JPH04197195A - 緑膿薗リポ多糖に対するヒトモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、緑膿菌リボ多糖に対するヒトモノクローナル
抗体、該ヒトモノクローナル抗体を産生ずるセルライン
、該ヒトモノクローナル抗体を含有する緑膿菌感染症の
予防・治療剤に関する。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、緑膿菌本間血清型
Ｇ型に強い感染治療効果を有する。

〈従来の技術〉 細菌感染症の治療において問題となる病原菌は、抗生物
質の開発とともに変化している。すなわち、臨床上用い
られる抗生物質の種類の変遷にともない感染症を引き起
こす細菌、いわゆる起炎菌が交代している。従来、低病
原性または弱毒性といわれた細菌、なかでも特に緑膿菌
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）に
よる感染例が増加し、緑膿菌は近年、主要な病原菌の一
つとなっている。緑膿菌感染症は、免疫抑制剤の投与を
受は免疫能の低下している患者、癌患者、熱傷患者、び
まん性汎細気管支炎やのう胞繊維症を基礎疾患としても
つ患者において重篤な症状を引き起こし死に至らしめる
場合が多い日和見感染として知られている。

細菌感染を予防・治療する方法として、まず第一にあげ
られるのが、抗生物質および合成抗菌剤を用いた化学療
法である。ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシ
リンやセファロスポリンなど幾多の抗生物質が開発され
、その多くはブドウ球菌を代表とするほとんどのダラム
陰性菌に感受性を示し、著しい臨床効果を示してきた。

しかしながら、今日までの多くの研究開発にもかかわら
ず、緑膿菌に感受性を示す薬剤は依然少ないのが現状で
あり、しかも今日、感受性を示すとされる薬剤でも緑膿
菌の薬剤耐性獲得や、さらにそのほとんどが、緑膿菌に
対してその増殖を単に阻害するいわゆる静菌的に作用す
るのみで、殺菌力にかけており、臨床の場において有用
な治療効果を示すには至っていない。

第二に、細菌感染症を予防および治療することができる
療法として、免疫グロブリン製剤の投与、いわゆる抗体
療法かあり、抗生物質療法との併用、またはそれに代わ
るものとして注目されている。ウマやウサギ等の動物を
能動的に免疫することによって抗体価の高い血清を得る
ことができ、その血清を投与する抗体療法は、各種の動
物を用いた実験的感染症において著しい治療効果を示す
ことが多くの実験によって実証されている。

しかし、ヒト以外の動物から得られた異種蛋白をヒト体
内へ移入するこの方法は、アナフィラキシ−やその他ア
レルギー反応などの重篤な副作用を引き起こし一般細菌
感染症の治療法として採用されるに至っていない。

〈発明が解決すべき課題さ 以上のような理由で、細菌に対して高い抗体力価を有し
、感染症に対する治療効果の大きいヒト免疫グロブリン
の開発が望まれている。従来のヒト免疫グロブリン製剤
は、健常人または細菌感染既往患者から血液を採取し、
既知の方法にて免疫グロブリン画分を分取・精製した後
に、ポリエチレングリコール添加、蛋白分解酵素処理、
スルホン化、ＤＥＡＥ−カラムクロマトグラフィー等の
、凝集物を除去する方法により筋肉注射用のみならず、
静脈注射用に製剤化されたものである。これらヒト免疫
グロブリン製剤には、ヒト以外の異種動物由来の免疫グ
ロブリンを投与したときにみられるアナフィラキシ−等
の副作用がない等の利点を持つが、いくつかの欠点をも
つ。第一に、細菌に対する抗体価が低く、必ずしも充分
な治療効果を期待しえない。第二に、高力価の免疫グロ
ブリンを大量に安定して供給することが難しい。健常人
ボランティアや患者より採取された血液を材料に製造さ
れており、高い力価の血清を一定して入手することは極
めて難しい。従って、製造ロフト毎に、抗体価が変動す
ることがある。第三に、任意のヒト血液を材料に製造さ
れることにより免疫グロブリン製剤ＨＢウィルスなどの
肝炎ウィルスやＡｄｕｌｔ　Ｔ　ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋａ
ｅｍｉａｖｉｒｕｓ（ＡＴＬＶ、　ＨＴＬＶ）、エイズ
ウィルス（Ｈｍなどが混入することが有り得る。これら
の問題を解決すべく、従来のヒト免疫グロブリン製剤や
マウスモノクローナル抗体に代わるものとして、細菌感
染症の予防および治療に有効且つ有用なヒトモノクロー
ナル抗体の作製およびその応用が望まれている。

抗体が細菌の表層へ結合すると、倉食細胞による細菌の
責食が促進されたり（オブソニン化による責食能の促進
）、または補体による細菌の溶解が引き起こされる。抗
体療法のターゲットとなる緑膿菌の表層抗原としては、
リボ多糖（ＬＰＳ）、外膜蛋白、鞭毛および線毛等が知
られている。このうち外膜蛋白についてはＳａｗａｄａ
らがこれらを認識するマウスモノクローナル抗体はＬＰ
Ｓを認識するマウスモノクローナル抗体に比べ有意な感
染治療効果を認めないかもしくは感染防御効果に対して
極めて多量の抗体量を必要とすることを示した（Ｊ、　
Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１５０、５７０−５７６
、１９８４）。

