JPH0355106B2

JPH0355106B2 -

Info

Publication number: JPH0355106B2
Application number: JP59273156A
Authority: JP
Priority date: 1984-12-26
Filing date: 1984-12-26
Publication date: 1991-08-22
Also published as: JPS61152281A

Description

【発明の詳細な説明】

(イ) 産業上の利用分野本発明は、緑膿菌のHommaの型別において、
１型、５型、７型、８型及び10型のいずれかの血
清型を産生するマウス−ヒトハイブリドーマとそ
の製造法、並びにその使用方法に関する。その目
的とするところは、緑膿菌感染症の診断及び治療
等に役立つところの緑膿菌のHommaの型別にお
いて、１型、５型、７型、８型及び10型のいずれ
かの血清型を産生する、マウス−ヒトハイブリド
ーマを提供することにある。 (ロ) 従来の技術緑膿菌（シユードモナス・エルギノーサ、
Pseudomonas aeruginosa）は本来病原性の低い
菌であるが、最近は、抗生物質の投与による菌交
代性増殖の結果、薬剤耐性緑膿菌による感染症が
増え、しばしば免疫不全、とりわけシステイツク
フアイブローシス（のう胞性線維症）、熱傷、
ガン等の患者に発症し重篤な症状を呈するように
なつている。この感染症においては、緑膿菌が薬
剤耐性をもつていることが多いため、又患者の免
疫力が弱まつている等のため、抗生物質による治
療が必ずしも十分な威力を発揮しないという問題
がある。従つて、抗緑膿菌抗体によるいわゆる免
疫療法が考えられ研究されつつあるが、未だ臨床
に供されるに至つていない。また、緑膿菌感染症
の治療を適格に行なうためには、その早期診断が
必要であるが、従来の抗血清を用いる方法では満
足すべき状況にないという問題がある。これらの
問題点を解決するためには、抗緑膿菌モノクロー
ナル抗体が必要である。一方、緑膿菌の表面抗原としては、リポ多糖
（LPS）、外層蛋白（outer membrane protein、
OMP）、ベン毛、スライム由来の多糖等が知られ
ている。このうちLPSは緑膿菌の血清型を決定す
るＯ−多糖側鎖を有し、今まで１から16までの16
種類の血清型（Hommaの分類による）が知られ
ている。LPSはＯ−多糖側鎖の他にコアーリージ
ヨン、リピドＡを有し、リピドＡが緑膿菌の外層
（outer membrane）にうずもれ、これより２−
ケト−３−デオキシオクトン酸を介しコアーリー
ジヨンが外層外に伸び、コアーリージヨンからＯ
−多糖側鎖が更に外側に伸展している。LPSに対
する抗体は、ヒトや動物において作られやすく、
感染防御的に働く事が知られている。抗LPS抗体
は緑膿菌のLPSと結合し、この抗原抗体複合体に
補体が結合し、免疫溶菌を受けるか、もしくは多
形核白血球などの食細胞により処理され、生体が
緑膿菌感染症から免がれる事ができると言われて
いる。緑膿菌の感染が成立している患者では、緑
膿菌抗原が多く、抗LPS抗体が不足になりがちで
ある。これを防ぎ治療するために、従来からヒト
の血液から調製した1gG製剤が使われてきたが、
その製剤に含まれている緑膿菌の抗体価は極めて
少なく、感染治療上十分ではなかつた。ところで、細胞融合の技術を用いて、特異的な
抗体を産生するやがては死滅する運命にあるリン
パ球又はＢ細胞（抗体産生細胞）と、培養器の中
で永久に増殖しつづけるミエローマ細胞（骨髄腫
細胞）を融合させることにより、モノクローナル
を永続的に産生分泌するハイブリドーマ（融合細
胞）株を樹立させる方法は公知である。そして、
