JPH02429A - ヒトｂリンパ芽球様細胞株、抗体産生ハイブリドーマ、抗体および抗体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗体産生ハイブリドーマ、抗体および抗体の
製造法に関する。

従来の技術 ケーラーとミルスタインにより開発されたハイブリドー
マを用いるモノクローナル抗体（以下、Ｍ　ｏ　Ａ　ｂ
と略記することがある）の製造法は、単一特異性を示す
抗体を人里にかつ安定的に得られるという利点を有して
おり、その技術は広範囲に応用されている　［Ｋｏｈｌ
ｅｒ、Ｇ、、　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，：ネイチャー　
（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、　２５６　、４９５　（１９７５
）］。特に最近では抗原の検出・精製あるいは診断薬の
開発だけでなく、予防薬や治療薬の創製に大きく寄与し
つつある。

しかし、一方で予防薬・治療薬としてＭｏＡｂを用いる
場合、ヒトにとって異種蛋白であるマウスＭｏＡｂを投
与することは、　ヒト体内でのマウスＭｏＡｂに対する
抗体の産生による治療効果の低減あるいは重篤なアレル
ギー反応を誘起する危険性がある。したがって予防薬・
治療薬としては、ヒトＭｏΔｂを用いるのがはるかに望
ましいが、一般にその作製技術はマウスのそれに比べて
著しく遅れており、実際の成功例も少ない。ヒトＭｏＡ
ｂはヒト−ヒトハイブリドーマ、マウス−ヒトヘテロハ
イブリドーマあるいはヒトリンパ球のエプスタイン−バ
ーウイルス（以下、ＥＢＶと略記することがある）トラ
ンスホーマントなどにより産生されるが、後２者は抗体
産生能の安定性および増殖能に劣るため、前者のヒト−
ヒトハイブリドーマによる産生が望ましい。しかし、ヒ
ト−ヒトハイブリドーマ作成における融合効率は一般に
非常に低（、このため医薬としてのヒトＭｏＡｂの開発
は著しく遅れている。この欠点を補うため、増殖能の優
れた、またヒトリンパ球と高い効率で融合できる親株の
開発が進められ、山田らはＨＯ−３２３細胞株［山田耕
路、村上浩紀：発酵と工業、４５゜２１８　（１９ｇ？
）］を、市森らはＴＡＷ−９２５細胞株［１ｃｈｉｍｏ
ｒｉ、　Ｙ、、　Ｈａｒａｄａ、　Ｋ、、　　ら：バイ
オケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ、　　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍ、）、　　１４２．８０５　（１９８７）］を
確立している。

しかし、さらに抗体産生能の安定なまた増殖能の良いヒ
ト−ヒトハイブリドーマを与え、かつ該ハイブリドーマ
の製造に用いられるヒトリンパ球とさらに高い効率で融
合できる親株の開発が急がれているのが現状である。

本発明は、抗体を安定に産生じ、また増殖能の優れたヒ
ト−ヒトハイブリドーマ、該ハイブリドーマを用いる抗
体の製造法および該ハイブリドーマによって産生される
抗体を提供するものである。

課題を解決するための手段 本発明者らはかかる技術的背景のもとに、ヒト癌細胞あ
るいは緑膿菌外毒素Ａ（以下、ＰＥＡと略記することが
ある）に対して高い結合能を有するヒトモノクローナル
抗体を安定的に生産するヒト−ヒトハイブリドーマを作
成することを目的として鋭意研究した結果、６−チオグ
アニン（６−ＴＧ）抵抗性ヒトＢリンパ芽球様細胞Ｗ［
−Ｌ２株（米国アルドンジョーンズ・セル・サイエンス
・センター所属のＤｒ、Ｇ、５ａｔｏより提供を受けた
）をウワバイン添加の培養液に段階的に馴化させること
により作成されるウワバイン抵抗性のヒトＢリンパ芽球
様細胞株Ａ（、−３３（以下、ＡＣ３３株と略記するこ
とがある）が、ＥＢＶトランスホーマントと高い効率で
融合し、また増殖能の優れたハイブリドーマが得られる
ことを見い出し、ヒトＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ取得
のための有用な親株となることを見い出した。