ＬＰＳは、〇−抗原を規定する〇−多糖、菌種によっで
ある程度の共通性があると考えられている外コア（ｏｕ
ｔｅｒ　ｃｏｒｅ）オリゴ糖、腸内細菌族に広く共通と
されている内コア（ｉｎｎｅｒ　ｃｏｒｅ）オリゴ糖、
およびリビドＡより成る。

このうち、菌体の表層で最も外側に存在する〇−多糖と
呼ばれる多糖体は２−５残基の糖から成る繰り返し単位
が重合しており、血清型によって特有の糖配列、糖組成
を有し〇−抗−原の抗原決定基を形成している。現在ま
でに緑膿菌のすべての血清型別について、型別標準株か
ら得られた〇−多糖の構造が解析され報告されている　
（Ａｃｔａ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｈｕｎｇ、。

３５、３−２４．１９８８）。

血清型特異抗原である〇−抗原に対するヒトモノクロー
ナル抗体は、対応する血清型の緑膿菌による動物を用い
た実験的感染症に対しては、優れた効果を示すことが明
らかにされている。以下に、その論文及び特許を示す。

　　（Ｓａｗａｄａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８
５）Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５２．９６５
−９７０．　Ｓａｗａｄａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、（１
９８７）Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１３
３．２５８１−３５９０゜５ｕｚｕｋｉ、Ｈ，ｅｔ　　
ａｌ、　　（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ、。

３１．９５９−９６６、Ｚｗｅｅｒｉｎｋ、Ｈ，Ｊ、（
１９８８）Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕｎ、、５６．　
１８３７−１８７９．Ｈｅｃｔｏｒ、Ｒ，Ｆ、ｅｔ　　
ａｌ、（１９８９）Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、
　１６０．４８３−４８９．特開昭６０−２４８６２６
、特開昭６１−６９７９６．特開昭６１−９１１３４．
特開昭６１−１５２２８０．１５２２８１、特開昭６２
−２４０６２６．特開昭６３−しかしながら現実の感染
症において、緑膿菌は〇−抗原多糖を発現しない場合が
少なくない。例えば嚢胞繊維症（Ｃｙｓｔｉｃ　ｆｉｂ
ｒｏｓｉｓ）やびまん性汎細気管支炎を基礎疾患として
持つ患者の緑膿菌慢性感染症からは〇−抗原を持たない
か非常に少ないラフ株やＭ型株が高頻度に分離されてい
ることが知られているｏ　　（Ｈａｎｃｏｃｋ、　Ｒ，
Ｅ、Ｗ、　（１９８３）　Ｉｎｆｅｃｔ、　　Ｉｍｍｕ
ｎ、、　４２、１７０−１７７、　Ｆｏｍｓｇａａｒｄ
、　Ａ、　（１９８８）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、、　２６．８２１−８２６．　　杉ら（１
９８７）第２１回緑膿菌研究会講演記録９．９７−９９
）。即ち、０−抗原をもたない形質に変換していくと考
えられている。

こうした状態では、抗〇−多糖抗体は効果を発揮しない
ことは容易に類推される。

く課題解決の手段〉 発明者らは鋭意研究を重ね、抗〇−多糖抗体と同程度の
結合スペクトラム及び感染症治療効果をもつＬＰＳのコ
ア部位を認識するヒトモノクローナル抗体を本発明によ
って得た。これまでに、コアを認識しかつ高い感染治療
効果をもつモノクローナル抗体は、はとんど報告されて
いない。この特許明細に記載されているヒトモノクロー
ナル抗体ＭＨ−４Ｈ７は複数の血清型に結合し、かつ高
い感染治療効果を有している（特開平２−８４１９７）
。しかしながら骸抗体は、Ａ、Ｆ、Ｇ、Ｈ，に、Ｍ型に
４５から８６％と高頻度に結合するものの抗〇−多糖抗
体のようにある特定の血清型株全てに結合するものでは
ない。

本発明によって得られるモノクローナル抗体は本間血清
型Ｇ型に属するすべての臨床分離株に結合し、Ｇ型〇−
抗原を認識する抗体とほぼ同様の結合スペクトルを示す
。さらには、一部のＭ型とも交差反応する。該抗体はＬ
ＰＳの〇−多糖鎖ではなく、Ｏ−多糖のつけ根に存在す
るコア部位を認識することを特徴とする。

本発明を以下、更に詳細に説明する。

本発明に含まれるヒトモノクローナル抗体の製造方法は
、基本的に、以下の諸過程にわけることができる。

■抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞の調製、■無制限
増殖能力の賦与によるモノクローナルな特異抗体産生細
胞株の樹立 ■モノクローナルな特異抗体産生細胞株の培養■培養液
からのモノクローナルな特異抗体の精製■モノクローナ
ルな特異抗体を含む高力価免疫グロブリン製剤の調製 順次、以下に説明する。

