden painot eroavat toisistaan molekyylissä olevien O-antigeenis-ten oligosakkaridisivuketjuyksiköiden lukumäärän mukaises-25 ti [Vimr, E.R. et ai., "Use of Procaryotic-Derived Probes to Identify Poly (Sialic acid) in Neonatal Neuronal Membranes", Proc. Natl. Acad. Sci. 81 (1983) 1971-1975; ja Holden, K.G. et al., "Gel Electrophoresis on Mucous Glycoproteins, I. Effect of Gel Porosity", Biochemistry 10 30 (1371) 3105-3109]. Nämä tulokset osoittavat, että mono- t • klonaalisen vasta-aineen 4F10 kohteena on joillakin S.

marcescens, K. pneumoniae ja E. aerogenes-serotyypeillä esiintyville hiilihydraattimolekyyleille yhteinen anti-geenideterminantti.

35 Proteinase K-käsittelyn jälkeen saadut immuunitäp- läkuviot olivat samanlaiset kuin ilman käsittelyä saadut, < 44 94489 ja viittaavat siten siihen, että 4F10-vasta-aineen kanssa reagoiva antigeeni ei ole luonteeltaan proteiini.

Jotta saataisiin tarkemmin todetuksi, reagoiko 4F10 hiilihydraattiepitoopin kanssa, elektroforeettisesti siir-5 retylle deoksikolaattinäytteelle tehtiin perjodaattihape-tus miedoissa olosuhteissa ennen nitroselluloosapaperin saattamista reagoimaan vasta-aineen kanssa. Elektroforeettisesti siirretyt deoksikolaattiuutteet, jotka käsiteltiin tällä tavalla, eivät enää reagoineet monoklonaalisen vas-10 ta-aineen 4F10 kanssa. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että tämän vasta-aineen tunnistama epitooppi on hiilihydraatti ryhmittymä, joka esiintyy tässä kuvattujen bakteerien molekyylien pinnoilla.

4. Monoklonaalisen vasta-aineen 4F10 isotyyppi mää-15 ritettiin ELISA-menettelyllä, joka oli muuten samanlainen kuin edellä esimerkissä I spesifisyystestien yhteydessä kuvattu, mutta antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen S. marcescens-serotyyppien 015 ja 018 yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 4F10 positiivinen reaktio S. mar-20 cescens-serotyyppien kanssa havaittiin ainoastaan käytettäessä anti-IgM-reagenssia, mikä osoittaa monoklonaalisen vasta-aineen olevan IgM-isotyyppiä. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos tämän esimerkin mukainen menettely toistettaisiin muutamia kertoja ja määritettäisiin siten * 25 saatujen sukujen välisesti ristireagoivien monoklonaalis- ten vasta-aineiden isotyypit, löydettäisiin lisää isotyyp-pejä, esimerkiksi IgM- ja IgG-isotyyppejä.

5. Monoklonaalisen vasta-aineen 4F10 toiminnallista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosimääri- , 30 tyksellä, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidista aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplementin läsnä ja poissa ollessa.

Tässä käytetyt bakteeriserotyypit inaktivoitulvat ainoastaan monoklonaalisen vasta-aineen 4F10, aktiivisen 35 komplementtilähteen ja ihmisen neutrofiilien läsnä ollessa *

· li t MM I I 4« . . I

45 94489 (taulukko 3). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä muutamia 4F10:n kanssa reagoimattomia bakteeriserotyyppejä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä), mikä osoittaa, että monoklonaalinen vasta-aine 4F10 5 on funktionaalisesti spesifinen ja pystyy opsonoimaan bakteereja ja edistämään niiden fagosytoosia.

Taulukko 3 10 Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisätty- fiilit aine mentti jen bakteerien tuhoutu- _____minen (%) S.marcescens 018 ja 015 + 7D7 -a 0 15 S.marcescens 018 ja 015 + 6Fllb + 0 S.marcescens 018 ja 015 - 7D7 + 0 S.marcescens 018 ja 015 + 7D7 + 85 % ^ K.pneumoniae K3 ja K12 + 7D7 - 0 K. pneumoniae K3 ja K12 + 6F11 + 0 K. pneumoniae K3 ja K12 - 7D7 + 0 ^ K.pneumoniae K3 ja K12 + 7D7 + 60 % E.aerogenes erist.näytt. (2) + 7D7 - 0 E.aerogenes erist.näytt. (2) + 6F11 + 0 : 30 : E.aerogenes erist.näytt. (2) - 7D7 + 0 E.aerogenes erist.näytt. (2) +__7D7_ + 85 % v 1 46 94489 *(-) = lämmöllä inaktivoitu (56 eC 30 min) ihmisen komplementti b(6Fll) = viljelmäsupernatantti, joka sisältää ihmisen mo-noklonaalista IgM-vasta-ainetta Pseudomonas aerugin-osa-5 Fisher-tyypille 2.

Esimerkki III

Esimerkissä III esitetään menetelmiä ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka reagoi sekä Escherichia colin (kapselityyppi K1) että Neisseria me-10 ningitidisin (N. meningitidis) (ryhmä B) polysakkaridin kanssa, ja lisäksi siinä osoitetaan mainitun vasta-aineen suojaava vaikutus in vivo homologisten E. coli ja N. me-ningitidis-bakteerilajien aiheuttamaa tappavaa infektiota vastaan. Toistettiin esimerkin I mukainen menettely (jota 15 kuvataan kohdissa A - G), jolloin saatiin ihmisen monoklo-naalista vasta-ainetta, joka oli ristisuojaava tässä kuvattujen bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan; tässä esimerkissä kuvatun vasta-aineen karakterisoimiseksi ja tutkimiseksi oli kuitenkin välttämätöntä muuntaa menette-20 lyä tietyllä tavalla. Seuraavassa esitetään määritysmenet-telyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvatulla monoklonaali-sella vasta-aineella saadut tulokset.

1. Viidestä transformaatiosta saadut viljelmäsuper-natantit analysoitiin edellä kuvatulla menetelmällä, jol-25 loin saatiin identifioiduksi neljä syvennystä (5D4, 2C10, 9B10 ja 8A8), joissa esiintyi anti-E. coli-spesifisyyttä E. coli serotyyppilevyllä, mutta ei S. marcescensia sisältävillä eikä vertailulevyillä, tutkittaessa. Myöhemmissä ELISA-määrityksissä, jotka tehtiin edellä kuvatulla taval-: 30 la käyttämällä yksittäisiä E. coli-serotyyppejä, todet tiin, että nämä syvennykset sisälsivät vasta-ainetta, joka reagoi ainakin E. coli-serotyyppien 01 (ATCC 23499), 07:K1 (ATCC 12792), 016:K1 (ATCC 23511) ja 050 (CDC 1113-83) kanssa, mutta ei serotyyppien 04 (ATCC 12792), 06:K2 (ATCC 35 19138), 08:K8 (ATCC 23501), 09:K2 (ATCC 23505) eikä 4 il . Iitit «iti: I list ii 47 94489 022:K13 (ATCC 23517) kanssa. Koska monoklonaalinen vasta-aine 9B10 käyttäytyi paremmin kloonauksessa ja sen tuotantomäärä oli suurempi, se valittiin jatkotutkimuksiin.

Ennen tämän patenttihakemuksen jättämistä tässä 5 9B10:ksi identifioitu jatkuva, transformoitu ihmissolulin-ja talletettiin the American Type Culture Collectioniin, Rockville, MD, ATCC-numerolla CRL 9006.

2. Se havainto, että kustakin kloonista saadut monoklonaaliset vasta-aineet reagoivat identtisen E. coli-10 O-antigeeniserotyyppien ryhmän kanssa, osoitti, että näiden vasta-aineiden kohteena oli näille serotyypeille yhteinen bakteerin pintarakenne. Käytettiin muutamia lähestymistapoja näille E. coli-serotyypeille yhteisen pintarakenteen määrittämiseksi. Kuten edellä esitettiin, kahdella 15 (07:K1 ja 016:K1) 9B10-vasta-aineen tunnistamista neljästä E. coli-serotyypistä oli Kl-kapseliserotyyppi, kun taas kahta muuta (01 ja 050) ei ollut tyypitetty K-antigeenise-rotyyppinsä suhteen. Siten pidettiin mahdollisena, että 9BlO-vasta-aine reagoi Kl-antigeenin kanssa ja että E. co-20 li-kannoilla, joilla on 0-antigeeni-serotyyppi 01 ja 050, on myös Kl-kapseliserotyyppi.

Jotkut tutkijat ovat käyttäneet hyväksi K1-kapselin termolabiiliutta sen läsnäolon toteamiseksi. Kl-positii-visten E. coli-serotyyppien kuumentaminen kiehuvassa vesi-25 hauteessa (100 °C) 60 min poistaa näiden kantojen kyvyn reagoida myöhemmin anti-Kl-seerumien kanssa ja edistää niiden kykyä reagoida anti-O-antigeeniseerumien kanssa (Orskov, F. ja Orskov, I., "Serotyping of Escherichia co-li” teoksessa Methods in Microbiology, voi. 14. toim. T.

. 30 Bergan, Academic Press, Lontoo 1984, s. 44-105). Keittämi- ‘ sen vastakkaiset vaikutukset johtuvat todennäköisimmin kapselin poistumisesta ja vasta-aineen parantuneesta pääsystä lipopolysakkaridimolekyyleille (LPS-molekyyleille). Kl-positiivisia E. coli-serotyyppejä (07 ja 016) ja Kl-35 tyypittämättömiä serotyyppejä (01 ja 050) kuumennettiin 48 94489 edellä kuvatulla tavalla, ja annettiin niiden reagoida 9B10-vasta-aineen ja LPS-serotyyppispesifisten heterolo-gisten seerumien (Difco Bacto-E. coli Typing Reagents) kanssa ELISA-menettelyssä. Lämpökäsitellyt organismit me-5 nettivät kokonaan reaktiivisuutensa 9B10-vasta-aineen kanssa, ja niiden reaktiivisuus homologisten LPS-serotyyppispesif isten seerumien kanssa kasvoi, kun taas käsittelemättömät (vertailu-)organismit reagoivat edelleen voimakkaasti 9B10-viljelmäsupernatanttien kanssa ja heikosti 10 vastaavien LPS-serotyyppispesif isten antiseerumien kanssa.

