NL8700286A - Kruis-beschermende humane monoklonale antilichaampreparaten. - Google Patents

Description

a VO 9012

Kruis-beschermende humane monoklonale antilichaampreparaten.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de toepassing van immunologische technieken om te voorzien in nieuwe materialen die bruikbaar zijn voor de behandeling en het diagnostiseren van bacteriële infecties en meer in het bijzonder op de produktie en toepassing van humane 5 monoklonale antilichamen die in staat zijn bescherming te geven tegen infecties veroorzaakt door verschillende genera van bacteriën.

Gram-positieve en gram-negatieve bacteriën kunnen bij geïnfecteerde patiënten gevaarlijke ziektes veroorzaken. Deze bacteriële infecties veroorzaken significante ziekte- en sterftepercentages. Er is een 10 toename in het voorkomen van dergelijke infecties bij te vroeg geboren babies, oudere patiënten en patiënten met ernstige bijkomende medische aandoeningen, zoals brandwonden, chirurgisch trauma, langzaam genezende wonden of kwaadaardige gezwellen. Deze infecties zijn typerend van nosoco-miale oorsprong (d.w.z. in het ziekenhuis opgelopen) en deze komen in het 15 bijzonder voor bij patiënten die langdurig in het ziekenhuis moeten verblijven in verband met een chirurgische ingreep, intravasale kwetsuren of verwondingen of die een langdurige therapie met immunosuppressieve middelen of antibiotica ondergaan. Tevens zijn pasgeborenen die een onvolgroeid immunosysteem hebben blijkbaar acuut vatbaar voor neonatale 20 sepsis en meningitis veroorzaakt door bijzondere gram-negatieve en gram-positieve bacteriën.

Onder de meest voorkomende organismen in gram-negatieve en gram-positieve ziekten bevinden zich Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Serratia marcescens (S. marcescens), 25 Enterobacter aerogenes en cloacae (E. aerogenes/cloacae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Neisseria meningitidis (N. meningitidis), groep B Streptococcus en Staphylococcus aureus (S. aureus) A.C. Sonnenwirth, "The Enteric Bacilli and Similar Gram-Negative Bacteria" biz. 753-790, in Microbiology, 2de druk, B.D. Davis, R. Dulbecco, 30 H.N. Eisen, H.S. Ginserberg, w.B. Wood, en M. McCarty, Uitg. Harper en Row (1973); W.R. McCabe, "Gram-Negative Bacteremia", Adv. Intern. Med., 19:135-138 (1974); Kregel et al, "Gram-Negative Bacteremia III.

Reassessment of Etiology, Epidemiology, en Ecology in 612 Patents",

Am. J. Med. 68:332-343 (1980); J.B. Robbins et al, "Escherichia coli Kl 35 Capsular Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis", New Engl.

J. Med., 290:1216-1220 (1974)? en J.M. Hughs et al, "Nosocomial Infec- 870023a £ & *i -2- tiion Surveillance, 1980-1982", Morb. Mort. Weekly Report, 32:1SS-16SS (1983)). Van deze infecties veroorzaken gewoonlijk verscheidene maar niet alle serotypen van bepaalde gram-negatieve bacteriën bijvoorbeeld E. coli, K. pneumoniae, E. aerogenes/cloacae, P. aeruginosa, en 5 S. marcescens, bacteremie onder de volwassen bevolking. In tegenstelling tot de volwassenen is de immunologisch onrijpe pasgeborene in het bijzonder vatbaar voor septicemie en meningitis veroorzaakt door de ingekap-sel.de stammen van E. coli, N. meningitidis groep B, Hemophilus influenzae type B en de vijf typen stammen van groep B Streptococcus. Hoewel ook 10"· andere bacteriën deze infectie kunnen veroorzaken zijn de voornoemde aangehaalde bacteriën de overwegende isolaten uit de voornoemde bloedinfec-ties.

Antibiotica zijn reeds lang het voornaamste therapeutische wapen ter bestrijding en uitroeiing van gram-positieve en gram-negatieve infec-15 ties. Het blijvende voorkomen en de ernst van de infecties, het voortdurend opduiken van antibioticum-resistente bacteriestammen en de inherente giftigheid van sommige antibiotica wijzen echter duidelijk op beperkingen van de antibioticatherapie. Deze waarnemingen hebben het onderzoek naar alternatieve preventieve en therapeutische benaderingen gestimu-20 leerd.

Er wordt algemeen aangenomen dat antilichamen die reactief zijn met op levende bacteriën toegankelijke structuren (uitwendig geplaatst) de bacteriële vernietiging door een aantal verschillende mechanismen kunnen vergemakkelijken. Onder deze mechanismen bevinden zich: 25. (1); de directe lysis van de bacteriën in aanwezigheid van serumkomple- ment, (2) bacteriostase door het blokkeren van voedingsmiddel-binderrecep-toren, (3) opsonisatie met daarop volgende fagocytose van de bacteriën in aanwezigheid of afwezigheid van serumcomplement of (4) voorkomen van hechting van de bacteriën aan de gastheerweefsels (C.A. Mims, "Recovery 30 from Infection" in The pathogenesis of Infectious Disease, biz. 198-222, C.A. Mims, Uitg. Academic Press (1982)). Voor bacteriën die oppervlakte-koolhydraatmoleculen bezitten, zoals lipopolysaccharide (LPS) en/of capsules blijken antilichamen het meest effectief te zijn via opsonisa-tiemechanismen (B. Kaijser et al, "The Protective Effect Against E. coli 35 of O and K Antibodies of Different Immunoglobulin Classes", Scand. J. Immunol., 1:276 (1972)). Derhalve kunnen antilichamen die tegen deze 8700286 «ï- -3- toegankelijke koolhydraatstructuren zijn gericht een effectief middel leveren voor het elimineren van bacteriën. In het algemeen produceren zoogdieren, die zijn blootgesteld aan ziekteproducerende bacteriën, anti-lichamen die specifiek zijn voor LPS of capsule. Deze antigenen zijn 5 chemisch uiteenlopende structuren die dikwijls zijn samengesteld uit zich herhalende oligosaccharidemoleculen en waarvan de aanwezigheid het serotype van faacteriële stammen bepaalt. Aangezien deze bacteriële antigenen dikwijls de immuniteit domineren, zijn serotype specifieke antilichamen (anti-LPS of capsule) daardoor de meest bestudeerde potentiële therapeu-1Q tische antilichamen. Vanwege de beperkte kruisreactiviteit van deze antilichamen en de duidelijk sterk gevarieerde aard van koolhydraatantigenen aan pathogene gram-positieve en gram-negatieve bacteriën zou het bijzonder moeilijk en kostbaar zijn om een therapeuticum te produceren dat alleen serotype specifieke antilichamen zou bevatten (zie bijvoorbeeld 15 B. Kaijser en S. Ahlstedt, "Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia coli 0 and K Antigens”, Infect. Immun-, 17:286-292 (1977); en D.C. Morrison en J.L. Ryan, "Bacterial Endotoxins and Host Immune Response", Adv. Immunol., 28:293-450 (1979)). Niettemin hebben verschillende rapporten de visie gestimuleerd dat immunotherapeutische benade-20 ringen voor het bestrijden van gram-negatieve bacteriële ziektes binnen bereik liggen. Gefraktioneerd humaan plasma, verrijkt aan immunoglobu-linen-bevattende specifieke en beschermende antilichamen tegen de infecterende organismen, zijn enigszins effectief tegen P. aeruginosa-infec-ties. (M.S. Collins en R.E. Robey, "Protective Activity of an Intravenous 25. Immune Globulin (Human) Enriched in Antibody Against Lipopolysaccharide Antigens of Pseudomonas aeruginosa", Amer. J. Med., _3:168-174 (1984). Commerciële produkten zijn echter in verband met bepaalde inherente beperkingen nog niet zonder meer beschikbaar waardoor hun algemene toepassing voor de bestrijding van levens-bedreigende bacteriële ziektes wordt be-30 lemmerd. Eën zo'n beperking van immunoglobuline-preparaten is dat zij . worden samengesteld uit grote verzamelingen plasmamonsters die zijn vóór-geselecteerd op de aanwezigheid van een beperkt aantal specifieke antilichamen. Typerend bestaan deze verzamelingen uit monsters van een duizendtal donors die lage titers ten opzichte van sommige pathogene 35 bacteriën kunnen bezitten. Aldus is er op zijn best slechts een beschei- . den verhoging in de resulterende titer van gewenste antilichamen.

87 0 0 28 6 $ *

V

-4-

Nog een andere beperking is dat het vóórselectieproces zelf een zeer dure, voortdurende selectie van de donorpopulatie vereist om een consistent produkt te verkrijgen. Ondanks aanzienlijke inspanningen kunnen de produktpartijen tussen de charges en tussen geografische ge-5 bieden nog steeds variëren. Nog een andere beperking die aan immuno-globulinepreparaten inherent is, is dat de toepassing ervan resulteert in een samenvallende toediening van grote hoeveelheden uitwendige pro-telneachtige substanties (bijvoorbeeld virussen), die eventueel nadelige biologische effecten kunnen veroorzaken. De combinatie van lage titers 10 van gewenste antilichamen en een hoog gehalte van uitwendige substanties beperkt dikwijls, tot suboptimale niveaus, de hoeveelheid specifieke en aldus gunstige immunoglobuline(n) die aan de patiënt-kunnen worden toegediend.

In 1975 rapporteerden Kohier en Milstein dat bepaalde muizecel-15 lijnen met muizemiltcellen konden worden gefuseerd voor het creëren van hybridoma's die zuivere "monoklonale" antilichamen zouden afscheiden (G. Kohier en C. Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature, 256;495-497 (1975)). Met het beschikbaar komen van deze technologie ontstond de mogelijkheid 20 murine antilichamen ten opzichte van een bepaalde determinant of determinanten aan antigenen te produceren. Met deze technologie zijn muize-monoklonale antilichamen, verkregen uit muizen geïmmuniseerd met polysaccharide uit Neisseria meningitidis groep B. Aan deze murine IgM monoklonale antilichamen werd waargenomen dat zij binden aan verschillende 25 KI-positieve E. coli-stammen ongeacht hun LPS serotypes en deze "bekleden met specifieke antistoffen" (Cross, supra, Söderström, supra en A.S. Cross et al, "The Importance of the KI Capsule in Invasive Infections Cause by Escherichia coli", J. Inf. Dis., 149:184-193 (1984)). Bovendien beschermden de monoklonale antilichamen muizen tegen lethale 30 infecties met Eh coli KI en groep B meningococale organismen (Cross, supra en Sunderstrom, supra). In een ander voorbeeld werd gerapporteerd dat muizemonoklonale antilichamen specifiek voor type III groep B Streptococcus beschermend werkten in het experimentele muizelnfectie-model (M.L. Egan et al, "Protection of Mice from Experimental Infection 35 with Type III Group B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies", J. Exp. Med., 1:1006-1011 (1983)).

8700285 % «? i -5-

Een muizemonoklonaal antilichaam, hoewel bruikbaar voor het behandelen van muizen heeft belangrijke nadelen ten gebruike bij mensen. Het humane immuunsysteem is in staat elk muizemonoklonaal antilichaam als vreemd proteïne te herkennen. Dit kan resulteren in een versnelde op-5 ruiming van het antilichaam en aldus afbreuk doen aan zijn farmacologische effect (R. Levy en R.A. Miller, "Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies", Fed. Proc., 42:2650-2656 (1983)). Ernstiger is dat dit ook tot een schok kan leiden en zelfs tot de dood door allergische reacties die analoog zijn aan "serumziekte". Door klinische ondervinding is aan-lo: getoond, dat anti-muize immunoglobulinereacties de bruikbaarheid van deze antilichamen in bij benadering de helft van de patiënten, die muize-monoklonale antilichamen voor de behandeling van verschillende tumoren ontvingen, heeft beperkt (H.F. Sears et al, "Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in Treatment of Gastrointestinal Tumor", Lancet, 15 1:762-764 (1982)? en R.A. Miller et al, "Monoclonal Antibody Therapeutic

Trials in Seven Patients with T-Cell Lymphoma", Blood, 62:988-995 (1983)).

Aldus bestaat er een behoefte aan humane monoklonale antilichamen die bescherming bieden tegen gram-negatieve en gram-positieve bacteriële ziektes. De gevarieerde antigeniciteit van gram-positieve en gram-nega-20 tieve ziekte-veroorzakende bacteriën geeft echter een sterke suggestie dat het produceren van serotype specifiekehumane monoklonale antilichamen ten opzichte van elk van de vele belangrijke bacteriële patho-genen onpraktisch zou zijn.

De gevarieerde antigeniciteit van gram-negatieve bacteriën wordt 25 toegeschreven aan variabele gebieden van het lipolysaccharide (met LPS), een molecuul gebonden met het buitenmembraan van gram-negatieve organismen. Het LPS-molecuul wordt algemeen beschouwd te bestaan uit drie structurele gebieden. Het gebied het dichtst bij het buitenmembraan is het zogenaamde lipide A deel van LPS. Dit structureel geconserveerde ge-30 bied bezit de endotoxische aktiviteit verbonden met gram-negatieve ziektes. Het tweede structurele gebied, genaamd de kern, is dikwijls gekoppeld aan een lipide A via een 2-keto-3-deoxy-D-mannoöctonaat rest (KDO) en evenals het lipide A gebied is het gewoonlijk niet toegankelijk voor antilichamen wanneer het derde buitenste gebied van LPS aanwezig is.

35 Hoewel dit gebied binnen sommige gram-negatieve bacteriële soorten gedeeltelijk wordt gehandhaafd zijn vele afwijkingen in de volledige kern 8700286 S? 9' *n -6- onder ladlen van de familie Enterobacteriaceae gevonden. Het buitenste gebied van het LPS-molecuul is samengesteld uit zich herhalende oligo-saccharide-eenheden en staat*bekend als de O-specifieke zijketen. De suikers in deze oligosaccharide-eenheden omvatten moleculaire eenheden 5 die serotype-specifieke structurele antigenische diversiteit vertonen. Aldus bepalen de suikers, hun volgorde en koppelingen de O-zijketen antigeniciteit via hun tertiaire structuur. Gevonden is dat antilichamen tegen de Q-groepen algemeen serotype-specifiek zijn. Serotypes worden typerend gedefinieerd door hun reactiviteit met monospecifieke antisera, 10 die bindingsactiviteit voor slechts één bepaalde antigene determinant bezitten. Zie in het algemeen Mayer et al, Meths. Microbiology, 18:157-201 (1985).

Er zijn antisera ten opzichte van de kern en lipide A gebieden van LPS geproduceerd in pogingen om bescherming tegen gram-negatieve 15 infectie te demonstreren. Sakulramrung en Domingue, J. Inf. Dis., 151: 995-1104 (1985); McCabe et al, J. Infect. Dial, 1365:516 (1977); en Mullan et al, Infect. Immun., 10:1195-1201 (1974). Meer recent zijn muize- en humane monoklonale antilichamen die reactief zijn met de geconserveerde gebieden geproduceerd. Hoewel deze antilichamen soms een 20 gedeeltelijke in vivo werkzaamheid in aangepaste modelsystemen hebben getoond (Teng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1790 (1985); en Bogard en Kung, octrooiaanvrage nr. W085/01659), waren andere laboratoria niet in staat soortgelijke effecten te demonstreren. Zie Elkins en Metcalf, Infect. Immun. 48:597 (1985); en Gigliotti en Shenap, J. Inf.

25 Dis. 151:1005-1011 (1985). Bovendien reageren deze antilichamen in het algemeen niet (binden niet) met intakte, levensvatbare gram-negatieve bacteriën of gezuiverde LPS-moleculen. Deze bevindingen laten vermoeden dat het twijfelachtig is of de kern van lipide A porties van LPS toegankelijk zou zijn of dat bacteriën in hun natuurlijke infectieuze toe-30 stand toegankelijk voor antilichaam zouden zijn. Het wordt tevens algemeen aanvaard dat anti-kem of anti-lipide A antilichamen niet met gram-positieve bacteriën reageren omdat de laatste geen LPS bezitten. Met het oog op deze bevindingen is het onwaarschijnlijk dat monoklonale antilichamen ten opzichte van de geconserveerde kern of lipide A gebieden 35 van LPS werkzaam zullen zijn ter bestrijding van humane gram-negatieve of ook wel gram-positieve bacteriële ziektes.

8700286 ? i -7-

Aldus bestaat er een significante behoefte aan humane monoklonale antilichamen die in ruime mate (intergenus) kruisbeschermend zijn tegen gram-positieve en gram-negatieve bacterieziektes, alsmede aan methoden voor de praktische produktie en toepassing van dergelijke antilichamen.

5 Door de onderhavige uitvinding wordt.aan deze behoefte voldaan.

Er wordt nu volgens de uitvinding voorzien in nieuwe cellijnen die humane monoklonale antilichamen produceren die in staat zijn tot specifieke kruisreactie met een veelvoud van bacteriële soorten door een toegankelijk epitoop, bestaande uit een niet-kernkoolhydraateenheid die 10 aan ten minste twee verschillende bacteriële soorten aanwezig is, te binden. Tevens wordt voorzien in een werkwijze voor het preventief behandelen van een humane patiënt die vatbaar is voor bacteriële infectie en het therapeutisch behandelen van een patiënt die aan een dergelijke infectie lijdt door toediening van een effectieve hoeveelheid van een pre-15 paraat, bestaande uit een veelvoud van humane monoklonale antilichamen, waarbij ten minste ëên van deze antilichamen in staat is tot reactie met een niet-kernkoolhydraat-antigene determinant die aan twee of meer bacteriële soorten gemeenschappelijk is. Het preparaat omvat bij voorkeur een fysiologisch aanvaardbare drager en het kan tevens één of meer van 20 de volgende bevatten: extra humane monoklonale antilichamen die in staat zijn tot reactie met andere bacteriële genera; een gammaglobulinefractie uit humaan bloedplasma; een gammaglobulinefractie uit humaan bloedplasma waarbij het plasma is verkregen uit een subject dat verhoogde niveaus van immunoglobulines reactief met één of meer bacteriële genera vertoont; 25 alsmede één of meer antimicrobiële middelen.

Beschrijving van specifieke uitvoeringsvormen

Volgens de onderhavige uitvinding wordt voorzien in nieuwe cellen die in staat zijn humane monoklonale antilichamen te produceren en preparaten die deze antilichamen bevatten, welke preparaten selectief in 30 reactie kunnen treden met een veelvoud van bacteriële genera die verantwoordelijk zijn voor nosocomiale heonatale of andere infecties, waarbij typerend individuele antilichamen in reactie treden met niet-kerakoolhy-draat epitopen die op multipele bacteriële genera aanwezig zijn. De onderhavige cellen hebben identificeerbare chromosomen waarin het kiemlijn 35 DNA daarvan op een voorlopercel is geherrangschikt en kodeert voor een antilichaam of bindingsfragment daarvan met een bindingsplaats voor een 8700286 ? «s> Λ -8- antigene determinant (epitoop) die gemeenschappelijk is aan koolhydraat-moleculen die op tenminste sommige serotypes van twee of meer bacteriële genera worden aangetroffen. Deze humane monoklonale antilichamen kunnen op verschillende wijzen worden gebruikt, met inbegrip van diagnose, pre-5 ventie en therapie voor bacteriële ziektes. De cellen van de onderhavige uitvinding zijn typerend cellen die in staat zijn tot een stabiele pro-duktie door kweken van een humaan antilichaam, in het bijzonder geïmmor-taliseerde humane lymfocyten die beschermende humane monoklonale antilichamen ten. opzichte van niet-kernkoolhydraat determinanten aan toegan-10λ kelijke moleculen, gemeenschappelijk aan ten minste twee bacteriële soorten, produceren. Onder "toegankelijk" verstaat men dat de niet-kernkoolhydraat determinanten fysisch in de gebruiksomgeving voor directe interakties met de monoklonale antilichamen beschikbaar zijn. De aldus geleverde monoklonale antilichamen zijn bruikbaar voor de behandeling of 15 preventie van ernstige ziektes veroorzaakt door een breed trajekt van bacteriële infecties. Verder zijn die niet-kernkoolhydraatmoleculen die in de omringende omgeving worden afgegeven tevens vrij om direct in inter-aktie te treden met de antilichaammoleculen en via het reticulo-endotheel-systeem te worden opgeruimd.