ヒトのリンパ球Ｂ細胞とは、緑膿菌ＬＰＳ中のコアオリ
ゴ糖に対する抗体を産生ずるヒトリンパ系細胞で、主と
して末梢血液よりリンパ球分離液を用いた遠心分離法に
よって分離されるか、各種疾患の診断および治療の目的
で摘出されたリンパ節、肺臓などの臓器や澗帯血由来の
リンパ球Ｂ細胞を材料に用いることもできる。緑膿菌に
よる感染症を患ったことがあり、生体内で感作された既
往症のヒト由来のリンパ球Ｂ細胞を用いることが望まし
い。あらかじめ、血清中の緑膿菌菌体あるいは緑膿菌由
来のＬＰＳに対する抗体価を測定することにより適切な
リンパ球提供者を選別することができる。また、別の方
法として、緑膿菌症の有無を問わず、ヒトリンパ球Ｂ細
胞を採取し、試験管内にて抗原と混合することによって
感作せしめることができる。すなわち、抗原としての緑
膿菌ホルマリン死菌、もしくはｉｓ菌ＬＰＳをリンパ球
Ｂ細胞に添加する。更にアメリカヤマゴボウレクチン（
ＰＷＭ）などの植物白米レクチン、Ｃｏｗａｎ　Ｉなど
の菌体成分、又はヒトリンパ球の混合培養液や肺臓、胸
腺細胞や済帯血細胞培養液など、Ｂ細胞増殖因子および
Ｂｍｍ胞化化因子のリンフ才力イン類を含む溶液を同時
に、又はそれぞれの組み合わせで添加することによって
試験管内にて抗原感作し、引き続き抗体産生細胞へと増
殖・分化させたヒトリンパ球Ｂ細胞を用いることかでき
る。これらのヒトリンパ球Ｂ細胞は、その細胞表面に抗
体分子を有し、ある限られた期間少量の抗体を分泌する
ことが可能であるが、無制限に増殖することはできない
ことを特徴とする。抗原感作されたヒトリンパ球Ｂ細胞
を無限に連続して増殖可能な細胞株とする方法としては
、抗原感作されたヒトリンパ球細胞と骨髄腫細胞とをポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下に細胞融合す
る方法を用いる。用いられる骨髄腫細胞はＰ３ｘ６３−
Ａｇ　８（Ｐ３）　、　Ｐ３ｘ６３−Ａｇ　８．６５３
なとのマウス骨髄腫細胞由来のヒボキサンチン・グアニ
ン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＰＴと
略）欠如変異株、ヒト骨髄腫細胞Ｕ−２６６由来のＨＧ
ＰＲＴ欠如変異株又は、マウス骨髄腫細胞とヒト骨髄腫
細胞。

これら骨髄腫細胞とヒトリンパ球Ｂ細胞との細胞融合に
より得られるマウス・ヒトへテロ骨髄腫細胞由来の）Ｉ
ＧＰＲＴ欠如変異株（例えばＳＨＭ−Ｄ３３．３ＨＬ３
−６Ｊ）などを指す。骨髄腫細胞の代わりに、ヒトＢリ
ンパ芽球細胞由来のＨＧＰＡＴ欠如変異株を用いること
もできる。融合方法は、マウス細胞同志を融合し、マウ
スモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを取得
したＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎらの方法
（Ｎａｔｕｒｅ２５６、４９５．１９７５）に準する。

得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の培養上清中の、
緑膿菌菌体あるいはＬＰＳに対する抗体価を酵素免疫測
定法（εＬＩＳＡと略）又はラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡと略）によって測定し、更には、ウェスタン・プロ
ッティングの手法を併用することにより、緑膿菌ＬＰＳ
のコア部位に対する特異抗体産生株を選別する。限界希
釈法又は軟寒天法によって、クローニングを繰り返し、
増殖の早い、特異抗体産生量の多い、安定な細胞株を得
る。以上、′細胞融合法（ｃｅｌｌ　ｆｕｓｉｏｎ　ｍ
ｅｔｈｏｄ；　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ｍｅｔｈｏｄ）を
用いて、抗原感作ヒトリンパ球Ｂ細胞より樹立された細
胞株は、連続的に増殖することができること、しかも、
特異抗体を安定的に、かつ大量に産生じ得ることを特徴
とする。これら樹立されたハイブリドーマを通常の動物
細胞培養培地にてＣｏｔインキュベーターを使用して２
〜１０％Ｃ０ｆｆ１．３２〜３７℃の条件のもとて培養
フラスコやプレート等の容器内で静置培養又は回転培養
する。特に大量に培養する時は、動物細胞用に設計され
たジャーファーメンタ−やホロファイバーシステム等を
用いることもできる。通常の動物細胞培養用培地とは、
ウシ胎児、仔ウシ、ウシ、ウマおよびヒトなどの血清を
２〜２０％含有するＲＰＭＩ　１６４０　、Ｅａｇｌｅ
’ｓ　ＭＥＭ　ニ代表される培地、又は、インシュリン
、トランスフェリン、エタノールアミン、セレナイト、
ウシアルブミン、リピドなど細胞の増殖に必要な微量成
分を含む無血清培地を指す。

抗体の精製は通常の生化学的手法を組み合わせることに
よってなされる。すなわち、硫安沈澱分画法、ＰＥＧ分
画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマ
トグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、プロティン
Ａ、プロティンＧ等の抗体結合蛋白や抗原そのものをリ
ガンドとしたアフィニティクロマトグラフィー等である
。

精製されたヒトモノクローナル抗体は、生物学的製剤の
製剤化に通常用いられる方法によって製剤化される。基
本的には、メンブレンフィルター等による濾過除菌操作
の後に、安定化剤とともに滅菌バイアルに凍結乾燥され
る。