Neisseria meningitidis (ryhmä B)-bakteereista saatavan polysakkaridin (hiilihydraatti) (sialiinihapon homo-polymeeri, alfa-2,8-kytkeytynyt poly-N-asetyylineuramiini-happo) on osoitettu kemiallisesti ja antigeenisestä homo-15 seeniseksi E. coli K1-polysakkaridin kanssa [Grados, O. ja Ewing, W. il., "Antigenic Relationship between Eschrichia coli and Neisseria meningitidis", J. Immunol. 110 (1973) 262-268]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että jos monoklo-naalinen vasta-aine 9B10 on spesifinen E. coli-Kl-kapse-20 lille, tulisi sen olla spesifinen myös N. meningitidisin B-ryhmän polysakkaridille, ja lisäksi siihen, että mono-klonaalisten vasta-aineiden, jotka ovat spesifisiä N. meningitidisin B-ryhmän polysakkaridille, tulisi reagoida myös Kl-kapselin sisältävien E. coli-kantojen kanssa. Käy-25 tettiin kahta koeohjelmaa, joissa tutkittiin (1) 9B10-vasta-aineen kykyä reagoida N. meningitidisin kanssa ja (2) N. meningitidisin B-ryhmän polysakkaridien kanssa reagoivan vasta-aineen kykyä reagoida neljän, 9B10:n kanssa . 30 reagoivan E. coli-serotyypin kanssa.

Hyvin puhtaan B-ryhmän polysakkaridin (Connaught Laboratories, Toronto, Kanada) ja elävien N. meningitidis (ryhmä B)-bakteerien annettiin reagoida 9B10-vasta-aineen kanssa ELISA:ssa edellä kuvatulla tavalla. Monoklonaalinen 35 vasta-aine 9B10 reagoi voimakkaasti kummankin antigeeni- 49 94489 valmisteen kanssa. Vastavuoroisen spesifisyyden osoittamiseksi käytettiin myynnissä olevaa N. meningitidis Group B Meningitidis Test Kit’iä ("Directagen" Direct Antigen Detection System, Hynson, Westcott, and Dunning, Baltimore, 5 MD), jossa käytetään lateksipalloja, jotka on päällystetty hiiren monoklonaalisella vasta-aineella B- ryhmän polysakkaridille. Agglutinaatiokokeissa, joissa käytettiin 9B10-positiivisia E. coli-serotyyppejä, kaikki neljä serotyyp-piä reagoivat voimakkaasti vasta-aineella päällystettyjen 10 pallojen kanssa. Kl-antigeeni-negatiivisiksi tiedetyt E. coli-serotyypit olivat negatiivisia myös tässä koejärjestelyssä. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että monoklo-naalinen vasta-aine 9B10 reagoi E. colin Kl- kapselin ja B-ryhmän N. meningitidisilla olevan tyyppispesifisen hii-15 lihydraatin kanssa. Koska monet näistä kokeista tehtiin koskemattomilla, elävillä bakteereilla, voidaan lisäksi päätellä, että monoklonaalinen vasta-aine 9B10 on spesifinen polysialiinihappomolekyylin ulospäin suuntautuneen alueen jollekin osalle.

20 3. Monoklonaalisen vasta-aineen 9B10 isotyyppi mää ritettiin muuten esimerkissä I kuvattuja spesifisyystes-tejä vastaavalla ELISA-menettelyllä, mutta antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen Kl-positiivisten E. coli-se-rotyyppien yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 9B10 25 positiivinen reaktio Kl-positiivisten E. coli-serotyyppien kanssa havaittiin vain käytettäessä anti-IgM-reagenssia, mikä osoittaa, että tämän monoklonaalinen vasta-aine on isotyyppiä IgM. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos tämän esimerkin mukainen menettely toistettaisiin muutamia : 30 kertoja ja määritettäisiin siten saatujen Kl-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden isotyypit, löydettäisiin lisää isotyyppejä, esimerkiksi IgM- ja IgG-isotyyppejä.

4. Monoklonaalisen vasta-aineen 9B10 funktionaalista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosiko-35 keella, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidistä ak- 50 94489 tiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplementin läsnä ja poissa ollessa (taulukko 4). Kun tämä koe toistettiin muutamilla Kl-negatiivisilla E. coli-sero-tyypeillä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia 5 ei esitetä tässä), mikä osoittaa monoklonaalisen vasta-aineen 9B10 Kl-spesifisyyttä ja sen kykyä opsonoida bakteereja ja edistää niiden fagosytoosia. Koska opsoniinien (spesifisten vasta-aineiden) ja polymorfonukleaaristen leukosyyttien (neutrofiilien) yhteisvaikutus osoittautui 10 päämekanismiksi, jolla immuniteetti Kl-positiivisille E. coli-serotyypeille muodostuu, viittasivat nämä tulokset siihen, että vasta-aine 9B10 antaisi sopivasti annettuna suojan mitä tahansa E. coli-Kl-kapseliserotyyppiä vastaan riippumatta sen O-antigeeniserotyypistä.

15

Taulukko 4

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisättyjen fiilit aine mentti bakteerien tuhoutumi- 20_____nen (%)_ E.coli 01:K1 ja 018:K1 + 9B10 -a 0 E.coli 01:K1 ja 018:K1 + 6Fllb + 0 2= E.coli 01:K1 ja 018:Kl - 9B10 + 0 E.coli 01:K1 ja 018:Kl + 9B10 + 99 % N.meningitidis ryhmä B + 9B10 - 0 : 30 N.meningitidis ryhmä B + 6F11 + 0 N.meningitidis ryhmä B - 9B10 + 0 N,meningitidis ryhmä B__+__9B10 + 99 % 51 94489 *(-) = lämmöllä inaktivoitu (56 eC 30 min) ihmisen komplementti .

b(6Fll) - viljelmäsupernatantti, joka sisältää monoklonaa-lista ihmisen IgM-vasta-ainetta Pseudomonas aeruginosa-5 Fisher-tyypille 2.

5. Edellä esitetyn hypoteesin testaamiseksi tehtiin eläinkokeita käyttämällä 9B10-vasta-ainetta ja muutamia Kl-positiivisia ja -negatiivisia E. coli-serotyyppejä samoin kuin ryhmän B N. meningitidis-serotyyppiä (kanta 10 H313, luovuttaja tri Carl Frasch, Laboratory of Bacterial

Polysaccharides, Office of Biologies, Food and Drug Administration, Bethesda, MD).

Kullakin bakteerilla tehtyä infektointia varten etäissiittoiset Swiss-Webster-hiiret, jotka painoivat 20 -15 22 g, jaettiin kolmeen kymmenen hiiren ryhmään. Tyypilli nen koe tehtiin seuraavasti:

Ryhmä_ Bakteeri_Vasta-aine A E. coli ΚΙ 9B10 B E. coli K1 6F11 20 C E. coli K2 9B10

Kuhunkin vasta-ainetta saavaan ryhmään injektoitiin laskimonsisäisesti 200 μΐ steriiliä PBS:ää, joka sisälsi 25 pg puhdistettua vasta-ainetta. Kaikki eläimet infektoitiin kahden tunnin kuluttua intraperitoneaalisesti 300 pl:lla 25 eläviä bakteereja, joka määrä sisälsi 3 LD50-annosta vastaavaa bakteerikantaa. Bakteerisuspensio oli valmistettu logaritmisessa kasvuvaiheessa olevasta liemiviljelmästä, josta bakteerit erotettiin sentrifugoimalla, pestiin kahdesti PBS:llä ja suspendoitiin takaisin sopivaksi pitoi-30 suudeksi PBS:ään. Eläimiä tarkkailtiin viisi vrk. Kaikki ryhmän B (irrelevantti vasta-aine) ja ryhmän C (irrelevantti organismi) eläimet kuolivat 1-2 vrk:n kuluessa infektoinnista. Vasta-ainetta 9B10 saaneet eläimet (ryhmä A) olivat sitä vastoin kaikki elossa ja oireettomia.

52 94489 Tällä eläinsuojausmallilla osoitettiin vasta-aineen 9B10 terapeuttinen vaikutus tässä mainittuihin kahteen lajiin kuuluvien organismien aiheuttamia bakteeri-infektioita vastaan.

5

Taulukko 5

Infektoiva Vasta- Eloonjäänti/ Eloonjäänti bakteeri aine infektoitujen (%) lukumäärä 10---- E.coli ΚΙ 9B10 10/10 100 % E.coli K1 6F11® 0/10 0 % E.coli K2b 9B10 0/10 0 % 15 N.meningitidis ryhmä B 9B10 5/5 100 % N. meningitidis ryhmä B 6F11 0/5 0 % E.coli K2__9B10__0/5__0_%_ 20 “6Fll-vasta-aine on spesifinen Pseudomonas aeroginosa-Fisher-immunotyypille 2 ja toimii negatiivisen vertailu-vasta-aineena bE. coli K2 ei reagoi 9B10-vasta-aineen kanssa ja toimii 25 epäspesifisenä vertailuorganismina.

Nämä tulokset osoittavat, että ihmisen monoklonaa-lisella vasta-aineella 9B10 on kyky suojata hiiret kahteen eri gram-negatiiviseen bakteerilajiin kuuluvien bakteerien aiheuttamilta tappavilta infektioilta. Sukujen välisesti ; 30 ristisuojaavalla vasta-aineella oli kyky antaa passiivisesti suoja gram-negatiivisiin bakteerilajeihin E. coli ja N. meningitidis, ryhmä B, kuuluvien organismien aineutta-maa infektiota vastaan.