20 De preparaten die de monoklonale antilichamen volgens de onder havige uitvinding bevatten zijn karakteristiek bruikbaar voor de therapeutische en preventieve behandeling van nosocomiale, neonatale en andere infecties. Nosocomiale infecties worden typerend veroorzaakt door infecties van de volgende bacteriën: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, 25 Klebsiella, pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia marces-cens en Streptococcus agalactlae groep B. Antilichaampreparaten die beschermend zij tegen 2, 3, 4 of meer van dergelijke bacteriën hebben de voorkeur. Eveneens zijn voor neonatale toepassing, zoals bij neonatale sepsis en meningitis, de antilichamen gewenst specifiek ten opzichte van 30 twee. of meer van de volgende bacteriële organismen: Escherichia coli KI, Neisseria meningitidis groep B, Streptococcus agalactiae groep B, en

Hemophilus influenzae type B. Andere gewoonlijk infectieuze bacteriën * omvatten: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis,

Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, 35 Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Providencia morganii, Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, 8700233 'i 'ï -9-

Acinetobacter herellea, Pasturella multocida, Klebsiella oxytoca. Voor andere relevante pathogene bacteriën, die aan de vakman bekend zijn, zie J.M. Hughs et al, "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982" Morb.

Mort, Weekly Report, 32:1SS~16SS (1983), en algemeen, Microbiology, 5 3de druk, B.D. Davis, R. Dulbecco, H.N. Eisen,. H.S. Ginserberg, W.B. Wood en M. McCarty, üitg. Harper en Row (1980), die beide hierin als referentie worden opgenomen. De monoklonale antiiichamen reageren met individuele leden of alle leden van een bepaalde bacteriële soort, waarbij de leden door hun oppervlak-epitopen, in het bijzonder EPS of 10. capsuleplaatsen, bijvoorbeeld serotypes, kunnen worden onderscheiden.

De onverwachte ontdekking van monoklonale antilichaam-kruisreactiviteit ten opzichte van verschillende bacteriële soorten, met inbegrip van de klinisch belangrijke soorten als boven aangegeven, levert een nieuw middel voor therapeutische en preventieve behandelingen. Door gebruik IS te maken van voorgekozen kruis-reactieve antiiichamen in combinatie, kan een mengsel van enkele antiiichamen worden geproduceerd voor behandeling tegen een aantal verschillende soorten infectieuze bacteriën. Bij wijze van voorbeeld maar niet als beperking, zal een mengsel van twee monoklonale antiiichamen één kruisreactief met ten minste twee bacteriële soor-20 ten van klinische significantie en de tweede kruisreactief met ten minste twee of drie verschillende soorten, bruikbaar zijn voor de behandeling tegen 4, 5, 6 of meer verschillende soorten. Wanneer men een derde of vierde monoklonaal antilichaam toevoegt, waarvan elk kruisreactief is met ten minste twee klinisch belangrijke soorten, zelfs indien één of 25' meer van de soorten dezelfde is als die herkend door het eerste en/of tweede antilichaam, zal de bruikbaarheid van de behandeling ten opzichte van vijf tot tien of meer soorten toenemen. Het kan uiteraard noodzakelijk zijn tevens één of meer monoklonale antiiichamen toe te voegen, elk specifiek voor juist een enkele voorgekozen bacteriële soort, bij-30 voorbeeld wanneer monoklonale antiiichamen die met die soort kruisreactief zijn niet beschikbaar zijn. Eveneens wordt voorzien in nieuwe werkwijzen gebaseerd op de ontdekking voor het bestrijden van bacteriële infecties. Bij wijze van voorbeeld en niet als beperking bedoeld omvat een nieuwe werkwijze het behandelen van een patiënt waarvan wordt vermoed 35 dat deze een door een gekozen bacteriële soort veroorzaakte bacteriële infectie heeft of daarvoor vatbaar is. De behandeling omvat het toedienen 870 028 6.

P 5} -10- van; een preparaat bestaande uit een monoklonaal antilichaam dat met de bacteriële soort, waarvan wordt vermoed dat deze de infectie veroorzaakt, reactief is, waarbij het monoklonale antilichaam aanvankelijk werd gekenmerkt als reactief met een andere bacteriële soort- Een ander voorbeeld 5 is een werkwijze voor het behandelen van bacteriële infecties door preparaten toe te dienen die bestaan uit een veelvoud van monoklonale anti-lichamen die reactief zijn met een aanzienlijke hoeveelheid (d.w.z. meer dan 50%, bij voorkeur 60-80% of met de meeste voorkeur ongeveer 90%) van. een voorafgekozen, klinisch belangrijke bacteriële soort, waarbij 10 het, aantal antilichamen tenminste ongeveer twee minder is dan het aantal bacteriële soorten. Typerend indien "η" het aantal bacteriële soorten voorstelt zal het preparaat ongeveer η-2 antilichamen, meer in het bijzonder ‘ongeveer η-4 tot η-8 of minder antilichamen voor het bestrijden tot aan ongeveer 15-20 bacteriële soorten bevatten.

15 In situaties waarin de bestrijding van een breed spectrum (b.v.

50 of meer) bacteriële soorten gewenst is omvat het preparaat typerend r,-10 tot η-20 antilichamen of minder.

De bereiding van monoklonale antilichamen kan men tot stand brengen door de expressie van nuclelnezuurvolgordes, die koderen voor 20 ‘ antilichamen of bindingsfragmenten daarvan specifiek voor een niet-kern-koolhydraatepitoop dat op veelvoudige bacteriële soorten aanwezig is, te immortaliseren. Typererend worden de monoklonale antilichamen geproduceerd door cel-gestuurde Epstein-Barr virus (EBV) transformatie van lymfo-cyten verkregen uit humane donors die aan de respectievelijke gram-nega-25S tieve bacteriën worden of zijn blootgesteld. De aldus geproduceerde anti-lichaam-afgevende cellijnen worden gekarakteriseerd als continu groeiende lymfoblastolde cellen die een diplolde karyotype bezitten, zijn Epstein-Barr nucleair antigeen (EBNA) positief en geven monoklonaal antilichaam hetzij IgG, IgM, ïgA of IgD isotype af. De celgestuurde transformatiewerkwijze 30 zelf is een uitvinding die is overgedragen aan Genetic Systems Corporation en die in bijzonderheden wordt beschreven in het Amerikaanse octrooi-schrift nr. 4.464.465, dat hierin als referentie wordt opgenomen. De monoklonale antilichamen kunnen intakt of als fragmenten, zoals F , Fab, F(ab')2 worden gebruikt, maar zij zijn gewoonlijk intakt.

35 Naar keuze kunnen de cellijnen, die de antilichamen produceren, worden geproduceerd door celfusie tussen geschikte geneesmiddel-gemar- 8700286 * * % -11- keerde humane myeloma, muizemyeloma of humane lymfoblastolde cellen met humane B-lymfocyten waarbij hybride cellijnen worden geleverd.

De cellijnen van de onderhavige uitvinding kunnen andere toepassingen vinden dan voor de directe produktie van de humane monoklonale 5 antilichamen. De cellijnen kunnen met andere cellen worden gefuseerd {zoals geschikte geneesmiddel-gemarkeerde humane myeloma, muizemyeloma of humane lymfoblastolde cellen) ter produktie van hybridoma's en aldus voorzien in de overdracht van de genen die koderen voor de humane monoklonale antilichamen. Naar keuze kunnen de cellijnen worden toegepast 10 als een bron van het DNA dat kodeert voor de immunoglobulinen, hetgeen geïsoleerd kan worden en overgebracht in cellen door technieken anders dan fusie. Tevens kunnen de genen die koderen voor de monoklonale antilichamen worden geïsoleerd en in overeenstemming met recombinant DNA-technieken toegepast voor de produktie van het specifieke immunoglobuline 15 in een veelvoud van gastheren. In het bijzonder kan door het samenstellen van cDNA bibliotheken uit boodschapper RNA, een enkel cDNA kloon dat kodeert voor het immunoglobuline en vrij van introns is, worden geïsoleerd en in geschikte prokaryotische of eukaryotische expressievectoren geplaatst en vervolgens getransformeerd in een gastheer voor de uiteinde-20 lijke massaproduktie. De lymfoblastolde of hybride cellijnen kunnen volgens gebruikelijke technieken worden gekloneerd en uitgeselecteerd, waarbij de antilichamen, die in staat zijn tot binding met de epitopen van verschillende bacteriële genera, in de celbovenlagen worden gedetecteerd. De monoklonale antilichamen van deze uitvinding zijn bijzonder 25' bruikbaar als komponenten van farmaceutische preparaten die een therapeutische of preventieve hoeveelheid van ten minste één van de monoklonale antilichamen van deze uitvinding tezamen met een farmaceutisch effectieve drager bevatten. Een farmaceutische drager kan elke verenigbare, niet-giftige stof zijn geschikt voor het afgeven van de monoklonale 30 antilichamen aan de patiënt. Steriel water, alkohol, vetten, wassen en inerte vaste stoffen kunnen in de drager worden opgenomen. Farmaceutisch aanvaardbare hulpmiddelen (buffermiddelen, dispersiemiddelen) kunnen tevens in farmaceutische preparaten worden opgenomen. Dergelijke preparaten kunnen een enkel monoklonaal antilichaam bevatten dat kruis-reac-35 tief is met niet-kernkoolhydraatepitopen die gemeenschappelijk zijn aan twee of meer bacteriële soorten die bijvoorbeeld nosocomiale en neonatale (bijvoorbeeld sepsis of meningitis) infecties veroorzaken. Naar keuze kan 8700286 V <; -12- een farmaceutisch preparaat twee of meer monoklonale antilichamen bevatten en een "cocktail" vormen. Bijvoorbeeld zal een cocktail, die humane monoklonale antilichamen bevat die elk beschermen tegen twee of meer gram-negatieve genera die verantwoordelijk zijn voor humane infecties, 5 activiteit bezitten ten opzichte van de meerderheid van de gebruikelijke klinische isolaten. Desgewenst kunnen ook één of meer van de monoklonale antilichamen'worden uitgekozen die kruis-reactief zijn met gram-positieve bacteriën, waardoor zelfs nog bredere produkttoepassingen haalbaar zijn. Van belang zijn preventieve en/of therapeutische monoklonale i;o;; antilichaampreparaten die in staat zijn tot reactie met niet-kernkool-hydraatdeterminanten die gemeenschappelijk zijn aan drie of meer, gewoonlijk ten minste vijf en meestal ten minste tien en tot vijftien of meer bacteriële serotypes, welke ten minste twee, gewoonlijk ten minste drie, meestal ten minste vijf en vooral minder dan tien bacteriële 15 genera omvatten.

Van bijzonder belang zijn monoklonale antilichaampreparaten die met ten minste ongeveer drie, bij voorkeur ten minste ongeveer vijf en tot en met inbegrip van alle van de volgende gebruikelijke nosocomiale infectie-veroorzakende bacteriën reageren: Escherichia coli, Pseudomonas 20 aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae,

Serratia marcescens en Streptococcus agalactiae groep B. Voor de behandeling van neonatale infecties is het gewenst dat de preparaten reageren met ten minste twee, gewoonlijk drie en meestal ten minste vier en tot aan en met inbegrip van alle van de volgende infectie-veroorzakende bac-25- teriële genera: Escherichia coli KI, Neisseria mehingitidis groep B, Streptococcus agalactiae groep B, Hemophilus influenzae type B, Staphylococcus aureus en Staphylococcus epidermidis.

Elk van de preparaten zal ten minste twee, gewoonlijk ten minste drie tot vijf en meestal zes tot tien humane monoklonale antilichamen 30 omvatten, waarbij ten minste één antilichaam in reactie treedt met niet-kernkoolhydraatepitopen (bijvoorbeeld van de LPS-moleculen) die gemeenschappelijk zijn aan twee of meer bacteriële genera en bescherming leveren. Typerend zal het antilichaam niet binden aan alle serotypes van elke bacterie, maar zal binden aan twee, drie of meer soorten. Het 35 is gewenst dat er ten minste één monoklonaal antilichaam is dat bindt aan een toegankelijke niet-kernkoolhydraateenheid van ten minste twee genera van gram-negatieve bacteriën en ten minste één monoklonaal anti- 8700286 * -13- lichaam dat bindt aan een toegankelijke kooIhydraateenheid van een gram-negatieve bacterie en een gram-positieve bacterie.

De molverhouding van de verschillende monoklonale antilichaam-komponenten zal gewoonlijk van de een naar de ander met niet meer dan een 5 factor 10, meestal met niet meer dan een factor 5 variëren, en is gewoonlijk in het molverhoudingsgebied van ongeveer 1:1-2 ten opzichte van elk van de andere antilichaamkomponenten.

De humane monoklonale antilichamen kunnen tevens individueel toepassing vinden, in het bijzonder wanneer het pathogeen is geïdentificeerd 10'. of is beperkt tot een nauw trajekt van pathogeneh binnen het bindings-spectrum van het bepaalde antilichaam. De humane monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding kunnen tevens in combinatie met. andere monoklonale antilichamen worden toegepast (b.v. de overgedragen aanvrage getiteld "Monoklonale antilichamen kruis-reactief en beschermend tegen 15 P. aeruginosa serotypen", Amerikaanse octrooiaanvrage nr. 807.394, ingediend 10 december 1985, die hierin als referentie wordt opgenomen), alsmede bestaande bloedplasmaprodukten, zoals in de handel verkrijbare gamma-globuline- en immuneglobulineprodukten toegepast voor de preventieve of therapeutische behandeling van bacteriële ziektes bij mensen. Bij voor-20 keur zal voor immuneglobulinen het plasma worden verkregen uit humane donors die verhoogde niveaus van immunoglobulinen vertonen die reactief zijn met verschillende infectieuze bacteriële genera. Zie in het algemeen het compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med., 76(3a), 30 maart 1984, blz. 1-231, dat hierin als referen-25 tie wordt opgenomen. De monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding zijn bruikbaar als afzonderlijk toegediende preparaten die tezamen met antibiotica of antimicrobiële middelen worden gegeven. De anti-microbiële middelen kunnen typerend het penicilline of cefalosporine (b.v. carbenicilline, penicilline G en dergelijke) tezamen met een amino-30 glycoside (b.v. gentamicine, tobramycine enz.) omvatten, maar ook talrijke andere middelen (b.v. cefalosporinen, sulfageneesmiddelen enz.), die aan de vakman op dit gebied welbekend zijn, zijn bruikbaar.

De humane monoklonale antilichamen en farmaceutische preparaten daarvan volgens de uitvinding zijn bijzonder bruikbaar voor orale of pa-35 renterale toediening. Bij voorkeur zullen de farmaceutische preparaten parenteraal worden toegediend dat wil zeggen subcutaan, intramusculair 8700286 -14- of intraveneus. Aldus voorziet de uitvinding in preparaten voor parente-rale toediening welke een oplossing van het humane monoklonale anti-lichaam, of een cocktail daarvan, opgelost in een aanvaardbare drager, bij voorkeur een waterige drager, omvatten. Men kan een veelvoud van 5 waterige dragers toepassen, bijvoorbeeld water, gebufferd water, 0,4%'s pekel, 0,3%'s glycerol en dergelijke. Deze. oplossingen zijn steriel en meestal vrij van fijnverdeeld materiaal. Deze preparaten kunnen door gebruikelijke welbekende sterilisatietechnieken worden gesteriliseerd.

De preparaten kunnen naar behoefte farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen 10 bevatten om fysiologische omstandigheden te benaderen, zoals pH-instellende en bufferende middelen, de giftigheid-aanpassende middelen en dergelijke, bijvoorbeeld natriumacetaat, natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride, natriumlactaat enz. De concentratie van antilichaam in deze preparaten kan ruim variëren, dat wil zeggen van minder dan ongeveer 15 0,5%, gewoonlijk bij of tenminste ongeveer 1%, tot zelfs 15 of 20 gew.%, en zij worden in hoofdzaak gekozen gebaseerd op vloeistofvolumes, visco-siteiten enz., volgens de bepaalde gekozen toedieningswijze.

Aldus kan typerend een farmaceutisch preparaat voor intramuscu-laire injectie zodanig worden samengesteld dat dit 1 ml steriel gebuf-20 ferd water en 50 mg monoklonaal antilichaam bevat. Een typerend preparaat voor intraveneuze infusie kan zodanig worden samengesteld dat dit 250 ml steriele Ringers-oplossing en 150 mg monoklonaal antilichaam bevat. Feitelijke methoden ter bereiding van parenteraal toedienbare preparaten zijn aan de vakman bekend of duidelijk en deze worden meer in detail 25;. beschreven in bijvoorbeeld Remington's Pharmaceutical Science,. 15de druk, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), dat hierin als referentie wordt opgenomen. De monoklonale antilichamen van deze uitvinding kunnen gevriesdroogd worden opgeslagen en vóór het gebruik met een geschikte drager worden aangemaakt. Deze techniek blijkt effectief te 30 zijn voor gebruikelijke immuneglobulinen en men kan welbekende vriesdroog-en aanmaaktechnieken toepassen. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat vriesdrogen en aanmaken tot verschillende graden activiteitsverlies van het antilichaam kan leiden (b.v. bij conventionele immuneglobulinen, blijken IgM-antilichamen een groter activiteitsverlies te geven dan IgG-35 antilichamen) en dat de gebruiksniveaus ter compensatie hiervan moeten worden aangepast. De preparaten die de onderhavige humane monoklonale antilichamen, of een cocktail daarvan, bevatten kunnen voor de.preventie- 8700286 J» >* * -15- ve en/of therapeutische behandeling van bacteriële infecties worden toegediend. Bij therapeutische toediening worden de preparaten in een voldoende hoeveelheid aan een reeds geïnfecteerde patiënt toegediend om genezing te bewerken of de infectie en zijn complicaties althans gedeel-5 telijk te stoppen. Een voldoende hoeveelheid om dit te bereiken wordt hierin gedefinieerd als "therapeutisch effectieve dosis". Effectieve hoeveelheden voor dit gebruik hangen af van de sterkte van de infectie en de algemene toestand van het immuunsysteem van de patiënt zelf, maar zij variëren meestal van ongeveer 1 tot ongeveer 200 mg antilichaam per kg 10 lichaamsgewicht, waarbij veelal doseringen van 5 tot 25 mg per kg worden gebruikt. De materialen van deze uitvinding zijn algemeen bruikbaar voor zeer enstige ziektetoestanden, dat wil zeggen levensgevaarlijke of potentieel gevaarlijk situaties, in het bijzonder bacteremie en endotoxemie.

In dergelijke gevallen is het met het oog op de afwezigheid van uitwen-15 dige stoffen en afstoting van "vreemde substantie", zoals door de humane monoklonale antilichamen van deze uitvinding bereikt, mogelijk en zelfs volgens de behandelende arts wenselijk een aanzienlijke overmaat van deze antilichamen toe te dienen.

Bij preventieve toepassingen worden de preparaten, die het onder-20 havige antilichaam of een cocktail daarvan bevatten, toegediend aan een patiënt die nog niet door de betreffende bacteriën is geïnfecteerd met het doel de weerstand van de patiënt tegen een eventuele infectie te verhogen. Deze hoeveelheid wordt hierin gedefinieerd als een "preventief effectieve dosis". Bij deze toepassing hangen de nauwkeurige hoeveelheden 25 opnieuw af van de toestand van de patiënt en het algemene niveau van immuniteit, waarbij zij algemeen variëren van 0,1 tot 25 mg per kg en in het bijzonder 0,5 tot 2,5 mg per kg bedragen.

Enkele of veelvoudige toedieningen van de preparaten zijn uitvoerbaar bij dosisniveaus en volgens een patroon dat wordt gekozen door 30 de behandelende arts. Steeds dienen de farmaceutische mengsels een hoeveelheid van het antilichaam (de antilichamen) van deze uitvinding te leveren die voldoende is om de patiënt effectief te behandelen.

De monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding vinden verder een breed toepassingsgebied in vitro. Bij wijze van voorbeeld 35 kunnen de monoklonale antilichamen voor bacteriële typering, voor het isoleren van specifieke bacteriële stammen of fragmenten daarvan, 8700286 p * -16- voor vaccinbereiding en dergelijke worden toegepast. Voor diagnostische doeleinden kunnen de monoklonale antilichamen hetzij worden gemerkt of ongemerkt blijven. Diagnostische onderzoekingen betreffen meestal de detectie van de vorming van een complex via binding van het monoklonale 5 antilichaam aan het LPS van het organisme. Wanneer niet gemerkt vinden de antilichamen toepassing in agglutineringsanalyses. Bovendien kunnen ongemerkte antilichamen worden gebruikt in combinatie met andere gemerkte antilichamen (tweede antilichaam) die reactief zijn met het monoklonale antilichaam, zoals antilichamen specifiek voor humaan immunoglobuline.

10 Naar keuze kunnen de monoklonale antilichamen direct wordt gemerkt. Men kan vele merkmogelijkheden toepassen zoals radionucliden, fluorescentie-middelen, enzymen, enzymsubstraten, enzymcofactoren, enzymremmers, ligan-den (in het bijzonder haptenen); enz. Talrijke typen immunoanalyses zijn beschikbaar en bij wijze van voorbeeld worden sommige beschreven in de 15 Amerikaanse octrooischriften nrs. 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074 en 4.098.876 die hierin alle als referentie worden opgenomen.

Gewoonlijk worden de monoklonale antilichamen van de onderhavige uitvinding toegepast in enzymimmunoanalyses, waar de onderhavige anti-2Ό lichamen, of tweede antilichamen van een verschillende soort aan een enzym worden geconjugeerd. Wanneer een monster, zoals humaan bloed of lysaat daarvan, dat een of meer bacteriën van een bepaald genus of serotype bevat, met de onderhavige antilichamen wordt gecombineerd vindt binding plaats tussen de antilichamen en die moleculen die de uitgekozen 25 epitopen bezitten. Dergelijke cellen kunnen daarna uit het ongebonden reagens: worden geïsoleerd en een tweede antilichaam (gemerkt met een enzym) worden toegevoegd. Daarna wordt de aanwezigheid van het anti-lichaam-enzymconjugaat dat specifiek aan de cellen is gebonden bepaald. Ook andere gebruikelijke aan de vakman op dit gebied welbekende technie-30 ken zijn bruikbaar.

Men kan ook kits leveren ten gebruike met de onderhavige antilichamen voor de detectie van bacteriële infectie of de aanwezigheid van een gekozen antigeen. Aldus kan het onderhavige monoklonale antilichaam-preparaat van de onderhavige uitvinding worden geleverd, gewoonlijk in 35 een gevriesdroogde vorm in een houder, hetzij alleen of gecombineerd met extra antilichamen die specifiek zijn voor andere gram-negatieve 8700286 -17- bacteriên. De antilichamen, die aan een merker kunnen zijn geconjugeerd of ongeconjugeerd zijn, worden in de kits met huffers zoals Tris, fosfaat, carbonaat enz., stabilisatoren, biociden, inerte proteïnen, bijvoorbeeld runderserumalbumine en dergelijke opgenomen. In het algemeen zullen 5 deze materialen in een hoeveelheid van minder dan ongeveer 5 gew.%, gebaseerd op de hoeveelheid actief antilichaam, aanwezig zijn waarbij zij gewoonlijk aanwezig zijn in een totale hoeveelheid van tenminste ongeveer 0,001 gew.%, gebaseerd op de antilichaamconcentratie. Dikwijls zal het wenselijk zijn een inerte verdunner of excipiêns op te nemen om de 10 actieve komponenten te verdunnen, waarbij de excipiêns aanwezig kan zijn in een hoeveelheid van ongeveer 1 tot 99 gew.% van het totale preparaat. Wanneer een tweede antilichaam in staat tot binding aan het monoklonale antilichaam wordt toegepast zal dit gewoonlijk in een afzonderlijk flesje aanwezig zijn. Het. tweede antilichaam wordt typerend geconjugeerd aan 15 een merker en op analoge wijze met de antilichaamsamenstellingen die boven zijn beschreven samengesteld.

De volgende experimentele gegevens en informatie worden bij wijze van voorbeeld en niet als beperking gegeven.

VOORBEELD I

20 Dit voorbeeld demonstreert methoden voor de produktie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactiviteit tegen leden van de genera Escherichia coli (E. coli), Serratia marcescens (S. marcescens), Klebsiella pneumonias (K. pneumoniae) en Enterobacter aerogenes (E. aerogenes) bezit. Verder demonstreert dit voorbeeld de in 25 vivo beschermende activiteit van genoemd antilichaam tegen een lethale besmetting van homologe (kruis-reagerende) E. coli en E. aerogenes serotypes.

A. Het verkrijgen van geschikte humane cellen

Geschikte humane B cellen (lymfocyten) worden verkregen uit het 30 periferale bloed van een individu waarvan bekend was dat dit de ziekte cystische fibrose vertoonde. Mononuclaire cellen werden uit het periferale bloed volgens standaard centrifugeringstechnieken over FicollrrPaque afgescheiden (A. Boyum, "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood", Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21. Suppl. 97:77-89 35 (1968)) en tweemaal in calcium-magnesiumvrij fosfaat-gebufferde pekel (PBS) voor suspensie in 1 ml 90% foetaal runderserum (FBS) en 10% dime- 8700238 .p 't -18- thylsulfoxide gewassen en bij -196°C in vloeibare stikstof ingevroren.

Wanneer men de mononucleaire cellen wenste te transformeren werd 7 een ampul die 5 x 10 cellen bevatte snel bij 37°C ontdooid. De celsus-pensie werd aan 10 ml van Iscove's medium, dat 15% FBS bevatte, toege-5 voegd en gedurende 10 minuten bij 250 x g bij kamertemperatuur gecentrifugeerd. De mononucleaire cellen werden ontdaan van C-cellen (lymfocyten) met de gemodificeerde E-rosetvormingsprocedure. In het kort werden de cel- 7 len opnieuw gesupsendeerd tot een concentratie van 1 x 10 cellen/ml in PBS dat 20% FBS bij 4°C bevatte. Eén ml van deze suspensie werd in een 9

10 17 x 100 mm polystyreen rondbodembuis gebracht, waaraan 1 x 10 2-ammo-ethyliso-thiouroniumbromide (AET)-behandelde schaperode bloedcellen waren toegevoegd uit een 10%'s (v/v)oplossing in Iscove's medium (M. Madsen en H.E. Johnson, "A Methodological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells", J. Immun. Methods, 27:61-15 74 (1979)). De suspensie werd krachtig gedurende 5-10 minuten bij 4°C

gemengd en de aan E-rosetvorming onderworpen cellen werden door centrifugering via Ficoll-Paque gedurende 8 minuten bij 2500 x g bij 4°C verwijderd. E-rosetvormige negatieve perifirale mononucleaire bloedcellen (E PMBC), die banden vormden bij het grensvlak, werden eenmaal in Iscove's 20 medium gewassen en opnieuw in dit medium gesuspendeerd dat 15% w/v FBS

(g/ml), L-glutamine (2 mM/1), natriumpyruvaat (1 mM/1), penicilline -4 (100 IU/ml), streptomycine (100 pg/ml), hypoxanthine (1 x 10 M) en ~s thymidine (1,6 x 10 M) bevatte. Dit medium wordt hierna aangeduid als HAT-medium.

25.' Bv Cellijn-gestuurde transformatie van periferale mononucleaire bloedcellen

Cel-gestuurde transformatie van het E PBMC werd tot stand gebracht door het E PBMC gelijk te kweken met een transformerende cellijn.

De transformerende cellijn was een EBNA positieve humane lymfoblastolde 30 cellijn afgeleid door ethylmethaan-sulfonaat-mutagenese van de GM 1500 lymfoblastolde cellijn. Door selectie in aanwezigheid van 30 yg/ml 6-thioguanine werden de cellen hypoxanthine-guanine fosforibosyltrans-ferase deficiënt gemaakt en aldus HAT-gevoelig. De cellijn wordt aangeduid als de 1A2 cellijn die werd gedeponeerd bij de American Type Culture 35 Collection (A.T.C.C.) 29 mart 1982, onder A.T.C.C. nr. CRL 8119. 1A2 cellen in de logaritmische groeifase werden in Hat-medium gesuspendeerd en 8700286 -19- μ i gecombineerd met E PBMC in een verhouding van 30 1A2 cellen per E PMMC.

Het celmengsel werd in 10 rondbodem microtiterplaten met 96 cupjes aangebracht in een concentratie van 62.000 cellen/cupje in een volume van 200 μΐ/cupje, en de kweek bij 37°C in een vochtige atmosfeer, die 6% 3 C02 bevatte, geincubeerd. De kweken werden 5 dagen na de transformatie gevoed door de helft van de bovenlaag te vervangen door vers HAT-medium.

De cupjes werden om de andere dag met een omgekeerde microscoop op tekenen van celvermenigvuldiging waargenomen. Tien dagen na het op de plaat brengen van het celmengsel en nadat de 1A2 cellen wegens de HAT-selectie 10 waren gestorven, werd de voeding van de cupjes tot stand gebracht met een nieuwe mediasamenstelling identiek aan het HAT-medium met uitzondering dat de aminopterinekomponent ontbrak. Vijftien dagen na het op de plaat brengen werd waargenomen dat 100% van de cupjes zich vermenigvuldigende cellen bevatte, dat in de meeste van de cupjes de cellen een voldoende 15 dichtheid hadden om de bovenlagen te verwijderen en te onderzoeken op anti-E. coli of anti-S. marcescens antilichamen.

C. Detectie van specifieke antilichaam-afgevende cellen

De bovenlagen werden onderzocht op de aanwezigheid van anti-E. coli of anti-S. marcescens antilichamen met een enzym-gekoppelde immuno-20 sorbens analyse (ELISA) techniek (E. Engvall, "Quantitative Enzyme Immunoassay (ELISA) in Microbiology", Med. Biol., 55:193-200 (1977)).

De antigeenplaten bestonden uit een reeks van rondbodem Immunlon 2 microtiterplaten met 96 cupjes, waarvan de cupjes. een mengsel van hetzij levende E. coli of S. marcescens serotypes gehecht aan de oppervlakken 25 van de cupjes met poly-L-lysine (PLL) bevatten. In het kort werd 50 μΐ PLL (1 μg/ml) in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) aan elk cupje toegevoegd. De platen werden driemaal met PBS gewassen en hetzij PBS of 50 μΐ van een gemengde bacteriesuspensie bij ο·ο·660=0,2 werd aan elke cup toegevoegd. De platen werden gedurende 60 minuten bij 37°C 30 geincubeerd ën driemaal gewassen met pekel/0,02% Tween 20 (pekel/T) ter verwijdering van niet-vastgehechte bacteriën. Verschillende antigeenplaten die in het onderzoek werden toegepast omvatten: 1) een mengsel van E. coli serotypes 01 (A.T.C.C. nr. 23499) en 04 (A.T.C.C. nr. 12791); 2) een mengsel van S. marcescens serotypes 07, 35 015, 016 en 018 (alle aangehaalde typerende stammen waren verkregen uit het Communicable Disease Center (CDC) Atlanta, GA); en 3.) een microtiter-plaat zonder bacteriën.

8700286 -20-

Wat de ELISA-procedure betreft werden de analysecupjes eerst geblokkeerd met 200 μΐ van een mengsel, dat 5% w/v droge taptemelk, 0,0001% schuim A en 0,01% w/v Thimerosal in 500 ml PBS bevatte, ter voorkoming van niet-specifieke protexnebinding. Na gedurende 1 uur incubatie bij RT 5 werden de platen driemaal met 200 μΙ/cupje/pekelwasvloeistof/T gewassen. Aan elk cupje werd 50 μΐ toegevoegd van een mengsel dat 0,1% Tween 20 en 0,2% runderserumalbumine en PBS (PTB) bevatte. Bovenlagen uit cupjes van de kweekplaat werden opnieuw op platen gebracht in overeenkomstige cupjes van de antigeen- en controleplaten (50 μΐ/cupje) en de platen werden bij 10 RT gedurende 30 minuten geïncubeerd. De bovenlagen werden daarna verwijderd, de platen vijfmaal gewassen met pekel/T en 50 μΐ van gebiotiny-leerde geite-anti-humaan immunoglobuline (Ig) (TAG # 9303040 verdund 1:250 in PTB) werd aan elk cupje toegevoegd. Na 30 minuten incubatie bij RT werd het gebiotinyleerde reagens verwijderd, de cupjes vijfmaal met 15 pekel/T gewassen en werd aan elk cupje 50 μΐ van een voorgevormde avidine: gebiotinyleerd mierikswortelperoxydaatcomplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories) toegevoegd. Na 30 minuten bij RT werd het Vectastain ABC reagens verwijderd, de cupjes werden vijfmaal gewassen met pekel/T en aan elk cupje werd 100 μΐ substraat (0,8 mg/ml ortho-fenyleendiamine-20 dihydrochloride in 100 mM citraatbuffer, pH 5,0 plus 0,03% in gede- ioniseerd water gemengd met gelijke volumes juist voor het op de plaat brengen) toegevoegd. Na 30 minuten incubatie in het donker werd aan elk cupje 50 μΐ 3N toegevoegd om de reactie te beëindigen. De kweek- bovenlagen met antilichaam dat reactief was met de met bacteriën beklede 25. platen, werden getecteerd door de absorptie bij 490 nm over een Dynatech MR. 580 microELISA-aflezer te meten.

Kweekbovenlagen uit zes transformaties werden volgens de bovenstaande methode geanalyseerd hetgeen leidde tot identificatie van één cupje (7D7) dat activiteit ten aanzien van E. coli en S_. marcescens sero-30 type-platen bezat, maar niet ten opzichte van de controleplaten. Er werd in de volgende ELISA's met individuele E. coli serotypes vastgesteld dat dit cupje een antilichaam bevatte dat reactief was met tenminste E. coli serotypes: 08, (A.T.C.C. nr. 23504) en 075 (A.T.C.C. nr. 12798), maar niet 04, 06:K2, 08:K8, 09:K9 of 022:K13 (A.T.C.C. resp nrs. 12791, 35 19138, 23501, 23505 en 23517). Verder bevatte deze cup antilichaam dat reactief was met de S. marcescens serotypes 012, 013 en 015, maar niet met één van de andere twintig bekende S. marcescens LPS-serotypes.

8700236 jc i -21- D. Klonering van specifieke antilichaam-producerende cellen

De cellen in cupje 7D7 werden aan verschillende kloneringsronden (vier) onderworpen totdat alle klonale bovenlagen die volgens de bovenstaande ELISA-procedure waren geanalyseerd een positieve reactie op 5 E. coli serotypes 08 en 075 en op E. marcescens serotypes 012, 013 en 015 gaven. Er was geen enkel voorbeeld waarbij een klonale bovenlaag segratie in zijn reactiviteitspatroon demonstreerde, hetgeen suggereert dat de kweekbovenlaag uit cupje 7D7 een ware intergenus kruisreactiviteit ten opzichte van de E. coli en marcescens serotypes als vermeld bezat 10 en niet meer dan één cellijn bevatte (die elk individuele serotype reactiviteit demonstreerden). Cellen werden gekloneerd door de verdunning in rondbodem 96-cupjesplaten in afwezigheid van toevoercellen te beperken. Media bestonden uit Iscove's medium dat 15% v/v FBS, L-glutamine (2 mM/l), natriumpyruvaat (1 mM/1), penicilline (100 Πΐ/ml) en strepto-15 micine (100 ug/ml) bevatte. De kweken werden om de drie dagen gevoed door de helft van de bovenlaag door vers medium te vervangen. In het algemeen hadden de cupjes een voldoende lymfoblastoïde celdichtheid tussen 2 en 3 weken na het op de plaat aanbrengen voor analyse op anti-E. coli en S. marcescens serotype specificiteit.

20. Aldus werd in dit experiment één gekloneerde getransformeerde humane cellijn bereikt die continu (onsterfelijk) is en een humaan mono-klonaal antilichaam ten opzichte van een determinant aan het oppervlak van de E. coli en S. marcescens serotypes als aangegeven afgeeft.

Vóór de indiening van deze octrooiaanvrage werd de continue ge-25 transformeerde humane cellijn geïdentificeerd als 7D7 gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, Rockville, MD onder A.T.C.C. nr.

CRL 9009.

E. Vërdere kenmerken van intergenus kruisreactiviteit

Antilichaam uit de gekloneerde 7D7 cellijn werd onderzocht op 30 verdere intergenus kruis-reactiviteit door een modificatie van de standaard immunodeklaagtechniek ("blotting"). In het bijzonder werd de kruisreactiviteit ten opzichte van de bacteriën K. pneumoniae, E. aerogenes en E. cloacae onderzocht door bacteriën aan te stippen op een nitrocel-lulose-papierschijf met roosters, de schijf die bacteriën bevatte met 35 genoemd antilichaam in reactie te brengen en de antilichaamreacties met een alkalische fosfatase/nitroblauw tetrazoliumenzymsysteem te ontwikkelen.

8700235 S' « -22-

In het kort werd 1,0 μΐ bacteriën (O.E.c^ =0,4) per roostersectie gestipt

boU

op een nitrocellulose-papierschijf (Schleicher en Schuell, 37 mm nitro-cellulose-schijf, met rooster 0,45 pm). Elke schijf kan geschikt 60 verschillende bacteriële monsters bevatten. De aangestipte schijven werden 5 aan de lucht gedroogd, gedurende 30 minuten gefixeerd in 25% v/v isopro-panol en gedurende 10 minuten in het droge taptemelkreagens als beschreven voor de ELISA-methode geblokkeerd. De geblokkeerde schijven werden elk driemaal gedurende 5 minuten gewassen in PBS/Tween 20 en overgebracht op de deksels van 35 x 10 mm weefselkweekschalen. De antilichaam-bevat- 10. tende bovenlaag (1,0 ml) werd aan het deksel toegevoegd en bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten geïncubeerd. Na drie 5-minuten wassingen in PBS/Tween 20, werd 1-2 ml van een 1:1000 verdund (PBS) alkalifosfatase geconjugeerd geite-anti-humaan immunoglobule (TAGO, Burlingame, CA) gedurende 60 minuten bij RT toegevoegd. De schijven werden als boven gewassen 15 en ondergedompeld in 1-2 ml vers substraat dat als volgt was bereid: 16,5 mg broom-chloorindolylfosfaat en 8,5 mg nitroblauw tetrazolium werden in 50 ml alkalische fosfatase buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5 met 0,1 M NaCl en 5 mM MgCl2) opgelost, de oplossing werd in het donker gehouden en onmiddellijk vóór gebruik gefiltreerd. Na geschikte kleuront-, 20 wikkeling (10-15 minuten) werd de reactie gestopt door de schijf in verschillende hoeveelheden gedestilleerd water te spoelen. De ontwikkelde schijven kunnen na drogen worden opgeslagen.

De- schijven bevatten 50 K. pneumoniae capsule-getypeerde referenties tammen verkregen van de Dr. George Kenney, Universiteit van 25 Washington, Department of Pathobiology, Seattle, WA en de American Type Culture Collection, 4 E. aerogenes klinische bloedisolaten en 6 E. cloacae klinische bloedisolaten (bloedisolaten verkregen van Harborview Hospital, Seattle, WA). De Enterobacter isolaten werden getypeerd (gespecificeerd) met het API 20E systeem van 23 gestandaardiseerde biochemische proeven 30 (API Analytab Products, Plainview, NY) . Met deze methode worden het genus en het species van de gram-negatieve bacteriën geïdentificeerd maar niet het serotype. Derhalve werden de Enterobacters anders dan de E. coli, S. marcescens en pneumoniae niet alle wat betreft serotype geïdentificeerd, maar alleen op genus en species.