該ヒトモノクローナル抗体製剤は、緑膿菌感染予防・治
療剤として緑膿菌ＬＰＳコア部位に対する１種類のヒト
モノクローナル抗体より成ることも可能であるが、更に
好ましくは、緑膿菌ＬＰＳの〇−抗原多糖やコアオリゴ
糖の異なる化学構造に基づく抗原決定部位を認識する、
２種類以上のヒトモノクローナル抗体と混合して用いら
れる。また、これら以外の緑膿菌表層抗原、例えば外膜
蛋白、ペン毛あるいは線毛、さらには、緑膿菌由来の病
原因子である、外毒素、エラスターゼ、プロテアーゼな
どの外酵素などを認識するヒトモノクローナル抗体ある
いは従来型のヒト免疫グロブリン製剤と混合して使用′
される。

更には、緑膿菌以外の細菌、ウィルス、真菌、原虫、癌
細胞に対するヒトモノクローナル抗体、あるいは従来型
のヒト免疫グロブリン製剤と混合して使用することも可
能である。従来のヒト免疫グロブリン製剤に、本発明に
より得られるヒトモノクローナル抗体を添加して、緑膿
菌に対する高力価免疫グロブリン製剤とされる。

該ヒトモノクローナル抗体は、緑膿菌ＬＰＳ中のコア部
位への結合を介して緑膿菌表層へ結合して、菌体をオプ
ソニン化することにより倉食細胞による寅食・殺菌作用
の増強、又は補体を活性化することによる溶菌作用等に
より緑膿菌感染症を治療することができる。

□緑膿菌による感染症および、その細菌を含む混合細菌
感染症の治療・予防に用いられる時、該ヒトモノクロー
ナル抗体は、通常、成人に対し約０．５〜５００ｍｇ　
、好ましくは５〜５０ｍｇが投与される。

以上、詳しく述べたように、本発明によって得られるヒ
トモノクローナル抗体は同抗原に対して、高い抗体価を
有し、マウス実験的感染症の系で抗〇−多糖抗体と同様
に優れた治療効果を示すことが第一の特徴である。その
他、ヒト由来の蛋白であることより、異種蛋白の投与時
にみられるアナフィラキシ−等の副作用の少ないことが
期待され、特定の細胞より生産・精製される抗体である
ことより、不特定多数のヒト血液より製造された従来の
免疫グロブリン製剤にくらべ、未知のバイオハザードが
混入してくる可能性の低いことが特徴である。又、本モ
ノクローナル抗体の製造方法としては、生体外で、大量
に、高力価の抗体を安定して製造することが特徴であり
、従来のヒト血液より製造する方法にくらべ高力価など
生物活性の点で、安定的供給ができるなど品質管理の点
で優れる。

〈実施例〉 次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれのみに限定されないことは言うまでもな
い。

養 血清中の緑膿菌表層に対する抗体価が高い健常人ボラン
ティアより末梢血１００−を採取した。遠心管（５〇−
容）に１５ｒｎｌのモノポリ分離液（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ
、）を入れ、その上に更に末梢血２０１ｎｌを静かに重
層した。１５００　ｒ　ｐｍで、室温３０分間遠心分離
し、赤血球とリンパ球を分離した。リンパ球を含む画分
を回収し、イスコツ改変イーグルＭＥＭ　（以下Ｉ−Ｍ
ＥＭと略す）で３回洗浄した後、細胞数を計算した。そ
の結果、　１．４ｘｌＯ”個のリンパ球を得た。

得られた末梢血リンパ球６ｘｌＯ’細胞を、抗原として
ホルマリン処理緑膿菌死菌（ＩｒＤ　１００１　（Ａ型
）、■Ｄ１０２０　（Ｇ型）　、Ｉ１Ｄ　１０１０　（
Ｉ型）各０．０００２％）を含む６６−のリンパ球培養
用培地（後述）に懸濁し、１ウエルあたり１ｘｌＯ６個
のリンパ球細胞となるように２４ウエルマイクロプレー
ト（Ｃｏｓｔｅｒ）に分注し、５％ＣＯ２，３７℃にて
、６日間培養した。上記のリンパ球培養用培地とは、２
０％（Ｖ／Ｖ）の非動化したウシ胎児血清（以下ＦＣＳ
と略す。ＨｙＣｌｏｎｅ）、ピルビン酸ナトリウム（０
，０５■／ｍｌ　２−メルカプトエタノール（５ｘｌＯ
−’　Ｍ）、ウシ血漿来トランスフェリン（３０μｇ／
ｍ／；Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）　、０．０１％（ｖ／ｖ）　　ア
メリカヤマゴボウ由来植物レクチン（以下ＰＭＷと略す
。Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂ、）を含存するＲＰλ１１−１６
４０培地を指す。

（２）細胞融合 トリプルハイブリドーマ３ＨＬ３−６Ｊ−Ｃ５（東京理
科大学　千葉教授より分与）を１５％　ＦＣＳ　　含有
１−ＭＥＭで継代しておき、そのうち２．４ｘｌＯ”個
の細胞をｒ−ＭＥＭにて２回洗浄した。一方、上記の方
法で、末梢血リンパ球を６日間培養後、２４ウエルマイ
クロプレートより回収し、細胞数を計算したところ、１
．２ｘ１０１、個のリンパ球が回収された。このリンパ
球をＩ−ＭＥＭにて３回洗浄し、上記のトリプルハイブ
リドーマと混合し、遠心により細胞を沈査とした。

この沈査に、ｌ−のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）
溶液（０，４５ｇ　ＰＥＧ　４０００　Ｍｅｒｃｋ、　
０．４５　ｍｌ＋ＰＢｓ（−）、　０゜１ｍｌ＋ジメチ
ルスルフオキシド）を約１分間かけて遠心管を回転しつ
つ添加し、室温にて１分間静置した。