53 94489

Esimerkki IV

Esimerkissä IV esitetään menetelmiä ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, joka on sukujen välisesti ristireaktiivinen lajien Escherichia coli (E.

5 coli), Enterobacter cloacae (E. cloacae) ja ryhmän B Streptococcus-lajien jäseniä vastaan. Lisäksi tässä esimerkissä esitetään vasta-aine, joka on ristireaktiivinen bakteerien kahteen pääryhmään, gram-negatiivisiin bakteereihin (E. coli ja E. cloacae) ja gram-positiivisiin bak-10 teereihin (ryhmän B streptokokit) kuuluvien lajien kanssa. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa mainitun vasta-aineen suo-jaavan vaikutuksen in vivo homologisten E. coli ja Streptococcus, ryhmän B, -serotyyppien aiheuttamia tappavia infektioita vastaan. Toistettiin muuten esimerkin I mukainen 15 menettely (jota kuvataan kohdissa A - G) tässä kuvattujen bakteerien aiheuttamia infektioita vastaan ristisuojaavan, monoklonaalisen ihmisvasta-aineen valmistamiseksi, mutta menetelmiin täytyi tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvatun vasta-aineen karakterisoimiseksi ja tutkimi-20 seksi. Seuraavassa esitetään koemenettelyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvatulla monoklonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

1. Supernatanteista tutkittiin B-ryhmän streptokokkien vastaisten vasta-aineiden läsnäolo käyttämällä esi-25 merkissä I kuvattua ELISA-menetelmää. Antigeenilevyt koostuivat sarjasta tasapohjaisia 96-syvennyksisiä Immunolon 2 -mikrotitrausmaljoja, joiden syvennykset sisälsivät ryhmän B streptokokkien kapselityyppien seoksia immobilisoituina syvennyksen pinnoille poly-L-lysiinillä (PLL). Kokeessa 30 käytettyjä antigeeni levyjä olivat: ’ (1) ryhmän B Streptococcus-tyyppien Ia (ATCC-nro 12400),

Ib (ATCC-nro 12401) ja Ie (ATCC-nro 27591) seos; (2) tyyppien II (ATCC-nro 12973) ja III (kliininen iso-laattikanta, luovuttaja tri C. Wilson, Children's Orthope-35 die Hospital, infektiotautiosasto, Seattle, WA); ja < (3) bakteeriton mikromalja.

54 94489

Kahdesta transformaatiosta peräisin olevat viljel-mäsupernatantit analysoitiin edellä esitetyllä menetelmällä, jolloin saatiin identifioiduksi yksi syvennys (4B9), joka reagoi kummankin B-ryhmän streptokokkeja sisältävän 5 tyypityslevyn kanssa, mutta ei vertailulevyn kanssa. Myöhemmissä ELISA-määrityksissä, joissa käytettiin yksittäisiä ryhmän B Streptococcus-tyyppejä, todettiin, että tämä syvennys sisälsi vasta-ainetta, joka reagoi kaikkien viiden referenssityypityskannan kanssa.

10 Siten tässä kokeessa saatiin yksi kloonattu trans formoitu ihmissolulinja, joka on jatkuva (immortaalinen) ja erittää ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta edellä esitettyjen ryhmän B streptokokkityyppien pinnalla olevalle determinantille.

15 4B9:ksi identifoitu jatkuva, transformoitu ihmis solulinja talletettiin ennen tämän patenttihakemuksen jättämistä the American Type Culture Collectioniin, Rockvil-ler MD, ATCC-numerolla CRL 9008.

2. Kloonatusta 4B3-solulinjasta saadun vasta-aineen 20 ristireaktiivisuus gram-negatiivisten ja gram-positiivis-ten bakteerien kanssa tutkittiin tavanomaisen immuunitäp-lämenetelmän muunnoksella. Tarkemmin ilmaistuna ristireaktiivisuus bakteerien E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, Hemophilus influenzae ja 25 Staphylococcus aureus kanssa tutkittiin laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosa-paperikiekolle, antamalla bakteerit sisältävän kiekon reagoida mainitun vasta-aineen kanssa ja kehittämällä vasta-ainereaktiot alkalinen fosfataasi/nitrosinitetratsolium-.. 30 entsyymijärjestelmällä (esimerkissä I kuvatulla tavalla).

Näissä kokeissa havaittiin 4B9-vasta-aineen risti-reagoivan tiettyjen gram-negatiivisten bakteerilajien kanssa. Tämä vasta-aine reagoi E. coli-LPS-serotyyppien 04, 07, 018 ja 025 ja kliinisten E. cloacae-isolaattien 35 kanssa. Siten ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 4B9 rea- 55 94489 goi ristiin sukujen välisesti lajeihin E. coli, E. cloacae ja Streptococcus ryhmä B kuuluvien gram-negatiivisten ja gram-positiivisten bakteerien kanssa.

3. Se havainto, että monoklonaalinen vasta-aine 5 reagoi muutamien eri bakteerisukujen kanssa, joissa oli kummankin pääryhmän, gram-negatiivisten ja -positiivisten bakteerien, jäseniä, viittasi siihen, että vasta-aineen kohteena oli yhteinen proteiini tai hiilihydraatti. Vasta-aineen 4B9 tunnistaman molekyylispesieksen biokemiallinen 10 karakterisointi tehtiin immuunitäpläanalyysillä. Gram-negatiivisten sukujen analysoimiseksi pestyt bakteerit uutettiin deoksikolaattiin esimerkissä I kuvatulla tavalla. Gram-positiivisten bakteerien ollessa kyseessä 1,0 lista viljelmää, jota oli kasvatettu 6 tuntia muunnetussa 15 Todd-Hewitt-liemessä (Difco, Todd-Hewitt Broth, joka sisältää 2,8 g/1 vedetöntä natriumfosfaattia, pH 7,8) lämpötilassa 37 eC, kerättiin bakteerit sentrifugoimalla, ja pestiin ne kolmesti PBS:llä. Bakteerit suspendoitiin 85 ml:aan protoplastialustaa [40 % sakkaroosia (paino/tila-20 vuus) 0,03 M kaliumfosfaattipuskurissa, pH 6,8, joka sisälsi 10 mmol/1 MgCl2], ja suspensiota lämmitettiin 37 °C:-ssa 10 min. Lisättiin noin 3000 yksikköä mutanolysiiniä (SIGMA), ja seosta ravisteltiin 37 °C:ssa 90 min tai kunnes suspension OD660 oli laskenut yli 90 %. Hajotettua ma-25 teriaalia sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 2000 x g 15 min huoneen lämpötilassa, ja supernatanttia dialysoitiin PBS: ää vastaan 48 tuntia [Young, M.K. ja Mattingly, S.J., "Biosynthesis of Cell Wall Peptidoglycan and Polysaccharide Antigens by Protoplasts of Type III Group B Strepto-.. 30 coccus", J. Bact. 154 (1983) 211-220]. Dialysaatti väke-’ vöitiin kymmenkertaiseen pitoisuuteen tekemällä dialyysi positiivisella paineella PM-10-suodattimen läpi (Amicon Corp., Danvers, MA).

Vehnänalkioagglutiniiniin sitoutuvat hiilihydraatit 35 puhdistettiin tekemällä affiniteettikromatografia vehnän- 56 94489 alkiolektiini-Sepharose 6MB-kolonnilla (SIGMA). Sitoutunut, edellä kuvattu pilkkomistuote eluoitiin kolonnista 10 ml:lla 0,1 M N-asetyyliglukosamiinia, ja eluaattia dialy-soitiin tislattua vettä vastaan 4 °C:ssa. Affiniteettipuh-5 distettu eluaatti kylmäkuivattiin ja punnittiin saatu kuiva materiaali (Gray, B.M. et a], "Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinin and Other Lectins", J. of Immunol. Meth.

72 (1984) 269-277]. Positiivisia reaktioita havaittiin 10 kaikilla kaistoilla, jotka sisälsivät tässä kuvattujen bakteerien deoksikolaattiuutteita. Niillä kaistoilla, jotka sisälsivät gram-negatiivisten bakteerien uutteita, vasta-aine 4B9 tunnisti sarjan säännöllisin välein esiintyviä molekyyliyksiköitä, jolloin muodostui tikapuumainen immuu-15 nitäpläkuvio. Tämä kuvio on täysin yhdenmukainen sen kanssa, joka havaitaan LPS:n polyakryyliamidigeelielektrofo-reesissa SDS:n läsnäollessa, jonka yhteydessä on osoitettu, että vyöhykkeiden heterogeeninen kokokuvio johtuu LPS-molekyylipopulaatiosta, jossa molekyylipainot eroavat toi-20 sistaan molekyylissä olevien O-antigeenisten oligosakkari-disivuketjuyksiköiden lukumäärää vastaavalla tavalla (Palva, E.T. ja Mäkelä, P.H., supra, ja Goldman, R.D. ja Leive, L., supra). Niillä kaistoilla, jotka sisälsivät B-ryhmän Streptococcus-tyypeistä saatuja uutteita, vasta-25 aine 4B9 tunnisti leveällä vyöhykkeellä esiintyviä komponentteja. Tämä kuvio oli yhdenmukainen sen kanssa, joka havaitaan analysoitaessa polyakryyliamidigeelielektrofo-reettisesti hiilihydraattiryhmittymiä, joiden molekyyli-paino on voimakkaasti heterogeeninen ja jotka sisältävät o. 30 tiheästi toistuvan spesifisen sokerisekvenssin (Vmir, E.R.

et ai., supra, ja Holden, K.G., supra). Nämä tulokset osoittavat, että monoklonaalisen vasta-aineen 4B9 kohteena on joillakin E. coli, E. cloacae ja B-ryhmän Streptococcus- serotyypeillä esiintyville molekyyleille yhteinen 35 antigeenideterminantti.