モノクローナルな抗緑膿菌抗体を得ようとする場
合には、抗緑膿菌抗体産生細胞とミエローマ細胞
とを融合させ、クローニングによつて抗緑膿菌抗
体産生性のハイブリドーマを得ればよいことは一
般論としては知られている。そして、具体的に
は、例えば、特開昭59−29622号公報には、緑膿
菌のLPSで免疫されたBALB／Ｃマウスの脾臓細
胞（抗体産生細胞）と、マウスのミエローマ細胞
（P3−X63−Ag8−U1株）とを融合させハイブリ
ドーマを得、これをクローニングすることによつ
て、モノクローナルな抗緑膿菌マウス抗体を産生
するハイブリドーマを得たことが開示されてい
る。 (ハ) 発明が解決しようとする問題点以上のごとく、抗緑膿菌抗体を産生するハイブ
リドーマに関しては、具体的な成功例は抗緑膿菌
マウス抗体を産生するマウス−マウスハイブリド
ーマだけである。しかし、ヒトの病気の診断や治
療のためには、同種タンパクである抗緑膿菌ヒト
抗体の方が有用でかつ安全であり、そのために
は、ヒトの抗体産生細胞を用いてマウス−ヒトハ
イブリドーマやヒト−ヒトハイブリドーマを樹立
する必要がある。しかしながら、動物の場合と異
なり、ヒトの場合には、ヒトをあらかじめ多量の
緑膿菌やその表面抗原で免疫し、有効に刺激され
た抗体産生細胞を採取して細胞融合に用いるとい
つた方法をとるわけにはいかないので、適切な抗
体産生細胞の採取・調整が困難であるといつた問
題等があり、未だ明確な成功例の報告がない。 (エ) 問題点を解決するための手段本発明者らは、抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマ
ウス−ヒトハイブリドーマを得ることを目的とし
て鋭意研究を行なつた結果、まず、抗緑膿菌抗体
を産生するヒトの細胞を多く含む組織を選別し、
この組織の細胞とマウスのミエローマ細胞とを融
合させるという方法によつて、緑膿菌のHomma
の型別において、１型、５型、７型、８型及び10
型のいずれかの血清型を産生するマウス−ヒトハ
イブリドーマを得ることができた。本発明においてヒトの抗体産生細胞とは、ヒト
のリンパ球（又はＢ細胞）であつて、抗体を分泌
している又は分泌する能力を持つた細胞をいう。
これは脾臓、リンパ節、末梢血、骨髄、扁桃、ア
デノイド等の細胞の中に含まれている。本発明の
目的のためには、いかなるソースのリンパ球でも
用いることができるが、好ましいのは扁桃腺又は
脾臓から採取されたものである。マウスのミエローマ細胞としては、８−アザグ
アニン耐性株を用いるのが有利であり、公知のも
のとしては、BLAB／ｃマウスのP3−X63−
Ag8、P3−X63−Ag8−U1、P3−NS1／１−
Ag4−１、P3−X63−Ag8−6.5.3、SP2／Ｏ−
Ag14、FO、MPC11−45.6TG1.7などがある。本発明においては、抗原としては、以下LPSを
用いた場合について説明する。まず、抗原である
特定のLPSを有する緑膿菌を選ぶ。次にヒトのリ
ンパ球を扁桃腺、リンパ節、脾臓及び末梢血等の
組織からモノヌクリアーセル（単核細胞）として
調製する。モノヌクリアーセルを５日〜７日、ポ
ークウイードマイトジエン等のマイト−ジエンの
添加もしくは無添加の条件下で、５％CO₂インキ
ユベーターで培養し、その培養上清液中の抗体
を、緑膿菌を固定したプレートで酵素抗体法
（ELISA）により測定し、望ましいモノヌクリア
ーセルを含む組織を選ぶ。次いで、この組織のリ
ンパ球とマウスのミエローマ細胞を融合させ、ハ
イブリドーマの異質集落を形成させる。細胞融合
は公知の方法で行なうことができる。例えば、抗
体産生細胞とミエローマ細胞融を10：１〜１：
10、好ましくは１：１〜１：３の比率で混合し、