35 Uit deze proeven werd waargenomen dat het 7D7 antilichaam verder intergenus kruis-reactiviteit bezat. Dit antilichaam reageerde met de 8700286 -23- volgende serotypes : K. pneumoniae E. coli S. marcescens E. aerogenes K14,57,60 08,75 012,13,15 Klinische isolaten

Aldus werd waargenomen dat het humane monoklonale antilichaam 7D7 inter-5 genus kruis-reactiviteit ten opzichte van bacteriën behorende tot het species E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes bezat maar niet ten opzichte van E. cloacae.

F. Karakterisering van monoklonale antilichamen

De vondst dat het monoklonale antilichaam in kruisreactie treedt 10 met verschillende bacteriële genera deed vermoeden dat het antilichaam gericht was tegen een gemeenschappelijk proteïne of koolhydraat. Deze twee moleculaire verbindingssoorten blijken verantwoordelijk te zijn voor intragenus kruisreacties (L. Mutharia en R.E.W. Hancock, "Characterization of Two Surface-Localized Antigenic Sites on Porin Protein F of 15 Pseudomonas aeruginosa", J. Canadian of Microbiol., 31:381-386 (1985) en F. Orskov en I. Orskov, "Serotyping of Escherichia Coli" in Methods in Microbiology, Vol. 14, T. Bergan, Uitg. Academic Press, Orlando, FL, 43-112 (1984)).

Biochemische karakterisering van de moleculaire soort die wordt 20 herkend door het 7D7 antilichaam werd tot stand gebracht door immuno-membraananalyse ("blotting"). In het kort werden gewassen bacteriën uit een 20 ml overnachtse bouillonkweek (voor E. coli, S. marcescens en E. aerogenes serotypes) of uit overnachtse gegroeide platen (K. pneumoniae) geëxtraheerd in 1,0 ml van een oplossing die 64 ml 50 mM Ttis 25r pH 7,6, 30 ml glycerol, 0,3 g deoxycholaat (natriumzout), 0,14 ml beta-mercaptoethanol en 6 ml gedeïoniseerd water bevatte (I. Schechter en K. Block, "Solubilization and Purification of trans-Formesyl Pyrophos-phate-Squalene Synthetase", J. Biol. Chem., 246:7690-7696 (1971)).

Na 18 uur incubatie bij 4°C werd de suspensie bij 10.000 x g gedurende 30 10 minuten gecentrifugeerd. De bovenlaag werd verwijderd en het proteïne gekwantificeerd met de Bio-Rad proteïne-analyse (Bio-Rad Laboratories Richmond, CA). Tussen 100 en 100 ng proteïne (verschilt voor elk bacte-rieel extract) uit elke bacterie werden elk aan natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide-gelelektroforese onderworpen (B. Kusecek et al, 35 "Lipopolysaccharide, Capsule, and fimbriae as Virulence Factors Among 01, 07, 016, 018 or 075 and KI, K5 or K100 Escherichia coli". Infection \ 8700286 -24-

If v and Immunity, 43:368-379 (1984)). Afzonderlijke moleculaire soorten werden uit de gel overgebracht op een nitrocellulose-membraan (NCM) als elders beschreven (H. Towbin et al, "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure 5 and Some Applications", Proc. Natl. Acad. Sci., 76:4350-4354 (1979)) en de NCM-laag gedurende 1 uur in PBS-Tween geblokkeerd (B. Batteiger et al, "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins transferred to Nitrocellulose Membranes", J. Immunol. Meth. 55:297-307 (1982)). De membraanlaag werd gedurende 1 uur bij kamertempe-10' ratuur in 10 ml verbruikte kweekbovenlaag uit de 7D7 lijn geincubeerd.

Na vier 5-minuten spoelingen in PBS-Tween werd de membraanlaag geïncu-beerd in geite-anti-humaan Ig geconjugeerd met alkalisch fosfatase en ontwikkeld als daarin beschreven voor de bacterie-nitrocellulose schijf-analyse. Er werden in alle sporen die deoxycholaatextracten van de hierin 15 beschreven bacteriën bevatten, positieve reacties opgemerkt. In deze sporen bleek het 7D7 antilichaam een reeks van regelmatig op afstand staande moleculaire eenheden te herkennen, hetgeen aanleiding gaf tot een ladderachtig patroon op het immunomembraan. Dit profiel was geheel in overeenstemming met die waargenomen in polyacrylamidegel-elektroforetische 20 analyse van LPS in aanwezigheid van SDS, waarbij is gedemonstreerd dat het heterogene maatprofiel dat door de banden wordt vertoond toe te schrijven is aan een populatie van LPS-moleculen, die verschillen in gewichts-incrementen die equivalent aan het aantal O-antigenische oligosaccharide-zijketeneenheden die per molecuul aanwezig zijn (E.T. Pavla en P.H Makela, 25: "Lipopolysaccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Eur. J. Biochem., 107:137-143 (1980) en R.C. Goldman en L. Leive, "Heterogeneity of Antigenic-Side-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2n, Eur. J. Biochem., 107:143-154 (1980)). 30 Deze gegevens wijzen erop dat het monoklonale antilichaam 7D7 gericht is tegen een antigenische determinant die gemeenschappelijk is aan de LPS-moleculen die men aantreft op sommige serotypes van E. coli, S. mar-cescens, K. pneumoniae en E. Aerogenes. Voor een verdere definitie van de moleculaire aard van het antigeen werden de deoxycholaatextracten vóór 35 hun elektroforese behandeld met het proteolytische enzym Proteinase K (W. Eberling et al, "Proteinase K from Tritirachium album Limber", Eur.

8700285 A *.

-25- J. Biochem. 47:91-97 (1974)). Ter bereiding van het monster werd 10 ug proteinase K toegevoegd aan 50 yg monsterproteine en het mengsel gedurende 60 minuten verhit tot 65°C. De monsters werden aan elektroforese onderworpen en als hierin beschreven aan een immunomembraanproef onderworpen.

5 De immunomembraanpatronen die na de Proteinase K behandeling werden waargenomen waren identiek aan die patronen waargenomen zonder behandeling, waardoor zij aldus suggereren dat het antigeen, dat reactief is met het 7D7 antilichaam van nature geen proteïne is.

Voor het specifiek opsparen of 7D7 reageerde met een koolhydraat-10 epitoop, werd het elektro-overgedragen deoxycholaatmonster onderworpen aan een milde perjodaatoxydatie vóór de reactie van het nitrocellulose-papier met antilichaam. Deze reactie blijkt de koolhydraatdeterminanten te vernietigen en aldus tevens hun aansluitende reactiviteit met antilichaam, zonder proteïne of lipide epitopen te wijzigen (M.P. Woodward 15 et al, "Detection of Monoclonal Antibodies Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation", J. of Immunol. Methods, 78:143-153 (1985)). In het kort nadat het elektro-gevloeide nitrocellulosepapier, dat het monster onderworpen aan elektroforese bevatte, werd geblokkeerd met PBS-Tween, als hierin beschreven, werd het papier gespoeld in 50 mM 20 azijnzuur-natriumacetaat pH 4,5 buffer. Het nitrocellulosepapier werd in 50 mM perjoodzuur, opgelost in de azijnzuurbuffer gedurende 60 minuten in het donker bij kamertemperatuur geincubeerd. Het behandelde papier werd driemaal in PBS-Tween gespoeld en gereageerd met het antilichaam als hierin beschreven. Op deze wijze behandelde door elektromembraan-25' techniek verkregen deoxycholaatextracten waren niet langer reactief met het 7D7 monoklonale antilichaam. Deze gegevens geven een sterke indicatie dat het door dit antilichaam herkende epitoop een koolhydraat is dat op het LPS-molecuul van de hierin beschreven bacteriën aanwezig is.

Het isotype van het 7D7 monoklonale antilichaam werd in een 30 ELlSA-procedure gelijk aan de bovenbeschreven specificiteitsproeven vastgesteld met uitzondering dat gebiotinyleerd geite-anti-'humaan IgG (gamma-keten specifiek, TAGO) of gebiotinyleerd geite-anti-humaan IgM (mu-keten specifiek, TAGO) als het tweede-trapsreagens werd toegepast in plaats van het meer algemeen reactieve gebiotinyleerde geite-anti-humaan Ig. Beide 35 reagentia werden bij een 1:500 verdunning toegepast en de antigeenplaat bevatte verzamelingen van PLL-geïmmobiliseerde E. coli 08 en 075 stammen.

8700238 * -26- Λ '* ,

Een positieve reactie van het 7D7 monoklonale antilichaam met de E. coli-stammen werd alleen waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat bij herhaling van het bovenstaande proces en 5 van bepaling van de isotypes van aldus verkregen intergenus kruis-reac-tieve monoklonale antilichamen men tevens bijvoorbeeld IgM en IgG isotypes zou aantreffen (M. Frosch et al; "NZB Mouse System For Production of Monoclonal Antibodies to Weak Bacterial Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli K1 and Grop 10: Meningocci", Proc. Natl. Acad. Sci., 82:1194-1198 (1985)).

G. In vitro activiteit

De in vitro functionele activiteit van het 7D7 monoklonale antilichaam werd in een in vitro opsonofagocytose-analyse onderzocht waarbij de bacteriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en af-15 wezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken.

Bacteriën werden verkregen door hetzij 10 ml tryptisch sojabeslag (TSB) te inoculeren met 50 yl van een overnachtse beslagkweek (voor E. coli, S. marcescens en E. aerogenes) of voor K. pneumoniae, waarbij 20 een petrischaal die Worfel-Ferguson agar bevatte werd aangestreken. Voor beslagkweken werden de buizen bij 37°C in een schudinrichting beent gedurende 3 uur, in welke periode 1,5 ml van de kweek gedurende 1 minuut bij 10.000 x g werd gecentrifugeerd, de verbruikte kweekmedia werden af-gevoerd en de centrifugekoek gesuspendeerd in 3,5 ml van Hank's uitgeba-25. lanceerde zoutoplossing die 0,1% gelatine en 5 mM HEPES (HBSS/gel) bevatte. Van dé op de agarplaat gegroeide bacteriën werden de kolonies afgeschraapt in steriele HBSS/gel. De bacteriële concentraties voor de bacteriën die onder beide omstandigheden waren gegroeid werden ingesteld op 3 x 103 bacteriën/ml door de °*D·ggg te meten en de geschikte verdun-30 ningen aan te brengen (bij benadering 1:50.000).

Humane neutrofielen werden volgens van Furth en Van Zwet geïsoleerd ("In Vitro Determination of Phagocytosis and Intracellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear Phagocytes", in Handbook of Experimental immonology, deel 2, D.M. Weir, Uitg. 2de druk, Blackwell Scientific 35 Publications, Oxford 36.1-36.24 (1973)) met verschillende modificaties. Een met Witte bloedcellen verrijkte laag van 10 ml gehepariniseerd bloed 8700286 -27- werd op Ficoll-Paque gelegd en gecentrifugeerd. De rode bloedcel (RBC) -koek werd eenmaal gewassen met RPMI 1640 medium en opnieuw gesuspendeerd in een gelijk volume van 37°C PBS. Drie ml van deze suspensie werd toegevoegd aan 6 ml 2% dextran (in 37°C PBS) en de inhoud zachtjes maar gron-5 dig door omkering gemengd. Na 20 minuten incubatie bij 37°C om de RBC's te laten sedimenteren, werd de bovenlaag (die neutrofielen bevatte) verwijderd, tweemaal gewassen in 4°C PBS, eenmaal in HBSS/gel en daarin ge- 7 suspendeerd tot 5 x 10 neutrofielen/ml. Voor de complementbron gebruikt met E. coli en marcescens, werd humaan serum tweemaal geadsorbeerd met 10 levende bacteriënverzamelingen (A.B. Bjornson en J.G. Michael, "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of Opsonins with the Bacterium", J. of Inf. Dis., 130Suppl: S119-S126 (1974)), hetgeen overeenkomt met de organismen die in de analyse zijn gebruikt. Dit serum werd verder geadsorbeerd met gekookt 15 Zymosan (Bjornson, supra) ter verwijdering van de serumkomponent prope-ridine, een molecuul dat noodzakelijk is voor de activering van de alternatieve complementroute. Voor opsonofagocytische analyses met K. pneumoniae en E. aerogenes was de complementbron ongeadsorbeerd normaal humaan serum toegepast bij een 1%'s eindconcentratie.

20 Platen toegepast voor het kwantificeren van het aantal over- levende/vernietigde bacteriën werden klaargemaakt te beginnen met verwarming van platen met 24 cupjes gedurende 3-5 uur bij 37°C. Een 0,4%’s oplossing van agarose in TSB werd bereid door -het mengsel gedurende 5 minuten in een autoclaaf te behandelen en dit tot 50°C in een waterbad 25 te laten afkoelen. Bij benadering 15 minuten voor'het einde van de eind-incubatieperiode in de opsonofagocytose-analyse werd een plaat met 24 cupijes uit de 37°C-incubator verwijderd, op een 42°C-verwarmingsplaat geplaatst en aan elk cupje werd 0,4-ml TSB/agarose toegevoegd. De plaat werd onmiddellijk in de 37°C-incubator teruggevoerd en wel zodanig dat 30 de agarose niet onder 37°C werd gekoeld.

Voor.de analyse werden 25 μΐ 7D7 kweekbovenlaag en 25 μΐ van een geschikte bacteriële stam in duplicaat toegevoegd aan rondbodemmicrotiter- platen met 96 cupj es en bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten geïncu- beerd. Dit werd gevolgd door toevoeging van 15 μΐ humaan complement, £ 35 15 μΐ humane neutrofielen (5 x 10 /ml) en 70 μΐ HBSS/gel. Het gehele oppervlak van de plaat werd af geveegd met een steriel wattenstaafje, een 870 028 6- * * -28- klevende kunststof afdichtplaat werd aangebracht om de gehele plaat en het gebied tussen de cupjes te bedekken waarna de plaat bij 37°C gedurende 1 uur werd geroteerd. Na incubatie werd de plaat gedurende 5 minuten bij 100 x g gecentrifugeerd, de afdichtplaat werd zachtjes verwijderd en 5 het plaatoppervlak werd gedroogd met een steriel wattenstaafje dat in 70% ethanol was gedompeld. Vijftig microliter werd uit elk microtiter-cupje verwijderd en toegevoegd aan de individuele cupjes van de kwantifi-ceringsplaten met 24 cupjes die reeds het 0,4 m/cupje van gesmolten (38°-40°C) 0,4% TSB/agarose bevatten. Deze platen werden gedurende 1 uur . 10 aangebracht op een schudinrichting met een vlak bed bij 150 toeren per minuut en men liet het agarose gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur verharden. Tenslotte werd een 0,4 ml TSB/agarose deklaag aan elk cupje toegevoegd, gevolgd door een hardingsperiode van 15 minuten bij 4°C alvorens de platen overnacht bij 37°C werden geïncubeerd. Na 18 uur werden 15 de kolonies geteld en werden de gegevens opgegeven als kolonievormende eenheden (CFU) gedurende elke toestand.

De hierin toegepaste bacteriële serotypes, met uitzondering van K. pneumoniae werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 7D7, een actieve complementbron en humane neutrofielen 20 (tabel A). Na herhaling van deze proef met verschillende niet-7D7 reac-tieve bacteriële serotypes, werd geen bacterievernietiging waargenomen (gegevens niet weergegeven), hetgeen aldus de functionele specificiteit van het monoklonale antilichaam 7D7 demonstreert alsmede zijn vermogen bacteriën te opsoniseren en hun fagocytose te bevorderen. Aangezien de ge-25“ combineerde werkingen van opsoninen (specifieke antilichamen) en polymor-fónucleaire leukocyten (neutrofielen) het primaire mechanisme voor immuniteit ten opzichte van deze bacteriële stammen blijkt te zijn, suggereren deze gegevens dat antilichaam 7D7 na een geschikte toediening bescherming zal verlenen tegen lethale besmetting met de hierin beschreven 30 bacteriële serotypes.

8700286 -29-lasEL· a

Bacterie Neutrc- totilichaam -% Vernietiging van fielen Complement Ingebrachte _ _ _ _ bacterie E. coli , a Ö8iïTÖ75 + 707 - 0 ίο + 6Fllb + 0 08 en 075 E· COli ΤΓ1-7 ~ 7D7 + 0 08 en 075 E. coli . . ___ — -— _ + 7D7 + 85% 08 en 075 S. marcescens .

— _-—=—- + 7D7 - 0 012 en 015 S. marcescens .

— --—-- + 6F11 + 0 012 en 015 S. marcescens — _-—z- - 7D7 + 0 012 en 015 S. marcescens , ___ . ___ — _-—- + 7D7 + 85% 012 en 015 E. aerogenes _

Isolaten (2) υ f f^SSEBg + 6PU + 0

Isolaten (2) E. aerogenes — —7rr - 7D7 + 0

Isolaten (2) E. aerogenes , ___

Isolaten (2) a (-) = warmte-gelnactiveerd (56°C gedurende 30 minuten) humaan complement.

(6F11) = kweekbovenlaag die een IgM humaan monoklonaal antilichaam ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 bevatte.

8700286 -30- H. In vivo activiteit

Voor het onderzoeken van de bovenstaande hypothese werden dier-beschermingsproeven uitgevoerd met het 7D7 antilichaam en ten minste één organisme uit de hierin beschreven E. coli en E. aerogenes soorten. 7D7 5 en negatieve controle (6F11, humaan IgM monoklonaal antilichaam specifiek ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher immunotype 2) antilichamen werden eerst uit verbruikte kweekbovenlagen gecontroleerd door neerslaan met vast ammoniumsulfaat (50% eindconcentratie) (A.J. Good et al, "Purification of Immunoglobulins and Their Fragments", in Selected 10 Methods in Cellular Immunology, B.B. Mishell en S.M. Shiigi, Uitg.

W.H. Freeman and Company, San Francisco, CA (1980) 179-286). Het neergeslagen materiaal werd aangemaakt in steriel water en intensief tegen PBS gedialyseerd.

Het IgM antilichaam in het ammoniumsulfaatzoutneerslag werd ge-15 zuiverd door affiniteitschromatografie over een murine monoklonaal anti-humaan IgM antilichaam affiniteitskolom. Voor het prepareren van de kolom werd 1 gram van gedehydrateerd cyanogeenbromide geactiveerd Sepharose 4B (Pharmacia) gemengd met 15 ml ijskoud 1 mM HC1 in gedestilleerd water. De gehydrateerde gel werd in 30 ml koppelingsbuffer (0,1 M 20 carbonaat (NaHC03) in 0,5 M NaCl, pH 8,2) gewassen, uitgelekt onder vorming van een vochtige koek en daarna gecombineerd met het ammoniumzout-neerslag opgelost in 1-3 ml koppelingsbuffer. De gelsuspensie werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur door omkering gemengd en tenslotte bij 200 x g gedurende 5 minuten gecentrifugeerd. Ter blokkering van de nog 25; steeds beschikbare reactieve plaatsen werd de bovenlaag verwijderd, werd 10 ml 1 M ethanolamine aan de gel toegevoegd en werd het mengen als boven voortgezet. De suspensie werd bij 200 x g gedurende 5 minuten gecentrifugeerd en de bovenlaag verworpen. De gel werd voor gebruik bereid met 1 wassing in 0,1 M acetaat/pekelbuffer (6,8 g natriumacetaattrihydraat 30 en 14,6 g NaCl werden in 500 ml gedestilleerd water dat 2,9 ml ijsazijn, pH 4,0 bevatte opgelost), twee wassingen in koppelingsbuffer en twee wassingen in PBS. De gel werd in een Pharmacia C10/10 kolom geschonken en tot aan gebruik bij 4°C opgeslagen.