57 94489

Antigeenimolekyylin luonteen määrittämiseksi tarkemmin deoksikolaattiuutteet käsiteltiin proteolyyttisellä entsyymillä Proteinase K ennen elektroforeesia (Eberling, W., supra). Proteinase K-käsittelyn jälkeen saadut immuu-5 nitäpläkuviot olivat samanlaiset kuin ilman käsittelyä saadut, ja viittaavat siten siihen, ettei vasta-aineen 4B9 kanssa reagoiva antigeeni ole luonteeltaan proteiini.

Sen toteamiseksi tarkemmin, reagoiko 4B9 hiilihyd-raattiepitoopin kanssa, tehtiin elektroforeettisesti siir-10 retyille deoksikolaattinäytteille ja vehnänalkioaggluti- naatioaffiniteettipuhdistetuille näytteille perjodaatti-hapetus miedoissa olosuhteissa ennen nitroselluloosapape-rin saattamista reagoimaan vasta-aineen kanssa (katso esimerkki I). Tällä tavalla käsitellyt elektroforeettisesti 15 siirretyt deoksikolaattiuutetäplät eivät enää reagoineet monoklonaalisen vasta-aineen 4B9 kanssa. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että tämän vasta-aineen tunnistama epitooppi on hiilihydraattiryhmä, joka esiintyy tässä kuvatuissa sekä gram-negatiivisissa että -positiivisissa 20 bakteereissa esiintyvissä molekyyleissä.

4. Monoklonaalisen vasta-aineen 4B9 isotyyppi määritettiin ELISA-menettelyllä, joka oli muuten samanlainen kuin edellä spesifisyystestien yhteydessä kuvattu, mutta antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen ryhmän B Strep-25 tococcus-tyyppien II ja III yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 4B9 positiivinen reaktio ryhmän B Streptococ-cus-kantojen kanssa havaittiin vain käytettäessä anti-IgM-reagenssia, mikä osoittaa, että monoklonaalinen vasta-aine oli IgM-isotyyppiä.

30 5. Monoklonaalisen vasta-aineen 4B9 funktionaalista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosikokeel-la, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidistä aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplementin läsnä ollessa.

• 58 94489 Tässä käytetyt bakteerikannat inaktivoitulvat ainoastaan monoklonaalisen vasta-aineen 4B9, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmisen neutrofiilien läsnä ollessa (taulukko 6). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä muuta-5 mia 4B9:n kanssa reagoimattomia bakteeriserotyyppejä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä), mikä osoittaa, että monoklonaalisen vasta-aineen 4B9 funktionaalisen spesifisyyden ja sen kyvyn opsonoida bakteereja ja edistää niiden fagosytoosia. Koska opsoniinien 10 (spesifisten vasta-aineiden) ja polymorfonukleaaristen leukosyyttien (neutrofiilien) yhteistoiminta osoittautui päämekanismiksi, jolla immuniteetti kehittyy näille bakteerikannoille, viittaavat nämä tiedot siihen, että vasta-aine 4B9 antaisi sopivasti annettuna suojan tässä kuvattu-15 jen bakteerikantojen aiheuttamia tappavia infektioita vastaan.

Taulukko 6 59 94489

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisättyjen fiilit aine mentti bakteerien tuhoutuminen (%) 5----- E.coli 018 ja 025 + 4B9 -a 0 E.coli 018 ja 025 + 6Fllb + 0 E.coli 10 018 ja 025 - 4B9 + 0 E.coli 018 ja 025 + 4B9 + 85 % E.cloacae erist.näytt. + 4B9 - 0 E.cloacae 15 erist.näytt. + 5F11 + 0 E.cloacae erist.näytt. - 4B9 + 0 E.cloacae erist.näytt. + 4B9 + 85 %

Ryhmän B

20 streptokokkej a ja tyypit Ia ja III + 4B9 - 0 - " - + 6F11 + 0 - " - - 4B9 + 0 - " - + 4B9 + 85 %

4· O

a(-) = lämmöllä inaktivoitu (56 °C 30 min) ihmisen komplementti .

2q b(6Fll) = viljelmäsupernatantti, joka sisältää ihmisen mo-noklonaalista IgM-vasta-ainetta Pseudomonas aeruginosa-Fisher-tyypille 2.

6. Edellä esitetyn hypoteesin testaamiseksi tehtiin eläinkokeita käyttämällä vasta-ainetta 4B9 ja vähintään yhtä organismia kustakin tässä kuvatusta suvusta.

60 94489

Kutakin gram-negatiivisilla bakteereilla tehtävää infektointia varten jaettiin etäissiittoiset Swiss-Webs-ter-naarashiiret, jotka painoivat 20 - 22 g, kolmeen kymmenen hiiren ryhmään. Tyypillinen koe tehtiin seuraavas-5 ti:

Ryhmä_Bakteeri_ Vasta-aine A E.coli 018 4B9 B E.coli 018 6F11 C S.marcescens 014 4B9 10 Kuhunkin vasta-ainetta saavaan ryhmään injektoitiin laskimonsisäisesti 200 μΐ steriiliä PBS:ää, joka sisälsi 25 pg puhdistettua vasta-ainetta. Kahden tunnin kuluttua kaikki hiiret infektoitiin intraperitoneaalisesti 300 piillä eläviä bakteereja, joka määrä sisälsi 3 LD50-annosta 15 vastaavaa bakteerikantaa. Bakteerisuspensio oli valmis tettu logaritmisessa kasvuaiheessa olevasta liemiviljel-mästä, josta erotettiin bakteerit sentrifugoimalla, pestiin ne kahdesti PBSrllä ja suspendoitiin takaisin sopivaksi pitoisuudeksi PBS:ään. Eläimiä tarkkailtiin viiden 20 vrk:n ajan. Kaikki ryhmän B (irrelevantti vasta-aine) ja ryhmän C (irrelevantti organismi) hiiret kuolivat 1-2 vrk:n kuluessa. Sitä vastoin vasta-ainetta 4B9 saaneet eläimet (ryhmä A) olivat kaikki elossa ja oireettomia. Tutkittaessa suojausvaikutusta ryhmän B streptokokkeja 25 vastaan käytettiin vastasyntynyt rotta-mallia. Alle 48 tunnin ikäiset etäissiittoiset Sprague-Dawleyrotanpoikaset (emojensa hoidossa) saivat vasta-ainetta ja bakteereja suurin piirtein hiirikokeiden yhteydessä kuvatulla tavalla. Tärkeimmät erot olivat seuraavat: 30 (1) sekä vasta-aineet että bakteerit injektoitiin intra peritoneaalisesti ja (2) inokulaatin tilavuus oli 20 pl.

Näillä eläinkokeilla osoitettiin 4B9-vasta-aineen terapeuttinen vaikutus tässä kuvattuihin kolmeen lajiin 35 kuuluvien organismien aiheuttamia bakteeri-infektioita 61 94489 vastaan. Näistä tuloksista esitetään yhteenveto taulukossa 7.

Taulukko 7 5 Infektoiva Vasta- Eloonjääneet/ Eloonjäänti bakteeri__aine__infektoidut__(% ) _ E.coli 025 4B9 10/10 100 E.coli 025 6Fll“ 0/10 0 S. marcescens 4B9 0/10 0 014b

Ryhmä B Streptococcus Ia ja 4B9 10/10 100

III

Ryhmä B Strep- 15 tococcus Ia ja 6F11 0/10 0

III

S.marcescens 9B10 0/10 0 014____ 20 *6F11-vasta-aine on spesifinen Pseudomonas aeruginosa-Fisher-immunotyypille 2 ja toimii negatiivisena vertailu-vasta-aineena.

bS. marcescens 014 ei reagoi 7D7-vasta-aineen kanssa ja ; toimii epäspesifisenä vertailuorganismina.

25 Nämä tulokset osoittavat, että ihmisen monoklonaa-lisella vasta-aineella 4B9 on kyky suojata hiiret ja rotat tappavilta infektioilta, joiden aiheuttajina on sekä gram-negatiivisten että -positiivisten bakteerien pääryhmiin kuuluvat bakteerisuvut. Sukujen välisesti ristireagoivalla on J monoklonaalisella ihmisvasta-aineella 4B9 oli kyky antaa suoja gram-negatiiviseen bakteerisukuun E. coli ja gram-positiivisiin B-ryhmän streptokokkeihin kuuluvien organismien aiheuttamia infektioita vastaan.

62 94489

Esimerkki V

Esimerkissä V esitetään menetelmiä ihmisen monoklo-naalisen vasta-aineen valmistamiseksi ja valikoimiseksi, joka vasta-aine ristireagoi sukujen välisesti sukujen Ser-5 ratia marcescens, Klebsiella pneumoniae ja Enterobacter aerogenes jäseniä vastaan. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa mainitun vasta-aineen opsonoivan aktiivisuuden in vitro homologisia S. marcescens, K. pneumoniae ja E. aerogenes-serotyyppejä vastaan. Toistettiin suurin piirtein esimer-10 kin I mukainen (kohdissa A - G kuvattu) menettely, paitsi että oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen karakterisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään koemenettelyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvatulla monoklonaalisella vasta-15 aineella saadut tulokset.

1. Neljästä transformaatiosta saadut viljelmäsuper-natantit tutkittiin edellä kuvatulla menetelmällä, jolloin identifioiduksi tuli yksi syvennys (7E10), jossa esiintyi sitoutumisaktiivisuutta ainakin yhteen neljästä K. pneu-20 moniae serotyyppilevystä, jotka sisälsivät kapselisero- tyyppejä 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 ja 55, mutta ei (bakteerittoman) vertailulevyn suhteen. 7E10-solulinjasta saadun vasta-aineen sukujen välinen ris-tireaktiivisuus tutkittiin tarkemmin käyttämällä tavan-25 omaista immuunitäplämenetelmää. Tarkemmin ilmaistuna ris- tireaktiivisuutta bakteerien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli ja P. aeruginosa kanssa tutkittiin laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosapaperikiekolle, antamalla bakteereja sisäl-30 tävän kiekon reagoida mainitun vasta-aineen kanssa ja kehittämällä vasta-ainereaktiot alkalinen fosfataasi/nitro-sinitetratsolium-entsyymij ärjestelmällä.