適当な細胞融合用溶液、例えば約35％ポリエチレ
ングリコール（分子量1000〜6000程度）および約
75％ジメチルスルホキシドを含むRPMI1640を加
えて、室温37℃で１〜数分間攪拌し、その後10％
FCS加RPMI1640で徐々に希釈し、洗浄の後
HAT（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミ
ジン）選択培養液にて細胞濃度が１〜５×10⁵
個／mlとなるように調整する。これを0.2mlずつ、
例えば96穴プレートに分注し、５％CO₂を含む空
気中で35〜38℃で２〜３週間培養する。HAT培
養液中ではハイブリドーマのみが生存し、８−ア
ザグアニン耐性のミエローマ細胞及びミエローマ
同士の融合細胞は生存し得ない（未融合の抗体産
生細胞は数日で死滅する）。次に、このハイブリ
ドーマ集落から、緑膿菌LPSに対し特異的なヒト
モノクローナル抗体を分泌するものだけ選別す
る。この選別工程（クローニング）は、異なるハ
イブリドーマより産生されたヒトモノクローナル
抗体を、目的とする血清型を有する緑膿菌又は緑
膿菌LPSを固定したプレートを用いて、酵素抗体
法を用いて行なう事ができる。全ての緑膿菌の血
清型に反応するヒトモノクローナル抗体を得る為
には、16種類の異る血清型の緑膿菌を使用しなく
てはならない。これらの緑膿菌は、アメリカンタ
イプカルチヤーコレクシヨン（ATCC）等から入
手できる。次に、選択したハイブリドーマを培養して、所
望の特異的ヒトモノクローナル抗体を生成させ
る。クローニングによつて選択された、本発明の抗
緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイブリ
ドーマは、凍結して保存することができ、また、
これを適当な方法で大量に培養することもでき
る。かかるセルライン（細胞株）又は複製された
細胞も本発明の範囲に含まれるものである。ま
た、クローン化されたハイブリドーマと実質的に
同一の抗緑膿菌ヒト抗体を産生する限り、その変
異株等も本発明の範囲に含まれる。 (ホ) 発明の効果本発明のハイブリドーマを、適当な方法で大量
に培養すると、培養上清から、例えば、緑膿菌の
LPSに特異的に結合するモノクローナルな抗緑膿
菌ヒト抗体を得ることができる。また、このハイ
ブリドーマを動物に移植して腫瘍化し、その腹水
や血清から抗緑膿菌ヒト抗体を得ることもでき
る。抗緑膿菌ヒト抗体の精製は、モノクローナル
抗体を用いるアフイニテイクロマトグラフイー等
の方法によつて行なわれる。本発明のハイブリドーマは、緑膿菌の、例えば
LPSに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体
を提供し、かかる抗緑膿菌抗体は、緑膿菌感染症
の患者に投与する事により、血中に抗LPS抗体の
力価を有意に上昇せしめ、治療を達成する事がで
きる。また、モノクローナル抗体は、高い精度と
信頼度をもつ緑膿菌の検査試薬や標識試薬などに
応用できる。 (ヘ) 実施例以下、実施例により本発明を詳述する。実施例１ (1) 抗緑膿菌抗体産生細胞の選別８人の扁桃炎患者より８ロツトの扁桃腺を
得、これよりフアイコールパツクを用いモノヌ
クリアーセルを調製した。細胞濃度が５×
10⁶／mlになる様に、モノヌクリアーセルを培
養液Ａ（RPMI1640＋10％胎児牛血清＋２ｍＭ
グルタミン＋１ｍＭピリジン酸＋0.02mg／mlセ
リン＋80μｇ／mlゲンタマイシン）に浮遊さ
せ、これに、ポークウイードマイトジエン
（PWM）を20μｇ／mlになる様に加えた。この
試料を200μづつ培養プレートに入れ、CO₂イ
ンキユベーター（５％CO₂）で６〜７日培養し