次に、［−ＭＥＭを１分間２ｘｔ’の割合で遠心管を回
転しつつ添加し、これを４回繰り返し、更に、１．５−
ＦＣＳを含むＩ−ＭＥＭで同様の操作を３回繰り返す。

最後に１．５ｄ　ＦＣＳを加えた後、３７＠Ｃにて２０
分間静置した。静置後、遠心により細胞を沈査として集
め、１５％ＦＣＳ、　５ｘｌＯ−’　Ｍ　　２−メルカ
プトエタノール、１００μＭヒボキサンチン、ＩＡ１ｇ
／ｍｌＡ１上リンを含む４０−の［−ＭＥＭ　（以下Ｈ
Ａｚ選択培地と略す）に懸濁して、１ウエルあたり　６
．０ＸＩＯ’個のミエローマ細胞となるように、９６ウ
エルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３０４０）に
１００μ／ずつ分注した。マイクロプレートには、あら
かじめ保護細胞として、各ウェルにマウスＢＡＬＢ／ｃ
肺臓細胞１ｘｌＯ’個、およびマウスＢＡＬＢ／ｃ腹腔
浸出細胞１ｘｌＯ’個となる様に前出の培地に対する懸
濁液を１００μｌずつ分注し、５％ＣＯ，，３７℃にて
１日培養しておく。このマイクロプレートを、５％ＣＯ
，，３７℃にて培養し、２−３日毎にＨＡｚ選択培地に
て半量を培地交換した。１週間後に、ＨＡｚ選択培地に
替えてＨＡｚ選択培地よりアザセリンを除いたＨ培地に
て、半量を培地交換した。その後は、アザセリン・ヒポ
キサンチンを含まないハイブリドーマ培養用　１−ＭＥ
Ｍ培地（１５％ＦＣＳ、　５Ｘ１０−６Ｍメルカプトエ
タノールを含むＩ−ＭＥＭ培地）にて、２−３日毎に半
量を培地交換した。融合後約３週間の時点で増殖の認め
られたウェルの培養上清について、緑膿菌をグルタルア
ルデヒドにより固定した９６ウエルマイクロプレート（
Ｆａｌｃｏｎ　＃３９２１）を用いたＥＬＩＳＡ法によ
り、緑膿菌表層抗原に対する抗体産生の有無を調べた。

緑膿菌は重量の分類による１７種類の血清型の標準株（
ＡＴＣＣおよび東大医科学研究所微生物保存施設から入
手可）を用いた。ｌウェルで複数の緑膿菌血清型別標準
株と強く反応する　［ｇＭ抗体を産生じていることを確
認した。このウェル中のバイブリドーマを拡大培養及び
、限界希釈法（ｌｉｍｉｔｔｉｎｇ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ
）により、クローニングを行い安定にヒト　ＩｇＭ抗体
を産生ずる細胞株ＯＭ−Ｉ　Ｄ６が得られた。更に、ク
ローニングによってＯＭ−Ｉ　Ｄ６を抗体産生量を低下
させることなく無血清培地（セルグロッサ−Ｈ；住友製
薬）に馴化させた。

以下、細胞株ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の産生ずるヒトモノクロー
ナル抗体に対してもＯＭ−Ｉ　Ｄ６の名称を用いる。ハ
イブリドーマＯＭ−１Ｄ６は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第３１５７号（ＦＥＲＭＢＰ−３１
５７）として寄託した。ヒトモノクローナル抗体ＯＭ−
１Ｄ６は［ｇＭ　　（μ、λ）であった。

（１）ＥＬＩＳＡによる抗緑膿菌抗体価の測定抗緑膿菌
表層抗原抗体価の測定は以下の方法で行った。波長６０
０ｎｍにおける吸光度が０．２となる様に緑膿菌をリン
酸緩衝液（ｐＨ７，２，組成ＮａＣ１（８ｇ／ｆ　）、
ＫＣＩ（０，２ｇ／　Ｉ！　）、　ＮａＨＰＯ４・１２
ＨｔＯ（２，９９ｇ／ｌ）およびＫＨ２ＰＯ，（０，２
ｇ／　Ｉ！　）　　；　Ｐ　Ｂ　Ｓと略）に懸濁し、９
６ウエルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ　＃３９１２
）（マイクロプレートと略）に１ウエル当たり５０μｆ
ずつ分注、２００Ｏｒｐｍ、　　１５分間遠沈した。１
％グルタルアルデヒドを１ウエル当たり５０μｌずつ添
加し、室温で１５分間インキュベートすることにより菌
体をマイクロプレートに固定した。マイクロプレートか
ら菌体溶液を除去した後、３％ウシ血清アルブミン（以
下ＢＳＡと略称する）ＰＢＳ溶液をｌウェルあたり１０
０μｌずっ分注し、３７℃にて３０分間インキュベート
することによりウェル表面の菌体の未吸着部分をブロッ
キングした。マイクロプレートを抗原吸着プレートとし
て以後の操作（、こ用いた。必要に応じてこの段階で一
２０″Ｃに保存した。

