JPS6187630A

JPS6187630A - 単純ヘルペスウイルスに対するヒトモノクロ−ナル抗体及びその製造法

Info

Publication number: JPS6187630A
Application number: JP59209630A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiko Masuyasu; 安彦増保; Yoichi Matsumoto; 洋一松本; Toru Sugano; 徹菅野; Katsuhiko Tomibe; 富部　克彦
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1984-10-08
Filing date: 1984-10-08
Publication date: 1986-05-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（イ）　産業上の利用分野本発明は、単純ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍ
ｐｌ＠ｘ　　ｖｉｒｕｓ　、　Ｈ８Ｖ　）に対するヒト
モノクー−ナル抗体とその製造法に関する。その目的と
するところは、　Ｈ８Ｖ　１　ｍ又は２型によるウィル
ス感染症の診断及び治療等に役立つところの抗Ｈ８Ｖヒ
トモノクローナル抗体を提供することにある。

（−）　　従来技術細胞融合の技術を用いて、特異的な抗体を産生するがや
がては死滅する運命にあるリンパ球又はＢ１１ａ（抗体
産生細胞）と、培養器の中で永久に増殖しつづけるミエ
ローマｍＦ１（骨Ｍ腫細胞）を融合させることによシ、
特異抗体を永続的に産生分泌するハイブリドーマ（融合
細胞）株を樹立させる方法は公知である。

かかる方法によって作成されたハイブリドーマが産生ず
る七ツクｐ−ナル抗体は、高い精度と信頼度をもつ純粋
な化学試薬として、検査試薬や標識試薬、アフイニテイ
ークロマトゲラフイーなどに応用ができる他、各種疾病
の治療薬、予防薬としての応用も期待できるものである
。

ところで、モノクローナルなウィルス抗体を得ようとす
る場合には、ウィルス抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させ、クローニングによってウィルス抗体産生性
の・・イブリドーマを得ればよいことは一般論としては
知られている。そして、具体的には、例えば、特公昭５
９−２２７６号公報には、インフルエンザウィルス又は
狂犬病ウィルスで免疫されたＢＡＬＢ／Ｃマウスの膵臓
細胞（抗体産性細胞）と、同種のマウスのミエローマ細
胞とを融合させ・・イブリドーマを得、これをクローニ
ングＣることによって、モノクローナルな抗ウィルス・
マウス抗体を産生ずるノーイプリドーマを得たことが開
示されている。また、特開昭５８−１７５４８９号公報
には、単純ヘルペスウィルスで免疫したマウスの膵臓細
胞とマウスのミエローマ細胞とを融合させ、抗単純へル
ペスウイルス・マウス抗体を産生ずる・〜イプリドーマ
を得たことが開示されている。

（ハ）　発明が解決しようとする問題点以上のごとく、
抗ウイルス抗体を熾生ずるハイブリドーマに関しては、
具体的な成功例は抗ウィルス・マウス抗体を産生ずるマ
ウス−マウスハイブリドーマだけである。しかし、ヒト
の病気の治療等のためには、同種タンパクである抗ウィ
ルス・ヒト抗体の方が有用でかつ安全であり、そのため
Ｋは、ヒトの抗体産生細胞を用いてマウス−ヒトハイブ
リドーマやヒト−ヒトハイブリドーマを樹立する必要が
ある。しかしながら、動物の場合と異なり、ヒトの場合
には、ヒトをあらかじめ多量のウィルスで免疫し有効Ｋ
　３１ｉ１１　激された抗体産生細胞を採取して細胞融
合に用いるといった方法をとるわけにはいかないので、
適切な抗体産生細胞の採取、調整が困難であるといった
問題等があり、未だ明確な成功例の報告がない。

に）　問題点を解決するための手段（その１）本発明者
らは、抗Ｈ８Ｖ・ヒトモノクローナル抗体を得ることを
目的として鋭意研究を行なった結果、　　ｉｎ　　ｖｉ
ｔｒｏでマイト−ジエンの存在下Ｋ　Ｈ８Ｖ又はＨ８Ｖ
由来の蛋白若しくは糖蛋白で感作したヒトの抗体産生細
胞と、マウスのミエローマ細胞とを融合させるという方
法によって、抗Ｉ（ＳＶヒトモノクローナル抗体を産生
するマウス−ヒト・−、イブリドーマを得ることができ
た。そして、この）為イブリドーマ及び／又はそれに由
来する細胞株を培養し、培養物からＨ３Ｖに対するヒト
モノクローナル抗体を採取することができた。