た。その後、それぞれの培養上清液100μを、
緑膿菌をコートしたプレートに移し、ELISA
で測定を行つたところ、１ロツトだけ強く抗緑
膿菌抗体を産生していた。このロツトのモノヌ
クリアーセルを、マウスミエローマP3−X63−
Ag8−U1（以下P3U1と略記する）との細胞融
合に用いた。 (2) 細胞融合前もつてP3U1を培養液Ａ中で培養しておい
た。使用時の細胞濃度は６×10⁵個／mlであつ
た。上記の抗緑膿菌抗体産生がすぐれていた扁
桃腺ロツトのリンパ球とP3U1を、それぞれ
別々に無血清RPMI1640で２回洗浄した。そし
て、リンパ球と５×10⁶個のP3U1とを試験管の
中で一緒にし、次いで1500rpmで５分間遠心
し、上清を捨てた。細胞ペレツトを、試験管を
たたくことによつて、よく分散させた。これに
0.5mlのポリエチレングリコール液
（RPMI1640 5.75ml＋ポリエチレングリコール
1500 3.5ml＋ジメチルスルホキサイド0.7ml）
（PEG液と略記する）を加えて、細胞をゆるや
かに浮遊させた。１分後に0.5mlのRPMI640を
加え、さらに１分後に１mlRPMI、さらに２分
後に４mlのHAT培養液（RPMI1640＋20％胎
児牛血清＋80μｇ／mlゲンタマインシン＋
95μMヒポキサンチン＋0.4μMアミノプテリン
＋1.6μMチミジン）、さらに２分後には４mlの
HAT培養液を加えた。最後に、HAT培養液
で25ml細胞浮遊液とした。これを培養プレート
（96穴）１枚に蒔いて、37℃、５％CO₂含有空
気中で培養した。一週間毎に半量の培養液を新
しいHT培養液（HATからＡを除去したもの）
で交換していきハイブリドーマを得た。 (3) クローニング及び培養得られたハイブリドーマの上清を、ホルマリ
ン死滅緑膿菌をコーテイングしたプレートを用
いてELISA法で測定を行つた結果、緑膿菌血
清型Homma type5に結合するヒトモノクロー
ナル抗体P3を得た。そこで、P3を産生するハ
イブリドーマを、２回限界希釈法によりクロー
ニングを行い（96穴プレート２枚）、最終的に
P3D9というヒトモノクローナル抗体（IgG、
λ）を産生するマウス−ヒトハイブリドーマを
得た。本ハイブリドーマを、無血清培地RDF／
TES培地（Proc.Natl.Acod.Sci.USA vol.79、
1158−1162参照）１で培養を行い、P3D9を
含む培養液を限外濾過膜PM30（アミコン社製）
を用いて濃縮を行い、30mlとした。そして、
DEAE−Sephacelでカラムクロマトを行い、
P3D9を精製し、12mgを得た。実施例２ヒトの脾細胞を用いる以外は、実施例１の場合
と同様にして、抗体産生細胞の選別及び細胞融合
を行なつた。得られたハイブリドーマの上清を、
ホルマリン死滅緑膿菌をコーテイングしたプレー
トを用いてELISA法で測定を行つた結果、緑膿
菌血清型Homma type2、Homma type7、
Homma type13のいずれとも結合するヒトモノ
クローナル抗体B8を得た。B8を産生するハイブ
リドーマを、２回限界希釈法によりクローニング
を行い、B8E2というヒトモノクローナル抗体
（IgG、λ）を産生するマウス−ヒトハイブリド
ーマを得た。本ハイブリドーマを、10％FCSRPMI16401
で培養を行い、B8E2を硫安沈澱（50％飽和）に
より回収した。DEAE−Sephacelで部分精製を
行つた。ヒトIg量は、一元平板免疫拡散法
（SRID）により定量を行い、８mgのB8E2を含む
抗体溶液を得た。本モノクローナル抗体は、
Homma type2、Homma type7及びHomma
type13から、Johnson and Perry（Can.J.