Voor het zuiveren van het immunoglobuline werd 0,5 ml van zout 35 gefractioneerd materiaal, tot 2,0 ml in PBS verdund toegevoegd aan de affiniteitskolom. Na de monsterlading werd de kolom gewassen met PBS, 8700286 m -31- pH 8,0 tot de absorptie-monitor geen verder proteïne in de doorstroom aangaf. Het gebonden antilichaam werd met 2 mM MgCl in PBS geêlueerd, de protelneconcentratie werd voor elke fraktie bij O.D. vastgesteld en de piekfrakties samengevoegd. De antilichaam-bevattende fraktie werd ont-5 zout over een G-25 Sephadexkolom en zonodig geconcentreerd door micro-concexitratiecentrifugering (Centricon 30, Amicon Corp., Danver, MA) tot 1-2 mg/ml. Het eindpreparaat werd op zuiverheid onderzocht door SDS-poly-acrylamide-gelelektroforese gevolgd, door zilvernitraatkleuring van proteïnen (J.H. Morrissey, "Silver Stain for Proteins in Polyacrylamide 10 Gels: A Modified Procedure with Enhanced Uniform Sensitivity", Anal.

Biochem. (1981) 117:307-310), en op antilichaamactiviteit door een ELISA als hierin vermeld.

Voor elke bacteriële besmetting werden vrouwtjes Swiss-Webster muizen met een gewicht tussen 20 en 22 g in drie groepen van elk 10 mui-15 zen verdeeld. Een representatief experiment werd als volgt uitgevoerd:

Groep Bacterie Antilichaam A E. coli 08 7D7 B E. coli 08 6F11 C S. marcescens 014 7D7 20 Elke groep die antilichaam ontving werd intraveneus geïnjecteerd met 200 yl steriel PBS dat 25 yg gezuiverd antilichaam bevatte. 2 Uur later werden alle dieren intraperitoniaal besmet met 300 yl levende bacteriën die 3 LD5q van hun respectievelijke bacteriële stam bevatte. De bacteriële suspensie was bereid uit een beslagkweek in de logaritmische groei-25 fase, waaruit de bacteriën waren gecentrifugeerd, tweemaal in PBS gewassen en opnieuw gesuspendeerd tot de gewenste concentratie van PBS.

De dieren werden gedurende een periode vijf dagen waargenomen. 24-48 Uur na de besmetting waren alle dieren in groep B (irrelevant antilichaam) en in groep C (niet-irrelevant organisme) dood. In tegenstelling daarmede 30 waren die dieren die het 7D7 (groep A) antilichaam hadden ontvangen alle levend en zonder symptomen. Dit dierbeschermingsmodel werd toegepast voor het demonstreren van het therapeutische effect van het 7D7 antilichaam tegen bacteriële besmetting met organismen die behoren tot de drie hierin gemelde genera.

8700286 -32-

Een samenvatting van de gegevens is gegeven in tabel B.

• TABEL B

Besmettingsbacterie Overlevend Besmetting % Overlevenden antilichaam _ ______ E. coli 08 7D7 10/10 100 5 E. coli 08 6Flia 0/10 0 T- £3. marcescens 014 7D7 0/10 0 a 6F11 antilichaam is specifiek voor Pseudomonas aeruginosa

Fisher immunotype 2 en dient als een negatief controle antilichaam.

S. marcescens 014 is niet reactief met het 7D7 antilichaam en 10 dient als een aspecifiek controle organisme.

TABEL Ba

' Q

% Overlevenden ; dag

Antilichaam 0_1_2_3_4 6F11 12 2 2 1 1 15 7D7 12 10 6 4 4 C LD^q's en beschermingsstudies werden met muizen die neutropeen waren gemaakt door injectie met cyclofosfamide als volgt uitgevoerd:

Dag 0 - 150 mg/kg, dag 2 - 50 mg/kg. Op dag 4 ontvingen de muizen antilichaam en bacteriën als hierin beschreven.

20 Deze gegevens demonstreren dat het humane.monoklonale antilichaam 7D7 in. staat is muizen tegen lethale besmetting met bacteriën behorende tot drie verschillende gram-negatieve bacteriële soorten te beschermen. Omdat 7D7 reactief is met een koolhydraatepitoop dat op LPS aanwezig is, maar LPS-moleculen op K. pneumoniae minder toegankelijk zijn (I. Orskov 25 en F. Orskov, "Serotyping of Klebsiella" in Methods in Microbiology,

Vol. 14, T. Bergan, üitg. Academie Press, Orlando, FL (1984) 143-146) was bescherming door het 7D7 antilichaam tegen K. pseudomoniae infecties niet evident (gegevens niet getoond). Niettemin was het intergenus kruis-reac-tieve humane monoklonale antilichaam 7D7 in staat met 5 pg gezuiverd 30 antilichaam bescherming te verlenen tegen infectie-organismen die behoren tot de gram-negatieve bacteriële stammen E. coli en E. aerogenes.

§700286 « -33-

VOORBEELD II

Voorbeeld II demonstreert methoden voor de produktie en selectie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactiviteit ten opzichte van leden van de soort Serratia marcescens, Klebsiella pneu-5 moniae en Enterobacter aerogenes bezit. Verder demonstreert dit voorbeeld de in vitro opsonische activiteit van genoemd antilichaam tegen homologe S. marcescens, K. pneumoniae en E. aerogenes serotypes. De werkwijze van voorbeeld I (in wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald ter produktie van een humaan monoklonaal antilichaam dat kruis-reactief was 10 tegen infecties veroorzaakt door de hierin beschreven bacteriën, met uitzondering dat het noodzakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld beschreven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen wijzigingen in de analyseprocedures alsmede de resultaten verkregen met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

15 1. Kweekbovenlagen uit 6 transformaties werden volgens de boven staande methode geanalyseerd hetgeen resulteerde in de identificatie van een cupje (4F10) dat activiteit ten opzichte van de S. marcescens sero-typeplaat bezat maar niet ten opzichte van de E. coli of controleplaat.

In aansluitende ELISA1s werd met individuele S. marcescens serotypes vast-20 gesteld dat dit cupje antilichaam bevatte dat reactief was met de J>. marcescens serotypes 015 en 018, maar niet met één van de andere 20 bekende £3. marcescens LPS serotypes. Vóór de indiening van deze octrooiaanvrage werd de continu getransformeerde humane cellijn, geïdentificeerd als 4F10, gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, Rockville, 25'. MD als A.T.C.C. nr. CRL 9007.

2. Antilichaam uit de gekloneerde 4F10 cellijn werd geanalyseerd op verdere intergenus kruis-reactiviteit door een modificatie van de standaard immuno-membraandeklaagtechniek. In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën K. pneumoniae, E. aerogenes 30 en E. cloacae onderzocht door bacteriën op eeri nitrocellulose-papierschijf met roosters aan te stippen, de schijf met de bacteriën.in reactie te brengen met genoemd antilichaam en de antilichaamreacties met een alkalisch fosfatase/nitroblauw tetrazoliumenzymsysteem te ontwikkelen.

Uit deze experimenten werd waargenomen dat het 4F1Q antilichaam 35 verdere intergenus kruis-reactiviteit bezat. Dit antilichaam reageerde met de volgende serotypes: 8700236 -34- K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K3,12,29,31,68,72 015, 018 Klinische isolaten

Aldus bezat het humane monoklonale antilichaam 4F10 intergenus kruis-reactiviteit ten opzichte van bacteriën die behoren tot de soort 5 S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes.

3. Met de immunodeklaagtechniek werden positieve reacties in alle sporen die deoxycholaatextracten van de hierin beschreven bacteriën bevatte opgemerkt. In deze sporen bleek 4F10 antilichaam hetzij een brede band van komponenten of een reeks van regelmatig op afstand staande 10 moleculaire eenheden, die aanleiding gaven tot een ladderachtig patroon, te herkennen. Dit profiel was geheel gelijk met dat waargenomen in poly-acrylamide-gelelektroforetische analyses van koolhydraateenheden, die hetzij intensieve molecuulgewichtsheterogeniteit veroorzaakt door een dikwijls zich herhalende specifieke suikervolgorde demonstreren of ten 15 opzichte van LPS-moleculen die verschillen in gewichtsincrementen equivalent aan het aantal O-antigene oligosaccharide zijketeneenheden per molecuul (E.R. Vimr et al, "Use of Procaryotic-Derived Probes to Identify Poly (Sialic Acid) in Neonatal Neuronal Membranes", Proc. Natl. Acad. Sci., (1983) 81:1971:1975, en K.G. Holden et al, "Gel Electrophoresis 20 of Mucous Glycoproteins, I. Effect of Gel Porosity", Biochemistry (1971) 10:3105-3109). Deze gegevens tonen aan dat het monoklonale antilichaam 4F10 gericht is tegen een antigene determinant gemeenschappelijk aan de koolhydraatmoleculen die men aantreft op sommige serotypes van S. marces-senc, K. pneumoniae en E. aerogenes.

25 De immuno-membraanpatronen waargenomen na de Proteinase K behan deling waren identiek aan die patronen waargenomen zonder behandeling, waardoor aldus wordt gesuggereerd dat het antigeen dat reactief is met het 4F10 antilichaam van aard geen proteïne is. Om specifiek na te gaan of 4F10 reageerde met koolhydraatepitoop werd het elektro-overgedragen 30 deoxycholaat-monster onderworpen aan een milde perjodaatoxydatie alvorens het nitrocellulosepapier met antilichaam in reactie te laten treden.

De op deze wijze behandelde door de elektro-membraantechniek verkregen deoxycholaatextracten waren niet langer reactief met het 4F10 monoklonale antilichaam. Deze gegevens zijn een sterke aanwijzing dat de epitoop die 35 door dit antilichaam wordt herkend een koolhydraateenheid is die op moleculen, die de hierin beschreven bacteriën bevatten, aanwezig is.

8700286 -35- 4. Het isotype van het 4F10 monofclonale antilichaam werd vastgesteld in een ELISA-procedure gelijk aan de specificiteitsproeven als beschreven in voorbeeld I met uitzondering dat de antigeenplaat een samenvloeiing van PLL geïmmobiliseerde S. marcescens 015 en 018 serotypes bevatte.

5 De positieve reactie van het 4F10 monoklonale antilichaam met de S.. marcescens serotypes werd alleen waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat indien de werkwijze van dit voorbeeld verschillende malen zal worden herhaald en de isotypes van de aldus ver-10 kregen intergenus kruis-reactieve monoklonale antilichamen zouden worden vastgesteld men extra isotypes zou aantreffen, bijvoorbeeld IgM en IgG isotypes.

5. De in vitro functionele activiteit van het 4F10 monoklonale anti lichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bac-15 tericide activiteit van het antilichaam in afwezigheid en aanwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken.

De hierin toegepaste bacteriële serotypes werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 4F10, een actieve complement-bron en humane neutrofielen (tabel C). Bij herhaling van deze proef met 20 verschillende niet-4F10 reactieve bacteriële vernietiging waargenomen (gegeven niet weergegeven), hetgeen aldus de functionele specificiteit van monoklonaal antilichaam 4F10 en zijn capaciteit voor het opsoniseren van bacteriën en het bevorderen van het fagocytose demonstreert.

8700286 -36-

TABSL C

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van _ fielen lichaam _ ingebrachte bacterie S. marcescens „ a 018 en 015 S. marcencens b 018 en 015 S. marcescens , n Ö18 en 015 - 7D7 + 0 s. marcescens + 7D7 + 85% 018 en 015 K. pneumoniae , 7D7 _ n K3 en KI2

Pne,ujnonia_e K3 en K12

K. pneumoniae Q

K3 en KI 2 K. pneumoniae + ?D7 + 60% K3 en KI2 E. aerogenes + 7D7 . o

Isolaten (2) . I- fS£2S=2|£ + ail + o

Isolaten (2)

E. aerogenes _ 7D? + Q

Isolaten (2) E. aencgeaei + 7D7 + 85i

Isolaten (2) a (-) = warmte-geïnactiveerd (56°C gedurende 30 minuten) humaan complement.

}d (6F11) = kweekbovenlaag die een IgM humaan monoklonaal antilichaam ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 bevatte.

8700286 -37-

VOORBESLD III

Voorbeeld III demonstreert methoden voor het produceren van een humaan monoklonaal antilichaam dat reactief is met zowel het Escherichia coli capsulaire type Kl als Neisseria meningitidis groep B polysaccha-5 ride en het demonstreert verder de beschermende activiteit van genoemd antilichaam in vivo tegen een lethale besmetting van homologe E. coli en N. meningitidis bacteriêle soorten. De werkwijze van voorbeeld I (in wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald ter bereiding van een humaan monoklonaal antilichaam dat kruis-beschermend was ten opzichte 10. van infecties veroorzaakt door de hierin beschreven bacteriën met uitzondering dat het noodzakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld beschreven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen de wijzigingen in de analyseprocedures en de resultaten verkregen met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

15 1. Kweekbovenlagen uit vijf transformaties werden door de bovenstaan de methode geanalyseerd hetgeen resulteerde in de identificatie van 4 cupjes (5D4, 2C10, 9B1Q en 8A8) die anti-E. coli specificiteit op de E. coli serotypeplaat bevatten maar niet op de S. marcescens of controleplaten. Er werd in ELISA1s, uitgevoerd als reeds beschreven, aan indivi-20 duele E. coli serotypes, vastgesteld dat deze cupjes antilichaam bevatten dat reactief was met tenminste de E. coli serotypes: 01 (A.T.C.C. 23499), 07:K1 (A.T.C.C. 12792), 016-.K1 (A.T.C.C. 23511) en 050 (C.D.C. 1113-83), maar niet 04 (A.T.C.C. 12792), 06:K2 (A.T.C.C. 19138), Q8:K8 (A.T.C.C. 23501), 09:K9 (A.T.C.C. 23505) of 022:K13 25· (A.T.C.C. 23517). Vanwege zijn betere prestaties gedurende de klonerings-procedure en verhoogde antilichaamproduktie werd het 9B10 monoklonale antilichaam voor verdere analyse geselecteerd. Vóór de indiening van deze octrooiaanvrage werd de continu getransformeerde humane cellijn, hierin geïdentificeerd als 9B1Q, gedeponeerd bij de American Type Culture 30 Collection, Rockwille, MD, als A.T.C.C. nr. CEL 9006.

2. De vondst dat de monoklonale antilichamen uit elk van de klonen reageerden met de identieke groep van E. coli O-antigeen serotypes wees erop dat deze antilichamen gericht waren tegen een bacteriêle oppervlaktestructuur die aan deze serotypes gemeenschappelijk was. Verscheidene bena-35 deringen werden toegepast om de aan deze E. coli serotypes gemeenschappelijke oppervlaktestructuur vast te leggen. Als hierin vermeld bezaten 8700286 -38- twee (O,7:KI en 016:KI) van de vier E. coli serotypes geïdentificeerd door het 9B10 antilichaam het KI capsulaire serotype, terwijl de andere twee (01 en 050) niet door hun K-antigeen serotype waren getypeerd. Aldus werd de mogelijkheid nagestreefd dat het 9B10 antilichaam reactivi-5 teit ten opzichte van het KI antigeen bevatte en dat de E. coli-stammen , die de O-antigeen serotypes 01 en 050 bevatten, tevens het KI capculaire serotype bezaten.

Anderen hebben voordeel getrokken uit de thermolabiliteit van de KI capsule om zijn aanwezigheid vast te stellen. Door verhitting van KI 10' positieve E. coli serotypes in een kokend waterbad bij 100°C gedurende 60 minuten wordt de aansluitende capaciteit van deze stammen om in reactie te treden met anti-Kl sera weggenomen en hun vermogen tot reactie met anti-0 antigeen sera versterkt (F. Orskov en I. Orskov, "Serotyping of Escherichia coli", in Methods in Microbiology, deel 14, T. Bergan, üitg.

15 Academie Press, Londen (1984) blz. 44-105). De omgekeerde effecten van het koken zijn met de meeste waarschijnlijkheid veroorzaakt door de verwijdering van de capsule en de verhoogde toegankelijkheid van het antilichaam voor lipopolysaccharide (LPS) moleculen. De E. coli KI positieve serotypes (07 en 016) en de niet-Kl getypeerde serotypes (01 en 050) 20 werden als vermeld verhit en in reactie gebracht met het 9B10 antilichaam en LPS serotype specifieke heterologe sera (Difco Bacto-E. coli typerende reagentia) in de ELISA-procedure. Verhitte organismen verloren alle reactiviteit ten opzichte van het 9B10 antilichaam en hadden een verhoogde reactiviteit met hun homologe LPS serotype specifieke sera, terwijl niet-25 behandelde (controle)organismen sterk reactief bleven met 9B10 kweekboven-lagen en gering reactief met hun respectievelijke LPS serotype specifieke antisera.

Het polysaccharide (koolhydraat) uit Neisseria meningitidis groep B bacteriën (een homopolymeer van sialinezuur, alfa 2, 8-gekoppeld poly-30 N-acetylneuraminezuur) bleek chemisch en antigenisch homogeen te zijn met E. coli KI polysaccharide 0. Grades en W.H. Ewing, "Antigenic Relationship between Escherichia coli and Neisseria meningitidis", J. Immunol. (1973) 110:262-268). Deze gegevens suggereren dat indien het 9B1Q mono-klonale antilichaam specificiteit ten opzichte van E. coli KI capsule 35 bezit dat dan het antilichaam tevens specificiteit ten opzichte van

N. meningitidis groep B polysaccharide zal bezitten en dat verder mono-klonale antilichamen die specificiteit ten opzichte van het groep B

8790286 -39- polysaccharide van N. meningitidis bezitten tevens een reactiviteit ten opzichte van E. coli-stammen, die de KI capsule bezitten, demonsteren.

Er werden twee experimentele protocollen toegepast waarbij werd getest op (1) het vermogen van het 0B10 antilichaam tot reactie met N. meningi-5 tjdis en (2) het vermogen van een antilichaam tegen N. meningitidis groep B polysaccharide tot reactie met de vier E. coli 9B10 reactieve serotypes.

Sterk gezuiverd groep B polysaccharide (Connaught Laboratories Toronto, Canada) en levende N. meningitidis groep B bacteriën werden met 10 het 9B10 antilichaam in een ELISA als reeds vermeld gereageerd. Eet 9B10 monoklonale antilichaam reageerde sterk ten opzichte van beide antigeen-preparaten. Om de omgekeerde specificiteit te bewijzen werd een in de handel verkrijgbare N. meningitidis groep B Meningitidis Testkit ("Directagen" Direct Antigen Detection System, Hynson, Westcott en 15 Dunning, Baltimore, MD), toegepast, waarbij gebruik wordt gemaakt van latexbollen bekleed met een murine-monoklonaal antilichaam ten opzichte van het groep B polysaccharide. In agglutineringsanalyses onder toepassing van 9B10 positieve E. coli serotypes, demonstreren alle vier serotypes een sterke reactiviteit met de met antilichaam beklede bollen.

20 E. coli serotypes waarvan bekend is dat zij Kl-antigeen negatief zijn waren tevens in dit proefsysteem negatief. Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat het 9B10 monoklonale antilichaam reactief is met de E.coli KI capsule en het type-specifieke koolhydraat aan de N. meningitidis groep B. Aangezien vele van deze analyses met intakte levende bacteriën wer-25 den uitgevoerd kan men verder daaruit afleiden dat monoklonaal antilichaam 9B10 specifiek is voor een bepaald deel van een uitwendig vrij-liggend gebied van het poly-sialinezuur molecuul.

3. Het isotype van het 9B10 monoklonale antilichaam werd vastgesteld in een ELISA-procedure gelijk aan de specificiteitsproeven als beschreven 30 in voorbeeld I met de uitzondering dat de antigeenplaat een samenvloeiing van PLL geïmmobiliseerde E, coli KI positieve serotypes bevatte.

De positieve reactie van het 9B10 monoklonale antilichaam met de Kl positieve E. coli serotypes werd alleen waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert.

35 Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat indien de werkwijze van deze uitvinding verschillende malen zou worden herhaald en de isotypes van de 8700285 "1 -40- a-ldus verkregen KI specifieke monoklonale antilichamen zouden worden vastgesteld, men extra isotypen zou vinden, bijvoorbeeld IgM en IgG iso-types.