本発明のヒトモノクローナル抗体は、単純ヘルペスＣ・
イルス１勺又は２型′感染細胞の多量が約１６万でＩｙ
Ｇ型の抗体である。

本発明においてヒトの抗体産生細胞とは、Ｕトのリンパ
球（又はＢ細胞）であって、抗体を分泌している又は分
泌する能力を持った細胞をいう。これは牌臓、リンパ節
、末梢血。

骨髄、扁桃、アデノイド等の細胞の中に含まれている。

本発明の目的のためには、いかなるソースのリンパ球で
も用いることができるが、好ましいのは扁桃又はアデノ
イドから採取されたものである。

−ｒｆ）スのミエー−マ細胞としては、８−アザグアニ
ン耐性株を用いるのが有利であり、公知のものとし℃は
、　ＢＡＬＢ／ＣマウスのＰ３ｘ　ａ３ＡＪｉ１８株、
　Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａ、？４−１株、Ｐ３×６３Ａｇ
８　Ｕ　１株、　５Ｐ２１０Ａ、ｌｉｌ　１４株、　Ｐ
３　Ｘ　６３Ａ、ｊｉ１８゜６．５．３株、　ＭＰＣ１
１−４５，６，ＴＧ　１．７株＋　ＳＰ　−１株等があ
る。

本発明においては、ヒトの抗体産生細胞とマウスのミエ
ローマ細胞とを融合させるに先立って、ヒトの抗体産生
細胞Ｋ　ｉｎ　　ｖｉｔｒｏでマイト−ジエンの存在下
に感作する。

（ホ）　　作　　用ヒトの場合、正常人でもＨ８ｖに対する抗体を産生し得
る能力のあるリンパ球を有している場合が多いが、その
数が少ないためＫそのままでは目的とするハイグリドー
マを得るために利用することができない。これに対し、
本発明のＩｎ　ｖｉｔｒｏ　　でヒトの抗体産生細胞を
感作する方法によれば、感作により細胞の分化及び増殖
を促進し、目的とする抗体産生細胞の数を任意に増大さ
せることができる。かくしてＨ８Ｖで感作された抗体産
生細胞を用いて細胞融合を行な５ことによって、効率良
く抗）ＴＳＶモノクロ＋−ル抗体を産生ずる・・イブリ
ドーマを得ることができる。

（へ）　問題点を解決するための手段（その２）本発明
に用いられるウィルスとしては１型（例えば、ＫＯ３株
＋　Ｈａｙａｓｈｌｄａ株）と２型（例えば、ＭＳ−４
株）が知られている。感作のためＫは、これらのウィル
スだけでなく、かかるウィルス由来の蛋白若しくは糖蛋
白を用いてもよい。

マイト−ジエンは、リンパ球の分化及び増殖を促進させ
るものなら何でもよいが、１！Ｉ’ｌｌえば、ボークウ
ィドマイト−ジエン（ＰＷＭ）。

プロティンＡ、フイトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）コン
カナバリンＡがある。好ましいのは□であり、通常２〜
２００μｇ／なｔ、好ましくは２０〜１００μｉ／ｙｔ
ｌの量で用いられる。

感作の方法条件は特に限定されるものではないが、抗原
（Ｈ８Ｖ、又はＨＳ　Ｖ　ｗ由来の蛋白若しくは糖蛋白
）の濃度は１ダ／ゴ〜１　ｐｆ！／　ｙｄ　、　＋）ン
バ球（抗体産生細胞）の濃度はｌＸｌ０’〜Ｉ　Ｘ　１
０’個／プが適当であり、培％温度は３５〜４０℃で培
養時間は４〜ｌＯ日、好ましくは６〜８日でらる。培養
液は人、牛、馬等の血清を含むものなら何でも良いが、
特忙胎児１血清（Ｆ’Ｃ８）を含む培養液（例えばＲＰ
Ｍ１１６４０）が好ましい。