Näissä kokeissa havaittiin, että vasta-aineella 7E10 oli enemmän sukujen välistä ristireaktiivisuutta. Tä-35 mä vasta-aine reagoi seuraavien lajien ja serotyyppien ; kanssa: 63 94489 K. pneumoniae_S. marcescens E. aeroaenes K2, 8, 11, 12, 13, 21, 04, 12 kliinisiä 26, 29, 30, 33, 42, isolaatteja 68, 69 5 Ihraisen monoklonaalinen vasta-aine 7E20 ristireagoi siten sukujen välisesti sukuihin K. pneumoniae, S. marcescens ja E. aerogenes kuuluvien bakteerien kanssa.

2. Monoklonaalisen vasta-aineen 7E10 isotyyppi määritettiin ELISA-menettelyllä, joka oli muuten samanlainen 10 kuin edellä spesifisyystestien (esimerkki I) yhteydessä kuvattu, mutta antigeenilevy sisälsi PLL:llä (poly-L-ly-siinillä) immobilisoitujen K. pneumoniae K8 ja Kll-sero-tyyppien yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 7E10 positiivinen reaktio näiden K. pneumoniae-serotyyppien 15 kanssa havaittiin ainoastaan käytettäessä anti-IgM-rea- genssia, mikä osoittaa, että tämä monoklonaalinen vasta-aine on isotyyppiä IgM. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos tämän esimerkin mukainen menettely toistettaisiin muutamia kertoja ja määritettäisiin siten saatujen sukujen 20 välisesti ristireagoivien monoklonaalisten vasta-aineiden isotyypit, löydettäisiin lisää isotyyppejä, esimerkiksi IgM- ja igG-isotyyppejä.

3. Monoklonaalisen vasta-aineen 7E10 funktionaalista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosiko- 25 keella, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidista aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplementin läsnä ja poissa ollessa. Tässä käytetyt baktee-riserotyypit inaktivoituivat vain monoklonaalisen vasta-aineen 7E10, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmisen 30 neutrofiilien läsnä ollessa (taulukko 8). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä vasta-aineen 7E10 kanssa reagoimattomia serotyyppejä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä). Nämä kokeet osoittivat monoklonaalisen vasta-aineen 7E10 funktionaalisen spesifisyy-35 den samoin kuin sen kyvyn opsonoida bakteereja ja edistää / niiden fagosytoosia.

Taulukko 8 64 94489

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisättyjen fiilit aine mentti bakteerien tuhoutumi- _____nen (%) c S.marcescens 012 + 7E10 -“ 0 S.marcescens 012 + 6Fllb + 0 S.marcescens 012 - 7E10 + 0 10 S.marcescens 012 + 7E10 + 86 % K.pneumoniae K8 ja Kll + 7E10 - 0 K.pneumoniae K8 ja Kll + 6F11 + 0 15 K.pneumoniae K8 ja Kll - 7E10 + 0 K.pneumoniae K8 ja Kll + 7E10 + 94 % E.aeroaenes erist.näytt. + 7E10 - 0 20 E.aeroaenes erist.näytt. + 6F11 + 0 E.aeroaenes erist.näytt. - 7E10 + 0 E.aeroaenes 25 erist.näytt. + 7E10 + 60 % a ja b = katso taulukon 3 alahuomautukset.

Esimerkki VI

30· Esimerkissä VI esitetään menetelmiä ihmisen mono- klonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi ja valikoimiseksi, joka vasta-aine reagoi ristiin sukujen välisesti sukujen Serratia marcescens ja Klebsiella pneumoniae jäseniä vastaan. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa mainitun vasta-ai-35 . neen opsonoivan aktiivisuuden in vitro homologisia S. mar- 65 94489 cescens ja K. pneumoniae-serotyyppejä vastaan. Toistettiin muuten esimerkin I mukainen menettely (meneteltiin suurin piirtein kohtien A - G mukaisesti), mutta oli välttämätöntä tehdä joitakin muutoksia tässä esimerkissä kuvattavan 5 vasta-aineen karakterisoimiseksi ja tutkimimiseksi. Seu-raavassa esitetään koemenettelyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvattavalla monoklonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

1. Neljästä transformaatiosta saadut viljelmäsuper-10 natantit analysoitiin edellä kuvatulla menetelmällä, jolloin identifioiduksi tuli yksi syvennys (8C9), jossa esiintyi sitoutumisaktiivisuutta ainakin yhdellä neljästä K. pneumoniae-serotyyppilevystä, jotka sisälsivät kapseli serotyyppejä 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 15 31, 43, 44 ja 55, mutta ei (bakteerittoman) vertailulevyn suhteen. Solulinjasta 8C9 saadun vasta-aineen sukujen välinen ristireaktiivisuus tutkittiin tarkemmin käyttämällä tavanomaisen immuunitäplämenetelmän muunnosta. Tarkemmin ilmaistuna tutkittiin ristireaktiivisuutta bakteerien K.

20 pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli ja P.

aeruginosa kanssa laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosapaperikiekolle, antamalla bakteereja sisältävän kiekon reagoida mainitun vasta-aineen kanssa ja kehittämällä vasta-ainereaktiot alkalinen 25 fosfataasi/nitrosinitetratsolium-entsyymijärjestelmällä.

Näissä kokeissa löydettiin lisää 8C9-vasta-aineen sukujen välistä ristireaktiivisuutta. Tämä vasta-aine reagoi seuraavien lajien ja serotyyppien kanssa: K. pneumoniae_S. marcescens 30 K5, 6, 7, 14, 27, 36, 55, 64, 03

Ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 8C9 ristireagoi siten sukujen välisesti sukuihin K. pneumoniae ja S. marcescens kuuluvien bakteerien kanssa.

2. Monoklonaalisen vasta-aineen 8C9 isotyyppi mää- 35 ritettiin ELISA-menettelyllä, joka oli muuten esimerkissä 66 94489 I spesifisyystestien yhteydessä kuvatun kaltainen, mutta antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen K. pneumoniae K14 ja K27-serotyyppien yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 8C9 positiivinen reaktio K. pneumoniae-serotyyp-5 pien kanssa havaittiin vain käytettäessä anti-IgM-reagens-sia, mikä osoittaa, että tämä monoklonaalinen vasta-aine on isotyyppiä IgM. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos tämän esimerkin mukainen menettely toistettaisiin muutamia kertoja ja määritettäisiin siten saatujen monoklo-10 naalisten sukujen välisesti ristireagoivien vasta-aineiden isotyypit, löydettäisiin lisää isotyyppejä, esimerkiksi IgM- ja IgG-isotyyppejä.

3. Monoklonaalisen vasta-aineen 8C9 funktionaalinen aktiivisuus in vitro tutkittiin opsonofagosytoosikokeella, 15 jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidista aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplementin läsnä ja poissa ollessa. Tässä käytetyt bakteeriserotyypit inak-tivoituivat vain monoklonaalisen vasta-aineen 8C9, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmisen neutrofiilien läsnä 20 ollessa (katso taulukko 9). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä vasta-aineen 8C9 kanssa reagoimattomia serotyyppe-jä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä). Nämä kokeet osoittivat monoklonaalisen vasta-aineen 8C9 funktionaalisen spesifisyyden samoin kuin 25 sen kyvyn opsonoida bakteereja ja edistää niiden fagosy-toosia.

» Λ

Il . ts t Kili I I I M '

Taulukko 9 67 94489

Lisättyjen

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- bakteerien fiilit aine mentti tuhoutumi- _ nen (%) 5 ..........

S♦marcescens 03 + 8C9 -a 0 S.marcescens 03 + 6Fllb + 0 S.marcescens 10 03 - 8C9 + 0 S.marcescens 03 + 8C9 + 70 % K.pneumoniae K14 ja 27 + 8C9 - 0 K.pneumoniae 15 K14 ja 27 + 6F11 + 0 K.pneumoniae K14 ja 27 - 8C9 + 0 K.pneumoniae K14 ja 27_|_+_| 8C9 | +_ 93 %_ 20 a ja b = katso taulukon 3 alaviitteet.

Esimerkki VII

Esimerkissä VII esitetään menetelmiä ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi ja valikoimiseksi, joka vasta-aine ristireagoi sukujen välisesti sukujen Ser- 25 ratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter ae-rogenes ja Enterobacter cloacae jäseniä vastaan. Lisäksi tässä esimerkissä osoitetaan mainitun vasta-aineen opso-noiva aktiivisuus in vitro homologisia S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes ja E. cloacae-serotyyppejä vas- :30 taan. Toistettiin muuten esimerkin I mukainen menettely (suurin piirtein kohdissa A - G kuvatulla tavalla), mutta oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen karakterisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään koemenettelyihin tehdyt 35 muutokset ja tässä kuvattavalla vasta-aineella saadut tu-• lokset.

68 94489 1. Neljästä transformaatiosta saadut viljelmäsuper-natantit tutkittiin edellä kuvatulla menetelmällä, jolloin saatiin identifioiduksi yksi syvennys (1E4), joka sisälsi sitoutumisaktiivisuutta ainakin yhteen neljästä K. pneumo- 5 niae-serotyyppilevystä, jotka sisälsivät kapseliserotyyp- pejä 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 ja 55, mutta ei (bakteerittoman) vertailulevyn suhteen. Solulinjasta 1E4 saadusta vasta-aineesta etsittiin sukujen välistä lisäristireaktiivisuutta tavanomaisen immuunitäp-10 lämenetelmän muunnosta käyttämällä. Tarkemmin ilmaistuna tutkittiin ristireaktiivisuutta bakteerien K. pneumoniae E. aerogenes, S. marcescens, E. coli, E. cloacae ja P. aeroginosa kanssa laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosapaperikiekolle, antamal-15 la kiekon reagoida mainitun vasta-aineen kanssa ja kehittämällä vasta-ainereaktiot alkalinen fosfataasi/nitrisini-tetratsolium-entsyymij ärj estelmällä.