4. De in vitro functionele activiteit van het 9B10 monoklonale anti- 5 lichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bacteriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en afwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken. KI positieve E. coli serotypes werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 9B1Q, een actieve complementbron en 10 humane neutrofielen (tabel D). Bij herhaling van deze proef met verscheidene KI negatieve E. coli serotypes werd geen bacteriële vernietiging waargenomen (gegevens niet getoond) hetgeen aldus de KI specificiteit · van monoklonaal antilichaam 9B10 en zijn capaciteit bacteriën te opsoni-seren en hun fagocytose te bevorderen demonstreert. Aangezien de gecombi-15 neerde werking van opsoninen (specifieke antilichamen) en polymorfonu-cleaire leukocyten (neutrofielen) het hoofdmechanisme blijkt te zijn voor de immuniteit ten opzichte van KI positieve E. coli serotypes, suggereren deze gegevens dat antilichaam 9B10 na geschikte toediening bescherming zal leveren tegen een lethale besmetting met alle E. coli KI 20 ingekapselde serotypes, ongeacht zijn O-antigeen serotype.

8700236

-41-TABEL D

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van _ fielen lichaam _ ingebrachte bacterie .

Ξ. coli 01:KI a en 018:KI + 9B10 ” 0 E. coli 01:KI b en 018: KI + 6F11 + 0

E. coli 01:KI

5 ën ÖÏÏTki - 9610 + 0 °lsK1 + 910B + 99%

en 018: KI

N. meningitidis + 910B _ 0

Groep B

N. meningitidis + 6F11 + 0

Groep B

N. meningitidis . 9B10 + 0

Groep B

10 + 9B10 + 99%

Groep B

a (-J = warmte-gelnactiveerd (56°C gedurende 30 minuten) humaan complement.

^ (6F11) = kweekbovenlaag die een IgM humaêin monoklonaal antilichaam ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 bevatte.

5. Om de bovenstaande hypothese te staven worden dierbeschermings- proeven uitgevoerd met het 9B10 antilichaam en verscheidene KI positieve en Kl negatieve E. coli serotypes, alsmede een N. meningitidis groep B serotype (stam H313, verkregen van Dr. Carl Frasch, Laboratory 20 of Bacterial Polysaccharides, Office of Biologies, Food and Drug Administration, Bethesda, MD).

8700286 < * -42-

Voor elke bacteriebesmetting werden vrouwtjes Swiss-Webster muizen met een gewicht tussen 20 en 22 gram in drie groepen van elk 10 muizen verdeeld. Een representatief experiment werd als volgt uitgevoerd: 5 Groep Bacterie Antilichaam A E. coli KI 9B10 B E. coli KI 6F11 C E. coli K2 9B10 'Elke groep die antilichaam ontving werd intraveneus geïnjecteerd met 10. 2Q0 μΐ steriel PBS dat 25 pg gezuiverd antilichaam bevatte. 2 Uur later werden alle dieren intraperitoniaal besmet met 300 μΐ levende bacteriën die 2 LD5q van hun respectieve bacteriële stam bevatten. De bacteriële suspensie was bereid uit een beslagcultuur in de logaritmische groeifase, waaruit de bacteriën waren gecentrifugeerd, tweemaal gewassen in PBS en 15 opnieuw gesuspendeerd tot de geschikte concentratie van PBS. De dieren werden gedurende een periode van vijf dagen waargenomen. 24-48 Uur na de besmetting waren alle dieren in groep B (irrelevant antilichamen) en groep C (irrelevant organisme) dood. In tegenstelling daarmede waren die dieren die het 9B10 (groep A) antilichaam hadden ontvangen allen levend 20 en vrij van symptomen.

Dit dierbeschermingsmodel werd toegepast voor het demonstreren van het therapeutisch effect van het 9B10 antilichaam tegen bacteriële besmetting met organismen die de twee hierin genoemde soorten behoren. Een samenvatting van deze gegevens wordt in tabel E aangegeven.

25 TABEL E

Besmettingsbacterie Antilichaam Overlevenden % Overlevenden _ _ besmetting _ E. coli KI 9B10 10/10 100% E. coli· KI 6Flia 0/10 0% E. coli K2b 9B10 0/10 0% 30 N. meningitidis Groep B 9B10 5/5 100% N. meningitidis Groep B 6F11 0/5 0% E. coli K2 9B10 0/5 0% a 6F11 antilichaam is specifiek ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher immunotype 2 en dient als negatief con-35 , troleantilichaam E. coli K2 is niet reatief met het 9B10 antilichaam en dient als niet-specifieke controleorganismen.

8700288 * -43-

Deze gegevens demonstreren dat het humane mohoklonale antilichaam 9B10 in staat is muizen tegen een lethale besmetting met bacteriën, die behoren tot twee verschillende gram-negatieve bacteriesoorten te beschermen. Het intergenus kruis-beschermende antilichaam was in staat passieve 5 bescherming te verlenen tegen infectie door organismen die behoren tot de gram-negatieve bacteriesoorten E. coli en N. meningitidis groep B.

VOORBEELD IV

Voorbeeld IV demonstreert methoden voor de produktie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactiviteit tegen 10, leden van de soort Escherichia coli (E. coli) Enterobacter cloacae (E. cloacae) en groep B Streptococcus bezit. Verder demonstreert dit voorbeeld een antilichaam dat kruis-reactief is met soorten behorende tot de twee hoofdbacterie-afdelingen; gram-negatief (E. coli en E. cloacae) en gram-positief (groep B Streptococcus). Verder demonstreert dit voorbeeld 15 zelfs de in vivo beschermende activiteit van genoemd antilichaam tegen een lethale besmetting van homoloog E. coli en groep B Streptococcus serotypes.

De werkwijze van voorbeeld I (in wezen beschreven in delen A-G) werd herhaald voor de produktie van het humane monoklonale antilichaam dat kruis-bechermend was tegen infecties veroorzaakt door de hierin beschreven 20 bacteriën, met de uitzondering dat het noodzakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld beschreven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen wijzigingen in de analyse-procedures en de resultaten verkregen met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

25; 1. Bovenlagen werden uitgeselecteerd op de aanwezigheid van anti- groep B Streptococus antilichamen met behulp van een enzym-gekoppelde immunosorbensanalyse (ELISA)-techniek als beschreven in voorbeeld I. De antigeenplaten bestaande uit een reeks van Immunolon 2 plattebodem-micro-titerplaten met 96 cupjes, waarvan de cupjes mengsels van groep B Strepto-30 coccen capsuletypes vastgemaakt aan de cupjesoppervlakken met poly-L- lysine (POL) bevatten. De gedurende het onderzoek toegepaste verschillende antigeenplaten omvatten: (1) een mengsel van groep B Streptococcus types Ia (A.T.C.C. nr. 12400),

Ib (A.T.C.C. nr. 12401), Ic (A.T.C.C. nr. 27591); (2) een mengsel van 35 types II (A.T.C.C. nr. 12973) en III (klinisch isolaat verkregen van Dr. C. Wilson, Orthopedisch Kinderziekenhuis, afdeling infectieziekte, -mmSShi 8700286 H * -44-

Seattle, WA); en (3) een microtiterplaat zonder bacteriën. Kweekbovenlagen uit twee transformaties werden volgens de bovenstaande methode geanalyseerd, hetgeen resulteerde in identificatie van één cupje (4B9) dat activiteit ten opzichte van beide groepen B Streptococcus en typerende platen 5 bezat, maar niet ten opzichte van de controleplaten. Vastgesteld werd in opvolgende ELXSA's met individuele groep B Streptococcus types dat dit cupje antilichaam bevatte dat reactief was in alle vijf referentie typerende stammen.

Aldus werd in dit experiment één gekloneerde getransformeerde 10 humane cellijn verkregen die continu (onsterfelijk) is en een humaan mono-klonaal antilichaam ten opzichte van een determinant op het oppervlak van de groep B Streptococcus types als vermeld afgeeft.

Vóór de indiening van deze octrooiaanvrage werd de continu getransformeerde humane cellijn geïdentificeerd als 4B9 gedeponeerd bij de 15 American Type Culture Collection, Rockville, MD als A.T.C.C. nr. CRL 9008.

2. Antilichaam uit de gekloneerde 4B9 cellijn werd geanalyseerd op kruis-reactiviteit ten opzichte van gram-negatieve en gram-positieve bacteriën volgens een modificatie van de standaardimmuno-membraantechniek 20 ("blotting"). In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën E. coli, K. pneumoniae, _S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Hemophilus influenzae en Staphylococcus aureus nagegaan door bacteriën op een nitrocellulose-papierschijf met roosters aan te stippen, de schijf die de bacteriën bevat met genoemd antilichaam in reactie te 25'·· brengen en de antilichaam-reacties met een alkalische fosfatase/nitro-blauw tetrazoniumenzymsysteem te ontwikkelen (als beschreven in voorbeeld I). Uit deze proeven werd opgemerkt dat 4B9 antilichaam kruisreactiviteit met bepaalde gram-negatieve bacteriële soorten bezat. Dit antilichaam reageerde met de E. coli LPS serotypes 04, 07, 018 en 025 en de E. cloacae 30 klinische isolaten. Aldus bezit het humane monoklonale antilichaam 4B9 kruis-reactiviteit tussen de gram-negatieve en gram-positieve bacteriën die behoren tot de soorten E. coli, E. cloacae en groep B Streptococcus.

3. De vondst dat het monoklonale antilichaam in kruis-reactie trad met verschillende bacteriële genera die behoorden tot zowel gram-positieve 35 als gram-negatieve bacteriële afdelingen suggereerde dat het antilichaam was gericht tegen een gemeenschappelijk proteïne of koolhydraat. De biochemische karakterisering van de moleculaire soort herkend door het 4B9 8700286 -45- antilichaam werd tot stand gebracht door immunomembraananalyse. Voor de analyse van de graxn-negatieve genera werden gewassen bacteriën in deoxycholaat geëxtraheerd als beschreven in voorbeeld I. Voor de gram-positieve bacteriën werd 1,0 liter bacteriën gedurende 6 uur gekweekt in 5 gemodificeerd Todd-Hewitt beslag (Difco, Todd-Hewitt beslag dat 2,8 g/1 watervrij natriumfosfaat bevatte, pH 7,8) bij 37°C gewonnen door centrifugering en driemaal in PBS gewassen. De bacteriën werden opnieuw gesuspendeerd in 85 ml protoplastmedium (40% saccharose w/v in 0,03 M kalium-fosfaatbuffer, pH 6,8 dat 10 mM MgCl2 bevatte) en de suspensie werd gedu-10 rende 10 minuten op 37°C verarmd. Er werden bij benadering 3000 eenheden van het mutanolysine (SIGMA) toegevoegd en het mengsel werd gedurende 30 minuten bij 37°C geschud nadat de 0Dgë0 van de suspensie met meer dan 90% was verminderd. Het ontsloten materiaal werd met 2000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd en de bovenlaag werd ge-15 dialyseerd tegen PBS gedurende 48 uur (M.K. Young en S.J. Mattingly, "Biosynthesis of Cell Wall Peptidoglycan and Polysaccharide Antigens by Protoplasts of Type III Group B Streptococcus", J. Bact., (1983) 154: 211-220). Het dialysaat werd tienvoudig door positieve drukdialyse door een PM-10 filter geconcentreerd (Amicon Corp., Danvers, MA)-20 Koolhydraten die binden met tarwekiemagglutamine werden gezuiverd door affiniteitschromatografie over een tarwekiemlectine Sepharose 6MB kolom (SIGMA). Het gebonden ontsloten produkt als hierin beschreven werd uit de kolom geëlueerd met 10 ml 0,1 M N-acetylglucosamine en het eluaat werd bij 4°C tegen gedestilleerd water gedialyseerd. Het affiniteits-25 gezuiverde eluaat werd gevriesdroogd en het droge gewicht van het verkregen materiaal werd verkregen (B.M. Gray et al, "Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinin and Other Lectins", J. or Immunol Meth., (1984) 72:269-277). Er werden in alle sporen die deoxycholaatextracten van hierin beschreven bacteriën 30 bevatten positieve reacties waargenomen. In die sporen die extracten van gram-negatieve bacteriën bevatten bleek het 4B9 antilichaam een reeks van regelmatig op afstand staande moleculaire eenheden te herkennen, hetgeen aanleiding gaf tot een ladderachtig patroon op de immunolaag. Dit profiel was geheel in overeenstemming met dat waargenomen bij polyacrylamidegel-35 elektroforeseanalyse van EPS in aanwezigheid van SDS, waar was gedemonstreerd dat het door de banden getoonde heterogene maatprofiel toegeschre- 8700286 * * -46- veit kan worden aan een populatie van LPS-moleculen die in gewichtsincre-menten equivalent aan het aantal O-antigene oligosaccharide zijketeneenheden die per molecuul aanwezig zijn verschillen (E.T. Pavla en P.H. Makela, supra en R.D. Goldman en L. Leive, supra). In die sporen 5 die extracten van de groep B Streptococcus types bevatten bleek het 4B9 antilichaam komponenten aanwezig op een brede band te herkennen. Dit profiel was in overeenstemming met dat waargenomen in polyacrylamide gel-elektroforeseanalyses van koolhydraateenheden die een intensieve mole-cuulgewichtsheterogeniteit met een frequent zich herhalende specifieke 10; suikervolgorde demonstreren (E.R. Vmir et al, supra en K.G. Holden, supra). Deze gegevens geven de aanwijzing dat het monoklonale antilichaam 4B9 gericht is tegen een antigene determinant die gemeenschappelijk is aan moleculen aangetroffen op sommige serotypes van E. coli, E. cloacae en groep B Streptococcus.

15 Ter verdere definitie van de moleculaire aard van het antigeen werden deoxycholaatextracten vóör hun elektroforese behandeld met proteo-lytisch enzym Proteinase K (W. Eberling, supra). De immunopatronen waargenomen na de Proteinase K behandeling waren identiek aan die patronen waargenomen zonder behandeling en zij suggereren aldus dat het antigeen, 20 reactief met het 4B9 antilichaam, geen proteïne van nature is. Om specifiek na te gaan of 4B9 reageerde met een koolhydraatepitoop werden het via de elektromembraantechniek overgebrachte deoxycholaat en tarwekiem-agglutinering-affiniteitsgezuiverde monsters aan een milde perjodaatoxy-datie onderworpen voorafgaande aan de reactie van het nitrocellulose-25- papier met antilichaam (zie voorbeeld I) . De met de elektromembraantechniek verkregen op deze wijze behandelde deoxycholaatextracten waren langer reactief met het 4B9 monoklonale antilichaam. Deze gegevens zijn een sterke aanwijzing dat epitoop herkend door dit antilichaam een koolhydraat-eenheid is die in de moleculen van zowel de gram-negatieve en gram-posi-30 tieve bacteriën als hierin beschreven aanwezig is.

4. Het isotype van het 4B9 monoklonale antilichaam werd vastgesteld in een ELISA-procedure gelijk aan de specificiteitsproeven als boven beschreven met uitzondering dat de antigeenplaat een samenvloeiing van PLL geïmmobiliseerde groep B Streptococcus types II en III bevatte. Er werd 35 alleen een positieve reactie van het 4B9 monoklonale antilichaam met de groep B Streptococcus-stammen waargenomen met het anti-IgM reagens, het- 8700286 «> -47- geen een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert.

5. De in vivo functionele activiteit van het 4B9 monoklonale anti lichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bacteriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en afwezig-5 heid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken. De hierin toegepaste bacteriële stammen werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 4B9, een actieve complementbron en humane neutrofielen (tabel P). Bij herhaling van dit experiment met verschillende niet-4B9 reactieve bacteriële serotypes, werd geen bacte-10' rievernietiging waargenomen (gegevens niet weergegeven) hetgeen aldus de functionele specificiteit van monoklonaal antilichaam 4B9 en zijn capaciteit bacteriën te opsoniseren en hun fagocytose te bevorderen demonstreert. Aangezien de gecombineerde werkingen van opsoninen (specifieke antilicha-men> en polymorfonuclaire leukocyten (neutrofielen) het belangrijkste 15 mechanisme voor immuniteit ten opzichte van deze bacteriële stammen blijkt te zijn, suggereren deze gegevens dat antilichaam 4B9, na passende toediening, bescherming zou verlenen tegen lethale besmettingen met de hierin beschreven bacteriestammen.

20 8700206 4 + -48-

TABEL F

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van __ fielen lichaam _ ingebrachte bacterie + 4B9 -a 0 018 en 025 + 6Fllb + 0 018 en 025 £2Ü 4B9 + 0 018 en 025 |Tq—HOC + 4B9 + 85% 018 en 025 E. cloacae + 4B9 - 0

Isolaten |· + 6P11 + 0

Isolaten E. cloacae „ „ _ - - - 4B9 + 0

Isolaten E. cloacae , _ - ---° + 4B9 + 85%

Isolaten

Groep B Strep. ' + 4B9 - 0

Typen Ia en III

Groep B Strep. + 6P11 + 0

Typen Ia en III

Groep B Strep. _ 4B9 + 0 -

Typen Ia en III

Groep B Strep. + 4B9 + 85%

Typen Ia en III

a (-) = warmte-geïnactiveer (56°C gedurende 30 minuten) humaan complement.

y.

(6F11) = kweekbovenlaag die een IgM humaan monoklonaal anti-lichaam ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 bevatte.

8700286 t -49- 6. Voor het testen van de bovenstaande hypothese werden dierbe- schermingsproeven met het 4B9 antilichaam en ten minste één organisme uit elke hierin beschreven genus uitgevoerd.

Voor elke gram-negatieve beacteriebesmetting werden vrouwtjes 5 Swiss-Webster muizen met een gewicht tussen 20 en 22 gram verdeeld in drie groepen van elk tien muizen. Een representatief experiment werd als volgt uitgevoerd.

Groep Bacterie Antilichaam A E. coli 018 4B9 IQ B E. coli 018 6F11 C s. marcescens 014 4B9

Elke groep die antilichaam ontving werd met 200 μΐ steriel PBS dat 25 yg gezuiverd antilichaam bevatte intraveneus geïnjecteerd. 2 Uur later werden alle dieren intraperitoniaal besmet met 300 μΐ levende bacteriën 15 die 3 LDjq van hun respectievelijke bacteriêle stam bevatten. De bacte-riële suspensie was bereid uit een bouillonkweek in de logaritmische groeifase, waaruit de bacteriën waren gecentrifugeerd, tweemaal gewassen in PBS en opnieuw gesuspendeerd tot een geschikte concentratie van PBS.

De dieren werden gedurende een periode van vijf dagen waargenomen.

20 24-48 Uur na de besmetting waren alle dieren groep B (irrelevant anti lichaam) groep C(irrelevant organisme) dood. In tegenstelling daarmede waren die dieren die het 4B9 (groep A) antilichaam hadden ontvangen alle springlevend en zonder symptomen.

Voor de groep B Streptococcus beschermingsstudies werd een neona-25' taal rattemodel toegepast. Gekweekte Sprague-Dawley rattenjongen (bij hun moeders) minder dan 48 uur oud ontvingen antilichaam en bacteriën in wezen als beschreven voor de muizenbeschermingsstudies. De primaire verschillen waren als volgt: 1) zowel de antilichamen als bacteriêle besmettingen werden intraperi-30 toneaal geïnjecteerd en 2) de inoculumgrootte werd tot 20 μΐ verlaagd.

Deze dierbeschermingsmodellen werden toegepast voor het demonstreren van het therapeutische effect van het 4B9 antilichaam tegen bacteriêle besmettingen met organismen die tot de drie hierin vermelde soorten behoren. Een samenvatting van deze gegevens wordt in tabel G aangegeven.

8700235 35 -50-

TABEL G

Besmettingsbacterie Antilichaam besmetting6^ % 0verlevenden E. coli 025 4B9 10/10 100 E. coli 025 6Flia 0/10 0 5 S. marcescens 014 4B9 0/10 0 _ τττ 4B9 10/10 100

Streptococcus Ia en III

Groep B’ 6F11 0/10 0

Streptococcus Ia en III

S. marcescens 014 9B9 0/10 0 £ 6F11 antilichaam is specifiek ten opzichte van Pseudomonas 10 auruginosa Fisher immunotype 2 en dient als een- negatief controle-lichaam.