かくして得られたウィルスで感作したヒトの抗体産生細
胞とマウスのミエローマ細胞とは、次いで公知の方法に
従って細胞融合せしめられる。例えば、抗体産生細胞と
ミニｐ−マＡ田胞な１０：１−１：１０、好ましくは１
：１〜１：３の北本で混合し、適当な細胞融合用溶液、
例えば約３５チポリエチレングリフール（公刊Ｉ、００
０〜６，０００稿度）および約７．５％ジメチルスルホ
キシドを含むＲＰＭ１１６４０を加え℃、室温−！３７
℃で１〜数分間攪拌し、その後ｉ　Ｕ’％ＦＣ８加ＲＰ
Ｍ１１６４０で徐々に希釈し、洗浄の後ＨＡＴ（ヒポキ
サンチン−アミノプテリン−チミジン）選択培養液にて
細胞濃度が１〜５　Ｘ　１０’個／ｄとなるように調整
する。これをｏ、２＊１ずつ、例えば９６穴プレートに
分注し、５チＣＱ、を含む空気中で３５〜３８℃で２〜
３週間培養する。ＨＡＴ培養液中ではノ〜イプリドーマ
のみが生存し、８−７ザグアニン耐性のミエー−マ細膓
及びミエローマ同士の融合細胞は生存し得ないく未融合
の抗体産生細胞は数日で死滅する）。

培養後、培養液中の抗体価をチェックし、目的とする抗
体を産生しているハイブリドーマのみを選択しΦ離する
（クローニング）。

培養液中の抗体価のチェックは、ラジオイムノ７ツセイ
法（ＲＩＡ）、５％素抗体法（ＥＬＩＳＡ）。

蛍光抗体法などの、抗原への抗体の結合そのものを検出
する方法と、ウィルスの生物活性を阻害する抗体の活性
をみる方法等で行なうことができる。クローニングによ
って選択された、本発明の抗ウィルス・ヒト抗体を産生
するマウス−ヒトハイブリドーマは、凍結して保存する
ことができる。かかるハイグリドーマのセルライン（細
胞株）及び／又はそれに由来する細胞株を適当な方法で
大賞に培養すると、培養上清から本発明の目的とするヒ
ト七ツクローナル抗体を得ることができる。

また、このハイブリドーマを動物に移殖して腫瘍化し、
その腹水や血清からモノクローナル抗体を得ることもで
きる。

（ト）　　以下、実施例により本発明を詳述する。

実施例１　（Ｈ８Ｖに対するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ）（１）Ｈ８Ｖ抗原の作製単層に増殖したＶｅｒｏ　　細胞（約２　Ｘ　１０＠個
）に、４．４　Ｘ　１０’ＰＦＵ／＋ｉｔのＨ８ｖ（Ｋ
２Ｓ株）を接種した。３７℃で２時間吸着させたのち、
２チウシ血清を含むＭＥＭ培地で２４時間培養した。こ
の細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄したのち、超音波
により細胞を破壊した。これを６０００１１１８で３０
分間遠心した上清を得これを３０％シヨ哨溶液の上に重
層し、３００００ｒｆｌｌで３時間遠心した。遠心管の
底に沈澱したベレットをウィルス抗原として用いた。

ｆ２）　　ＨＳ　Ｖ　Ｋよるリンパ球感作ヒトの扁桃リ
ンパ球を培養液Ａ　（ＲＰ　Ｍ　１１６４０＋２０％胎
児牛血清＋２０ｍＭＨＥＰＥＳ＋２ｍＭグルタミ７　＋
　１　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａピルビン酸＋０．０２叩／−セリ
ン＋８０μＩ／ｄゲンタマイシン）Ｋ浮遊させた。細胞
濃度は１７　Ｘ　１０”個／ｄであった。この細胞浮遊
液な１．２コずつ、培養プレート（２４穴）の１２穴に
入れた。それらを３穴ずつ４群に分け、第１群は無添加
、第２群はＨ８Ｖ（ＫＯＳ　ａ　＋　部分’Ｉｎ　’Ｉ
Ｉ　標品）　ｎＪＦ　！　７　ハク／　’Ｒ１、第３１
ＰＫはＰＷＭ２０μゾ／ＴＲ１，第４群には同量のＨ８
ＶとＰＷＭを添加した。この培養プレートを３７℃＋　
５　％　ＣＯｘ−空気で６日間培養した。