Näissä kokeissa havaittiin, että lE4-vasta-aineella oli enemmän sukujen välistä ristireaktiivisuutta: Tämä 20 vasta-aine reagoi seuraavien lajien ja serotyyppien kanssa: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes E. cloacae Kl, 3, 8, 9, 13, 015 kliinisiä kliinisiä 15, 29, 31, 33, isolaatteja isolaatteja 25' 36, 68, 69

Ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 1E4 ristireagoi siten sukujen välisesti lajeihin K. pneumoniae, S. marcescens, E. cloacae ja E. aerogenes kuuluvien bakteerien kanssa.

2. Monoklonaalisen vasta-aineen 1E4 isotyyppi mää-30 ; ritettiin muuten samanlaisella ELISA-menettelyllä kuin esimerkissä I spesifisyystestien yhteydessä kuvattu, mutta antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen K. pneumoniae K3 ja K8-serotyyppien yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 1E4 positiivinen reaktio K. pneumoniae-serotyyppien 35 kanssa havaittiin vain käytettäessä anti-IgM-reagenssia, 69 94489 mikä osoittaa, että monoklonaalinen vasta-aine on isotyyp-piä IgM. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos tämän esimerkin mukainen menettely toistettaisiin muutamia kertoja ja määritettäisiin siten saatujen sukujen välisesti 5 ristireagoivien monoklonaalisten vasta-aineiden isotyypit, löydettäisiin lisää isotyyppejä, esimerkiksi IgM- ja IgG-isotyyppejä.

3. Monoklonaalisen vasta-aineen 1E4 funktionaalista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosikokeel-10 la, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidista aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplementin läsnä ja poissa ollessa. Tässä käytetyt bakteerisero-tyypit inaktivoituivat vain monoklonaalisen vasta-aineen 1E4, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmisen neutrofii-15 lien läsnä ollessa (taulukko 10). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä vasta-aineen 1E4 kanssa reagoimattomia sero-tyyppejä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä). Nämä kokeet osoittivat monoklonaalisen vasta-aineen 1E4 funktionaalisen spesifisyyden samoin kuin 20 sen kyvyn opsonoida bakteereja ja edistää niiden fagosy-toosia.

Taulukko 10 70 94489

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisättyjen fiilit aine mentti bakteerien 5 tuhoutumi- _____nen (%) S.marcescens 015 + 1E4 -a 0 S.marcescens 015 + 6Fllb + 0 10 S.marcescens 015 - 1E4 + 0 S.marcescens 015 + 1E4 + 86 % K.pneumoniae K3 ja 29 + 1E4 - 0 15 K. pneumoniae K3 ja 29 + 6F11 + 0 K. pneumoniae K3 ja 29 - 1E4 + 0 K.pneumoniae K3 ja 29 + 1E4 + 80 % 20 E.aeroaenes erist.näyte(2) + 1E4 - 0 E.aeroaenes erist.näyte(2) + 6F11 + 0 E.aeroaenes „ *. erist. näyte(2) - 1E4 + 0 /ir» E.aeroaenes erist.näyte(2) + 1E4 + 80 % E. cloacae erist.näyte + 1E4 - 0 E.cloacae 3Q ; erist.näyte + 6F11 + 0 E.cloacae erist.näyte - 1E4 + 0 E.cloacae erist .näyte__+_ 1E4 + 80 % 35 a ja b = katso taulukon 3 alaviittet.

;i sai ·ιΐϋ i.i i ei 71 94489

Esimerkki VIII

Esimerkissä VIII esitetään menetelmiä ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi ja valikoimiseksi, joka ristireagoi sukujen välisesti sukujen Serratia mar-5 cecsens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes ja Psudomonas aeruginosa jäseniä vastaan. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa mainitun vasta-aineen opsonoivan aktiivisuuden in vitro homologisia S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes ja P. aeruginosa-serotyyppejä vastaan. Tois-10 tettiin suurin piirtein esimerkin I (kohdissa A - G esitetty) mukainen menettely, mutta oli välttämätöntä tehdä tiettyjä muutoksia tässä esimerkissä kuvattavan vasta-aineen karakterisoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään koemenettelyihin tehdyt muutokset ja tässä kuvatta-15 valla monoklonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

1. Neljästä transformaatiosta saadut viljelmäsuper-natantit tutkittiin edellä kuvatulla menetelmällä, jolloin saatiin identifioiduksi yksi syvennys (9D1), jossa esiintyi sitoutumisaktiivisuutta ainakin yhteen neljästä K.

20 pneumoniae-serotyyppilevystä, jotka sisälsivät kapselise- rotyyppejä 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 24, 27, 31, 43, 44 ja 55, mutta ei vertailulevyyn (ilman bakteereja). Solu-linjasta 9D1 saadun vasta-aineen sukujen välistä risti-reaktiivisuutta tutkittiin edelleen käyttämällä tavanomai-25 sen immuunitäplämenetelmän muunnosta. Tarkemmin ilmaistuna tutkittiin ristireaktiivisuus bakteerien K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli ja P. aeruginosa suhteen laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosapaperikiekolle, antamalla bakteereja sisäl-3Q tävän kiekon reagoida vasta-aineen kanssa ja kehittämällä vasta-ainereaktiot alkalinen fosfataasi/nitrosinitetratso-lium-entsyymij ärj estelmällä.

Näissä kokeissa havaittiin, että vasta-aineella 9D1 on enemmän sukujen välistä ristireaktiivisuutta. Tämä vas-35 ta -aine reagoi seuraavien lajien ja serotyyppien kanssa: 72 94489 K. pneumoniae S. marcescens E. aeroaenes P. aeroalnosa E9, 13, 15, 03, 9, 15, 18 kliinisiä F6 29, 33 isolaatteja

Siten ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 9D1 ristireagoi 5 sukujen välisesti lajeihin K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes ja P. aeruginosa kuuluvien bakteerien kanssa.

2. Monoklonaalisen vasta-aineen 9D1 isotyyppi määritettiin ELISA-menettelyllä, joka oli muuten samanlainen kuin esimerkissä I spesifisyystestien yhteydessä kuvattu, 10 mutta antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoitujen K. pneumoniae K13-serotyypin yhdistelmän. Monoklonaalisen vasta-aineen 9D1 positiivinen reaktio K. pneumoniae-serotyyppien kanssa havaittiin vain käytettäessä anti-IgM-reagenssia, mikä osoittaa, että tämä monoklonaalinen vasta-aine on 15 isotyyppiä IgM. Alan ammattimiehet ymmärtänevät, että jos tämän esimerkin mukainen menettely toistettaisiin muutamia kertoja ja määritettäisiin siten saatujen monoklonaalisten sukujen välisesti ristireagoivien vasta-aineiden isotyy-pit, löydettäisiin lisää isotyyppejä, esimerkiksi IgM- ja 20 IgG-isotyyppejä.

3. Monoklonaalisen vasta-aineen 9D1 funktionaalista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosikokeel-la, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidista aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplemen- 25 tin läsnä ja poissa ollessa. Tässä käytetyt bakteerisero- tyypit inaktivoituivat vain monoklonaalisen vastaaineen 9D1, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmisen neutrofiilien läsnä ollessa (taulukko 11). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä vasta-aineen 9D1 kanssa reagoimattomia sero- 30. tyyppejä, ei havaittu bakteerien tuhoutumista (tuloksia ei esitetä tässä). Nämä kokeet osoittivat monoklonaalisen vasta-aineen 9D1 funktionaalisen spesifisyyden samoin kuin sen kyvyn opsonoida bakteereja ja edistää niiden fagosy-toosia.

* I

Taulukko 11 73 94489

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisättyjen fiilit aine mentti bakteerien tuhoutumi- 5 __nen (%) S.marcescens 03 + 9D1 -a 0 S.marcescens 03 + 6Fllb + 0 10 S.marcescens 03 - 9D1 + 0 S.marcescens 03 + 9D1 + 87 % K.pneumoniae K13 + 9D1 - 0 15 K.pneumoniae K13 + 6F11 + 0 K.pneumoniae K13 - 9D1 + 0 K.pneumoniae K13 + 9D1 + 50 % 2® E.aerooenes erist.näyt.(2) + 9D1 - 0 E.aerooenes erist.näyt.(2) + 6F11 + 0 E.aerooenes : erist.näyt.(2) - 9D1 + 0 75' E.aerooenes erist.näyt.(2) + 9D1 + 70 % P.aeruginosa F6 + 9D1 - 0 P.aeruginosa 3ϋ F6 + 6F11 + 0 P.aeruginosa F6 - 9D1 + 0 P.aeruginosa F6_|_f_ 9D1 +_ 75%_ 35 a ja b = katso taulukon 3 alaviitteet.

74 94489

Esimerkki IX

Esimerkissä IX esitetään menetelmiä ihmisen mono-klonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka on sukujen välisesti ristireaktiivinen lajien Pseudomonas aeruginosa 5 (P. aeuruginosa), Escherichia coli (E. coli) ja Serratia marcescens (S. marcescens) jäseniä vastaan. Lisäksi tämä esimerkki osoittaa mainitun vasta-aineen suojaavan vaikutuksen in vivo homologisten P. aeruginosa, E. coli ja S. marcescens-serotyyppien aiheuttamia tappavia infektioita 10 vastaan. Toimittiin suurin piirtein esimerkin I (kohtien A - G) mukaisesti ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tuottamiseksi, joka antoi ristisuojauksen bakteerien, joihin se sitoutuu, aiheuttamia infektioita vastaan. Tässä esimerkissä kuvataan erityismuutoksia, jota tehtiin esi-15 merkin I mukaiseen menetelmään tämän vasta-aineen karakte-risoimiseksi ja tutkimiseksi. Seuraavassa esitetään koeme-nettelyihin tehdyt muutokset ja monoklonaalisella vasta-aineella saadut tulokset.