microbiol.1976 vol.22、29−34）の方法により抽
出したLPS及びその熱処理（100℃−30分）LPS
をコーテイングしたプレートを用いたELISA法
で、それぞれのLPSに結合する事が確められ、
LPSを認識するモノクローナル抗体である事がわ
かつた。実施例３ヒトの扁桃腺細胞を用い、実施例１の場合と同
様にして、抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行
なつた。得られたハイブリドーマの上清を、ホル
マリン死滅緑膿菌をコーテイングしたプレートを
用いてELISA法で測定を行つた結果、緑膿菌血
清型Homma type1に結合する31−７、同type7
に結合する31−８、同type8に結合する31−９、
及び同type10に結合する31−12を得た。これらの
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マを、限界希釈法及び軟寒天法により２回クロー
ニングを行い（96穴プレート５枚）、それぞれ31
−７−2A、31−８−5G、31−９−F4、31−12−
H3のヒト型IgGを産生するハイブリドーマを得
た。かかるハイブリドーマを実施例２と同様の方法
で培養し、部分精製を行い、それぞれのモノクロ
ーナル抗体が反応する抗原部位を決定すべく、
LPS及び熱処理（100度×2hr）LPSとの結合性を
ELISA法により実施した。その結果を第１表に
示した（反応時間は60分）。

【表】第３表から、ヒトモノクローナル抗体はそれぞ
れ特異的なLPSに結合していることがわかる。実施例４ヒトの扁桃腺細胞を用いて、実施例１の場合と
同様に抗体産生細胞の選別及び細胞融合を行つ
た。得られたハイブリドーマの上清を、ホルマリ
ン死滅緑膿菌をコーテイングしたプレートを用い
て、第２次抗体をヤギ抗ヒトIgM抗体（アルカリ
フオスフアターゼ標識）として、ELISA法によ
る測定を行つた結果、血清型がHomma type5、
type7、type8に反応するIgM型ヒトモノクローナ
ル抗体が得られた。これらのヒトモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマを、限界希釈法及
び軟寒天法により２回クローニングを行い、それ
ぞれ、313−ａ、313−ｂ、313−ｃのヒトモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマを得た。
その後、実施例２と同様の方法により部分精製を
行い、それぞれのモノクローナル抗体が反応する
抗原部位を決定すべく、LPS及び熱処理LPSとの
結合性をELISA法により検討した。その結果を
第２表に示した。

【表】スコアーである。
実施例５緑膿菌敗血症患者の末梢リンパ球を用いて、実
施例１の場合と同様に細胞融合を行ない、スクリ
ーニングによりHomma type5にのみ反応するヒ
トIgAモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ4H11D10を得た。4H11D10は血清型type5の
９つの株にはすべて反応した。結果は第３表に示
した。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ヒトの抗緑膿菌抗体産生細胞とマウスのミエ
ローマ細胞とを融合させて得られた、緑膿菌の
Hommaの型別において、１型、５型、７型、８
型及び10型のいずれかの血清型を特異的に認識す
る抗緑膿菌ヒト抗体を産生するマウス−ヒトハイ
ブリドーマ及びそれに由来する細胞株。２産生される抗緑膿菌ヒト抗体がIgG抗体であ
る、特許請求の範囲第１項記載のマウス−ヒトハ
イブリドーマ及びそれに由来する細胞株。３ヒトの抗体産生細胞が扁桃腺または脾臓から
採取された細胞である、特許請求の範囲第１項記
載のマウス−ヒトハイブリドーマ及びそれに由来
する細胞株。４ヒトの抗体産生細胞組織から抗緑膿菌抗体を
産生する細胞を多く含む組織を選別し、次いで該
組織の細胞とマウスのミエローマ細胞とを融合さ
せることを特徴とする、緑膿菌のHommaの型別
において、１型、５型、７型、８型及び10型のい
ずれかの血清型を特異的に認識する抗緑膿菌ヒト
抗体を産生するマウス−ヒトハイブリドーマの製
造法。５増殖せしめた細胞から抗緑膿菌ヒト抗体を得
るために、増殖用の細胞として、ヒトの抗緑膿菌
抗体産生細胞とマウスのミエローマ細胞を融合さ
せて得られた、緑膿菌のHommaの型別におい
て、１型、５型、７型、８型及び10型のいずれか
の血清型を特異的に認識する抗緑膿菌ヒト抗体を
産生するマウス−ヒトハイブリドーマ及び／又は
該ハイブリドーマに由来する細胞株を使用するこ
とを特徴とする方法。