アッセイ前に抗原吸着プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ
　２０含有ＰＢＳ　（以下ＰＢＳＴと略）で３回洗浄し
た。その後、ＰＢＳＴをｌウェルあたり５０μｍ分注、
必要に応じＰＢＳで適宜希釈した試料（培養上清、血清
または精製抗体標品）をｌウェルあたり５０μ！加え、
３７°Ｃで２時間インキュベートした。その後試料を除
去し、ＰＢＳＴで３回洗浄した。続いて第２抗体を１ウ
エルあたり　１００μｌずつ加え、３７゜Ｃで２時間イ
ンキュベートした。第２抗体としてＰＢＳＴで５００−
１０００倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識アフ
イニテイ精製抗ヒト免疫グロブリン抗体（Ｋｉｒｋｅｇ
ａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ、　Ｉｎｃ、）を用
いた。ＩｇＧ、　［ｇＭ抗体価の測定にはそれぞれフォ
スファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体
を用いた。第２抗体を除去し、ＰＢＳＴで３回洗浄後、
発色基質溶液（１０％ジェタノールアミン緩衝液（ｐＨ
９，１）（ｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム塩３
　ｍｇ／　ｄの濃度（ＮａＮｓ　（０，２ｍｇ／ｌ＋ｔ
ｔ’）、　ＭｇＣｌ２−６８．０　（０，１ｍｇ／　ｒ
ｎｌ）　）をｌウェルあたり１００μｉ’ずつ加え、３
７°Ｃで反応させた。反応後のＯＤ４゜、をマルチスキ
ャン（Ｔｉｔｅｒｔｅｃｋ）で測定した。

（２）緑膿菌血清型別標準株との結合性抗緑膿菌ヒトモ
ノクローナル抗体０Ｍ−１０６の緑膿菌本間血清型別標
準株（東京大学医科学研究所菌株保存施設より分与）と
の反応をＥＬＩＳＡ法で調べた。各菌株はハートインフ
ュージョン寒天培地を用いて培養した。結果を表１に示
す。

表１　緑膿菌本間血清型別標準株との結合性血清型別　
　　菌　株　　　　ＥＬＩＳＡ値Ｍ　　　ｌ１Ｄ１０１
５　　　　　　　　０（３）ヒトモノクローナル抗体Ｏ
Ｍ−１Ｄ６の緑膿菌臨床分離株との結合性 ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の緑膿菌臨床分離株への結合をＥＬＩＳ
Ａ法によって検討した。臨床分離株は、当研究所で保存
しているものを用いた。Ａ型１９株、Ｂ型２０株、Ｅ型
２０株、Ｆ型５株、Ｇ型１９株、Ｈ型１３株、■型２０
株、Ｋ型３株、Ｍ型２０株について試験を行った。結果
を下表に示す。

表２　０Ｍ−Ｉ　Ｄ　６のＧ型臨床分離株への結合性菌
　株　　　ＥＬＩＳＡ値（ＯＤ４０５）ＳＰ　　９７２
８ａ　　　　　　１．６０表３　０Ｍ−１Ｄ６のＭ型苗
への結合性菌　　株　　　　　ＥＬＩＳＡ値　（ＯＤ４
０５）一方、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｈ，Ｉ、に型株について
は検討した菌株では、ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の結合性は全く認
められなかった。

０Ｍ−１０６の凝集活性を血清型別標準株のホルマリン
死菌を用いて、最小凝集抗体濃度として求めた。表３に
列記しである各標準株をハートインフュージョン寒天培
地を用いて培養し、菌体を１％ホルマリンで３７°Ｃ１
−夜装置した。得られたホルマリン死菌を６００ｎｍの
吸光度が０．２になる様にＰＢＳ（−）に懸濁し、これ
を５０μｌずつＵ字型９６ウエルマイクロプレート（住
人ベークライト）に分注した。そこに、２倍希釈系列を
とった抗体溶液を５０μｌずつ添加した。反応液を４℃
で一夜放置した後、凝集の有無を見た。

ＯＭ−Ｉ　Ｄ６とは結合スペクトルが異なるヒト抗緑膿
菌ＬＰＳコアモノクローナル抗体ＭＨ−４Ｈ７を対照と
した。結果を表４に示す。

以上の結果よりＯＭ−Ｉ　Ｄ６は、ＥＬＩＳＡ法で結合
の認められた株に対して特異的に凝集活性を有すること
が示された。

緑膿菌Ｇ型苗株であるｌ１Ｄ１０２０およびＦ−Ｄ　　
ｔｙｐｅ１株からのリボ多糖の調製は、ＷｅｓｔＰＦｌ
ａｌとＪａｎｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｃａｒｂｏｈ
ｙｄｒ、　Ｃｈｅｍ、、　５．　８３−９１．１９６５
）に準じて行った。即ち、ます緑膿菌をハート・インフ
ユージコン・ブイヨン培地（日永製薬）で対数増殖後期
まで培養し、遠心によって菌体を集めた。湿菌体を４５
％フェノールで６８°Ｃにて処理した後、３０００ｒｐ
ｍ、　１０℃、１５分遠心分離し、水層にリボ多糖を抽
出した。この水溶性画分を臭化セチルトリメチルアンモ
ニウムで脱核酸した後、エタノール沈澱をリポ多糖標品
とした。　Ｍ型苗株である５ＰＩ００６７株からのリボ
多糖はＬｌｃｈｉｄａとＭｉｚｕｓｈｉｍａの方法（Ａ
ｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　５１．３１０
７−３１１４．１９８７）に準じて行った。緑膿菌湿菌
体を２％　Ｔｒｉｔ。