S. marcescens 014 is niet reactief met het 7D7 antilichaam en fungeert als niet-specifieke controleorganismen.

Door deze gegevens wordt gedemonstreerd dat het humane monoklo-15 nale antilichaam 4B9 in staat is muizen en ratten tegen lethale besmettingen met bacteriegenera die behoren tot zowel de gram-negatieve als gram-positieve bacteriële afdelingen te beschermen. Het intergenus kruis-reactieve humane monoklonale antilichaam 4B9 was in staat bescherming te bieden met 25 yg gezuiverd antilichaam tegen infectie door organismen 20 die behoren tot de gram-negatieve bacteriegenera E. coli en de gram-positieve; bacteriën die behoren tot de groep B Streptococcus.

VOORBEELD V

Voorbeeld V demonstreert methoden voor de produktie en selectie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactiviteit 25 tegen leden van de genera Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae en Enterobacter aerogenes bezit. Verder demonstreert dit voorbeeld de in vitro opsonische activiteit van genoemd antilichaam tegen homoloog S. 'marcescens, K. pneumoniae en E. aerogenes serotypes. De werkwijze van voorbeeld I (in wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald met uit-30 zondering dat het noodzakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in het voorbeeld beschreven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen wijzigingen in de analyseprocedures en de resultaten verkregen met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

8700288 -51- 1. Kweekbovenlagen uit vier transformaties werden volgens de boven staande methode geanalyseerd hetgeen resulteerde in de identificatie van één cupje (7E10) dat bindende activiteit aan ten minste één van vier K. Pneumoniae serotypeplaten bezat, die de capsulè serotypen 1, 2, 3, 4, 5 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 en 55 bevatten maar niet op de controleplaat (geen bacteriën). Antilichaam uit de 7E10 cellijn werd op verdere intergenus kruis-reactiviteit geanalyseerd door een modificatie van de standaardimmunomembraantechniek. In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën K. pneumoniae, E. aerogenes, 10 S. marcescens, E. coli en P. aeruginosa onderzocht door bacteriën aan te stippen op een nitrocellulose-papierschijf met rooster, de schijf die de bacteriën bevatte in reactie te brengen met-genoemd antilichaam en de antilichaamreactie met een alkalifosfatase/nitroblauw tetrazoliumenzym-systeem te ontwikkelen. Uit deze experimenten werd waargenomen dat het 15 7E1Q antilichaam verdere intergenus kruis-reactiviteit bezat. Dit antilichaam reageerde met de volgende soorten en serotypes: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K2,8,11,12,13,21,26, 04,12 Klinische Isolaten 29,30,33,42,68,69 20 Aldus bezat het humane monoklonale antilichaam 7E10 intergenus kruis-reactiviteit ten opzichte van bacteriën behorende tot de genera K. pneumoniae, S. marcescens en E. aerogenes.

2. Het isotype van het 7E10 monoklonale antilichaam werd vastgesteld in een ELISA-procedure gelijk aan de specificiteitsproeven als beschreven 25 in voorbeeld X met de uitzondering dat de antigeenplaat een samenvloeiing van PLL (poly-L-lysine) geïmmobiliseerd K. pneumoniae K8 en Kil serotypes bevatte. Positieve reacties van het 7E10 monoklonale antilichaam met de K. pneumoniae serotypes werd alleen waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen het IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert.

30 Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat indien de werkwijze van dit voorbeeld verschillende malen zou worden herhaald en de aldus verkregen iso-types van intergenus kruis-reactieve monoklonale antilichamen zouden worden bepaald, extra isotypes, bijvoorbeeld IgM en IgG isotypes zouden worden aangetroffen.

«700258 J ύ.

-52- 3. In vitro functionele activiteit van het 7E10 monoklonale anti lichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bacteriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid of afwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken.

5 De hierin toegepaste bacteriële serotypes werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 7E10, een actieve komponentbron en humane neutrofielen (tabel H). Bij herhaling van deze proef met serotypes die niet reactief zijn met antilichaam 7E10 werd geen bacteriële vernietiging waargenomen (tegevens niet weergegeven). Deze experimenten 10 demonstreerden de functionele specificiteit van monoklonaal antilichaam 7E10 alsmede het vermogen daarvan bacteriën te opsoniseren en hun fagocy-tose te bevorderen.

3 \ 8700286 .

£ _

-53-TABEL H

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van _ fielen lichaam _ ingebrachte bacterie a S. marcescens + 7E10 - 0 12 narcescaas + 6F11b + 0 S. marcescens _ 7El0 + 0 012 S. marcescens + 7E10 + 86% 012 K. Eneumoniae + 7E10 . 0 K8 en Kil —* pneumoniae . + 0 K8 en Kil —* pneumoniae, _ 0 K8 en Kil .

K. pneumoniae + ?E10 + 94% K8 en Kil E. aerogenes + ?E10 _ 0

Isolaat E. aerogenes + 6pll - + 0

Isolaat E. aerogenes _ 7E10 + 0

Isolaat: E. aerogenes + 7Ei0 + 60%

Isolaat a (-) = warmte-gexnactiveerd (56°C gedurende 30 minuten) humaan complement.

y.

(6F11) = kweekbovenlaag die een IgM humaan monoklonaal antilichaam ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 bevatte.

8700286 -54-

VOORBEELD VI

Voorbeeld VI demonstreert methoden voor de produktie en selectie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactiviteit tegen leden van de genera Serratia marcescens en Klebsiella pneumoniae 5 bezit. Verder demonstreert dit voorbeeld de in vitro opsonische activiteit van genoemd antilichaam tegen homoloog S. marcescens en K. pneumoniae serotypes. De werkwijze van voorbeeld I (in wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald met uitzondering dat het noodzakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld beschreien ven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen de wijzigingen in de analyseprocedures en de resultaten verkregen met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

1. Kweekbovenlagen uit vier transformaties werden volgens de boven staande methode geanalyseerd hetgeen resulteerde in de identificatie van 15 1 cupje (8C9) dat bindende activiteit aan ten minste één van vier K. pneumoniae serotypeplaten bezat en dat de capsule-serotypen: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 en 55 bevatte maar niet op de controleplaat (geen bacteriën). Antilichaam uit de 8C9 cellijn werd geanalyseerd op verdere intergenus kruis-reactiviteit door een modificatie 20 van de standaard immunodeklaagtechniek. In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën K. pneumoniae, E. aerogenes, 5. marcescens, E. coli en P. aeruginosa onderzocht door bacteriën aan te stippen op een nitrocellulose-papierschijf met roosters, de schijf die de bacteriën bevatte met genoemd antilichaam te laten reageren en de anti-25:- lichaamreacties met een alkalische fosfatase/nitroblauw tetrazolium-enzymsysteem te ontwikkelen. Uit deze experimenten werd waargenomen dat het 8C9 antilichaam een verdere intergenus kruis-reactiviteit bezat.

Dit antilichaam reageerde met de volgende soorten en serotypes: K. pneumoniae S. marcescens 30 K5,6,7,14,27,36,55,64 03

Aldus bezat het humane monoklonale antilichaam 8C9 intergenus kruisreac-tiviteit met bacteriën die behoorden tot de genera K. pneumoniae en S. marcescens.

87 0 Q 2 8 6 « -55- 2. Het isotype van het 8C9 monoklonale antilichaam werd vastgesteld in een ELISA-procedure gelijk aan de specificiteitsproeven beschreven in voorbeeld I met uitzondering dat de antigeenplaat een samenvloeiing van PLL geïmmobiliseerde K. pneumoniae K14 en K27 serotypes bevatte. Een 5 positieve reactie van het 8C9 monoklonale antilichaam met de K. pneumoniae serotypes werd alleen met het anti-IgM reagens waargenomen, hetgeen een IgM isotype van het monoklonale antilichaam demonstreert. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat indien de werkwijze van dit voorbeeld verschillende malen zou worden herhaald en de aldus verkregen iso-10 types van intergenus kruis-reactieve monoklonale antilichamen zouden worden vastgesteld men extra isotypes bijvoorbeeld IgM en IgG isotypes zou aantreffen.

3. De in vitro functionele activiteit van het 8C9 monoklonale antilichaam werd in een opsonofagocytische analyse onderzocht waarbij de 15 bacteriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en afwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken. De hierin toegepaste bacteriële serotypes werden alle in de aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 8C9, een actieve complementbron en humane neutrofielen (tabel I) geïnactiveerd. Bij herhaling van dit experiment 20 met serotypes die niet reactief waren met antilichaam 8C9 werd geen bacteriële vernietiging waargenomen (gegevens niet weergegeven). Deze experimenten demonstreerden de functionele specificiteit van monoklonaal antilichaam 8C9, alsmede zijn vermogen bacteriën te opsoniseren en hun fagocytose te bevorderen.

25 8700288 3 * -56-

TABEL I

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van _ fielen lichaam ____- ingebrachte bacterie S. marcescens a — - + bey “* o 03 S. marcescens , 03 - + 6F11 + 0 S. marcescens 8C9 + 0 03 S. marcescens + 8C9 + 70% 03 K. pneumoniae + 8C9 - 0 KI4 en 27 K pneumoniae + mi + 0 KI4 en 27 K. pneumoniae KI4 en 27 10 l^nUe + 8C9 + 93% cl b en = Zie tabel C voetnoten.

VOORBEELD VII

Voorbeeld VII demonstreert methoden voor de produktie en selectie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactiviteit 15 ten opzichte van leden van de genera Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes en Enterobacter cloacae heeft. Dit voorbeeld demonstreert verder de in vitro opsonische activiteit van genoemd antilichaam tegen homologe £L marcescens, K. pneumoniae, Ξ. aerogenes en E. cloacae serotypes. De werkwijze van voorbeeld I (in 20 wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald met de uitzondering dat noodzakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld beschreven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen wijzigingen in de analyseprocedures en de resultaten verkregen met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

870 0 2 S6 -57- 1. Kweekbovenlagen uit vier transformaties werden volgens de boven staande methode geanalyseerd hetgeen resulteerde in de identificatie van één cupje (1E4) dat bindende activiteit op ten minste één van de vier K. pneumoniae serotypeplaten bezat die de capsule-serotypes: 1, 2, 3, 4, 5 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 en 55 bevatte maar niet op de controplaat (geen bacteriën). Antilichaam uit de 1E4 cellijn werd geanalyseerd op verdere intergenus kruis-reactiviteit door een modificatie van de standaard immunomembraantechniek. In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën K. pneumoniae, E. aerogenes, 10 S. marcescens, E. coli, E. cloacae en P. aeruginosa onderzocht door bacteriën aan te stippen op een nitrocellulose-papierschijf met rooster, de schijf die de bacteriën bevatte met genoemd antilichaam te laten reageren en de antilichaamreacties met een alkalische fosfatase/nitroblauw tetrazoliumenzymsysteem te ontwikkelen. Uit deze experimenten werd waar-15 genomen dat het 1E4 antilichaam verdere intergenus kruis-reactiviteit bezat. Dit antilichaam reageerde met de volgende soorten serotypes: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes E. cloacae KI,3,8,9,13, 015 Klinische Isolaten Klinische Isolaten 15,29,31,33,36 20 68,69

Aldus bezat het humane monoklonale antilichaam 1E4 intergenus kruis-reactiviteit met bacteriën die behoorden tot de soort K. pneumoniae en S. marcescens, S. cloacae en E. aerogens.

2. Het isotype van het 1E4 monoklonale antilichaam werd in een 25 ELISA-procedüre gelijk aan de specificeitsproeven beschreven in voorbeeld I vastgesteld, met uitzondering dat de antigeenplaat een samenvloeiing van PLI» geïmmobiliseerde K. pneumoniae K3 en K8 serotypes bevatte. Er werden alleen positieve reacties van het 1E4 monoklonale antilichaam met de K. pneumoniae serotypes met het anti-IgM reagens waargenomen, hetgeen 30 een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat indien de werkwijze van dit voorbeeld verschillende malen zou worden herhaald en de aldus verkregen isotypes van de intergenus kruis-reactieve monoklonale antilichamen zouden worden bepaald men extra isotypes, bijvoorbeeld IgM en IgG isotypes, zou aan-35 treffen.

8700285 » Je -58- 3. De in vitro functionele activiteit van het 1E4 monoklonale anti lichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bac-teriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en afwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken. De 5 hierin toegepaste bacteriële serotypes werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 1E4, een actieve complementbron en humane neutrofielen (tabel J). Bij herhaling van dit experiment met serotypes die niet reactief waren met antilichaam 1E4, werd geen bacteriële vernietiging waargenomen (gegevens niet weergegeven). Deze proeven demon-10 streerden de functionele specificiteit van monoklonaal antilichaam 1E4, alsmede de capaciteit daarvan bacteriën te opsoniseren en hun fagocytose te bevorderen.

15 870 02 8 6 -59-

TABEL J

Bacterie iTeutro- Anti- Complement % Vernietiging van fielen lichaam __ ingebrachte bacterie S. marcescens , a n 015- * 1E4 " ° S- marcescens , ,b , n 015

S. marcescens . + Q

015 S. marcescens + 1E4 + 86% 015 K. pneumoniae + 1E4 - 0 K3 en 29 K. pneumoniae + 6P11 + 0 K3 en 29 K. pneumoniae 1 4 + 0 K3 en 29 K. pneumoniae 1E4 + 80% K3 en 29 E. aerogenes + 1E4 - 0

Isolaat (2) E. aerogenes + 6F11 + 0

Isolaat (2) E. aerogenes _ 1E4 + 0

Isolaat (2) E. aerogenes + 1E4 + 80%

Isolaat (2) E. cloacae + 1E4 _ 0

Isolaat E. cloacae + 6PU + 0

Isolaat E. cloacae - 1E4 + 0

Isolaat E. cloacae + 1e4 + ' 80%

Isolaat ^ b en = Zie tabel C voetnoten.

8700286 f '< •s -60-

VOORBEELD VIII

Voorbeeld VIII demonstreert methoden voor de produktie en selectie van een humaan monoklonaal antilichaam dat intergenus kruis-reactivi-teit tegen leden van de genera Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, 5 Enterobacter aerogenes en Pseudomonas aeruginosa bezit. Verder demonstreert dit voorbeeld de in vitro opsonische activiteit van genoemd antilichaam tegen homoloog £!. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes en F. aeruginosa serotypes. De werkwijze van voor voorbeeld I (in wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald met de uitzondering dat het nood-10 zakelijk was specifieke modificaties aan te brengen om het in dit voorbeeld beschreven antilichaam te karakteriseren en te analyseren. Hierna volgen wijzigingen in de analyseprocedures en de resultaten verkregen . met het hierin beschreven monoklonale antilichaam.

1. Kweekbovenlagen uit vier transformaties werden volgens de boven- 15 staande methoden geanalyseerd hetgeen resulteerde in de identificatie van één cupje (9D1) dat bindende activiteit aan ten minste één van de vier K. pneumoniae serotypeplaten bezat, die de capsule-serotypes 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 24, 27, 31, 43, 44 en 55 bevatten maar niet op de controleplaat (geen bacteriën). Antilichaam uit de 9D1 cellijn werd voor 20 verdere intergenus kruis-reactiviteit geanalyseerd door een modificatie van de standaard immunomembraantechniek. In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli en P. aeruginosa onderzocht door bacteriën op een nitrocellulose-papierschijf met rooster te stippen, de schijf die de bac-25 teriën bevatte met genoemd antilichaam in reactie te brengen en de anti-lichaamreacties met een alkalische fosfatase/nitroblauw tetrazolium-enzymsysteem te ontwikkelen.

Uit de proeven werd waargenomen dat het 9D1 antilichaam verdere intergenus kruis-reactiviteit bezat. Dit antilichaam reageerde met de 30 volgende soorten en serotypes: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes P. aeruginosa E9,13,15,29,33 03,9,15,18 Klinische Isolaten F6

Aldus bezat het humane monoklonale antilichaam 9D1 intergenus kruis-reactiviteit ten opzichte van bacteriën behorende tot de genera 35 K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. aerogenes en P. aeruginosa.

8700236 -61- 2. Het isotype van het 9D1 monoklonale antilichaam werd vastgesteld in een ELISA-procedure gelijk aan de specificiteitsproeven beschreven in voorbeeld I met uitzondering dat de antigeen-plaat een samenvloeiing van PLL geïmmobiliseerd K. pneumoniae K13 serotype bevatte. Er werd alleen 5 een positieve reactie van het 9D1 monoklonale antilichaam met het K. pneumoniae serotype waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreert. Het zal aan de vakman duidelijk zijn dat indien de werkwijze van dit voorbeeld verschillende malen zou worden herhaald en de aldus verkregen isotypes van 10 intergenus kruis-reactieve monoklonale antilichamen zouden worden vastgesteld men extra isotypes, bijvoorbeeld IgM en IgG isotypes, zou aantreffen.

3. De in vitro functionele activiteit van het 9D1 monoklonale antilichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bac- 15 teriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en afwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken. De daarin toegepaste bacteriële serotypes werden alleen geïnactiveerd in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 9D1, een actieve complementbron en humane neutrofielen (tabel K). Bij herhaling van dit experiment met 20 serotypes die niet reactief zijn met antilichaam 9D1, werd geen bacteriële vernietiging waargenomen (gegevens niet weergegeven). Deze experimenten demonstreerden de functionele specificiteit van monoklonaal antilichaam 9D1 alsmede zijn mogelijkheid bacteriën te opsoniseren en hun fagosytose te bevorderen.

25 8700233 -62-

TABEL K

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van _ fielen lichaam _ ingebrachte bacterie S. marcescens a Ö3 + 9D1 - 0 S. marcescens + 6Ρ11* + 0 03 S. marcescens Ö3 - - 9D1 + 0 S. marcescens + 9Dl + 87% 03 K. pneumoniae , αη1 n K13 + 9D1 - 0 K. pneumoniae + 6F11 + 0 KI 3 K. pneumoniae - 9D1 + 0 KI 3 g. pneumoniae + 9D1 + 50% aeroymes + 9D! - 0

Isolaten (2) aerogenes + 6m + 0

Isolaten (2) E. aerogeneg gol 0

Isolaten (2) |· feroge2|£ + 9D1 + 704

Isolaten (2) P. aeruginosa + 9D1 _ 0 F6 P aeruginosa + 6P11 + 0 F6 P. aeruginosa - 9D1 + 0 F6 | aeruginosa + 9D1 + 75% F6 a b en = Zie tabel C voetnoten.

8700288 -» $ -63-

VOORBEELD IX

Voorbeeld IX demonstreert methoden voor de produktie van, een humaan monoklonaal antilichaam dat intergnus kruis-reactiviteit tegen leden van de soort Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Escherichia 5 coli (E. coli) en Serratia marcescens (S. marcescens) bezit. Verder de-' monstreerde dit voorbeeld de in vivo beschermende activiteit van genoemd antilichaam tegen een lethale besmetting van homologe E. aeruginosa, E. coli en S. marcescens serotypes. De werkwijze van voorbeeld I (in wezen als beschreven in delen A-G) werd herhaald ter produktie van een 10- humaan monoklonaal antilichaam dat kruis-reactief was tegen infecties veroorzaakt door de bacteriën waaraan het zich bindt. Specifieke modificaties van de werkwijze van voorbeeld I voor het karakteriseren en analyseren van het antilichaam worden in dit voorbeeld beschreven. De wijzigingen in de analyseprocedures en de resultaten verkregen met het mono-15 klonale antilichaam waren als volgt: 1. Bovenlagen werden onderzocht op de aanwezigheid van anti-P.

aeruginosa antilichamen met een ELISA-techniek als beschreven in voorbeeld I. De antigeen-plaat bestond uit een Immunolon 2 bodemmicrotiter-plaat met 96 cupjes (Dynatech, Alexandria, VA), waarvan de cupjes een 20 mengsel van poly-L-lysine (PLL) geïmmobiliseerde bacteriën behorende tot de zeven P. aeruginosa Fisher referentiestammen bevatten (M.W. Fisher et al, J. of Bacteriology (1969) 98:835-836, A.T.C.C. nrs. 27312-27318.