1. Supernatanteista tutkittiin anti-P. aeruginosa-20 vasta-aineiden läsnäolo käyttämällä esimerkissä I kuvattua ELISA-menetelmää. Antigeenilevy oli tasapohjainen 96-sy-vennyksinen Immunolon-2-mikromalja (Dynatech, Alexandria, VA), jonka syvennykset sisälsivät poly-L-lysiinillä (PLL: llä) immobilisoitujen seitsemään P. aeruginosa-Fisher-re- t 25 ferenssikantaan [Fisher, M.W. et ai., J. of Bacteriology 98 (1969) 835-836, ATCC-nrot 27312-27318] kuuluvien bakteerien seosta.

Yhdestä transformaatiosta saadut viljelmäsuperna-tantit analysoitiin edellä esitetyllä menetelmällä ja saa-30 tiin identifioiduksi yksi syvennys, joka oli aktiivinen P. aeruginosa-levyn suhteen, muttei PLL-vertailulevyn suhteen. Myöhemmissä ELISA-määrityksissä, joissa käytettiin 17 yksittäistä P. aeruginosa-serotyyppiä, jotka kuuluivat the International Antigenic Typing Schemeen (kansainväli-35 nen antigeenityypitysohjelma, IATS, ATCC-nrot 33348 •» 75 94489 33364), todettiin, että yksi alkuperäinen syvennys, 9C3, sisälsi vasta-aineita, jotka sitoutuivat IATS-serotyyppiin 1 [Liu, P.V., Int. J. Syst. Bacteriol. 33 (1983) 256-264, joka julkaisu mainitaan tässä viitteenä].

5 Siten tässä kokeessa saatiin yksi kloonattu trans formoitu ihmissolulinja, joka on jatkuva (immortaalinen) ja erittää yhtä monoklonaalista ihmisvasta-ainetta, joka sitoutuu P. aeruginosa IATS-tyypin 1 pinnalla olevaan determinanttiin .

10 Jatkuva, transformoitu 9C3:ksi identifioitu ihmis solulinja talletettiin ennen tämän patenttihakemuksen jättämistä the American Type Culture Collectioniin, Rockville, MD, ATCC-numerolla CRL 9239.

2. Kloonatusta solulinjasta 9C3 saadusta vasta-ai-15 neesta tutkittiin myös ristireaktiivisuus qram-neqatiivis- ten ja -positiivisten bakteerien kanssa käyttämällä tavanomaisen immuunitäplämenetelmän muunnosta. Tarkemmin ilmaistuna tutkittiin ristireaktiivisuus bakteerien E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, 20 Haemophilus influenzae ja Staphylococcus aureus kanssa laittamalla bakteereja täpliksi ristikolla varustetulle nitroselluloosapaperikiekolle, antamalla bakteereja sisältävän kiekon reagoida 9C3-vasta-aineen kanssa ja tekemällä vasta-ainereaktiot näkyviksi alkalinen fosfataasi/nitro-25 sinitetrasolium-entsyymijärjestelmällä (esimerkin I mukai sesti ).

Näissä kokeissa havaittiin, että vasta-aine 9C3 sitoutuu E. coli-serotyyppiin 06 ja S. marcescens-serotyyp-peihin 012 ja 014. Ihmisen monoklonaalinen vasta-aine 9C3 30 · ristireagoi siten sukujen välisesti gram-negatiivisten 1 bakteerien kanssa, jotka kuuluvat lajien E. coli, S. marcescens ja P. aeruginosa tiettyihin serotyyppeihin.

3. Se havainto, että monoklonaalinen vasta-aine ristireagoi muutamien erilaisten bakteerisukujen kanssa, 35 viittasi siinen, että vasta-aine saattaa sitoutua yhtei- 76 94489 seen antigeeniseen determinanttiin. Vasta-aineen 9C3 tunnistamat molekyylispesiekset karakterisoitiin biokemialli-sesti esimerkin I mukaisella immuunitäpläanalyysillä. Reaktioita havaittiin reaktiivisten P. aeruginosa ja E.

5 coli, muttei S. marcescens, -serotyyppien deoksikolaatti-uutteissa. Vaikka ei ole selvää, miksei vasta-aine 9C3 reagoi S. marcescens-valmisteen kanssa, on mahdollista, että vasta-aine tunnistaa konformationaalisen epitoopin, joka tuhoutuu preparoinnissa. E. coli ja P. aeruginosa-10 bakteeriuutteiden ollessa kyseessä vasta-aine 9C3 tunnisti sarjan säännöllisin välein esiintyviä molekyylispesieksiä, jolloin muodostui tikapuumainen immuunitäpläkuvio. Tämä kuvio oli täysin yhdenmukainen sen kanssa, joka havaitaan LPS:n SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesianalyysissä, 15 jonka yhteydessä on osoitettu, että vyöhykkeiden muodostama heterogeeninen kuvio johtuu LPS-molekyylipopulaatiosta, jossa molekyylipainot eroavat toisistaan molekyylissä olevien O-antigeenisten oligosakkaridisivuketjujen lukumäärän mukaisesti (Palva, E.T. ja Mäkelä, P.H., supra ja Goldman, 20 R.D. ja Leive, L., supra).

Antigeenin molekulaarisen luonteen määrittämiseksi tarkemmin deoksikolaattiuutteet käsiteltiin proteolyytti-sellä entsyymillä Proteinase K ennen elektroforeesia (Eberling, W., supra). Proteinase K-käsittelyn jälkeen 25 saatu immuunitäpläkuvio oli samanlainen kuin ilman käsittelyä saatu, mikä viittasi siihen, että vasta-aineen 9C3 kanssa reagoiva antigeeni ei ollut luonteeltaan proteiini.

4. Monoklonaalisen vasta-aineen 9C3 isotyyppi määritettiin ELISA-menettelyllä, joka oli muuten samanlainen 30 kuin edellä spesifisyystestien yhteydessä kuvattu, mutta : antigeenilevy sisälsi PLL-immobilisoituja P. aeruginosan

Fisher-serotyypin 4 bakteereja. Monoklonaalisen vasta-aineen 9C3 positiivinen reaktio P. aeruginosa-kannan kanssa navaittiin vain käytettäessä anti-IgM-reagenssia, mikä 35 osoittaa, että monoklonaalinen vasta-aine on isotyyppiä IgM.

ia ; »a.* anti ιι-ίβ*: 77 94489 5. Monoklonaalisen vasta-aineen 9C3 funktionaalista aktiivisuutta in vitro tutkittiin opsonofagosytoosikokeel-la, jossa verrattiin vasta-aineen bakterisidistä aktiivisuutta sekä ihmisen neutrofiilien että ihmisen komplemen-5 tin läsnä ja poissa ollessa.

Käytetyt bakteerikannat kuolivat vain monoklonaalisen vasta-aineen 9C3, aktiivisen komplementtilähteen ja ihmisen neutrofiilien läsnä ollessa (taulukko 12). Kun tämä koe toistettiin käyttämällä muutamia 9C3:n kanssa 10 reagoimattomia bakteeriserotyyppejä, ei havaittu baktee rien tuhoutumista, mikä osoittaa monoklonaalisen vasta-aineen 9C3 funktionaalisen spesifisyyden ja sen kyvyn opso-noida bakteereja ja edistää niiden fagosytoosia. Koska op-soniinien (spesifisten vasta-aineiden) ja polymorfonukle-15 aaristen leukosyyttien (neutrofiilien) yhteistoiminta osoittautui päämekanismiksi, jolla immuniteetti näille bakteerikannoille muodostuu, osoittavat nämä tulokset, että 9C3 antaisi sopivasti annettuna suojan tässä kuvattujen bakteerikantojen aiheuttamia tappavia infektioita 20 vastaan.

Taulukko 12 78 94489

Bakteerit Neutro- Vasta- Komple- Lisättyjen fiilit aine mentti bakteerien tuhoutumi- 5_____nen (%) E.coli 06 + 9C3 -(a) 0 E.coli 06 + 6Fll(b) + 0 E.coli 06 - 9C3 + 0 10 E.coli 06 + 9C3 + 98 % S.marcescens 014 + 9C3 - 0 S.marcescens 014 + 6F11 + 0 S.marcescens 15 014 - 9C3 + 0 S.marcescens 014 + 9C3 + 94 % P. aeruginosa

Fisher 4 + 9C3 - 0 P.aeruginosa 20 Fisher 4 + 6F11 + 0 P.aeruginosa

Fisher 4 - 9C3 + 0 P.aeruginosa

Fisher 4__+__9C3__+__79 %_ " 25 (a) = lämmöllä inaktivoitu (56 °C 30 min) ihmisen komplementti .

(b,6Fll = viljelmäsupernatantti, joka sisältää ihmisen mono-klonaalista IgM-vasta-ainetta Pseudomonas aeruginosa-30 Fisher-tyypille 2.

5 . 6. Vasta-aineen 9C3 suojausominaisuuksien tutkimi seksi tehtiin eläinkokeita, joissa käytettiin vähintään yhtä organismia kustakin tässä kuvatusta suvusta.