ｎ　Ｘ　１００　／　５０　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ１＊　／
　ｌ　ＯｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁
し、１００°Ｃ１１Ｏ分間加熱する。冷却後、１５，０
００Ｘｇで１５分間遠心し、沈澱を更にｌ　ＯｍＭ　　
Ｍｇ　Ｃ］　＊を含む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）で１回洗う。得られた沈査から５０ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ／２％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００１０，５Ｍ　
　ＮａＣ１（ｐＨ８，０）に懸濁し、３７°Ｃで６０分
分間上うしながらインキュベートして、ＬＰＳを可溶化
する。

１５．０００Ｘｇ、１５分間遠心し、その上清を回収す
る。得られた上滑に最終濃度が０．１ＭとなるようにＭ
　ｇ　Ｃ１！を添加し、３７℃、６０分間インキュベー
トする。得られた溶液を、直ちに１５℃で１００、ＯＯ
ＯＸｇ、９０分間遠心する。沈澱をｌＯｍ　Ｍ　　Ｍ　
ｇ　Ｃ１＊を含むｌＯｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，
０）に懸濁して１００，０００Ｘｇで遠沈させ沈澱を１
回洗う。得られた沈澱を、脱イオン水に懸濁後、脱イオ
ン水に対して透析、凍結乾燥する。これをリボ多糖標品
とした。

得られたリボ多糖をサンプルバッファー（３１ｍ＾（ト
リスバッファーｐＨ６，８／１．５％５ＤＳ１５％グリ
セロール／２、５％メルカプトエタノール１０．００５
％ＢＰＢ）で１００°Ｃ０５分処理後、０．２％ＳＤＳ
を含む１２．５％ポリアクリルアミドスラブゲルにて電
気泳動後、デュラボア・フィルター（ミリポア）にを用
いてトランスファーした。このフィルターを３％カゼイ
ンのＰＢＳ溶液に浸してブロッキングした後、ｌμｇ／
−の濃度のＯＭ−１Ｄ６溶液に浸し、浸とうしながら室
温で２時間インキュベートする。フィルターをＰＢＳＴ
で洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒト
［ｇＭ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂ。

Ｉｎｃ、　、　）溶液に浸して室温で２時間インキュベ
ートする。フィルターを基質溶液［５−ブロモ−４−ク
ロロインドイルリン酸ナトリウム（０，５ｍｇ／ｍｌ）
を０．１ｍｇ／ｍｌ　　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０，０，１
％　アジ化ナトリウムを含む１０％エタノールアミン緩
衝液（ｐＨ９，１’）に溶解したもの］に浸し、室温で
反応させる。以上に示す酵素抗体染色法により、ヒトモ
ノクローナル抗体が認識している抗原を同定した。ＬＰ
Ｓの泳動像は、同一試料を泳動したゲルを銀染色法（Ｂ
ｉｏ　Ｒａｄ製キット）によって検出した。

銀染色の結果、Ｇ型株であるｌ１Ｄ１０２０．Ｆ−Ｄ　
　ｔｙｐｅｌ由来のＬＰＳでは高分子量部分に〇−多糖
を有するスムース型ＬＰＳのハシゴ状の一連のバンドも
しくはスメア−状の染色が認められた。

このＬＰＳに特徴的なバンドは、０多糖の繰り返し単位
の数の不均一さに起因している。更に、低分子量部分に
は、ブロードなシングルバンドもしくは数本のバンドが
見られ、これらは〇−多糖をもたないもしくは繰り返し
を数単位しかもたないラフ型、セミラフ型ＬＰＳのバン
ドである。ラフの性質をもつＭ型株である５Ｐ１００６
７では、ラフ型のＬＰＳのバンド、即ち低分子量部分の
ブロードなシングルバンドのみが認められた。

免疫染色の結果は、Ｇ型９Ｍ型株由来のリボ多糖共に、
低分子量部分、即ち〇−多糖か短いセミラフ型もしくは
全く存在しないラフ型リポ多糖の位置に強い発色が認め
られた。銀染色で見られる〇−多糖繰り返し構造を存す
るスムース型リポ多糖のハシゴ状のバンドに相当する部
分には、ＯＭ−Ｉ　Ｄ６による反応は全く見られないか
、ごく僅かな発色しか認められなかった。この結果は、
ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の認識部位がＬＰＳ中の〇−抗原ではな
いことを示している。

性 ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の結合特異性について緑膿菌以外の菌種
由来のＬＰＳについて検討した。実験は、以下に示す通
りＬＰＳを固相抗原としたＥＬＩＳＡ法によった。用い
たＬＰＳは、大腸菌０１１１：Ｂ４゜Ｊ５．に２３５，
０５５　：Ｂ５，０１２７　：Ｂ８゜０２６：Ｂ６．Ｄ
３１ｍ４．サルモネラ・ミネソタ野生型、Ｒ６０，Ｒ３
４５，Ｒ５，Ｒ７，Ｒ５９５、サルモネラ・チフィムリ
ウムＡＴＣＣ１４０２８゜クレブシェラ・ニューモニア
ＡＴＣＣ１００３１゜エルシニア・エンテロコリティ力
ＡＴＣＣ２７７２９、ビブリオ・コレラ稲葉型５６９Ｂ
、セラチア・マルヶセンスＡＴＣＣ１４７５６（以上、
Ｌｉ５ｔ　Ｂｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ
、、　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　ＣＡ、より購入）、大腸菌
０１１３．サルモネラ・エンテリディナス。サルモネラ
・チフィムリウムＧ３０／Ｃ２１、シュウトモナス・フ
ルオレッセンス（Ｒｉｂｉ　１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、　Ｈａｍｉｌｔｏｎ、　Ｍ
Ａ、より購入）である。