Kweekbovenlagen uit één transformatie werden volgens de bovenstaande methode geanalyseerd, hetgeen resulteerde in de identificatie van 25 één cupje dat activiteit op de P. aeruginosa-plaat bezat, maar niet op de PLL controleplaten. In aansluitende ELISA's met de 17 individuele P. aeruginosa serotypes behorende tot het International Antigenic Typing Scheme (IATS. A.T.C.C. nrs. 33348-33364), dat een hoofdcupje 9C3 antilichaam bevatte die binden aan IATS serotype 1 (P.V. Liu, Int. J. Syst.

30 Bacteriol. (1983) 33:256-264, dat hierin als referentie wordt opgenomen).

Aldus werd uit dit experiment één gekloneerde getransformeerde humane cellijn bereid die continu (onsterfelijk) is en een enkel humaan monoklonaal antilichaam afgeeft dat bindt aan een determinant op het oppervlak van het P. aeruginosa IATS type 1.

35 Vóór de indiening van deze octrooiaanvrage werd de continu ge transformeerde humane cellijn, geïdentificeerd als 9C3, gedeponeerd bij 8700233 -64- de American. Type Culture Collection, Rockville, MD bij A.T.C.C. nr. CRL 9239.

2. Antilichaam uit de gekloneerde 9C3 cellijn werd tevens onderzocht op kruis-reactiviteit ten opzichte van gram-negatieve en gram- 5 positieve bacteriën door modificatie van de standaard immunomembraan-techniek. In het bijzonder werd de kruis-reactiviteit ten opzichte van de bacteriën E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E'. aerogenes, E. cloacae, Haemophilus influenzae en Staphylococcus aureus onderzocht door bacteriën op een nitrocellulose-papierschijf met rooster aan te 10. stippen, de schijf die de bacteriën bezat in reactie te brengen met 9C3 antilichaam en de antilichaamreacties zichtbaar te maken met een alkalische fosfatase/nitroblauw tetrazoliumenzymsysteem (als beschreven in voorbeeld I). Uit deze experimenten werd waargenomen dat antilichaam 9C3 zich bindt aan E. coli serotype 06 en de S. marcescens serotypes 012 en 15 014.

Aldus bezit het humane monoklonale antilichaam 9C3 intergenus kruis-reactiviteit onder de gram-negatieve bacteriën die behoren tot specifieke serotypes van de soort E. coli, S. marcescens en P. aeruginosa.

3. De vondst dat het monoklonale antilichaam in kruis-reactie trad 20 met verschillende bacteriële genera suggereerde dat het antilichaam zich kan binden aan een gemeenschappelijke antigene determinant. De biochemische karakterisering van de moleculaire soort die wordt herkend door het 9C3 antilichaam werd tot stand gebracht door een immunomembraanana-lyse als beschreven in voorbeeld I. De reacties werden in deoxycholaat-25' extracten van reactieve serotypes uit P. aeruginosa en E. coli, maar niet S. marcescens genoteerd. Hoewel het niet duidelijk is waarom antilichaam 9C3 niet reactief was met het S. marcescens preparaat is het mogelijk dat het antilichaam een conformationeel epitoop herkent dat door de voorbe-reidingsbehandelingen was vernietigd. Uit de E. coli en P. aeruginosa 30 bacteriële extracten bleek het 9C3 antilichaam een reeks van regelmatig op afstand staande moleculaire eenheden te herkennen, hetgeen aanleiding gaf tot een ladderachtig patroon op het immunomembraan. Dit profiel was geheel in overeenstemming met dat waargenomen in polyacrylaminegel-elektroforetische analyse van LPS in aanwezigheid van SDS, waarbij is ge-35 demonstreerd dat het heterogene maatprofiel, vertoond door de banden, veroorzaakt wordt door een populatie van LPS moleculen die met gewichts- 8700286 « ~r v- -65- increment verschillen die equivalent zijn aan het aantal O-antigeen oligosaccharide zijketeneenheden die per molecuul aanwezig zijn E.T. Pavla en P.H. Makela, supra en R.D. Goldman en L. Leive, supra).-

Voor het verder definiëren van de moleculaire aard van het anti-5 geen werden de deoxycholaatextracten met proteolytisch enzym, Proteinase K vóór hun elektroforese behandeld (W. Eberling, supra). De immunomem-braanpatronen waargenomen na de Proteinase K behandeling waren identiek aan die patronen waargenomen zonder behandeling en zij suggereerden aldus dat het antigeen dat reactief is met het 9C3 antilichaam van nature geen 10. proteïne was.

4. Het isotype van het 9C3 monoklonale antilichaam werd vastgesteld in een ELlSA-procedure gelijk aan de boven beschreven specificiteits-proeven, met uitzondering dat de antigeenplaat PLL-gelmmobiliseerde P. aeruginosa Fisher serotype 4 bacteriën bevatte. De positieve reactie 15 van het 9C3 monoklonale antilichaam met de P. aeruginosa-stam werd alleen waargenomen met het anti-IgM reagens, hetgeen een IgM isotype voor het monoklonale antilichaam demonstreerde.

5. De in vitro functionele activiteit van het 9C3 monoklonale antilichaam werd onderzocht in een opsonofagocytische analyse waarbij de bac- 20 teriocidale activiteit van het antilichaam in aanwezigheid en afwezigheid van zowel humane neutrofielen als humaan complement werd vergeleken. De hierin toegepaste bacteriële stammen werden alleen gedood in aanwezigheid van monoklonaal antilichaam 9C3, een actieve complementbron en humane neutrofielen (tabel L). Bij herhaling van dit experiment met verschil-25 lende niet-9C3 reactieve bacteriële serotypes werd geen bacteriële vernietiging waargenomen, waardoor aldus de functionele specifiteit van monoklonaal antilichaam 9C3 en zijn capaciteit bacteriën te opsoniseren en hun fagocytose te bevorderen werd gedemonstreerd. Aangezien de gecombineerde werking van opsoninen (specifieke antilichamen) en polymorfo-30 nucleaire leukocyten (neutrofielen) het primaire mechanisme voor immuniteit ten opzichte van deze bacteriële stammen blijkt te zijn, wijzen deze gegevens erop dat antilichaam 9C3 na geschikte toediening bescherming zal verlenen tegen lethale besmettingen met de hierin beschreven bacteriestammen.

8700235 35 Λ 9 '« -66-

TABEL L

Bacterie Neutro- Anti- Complement % Vernietiging van _ fielen lichaam _ ingebrachte bacterie E. coli 06 + 9C3 -a 0 \“ï E. coli 06 + 6F11 + 0 E. coli 06 9C3 + 0 E. coli 06 + 9C3 + 98% S. marcescens „„„ ffI4- + 903 ‘ 0 mrojscen. + 6FU + o 014 S. marcescens „„„ Ö14 - 9C3 + 0 5. marcescens + + 94% 014 |: ;erufn°y + 9C3 0

Fisher 4 P. aeruginosa + 6F11 + 0

Fischer 4 |: . 9C3 + 0

Fischer 4 |. aeruginosa + 9C3 + 79%

Fischer 4 a - = warmte-geïnactiveerd (56°C gedurende 30 minuten) humaan complement.

6F11 = kweekbovenlaag die een IgM humaan monoklonaal antilichaam ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher type 2 bevatte.

6. Voor het onderzoeken van de beschermende eigenschappen van het 9C3 antilichaam werden dierbeschermingsstudies uitgevoerd met ten minste één organisme uit elk hierin beschreven genus.

8700286 k -67- üitgevoerd werden beschermingsproeven met P. aeruginosa Fisher 4 en S. marcescens 014 ten opzichte van muizen met brandwonden. Voor elke bacteriële besmetting werden vrouwtjes Swiss-Webster muizen met een gewicht van 22-25 g in drie groepen van elk 7 of 8 muizen verdeeld. Een 5 illustratief experiment werd als volgt uitgevoerd.

Groep Bacterie Antilichaam A P. aeruginosa F4 9C3 B P. aeruginosa F4 6F11 C P. aeruginosa F2 9C3 10 De dag voor het experiment werd elke muis geschoren en behandeld met een ontharingsmiddel om al het haar op de rug te verwijderen (brand-plaats). Op de experimentele dag ontving elk dier 0,1 ml in elke dij van een verdovende pekeloplossing die 0,7 ml 0,85% NaCl, 0,2 xylazine (20 mg/ml) en 0,1 ml ketamine (100 mg/ml) bevatte en wel zodanig dat de 15 dosis per muis 20 mg/kg xylazine en 180 mg/kg ketamine was. De verdoofde muis ontving over 10% van het totale lichaamsoppervlaktegebied, over de volledige dikte een derdegraadsgasvlambrandwond. Onmiddellijk na het aanbrengen van de wond werden de dieren onder de korst geïnjecteerd met 0,5 ml van 4°C antilichaam-bevattende verbruikte kweekvloeistof vóórge-20 mengd met 5-10 LD^'s bacteriën. De bacteriële suspensie was bereid uit een beslagcultuur in de logaritmische groeifase, waaruit de bacteriën waren gecentrifugeerd, tweemaal gewassen in PBS en opnieuw gesuspendeerd tot de geschikte concentratie in PBS. De dieren werden gedurende een periode van 10 dagen waargenomen. Drie tot vijf dagen na de beproeving 25 waren alle dieren in groep B (irrelevant antilichaam) en groep C (irrelevant organisme) dood. In tegenstelling daarmede waren die dieren die het 9C3 (groep A) antilichaam hadden ontvangen alle levend en vrij van symptomen (zie tabel M).

Voor de E. coli 06 beschermingsstudies werden gezonde Swiss-30 Webster muizen (20-22 g) in drie groepen van elk tien muizen verdeeld. Elke groep die antilichaam ontving werd intraveneus geïnjecteerd met 200 μΐ steriel PBS dat 25 U9 gezuiverd antilichaam bevatte. Twee uur later werden alle dieren intraperitoneaal besmet met 300 μΐ levende bacteriën, die 3 LD 's van hun respectievelijke bacteriële stam bevatte

DO

35 (voor de resultaten zie tabel M).

870 02 3 o y * ·> /a -68- TABEL Μ

Proef Besmettingsbacterie Anti- Overlenden/ % Overlevenden _ _ lichaam besmetting _ 1 P. aeruginosa F4 9C3 6/7 86% P. aeruginosa F4 6Flla 0/7 0 5 P. aeruginosa F2 9C3 0/7 0 2 E. coli 9C3 6/10 60% E. coli 6F11 0/10 0 3 S. marcescens 014 9C3 8/8 100% S. marcescens 014 6F11 0/8 0 10 a 6F11 antilichaam is specifiek ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa Fisher immunotype 2 en dient als een negatief controle antilichaam.

P. aeruginosa F2 is niet reactief met het 9C3 antilichaam en dient als niet-specifiek controle-organisme.

15 Deze gegevens demonstreren dat het humane monoklonale antilichaam 9C3 in staat is muizen tegen lethale besmettingen met bacteriën die behoren tot drie gram-negatieve genera te beschermen. Het intergenus kruis-reactieve humane monoklonale antilichaam 9C3 was in staat bescherming te verlenen met een antilichaam-bevattende kweekbovenlaag of gezuiverd 20 antilichaam tegen infectie door organismen behorende tot de gram-nega-tieve genera E. coli, S. marcescens en P. aeruginosa.

Uit het voorafgaande zal het duidelijk zijn dat de cellijnen van de onderhavige uitvinding preparaten van humane monoklonale antilichamen en fragmenten daarvan leveren die kruis-reactief zijn voor en kruis-25 beschermend tegen verschillende bacteriële soorten, zowel gram-negatieve als gram-positieve. Hierdoor kunnen gemakkelijker preventieve en therapeutische preparaten worden ontwikkeld die effectief zijn tegen nosoco-miale en neonatale infecties die worden veroorzaakt door de meeste, zo niet alle, bacteriële genera. Door de antilichamen te combineren is het 8700286 _ ...i.

-69- mogelijk een brede bescherming tegen een groot deel, gewoonlijk minder dan alle, van de klinisch significante antilichamen te verkrijgen. Tevens leveren de cellijnen antilichamen die toepassing vinden in immunoanalyses en andere welbekende procedures.

8700286

Claims (20)

1. Preparaat bruikbaar voor de preventieve en/of therapeutische behandeling van bacteriële infecties, welk preparaat een voor preventieve of therapeutische doeleinden effectieve hoeveelheid van een veelvoud van humane monoklonale antilichamen omvat en dat reactief is met ten minste 5 twee bacteriële soorten van ten minste twee genera, waarvan ten minste een van genoemde antilichamen of bindingsfragment daarvan in staat is tot:, een specifieke reactie met een niet-kern koolhydraatepitoop dat gemeenschappelijk is aan serotypes van twee verschillende soorten.

2. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat ten minste 10 één van genoemde antilichaam of bindingsfragmenten daarvan in reactie treedt met serotypes van soorten van ten minste drie bacteriële soorten en genera.

3. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat ten minste één van genoemde bacteriële soorten een gram-positieve en een tweede 15 een gram-negatieve soort is.

4. Preparaat volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat elk van ten minste twee van genoemde antilichamen beschermt tegen infectie veroorzaakt door bacteriën behorende tot ten minste twee verschillende genera.

5 P. aeruginosa; of (h) E. coli, S. marcescens en P. aeruginosa.

5. Preparaat bruikbaar voor de preventieve en/of therapeutische 20 behandeling van bacteriële infecties, welk preparaat een voor preventieve en therapeutische doeleinden effectieve hoeveelheid van ten minste twee humane monoklonale antilichamen of bindingsfragment daarvan bevat, waarbij. elk van genoemde antilichamen specifiek in reactie treedt met een niet-kem koolhydraatepitoop gemeenschappelijk aan serotypes van twee 25 of meer bacteriële soorten van verschillende genera en een veelvoud van serotypes in ten minste een soort, waarbij genoemde soort Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa en Streptococcus agalactiae groep B bevat.

6. Preparaat volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat dit ten minste één humaan monoklonaal antilichaam omvat, dat reageert met ten minste één van de volgende bacteriële soortcombinaties: (a) E. coli, S. marcescens en E. aerogenes; (b) coli en N. meningitidis; 8700286 £··»_—^ Λ -71- (c) E. coli/ E. cloacae en Streptococcus agalactiae groep B; (d) K. pneumoniae, £. marcescens en E. aerogenes; (e) K. pneumoniae en S. marcescens; (f) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes en E. cloacae; (g) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes en

7. Farmaceutisch preparaat omvattende een preparaat volgens een van de conclusies 1-6, en een fysiologisch aanvaardbare drager.

8. Werkwijze voor het remmen van symptomen van bacteriele ziektes in een humane gastheer welke omvat; 10 het aan genoemde gastheer toedienen van een voor therapeutische of preventieve doeleinden effectieve dosis van een preparaat volgens één van de conclusies 1-6; een fysiologisch aanvaardbare drager en een antimicrobieel middel en/of een gammaglobulinefraktie van humaan bloedplasma.

9. Onsterfelijke cellijn die een humaan monoklonaal antilichaam of bindingsfragment daarvan afgeeft dat specifiek kruis-reactief is met een epitoop, omvattende een toegankelijke niet-kern koolhydraateenheid aanwezig op ten minste twee serotypes van twee verschillende soorten van verschillende.bacteriële genera.

10. Cellijn volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat genoemde bac teriële soorten ten minste twee van de soorten Escherichia coli, Serratia marcescens, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa en Streptococcus agalactiae groep B zijn.

11. Cellijn volgens conclusie 9, aangeduid als ATCC nr. CRL 9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 en CRL 9239.

12. Humaan monoklonaal antilichaam of bindingsfragment daarvoor dat in staat is tot binding aan een koolhydraatepitoop reactief met een monoklonaal antilichaam geproduceerd door een cellijn volgens conclusie 11.

13. Kit ten gebruike voor de detectie van de aanwezigheid van ten minste twee leden van soorten van verschillende bacteriële genera, welke kit bestaat uit een monoklonaal antilichaampreparaat dat ten minste een monoklonaal antilichaam bevat, waarbij genoemd antilichaam reageert met een niet-kern koolhydraatdeterminant gemeenschappelijk aan ten min- 35 ste twee leden van verschillende bacteriële soorten en een merkstof die 8700286 «I *— . ·χ -72- een detecteerbaar signaal levert, dat covalent is gebonden aan genoemd antilichaam of is gebonden aan een tweede antilichaam reactief met genoemd monoklonaal antilichaam.

14. Preparaat bruikbaar voor de preventieve en/of therapeutische be-5 handeling van neonatale sepsis of meningitis, welk preparaat bestaat uit een voor preventieve of therapeutische doeleinden voldoende hoeveelheid van ten minste twee humane monoklonale antilichamen of bindingsfragment daarvan, waarbij elk van genoemde antilichamen specifiek reageert met een niet-kern koolhydraatepitoop gemeenschappelijk aan serotypes van twee 10 of meer bacteriële soorten van verschillende genera, waarbij genoemde soorten Escherichia coli Kl, Neisseria meningitidis groep B, Hemofhilus influenzae type B en Streptococcus agalactiae groep B omvatten.

15. Preparaat bruikbaar voor de preventieve en/of therapeutische behandeling van een voorgekozen aantal bacteriële soorten, welk preparaat 15 bestaat uit een voor preventieve of therapeutische doeleinden effectieve hoeveelheid van twee of meer humane monoklonale antilichamen of bindings-fragmenten daarvan, welke antilichamen in staat zijn tot reactie met in totaal ten minste vier van de bacteriële soorten alsmede een verenigbare drager.

16. Werkwijze voor het produceren van een farmaceutisch preparaat bruikbaar voor de preventieve of therapeutische behandeling van bacteriële infectie, welke werkwijze omvat: het combineren van een veelvoud van humane monoklonale antilichamen waarbij genoemd preparaat reageert met ten minste twee bacte-25- riële soorten van ten minste twee genera, waarbij ten minste één van genoemde monoklonale antilichamen of bind’ingsfragmenten daarvan in staat is tot specifieke reactie met een niet-kern koolhydraatepitoop gemeenschappelijk aan serotypes van twee verschillende soorten...

17. Werkwijze voor het produceren van een farmaceutisch preparaat 30 bruikbaar voor de preventieve en/of therapeutische behandeling van neonatale sepsis of meningitis, met het kenmerk, dat genoemde werkwijze omvat: het combineren van een voor preventieve of therapeutische doeleinden voldoende hoeveelheid van ten minste twee humane monoklonale 35 antilichamen of bindingsfragmenten daarvan, waarbij elk van genoemde antilichamen specifiek reageert met een niet-kern koolhydraatepitoop 8700286 -73- gemeenschappelijk aan serotypes van twee of meer bacteriële soorten van verschillende genera en genoemde soorten E. coli Kl, Neisseria meningitidis/ Hemophilus influenza en Streptococcus agalactiae groep B.

18. Werkwijze voor het produceren van een humaan monoklonaal anti-5 lichaam, dat specifiek kruisreageert met een niet-kern koolhydraat- epitoop dat aanwezig is op ten minste twee serotypes van ten minste twee verschillende soorten van verschillende genera van bacteriën, met het kenmerk, dat één van de cellijnen van de conclusies 9-11 wordt gekweekt en de antilichamen worden gewonnen.

19. Werkwijze voor het produceren van humane monoklonale anti lichamen welke specifiek kunnen binden aan een niet-kern koolhydraat-epitoop die serotypen van twee verschillende bacteriesoorten gemeen hebben, met het kenmerk, dat _ de B cellen van een individu worden geïsoleerd; 15 deze B cellen worden gelmmortalizeerd onder vorming van meer dere antilichaam-producerende kloons; deze kloons worden onderzocht op de produktie van antilichamen die specifiek zijn voor een niet-kern koolhydraatepitoöp van ten minste twee verschillende bacteriesoorten; en 20 dë geselecteerde kloons worden gekweekt en het daardoor gepro duceerde monoklonale antilichaam wordt geoogst.

20. Werkwijze volgens conclusie 19, met het kenmerk, dat de B cellen worden gelmmortalizeerd door EBV transformatie. 8700286