Suojauskokeisiin, jotka tehtiin P. aeruginosa 35 Fisher 4:llä ja S. marcescens 014:11a, käytettiin poltettu hiiri- mallia. Kutakin bakteeri-infektiota varten etäis- il an i aisti ι ι i «a 79 94489 siittoiset Swiss-Webster-hiiret, jotka painoivat 22 - 25 g, jaettiin kolmeen 7 tai 8 hiiren ryhmään. Tyypillinen koe tehtiin seuraavasti:

Ryhmä_Bakteerit_Vasta-aine 5 A P. aeruginosa F4 9C3 B P. aeruginosa F4 6F11 C P. aeruginosa F2 9C3 Päivää ennen koetta kultakin hiireltä ajettiin karvat ja ne käsiteltiin karvanpoistoaineella kaiken karvan 10 poistamiseksi selästä (polttokohdasta). Koepäivänä kullekin eläimelle annettiin kumpaankin reiteen 0,1 ml nuku-tusainesuolaliuosta, joka sisälsi 0,7 ml 0,85 %:sta NaCl-liuosta, 0,2 ml ksylatsiinia (20 mg/1) ja 0,1 ml ketamii-nia (100 mg/1), niin että hiiren saama annos oli 20 mg/kg 15 ksylatsiinia ja 180 mg/kg ketamiinia. Nukutetuille hiirille aiheutettiin kaasuliekillä kolmannen asteen palovammat jonka ala oli 10 % ruumiin koko pinta-alasta. Välittömästi vamman aiheuttamisen jälkeen hiiriin injektoitiin ruven alle 0,5 ml vasta-ainetta sisältävää käytettyä viljelmä-20 nestettä, johon oli ennalta sekoitettu 5-10 LD50-annosta bakteereja (seoksen lämpötila 4 °C). Bakteerisuspensio oli valmistettu logaritmisessa kasvuvaiheessa olevasta liemi-viljelmästä, josta bakteerit erotettiin sentrifugoimalla, pestiin kahdesti PBStllä ja suspendoitiin takaisin PBS:ään 25 sopivaksi pitoisuudeksi. Eläimiä tarkkailtiin 10 päivää.

3-5 päivän kuluttua infektoinnista kaikki rynmän B (irrelevantti vasta-aine) ja ryhmän C (irrelevantti organismi) eläimet olivat kuolleet. Sen sijaan eläimet, jotka saivat 9C3-vasta-ainetta (ryhmä A), olivat kaikki elossa 30 ja oireettomia (katso taulukko 13).

' E. coli 06:11a tehtyjä suojauskokeita varten jaet tiin terveet Swiss-Webster-hiiret (20 - 22 g) kolmeen kymmenen hiiren ryhmään. Kullekin ryhmälle, joka sai vasta-ainetta, injektoitiin laskimonsisäisesti 200 μΐ steriiliä 35 PBS:ää, joka sisälsi 25 pg puhdistettua vasta-ainetta.

• 80 94489

Kahden tunnin kuluttua kaikki eläimet infektoitiin intra-peritoneaalisesti 300 pl:lla eläviä bakteereja, joka määrä sisälsi 3 LD50-annosta vastaavaa bakteerikantaa (tulokset esitetään taulukossa 13).

5

Taulukko 13

Koe Infektoivat Vasta- Eloonjääneet/ Eloon- bakteerit aine infektoidut jäänti 10-----lii- 1 P. aeruginosa 9C3 6/7 86 % F4 P. aeruginosa 6Fll(a) 0/7 0 F4 P-aeruginosa 9C3 0/7 0 15__F2(b)____ 2 E.coli 06 9C3 6/10 60 % __E.coli 06__6F11__0/10__0 3 S.marcescens 9C3 8/8 100 % 014 20 S.marcescens 6F11 0/8 0 014____ (a)6Fll-vasta-aine on spesifinen Pseudomonas aeruginosa-Fisher-immunotyypille 2 ja toimii negatiivisena vertailu-vasta-aineena.

25 (b)P. aeruginosa F2 ei reagoi vasta-aineen 3C3 kanssa ja toimii epäspesifisenä vertailuorganismina.

Nämä tulokset osoittavat, että monoklonaalisella vasta-aineella 9C3 on kyky suojata hiiret kolmeen gram-ne-gatiiviseen sukuun kuuluvien bakteerien aiheuttamilta tap-30 pavilta infektioilta. Sukujen välisesti ristireagoiva ih- : misen monoklonaalinen vasta-aine 9C3 pystyi antamaan suo jan gram-negatiivisiin sukuihin E. coli, S marcescens ja P. aeruginosa kuuluvien organismien aiheuttamia infektioita vastaan käytettäessä joko vasta-ainetta sisältävää vil-35 jelmäsupernatanttia tai puhdistettua vasta-ainetta.

• 81 94489

Edellä esitetyn perusteella lienee ilmeistä, että tämän keksinnön mukaisista solulinjoista saadaan ihmisen monoklonaalisia vasta-aineita ja niiden fragmentteja sisältäviä koostumuksia, jotka ovat ristireaktiivisia ja 5 ristisuojaavia erilaisia, sekä gram-negatiivisia että -po sitiivisia, bakteeri-lajeia vastaan. Tämä antaa mahdollisuuden kehittää helpommin profylaktisia ja terapeuttisia koostumuksia, jotka voivat olla useimpien, ellei kaikkien, bakteerisukujen aiheuttamia sairaala- ja vastasyntyneiden 10 infektioita vastaan. Yhdistämällä vasta-aineita on mahdol lista saada aikaan laaja suojaus useimpia, ei kuitenkaan yleensä kaikkia; kliinisesti merkittäviä bakteereja vastaan. Lisäksi solulinjoista saadaan vasta-aineita, joilla on käyttöä immuunimäärityksissä ja muissa tunnetuissa me-15 nettelyissä.

Vaikka tätä keksintöä on kuvattu melko yksityiskohtaisesti valaisevin esimerkein sen ymmärtämisen helpottamiseksi, lienee ilmeistä, että siihen voidaan tehdä tiettyjä muutoksia ja muunnoksia poikkeamatta liitteenä ole-20 vien patenttivaatimusten piiristä.

»

Claims (9)

82 94489

1. Menetelmä bakteeri-infektion ennalta ehkäisyyn ja/tai hoitoon käyttökelpoisten ihmisen monoklonaalisten 5 vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi, jotka vasta-aineet pystyvät reagoimaan spesifisesti vähintään kahteen eri sukuun kuuluvan kahden eri bakteerilajin vähintään kahdelle serotyypille ja vähintään yhden lajin useille serotyypeille yhteisen ei-ydinhiili-10 hydraattiepitoopin kanssa, jolloin vasta-aineet reagoivat ainakin yhden kanssa seuraavista bakteerilajiyhdistelmis-tä: (a) Escherichia coli, Serratia marcescens ja Enterobacter aerogenes, 15 (b) Escherichia coli ja Neisseria meningitidis, (c) Escherichia coli, Enterobacter cloacae ja Streptococcus agalactiae, ryhmä B, (d) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens ja Enterobacter aerogenes, 20 (e) Klebsiella pneumoniae ja Serratia marcescens, (f) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes ja Enterobacter cloacae, (g) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes ja Pseudomonas aeruginosa tai * 25 (h) Escherichia coli, Serratia marcescens ja Pseudomonas aeruginosa, tunnettu siitä, että (A) viljellään jatkuvasti viljeltävissä olevaa so-lulinjaa, joka erittää mainittua ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta tai sen sitoutuvaa fragmenttia, ja otetaan . 30 vasta-aineet talteen tai (B) eristetään ihmisen B-soluja, tehdään B-solut jatkuvasti viljeltäviksi, jolloin muodostuu useita vasta-aineita tuottavia klooneja, kloonit seulotaan vähintään kahden edellä mainitun eri bakteerilajin ei-ydinhiilihyd- 35 raattiepitoopille spesifisten vasta-aineiden tuottamisen 94489 83 suhteen, valittuja klooneja viljellään ja tuotettu mono-klonaalinen vasta-aine otetaan talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä Streptococcus agalactiaen, ryhmä B, aiheuttaman bakteeri-infek- 5 tion ennalta ehkäisyyn ja/tai hoitoon käyttökelpoisten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vasta-aineet pystyvät reagoimaan spesifisesti mainitun bakteerilajin monien serotyyppien saavutettavissa 10 olevan ei-ydin-B-hiilihydraattiepitoopin ja E. colin tai Enterobacterin ei-ydinhiilihydraattiepitoopin kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaalisten vasta-aineiden tunnistamia Streptococcus agalactiaen, ryhmä B, sero- 15 tyyppejä ovat tyypit Ia ja III.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään solulinjaa, jonka ATCC-numero on CRL 9008.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä E. co-20 Iin K1 tai Neisseria meningitidiksen aiheuttaman bakteeri- infektion ennalta ehkäisyyn ja/tai hoitoon käyttökelpoisten ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tai niiden sitoutuvien fragmenttien valmistamiseksi, tunnettu siitä, että vasta-aineet pystyvät reagoimaan spesifisesti ’25 E. colin K1 ja Neisseria meningitidiksen saatavissa olevan ei-ydinhiilihydraattiepitoopin kanssa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään solulinjaa, jonka ATCC-numero on CRL 9006. .30

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljellään solulinjaa, jonka ATCC-numero on CRL 9007, CRL 9009 tai CRL 9239.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kohdassa B) B-solut tehdään 35 jatkuvasti viljeltäviksi EBV-transformaation avulla. • · 94489 84

9. Jatkuvasti viljeltävissä oleva solulinja, tunnettu siitä, että se erittää ihmisen monoklo-naalista vasta-ainetta tai sen sitoutuvaa fragmenttia, jolloin vasta-aineet pystyvät reagoimaan spesifisesti vä-5 hintään kahteen eri sukuun kuuluvan kahden eri bakteerila-jin vähintään kahdelle serotyypille ja vähintään yhden lajin useille serotyypeille yhteisen ei-ydinhiilihydraat-tiepitoopin kanssa ja jolloin vasta-aineet reagoivat ainakin yhden kanssa seuraavista bakteerilajiyhdistelmistä: 10 (a) Escherichia coli, Serratia marcescens ja Enterobacter aerogenes, (b) Escherichia coli ja Neisseria meningitidis, (c) Escherichia coli, Enterobacter cloacae ja Streptococcus agalactiae, ryhmä B, 15 (d) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens ja Entero bacter aerogenes, (e) Klebsiella pneumoniae ja Serratia marcescens, (f) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes ja Enterobacter cloacae, 20 (g) Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Enterobac ter aerogenes ja Pseudomonas aeruginosa tai (h) Escherichia coli, Serratia marcescens ja Pseudomonas aeruginosa, ja että se on ATCC-CRL 9006, ATCC-CRL 9007, ATCC-CRL 9008, ATCC-CRL 9009 tai ATCC-CRL 9239. « • · 85 94489