ＬＰＳを２５μｇ　／　ｍｌの濃度で重炭酸緩衝液（１
５ｍＭ　　Ｎａ＊ＣＯ＊　、３０ｍＭ　　ＮａＨＣＯｓ
　。

３ｍＭ　　ＮａＮ＊　　；　ｐＨ９，５５）に溶解し、
９６ウエルプレートに５０μｍずつ分注して４℃で一夜
放置する。液を捨てて、抗体の非特異的な吸着をブロッ
クするために１％牛血清アルブミンを１００μｌずつ分
注して３７℃で２時間インキュベートする。

液を捨てた後、プレートを減圧下で乾燥させて、−２０
℃に保存する。ＥＬＩＳＡの方法は前述の方法に従った
。

ＥＬＩＳＡの結果、ＯＭ−１Ｄ６は緑膿菌Ｆ−Ｄｔｙｐ
ｅｔ株由来のＬＰＳに対して４０５１ｍの吸光度１．５
２と高い結合活性を有したか、一方検討した上記の他菌
種由来のＬＰＳとは全く結合しなかった。この結果は、
ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の認識部位がＬＰＳ中でダラム陰性菌全
般に共通性の高い内コア部位、もしくはリビドＡ部位に
は存在しないことを示唆している。

ＯＭ−Ｉ　Ｄ６のＬＰＳコア抗原に対する結合を単糖が
阻害するか否かを検討した。単糖はＤ−グルコース、Ｄ
−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｌ−ラムノース、Ｌ
−フコース、Ｄ−フコース、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、グルクロ
ン酸（いずれもナカライテスクより購入）を用いた。Ｏ
Ｍ−Ｉ　Ｄ６溶液（ｌμｇ／ｍ１）と種々の濃度の単糖
水溶液を等量を混和し、３７℃、１時間インキュベート
する。反応混液を実施例５に従って、緑膿菌ｌ１Ｄ１０
２０株由来のＬＰＳを固相抗原としたＥＬ　Ｉ　ＳＡに
供した。４０５ｎｍの吸光度を測定し、単糖を共存させ
ないときの吸光度を１００％として、阻害率を計算した
。

ＯＭ−１Ｄ６の抗原への結合は、Ｌ−ラムノースを０．
１Ｍ添加したときに４６％、ＩＭのときに８９％の阻害
が認められた。一方、検討した他の単糖ではＩＭの濃度
で添加しても有為な阻害活性は全く認められなかった。

以上の結果は、ＯＭ−Ｉ　Ｄ６の抗原への結合をＬ−ラ
ムノースか特異的に阻害していることを示している。

緑膿菌臨床分離株５Ｐ６７８８，５Ｐ９７９２　（いず
れもＧＷ）をそれぞれ５％ムチンに懸濁させ、ＩＣＲマ
ウス（４週令、雄、−群１０匹）の腹腔内に接種し、感
染させた。１時間後にヒトモノクローナル抗体ＯＭ−Ｉ
　Ｄ６を０．１　ｔｔ　ｇ／ｈｅａｄ腹腔内投与し、１
週間後の生存率をもって、治療効果を判定した。

非投与群及び、トリプルハイブリドーマ３ＨＬ３−６Ｊ
−Ｃ５をセルグロッサ−Ｈで培養して得た培養上清投与
群を対照とした。その結果を表５，６に示す。

ＯＭ−１Ｄ６は、Ｇ型の緑膿菌臨床分離株Ｃ：（二よる
実験的感染症において、有効な治療効果を示した。

更に、ＯＭ−Ｉ　Ｄ６とは結合スペクトラム（よ異なる
抗ＬＰＳコア抗体ＭＨ−４Ｈ７の感染症治療効果と比較
した。結果を表６に示す。ＯＭ−１Ｄ６１よ、ＭＨ−４
Ｈ７と同等の強い感染治療効果を示した。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の性質、 〔１〕緑膿菌リボ多糖のコア部位に存在し、 〔２〕緑膿菌本間血清型Ｇに属する臨床分離株のすべて
   に存在し、 〔３〕Ｇ型Ｏ−抗原多糖部位ではなく、 〔４〕緑膿菌本間血清型Ｇ型以外の血清型株の一部と交
   差反応する により表される抗原決定基を認識することを特徴とする
   ヒトモノクローナル抗体
2. （２）本間血清型Ｇ型に属する緑膿菌による感染症に対
   して治療効果を有する第１請求項記載のヒトモノクロー
   ナル抗体
3. （３）ＩｇＭであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項あるいは第２請求項記載のヒトモノクローナル抗体
4. （４）ヒトモノクローナル抗体ＯＭ−１Ｄ６（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−３１５７）
5. （５）特許請求の範囲第１、第２あるいは第３項記載の
   ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマおよ
   びその子孫細胞系
6. （６）ハイブリドーマＯＭ−１Ｄ６およびその子孫細胞
   系
7. （７）特許請求の範囲第１、第２あるいは第３項記載の
   ヒトモノクローナル抗体を少なくとも一種類含有する緑
   膿菌感染症予防・治療薬