（３）　　マウス・ミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｆ！　
８Ｕ１株（Ｐ３ＵＩと略記するンとの細胞融合。

前もってＰ３Ｕ１を培養液Ｂ　（ＲＰＭ１１６４０＋１
０％胎児牛血清＋２　ｍＭ　　グルタミン＋８０　Ｉ４
／　ｗｒｌゲンタマイシン）中テ培！’しておいた。使
用時の細胞濃度は６×１０″個／ゴであった。上記（２
）の感作りンバ球（３穴を一緒にした）４祥とＰ３ＵＩ
を、それぞれ別々に無血清ＲＰＭ１１６４０で２回洗浄
した。各群のリンパ球と５　Ｘ　１０’個のＰ３ＵＩと
を試験管の中で一緒にした。１５０Ｑｆで５分間遠心し
、上清を捨てた。細胞ペレットを、試験管をたたくこと
によって、よ（分散させた。これＶＣｏ、５ｍｌのポリ
エチレングリコール液（ＲＰＭＩ　１６４０　５．７５
＊ｊ＋ポリエチレングリコール１０００　３．５ｍ＋／
＋ジメチルスルホキサイドｏ、７ｓｄ）（ＰＥＧ液と略
記する）を加えて、細胞をゆるやかに浮遊させた。１分
径Ｋ　Ｏ，５ｄ＋ＲＰＭＩ　１６４０を加え、さらＴ／
ｃ１分後にＩＲＪＲＰＭＩ、さらに２分径ＶＣ４１１Ｌ
ｌのＨＡＴ培養液（ＲＰＭ１１６４０＋２０チ胎児牛血
清＋８０μｇ／−ゲンタマイシン＋９５μ１１１！しホ
キサンチン＋〇、４゛　μＭ　アミノグチリン＋１．６
ＩＩＭチミジン）、さらに２分後には４ｄのＨＡＴ培養
液を加えた。

最後に、ＨＡＴ培養液で２５ｄ細胞浮遊液とした。これ
を培養プレート（９６穴）１枚に蒔いて、３７℃、５ｔ
ｌｂｃｏ、含有空気中で培養した。−週間毎に半量の培
養液を新しいＩ（Ｔ培ｇ＃液（ＨＡＴからＡを除去した
もの）で交換していきハイブリドーマを得た。

（４）　　ヒトＩ、ＦＧと抗Ｈ８Ｖ抗体の測定酵素抗体
法（ＥＬＩＳＡ）Ｋよって測定した。ＬトＩｇＧを測定
するためにヤギ抗ヒトｌｌ１Ｇ抗体（ｔｏ＃／ａｄ）を
、あるいは抗Ｈ８ｖ抗体を測定するためＫＩ（ＳＶ（Ｋ
Ｏ８ｌｔｅ）１ρタンパク／−をそれぞれファルコン・
ミクレテスト■の９６穴プレートに固定した。

このプレートにハイブリドーマ培養上清６゜Ｐノ　　を
加えて、室温で１時間放置した。０．０５％　Ｔｗｅｅ
ｎ　２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｔｗｅｓｎ
−ＰＢＳ）で３回洗浄ののち、ヤキ抗ヒト１５１Ｇ抗体
−アルカリフオスファターゼ（２０００倍希釈液）を６
０μ！加えて、室温で１時間反応させた。さらにＴｗｅ
ｅｎ　−ＰＢＳで３回洗浄したのち、Ｐ−ニトロフェニ
ル７オスクエートをＩＭジェタノールアミン＋　１　ｍ
Ｍ　ｙＬＩｉＣ１＊　のｐＨ９、８溶液にｏ、６ｒｎｙ
、／ｌｌの割合で溶かした溶液１００／７１を加えた。

３０分から６０分後に４０５ｍμの吸光度を測定し、標
準１．ＰＧ液あるいは標準Ｈ８ＶＲ性血膚との比較から
、その値を算出した。

全群とも９６穴プレ一ト１枚に細胞を蒔き、９６大中の
、ハイブリドーマが成育してきた穴の数、さらＫそのう
ちヒ）ＩＪＩＧを産生じているハイブリドーマをもつ穴
の数、そして抗Ｉ（ＳＶ抗体を産生じている穴の数を第
１表に示した。第１表忙は　３つの扁桃より、リンパ球
な分離した例を示したが、どの場合にもＨ８ＶとＰＷＭ
を加えたとぎ忙最も多くの抗Ｈ８Ｖ抗体産生ハイブリド
ーマが成育した。

（以下余白ン第１表（以下余白）（５）　　坑Ｉ（Ｓｖ抗体産生ハイブリドーマのクロー
ニングクＰ　−ニングは限定希釈法を用いた。抗Ｈ８ｖ抗体陽
性の穴より細胞な取り出し、細胞数を数え培養ｇＢを用
い１個／穴あるいはｌＯ０個／穴細胞を蒔いた。２４間
後ＫＩｆａ胞が十分増殖したので、の上清に抗Ｈ８ｖ抗
体が娶るか否かをＥＬ　Ｉ　ＳＡによって測定し抗■Ｓ
ｖ抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。

（６１Ｋ）ｆｓＩ／モノクローナル抗体のＡ製得られた
ハイブリドーマの１つＤ３４を無戦清、′ｆＪ地ＩＴＳ
Ｓ（ＲＰ’Ｊ１１６４０　２容＋ダルペットＭＥＭＩ容
十Ｆ１２　１容＋インシー１す７８．５μＩ／　ｍｌ　
＋　）ランスフエリ７２μｍ１／ａｔ＋エタノールアミ
ン２０μＭ＋セレナイ）　２．５　Ｘ　Ｉ　Ｕ−”Ｍ　
）で培養した。その培養清４８０ｄを得て、これを限外
濾過（アミコンＰＭ３０）で１４ｒＬｌにした。これを
ｌＪ、０２　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，８）透析し
、同緩衝液で平衝化したＤＥ５２カラム（２ｍＸ　１４
α）にかけた。未吸層分画（２１ａｌ　）　Ｋヒトモノ
クロナール抗体が回収された。９ｍ抗体法で測定したと
き、培養上清（は１．９μＦ１／１１１ｔ１１１１ｉモ
ノクー−ナル抗体標品には２８μ！！／ゴのし）ＩｐＧ
が含まれていた。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリ
ルアミド（５チグル）電気永動にかけると、分子量約１
６万の位置ニ単一のバンドが形成された。

（７）　　抗Ｈ８Ｖモノクローナル抗体の特異性蛍光抗
体法により、モノクローナル抗体の特異性を調べた。Ｈ
８ＶＩ型のＫＯ８ｔｋｆ）感染したペーーー細膓をスラ
イドグラス上にア七トンで固定し、これにモノクローナ
ル抗体を含むハイブリドーマ培養上清な室温で１時間反
応させ、洗浄後、さらにフルオレッセインインチオシア
ネートでラベルされたヤギ抗ヒトＩ、９Ｇ（１０倍希釈
液）を室温で１時間反応させた。こうして作成したスラ
イドｙ、−蛍光項歳４で観察した。その結果、ハイプリ
ドー−ｆＤ３４１７−４１セして５−１１の産生ずする
モノクローナル抗体はいずれもウィルスの感染した細胞
の細胞膜と細胞質に反応し、非感染細胞には全く反応し
ないことが判った。

さらにＨ８Ｖの１型のＨａｙａｓｈｉｄａ株やＨ８Ｖｚ
型のＭＳ−４株の感染した細胞にも反応することが判っ
た。

・１２１．、じ

Claims

【特許請求の範囲】１、単純ヘルペスウィルス１型又は２型感染細胞の細胞
膜及び細胞質と反応し、非感染細胞とはほとんど反応し
ないという性質を有する分子量が約１６万でＩｇＧ型の
、単純ヘルペスウィルスに対するヒトモノクローナル抗
体。２、ヒトの単純ヘルペスウィルス抗体産生細胞とマウス
のミエローマ細胞とのマウス−ヒトハイブリドーマを作
成し、該ハイブリドーマ及び／又はそれに由来する細胞
株を培養し、培養物から単純ヘルペスウィルスに対する
ヒトモノクローナル抗体を採取することからなるヒトモ
ノクローナル抗体の製造法。