本発明者らは、さらに抗ヒト癌細胞抗体あるいは抗Ｐ　
Ｅ　Ａ　抗体産生ＥＢＶ）ランスホーマントをＡＣ−３
３株と融合することにより、安定に該抗体を産生ずるヒ
ト−ヒトハイブリドーマを製造できること、さらに該ハ
イブリドーマから抗ヒト癌細胞あるいは抗ＰＥＡヒトＭ
ｏＡｂを製造できることを見い出し、これらの知見に基
づいて、さらに研究した結果、本発明を完成した。本明
細書において、抗ヒト癌細胞ヒトＭｏＡｂはヒト癌細胞
と反応しうるヒトＭｏＡｂを示し、抗ＰＥＡヒトＭｏＡ
ｂはＰＥＡと反応しうるヒトＭｏＡｂを示す。

本発明は、（１）ヒトＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ３３ま
たはその継代株と、ＥＢＶによって形質転換されたヒト
リンパ球とのハイブリドーマ。

（２）該ハイブリドーマを培地に培養し、ヒトモノクロ
ーナル抗体を採取することを特徴とする抗体の製造法、
および（３）該ハイブリドーマにより産生されたヒトモ
ノクローナル抗体に関する。

ヒトＢ　ｌ／ンバ芽球様細胞株ＡＣ−３３は、ＨＡＴ（
ヒボキサンチン、アミノプテリン、チミジン）感受性で
かつウワバイン抵抗性であり、例えば米国アルトンジジ
ーンズ・セル・サイエンス・センター所属のＤｒ、Ｇ、
５ａｔｏより提供を受けた６−ＴＣ，抵抗性ヒトＢリン
パ芽球様細胞Ｗ　Ｉ　−Ｌ　２株の改良により作成でき
る。ＨＡＴ感受性でかつウワバイン抵抗性の細胞株は、
一般的には公知の方法により調製できるが、本発明者ら
は例えばヒト由来リンパ芽球様細胞株を培養する際に、
培地中の５−ＴＧおよびウワバイン濃度を徐々に上昇さ
せ、馴化させていくことにより、細胞株の本来有してい
る増殖性に影響を与えることなく、ＨＡＴ感受性・ウワ
バイン抵抗性の新しい細胞株を取得している。具体的に
は、５−ＴＧ抵抗性ヒヒトリンパ芽球様細胞Ｗｌ−Ｌ２
株を０．０１μＭ以下の低濃度、好ましくは０．００２
〜０．００５μＭ、さらに好ましくは０．００３μＭａ
度のウワバイン含有培地にて培養し、得られる生細胞か
らヒト免疫グロブリン非分泌型の細胞を選別する。得ら
れる免疫グロブリン非分泌性で低濃度ウワバイン抵抗性
株は、さらに高濃度のウワバインを含む培地、すなわち
約１．５〜５倍、好ましくは約１．５〜３．５倍、さら
に好ましくは馴化の初期段階で約１．５〜２倍、その後
約２〜３５倍にウワバインの濃度を上昇させた培地で培
養を続け、免疫グロブリン非分泌性であり、特にウワバ
インに対して強い抵抗性を示す細胞株、好ましくは２μ
Ｍｉ１１度以上のウワバインに対して抵抗性を示す細胞
株を作出・育種していく。このようにしてマーカーをＩ
大した細胞株は、ヒトモノクローナル抗体産生細胞との
細胞融合の親株として用いられるが、特に高い融合効率
を与える細胞株をクローニングなどによりあらかじめ選
択しておくことが望ましい。

後述の実施例１（１）に示すように、低濃度のウワバイ
ン含有培地から培養を開始し、ヒト免疫グロブリン非分
泌型の細胞を選別しながら、最終的に２μＭａ度のウワ
バイン含有培地で培養することにより得られたヒトＢリ
ンパ芽球様細胞株ＡＣ−３３は、免疫グロブリン非分泌
性、ＨＡＴ感受性、ウワバイン抵抗性を示し、第１図に
示されるように新規な染色体を有する細胞株である。ま
た、該ＡＣ−３３株は、ヒト−ヒトハイブリドーマ作成
における融合効率が、ＨＯ−３２３細胞株、ＴＡＷ−９
２５細胞株などの従来の親株より高く、得られたヒト−
ヒトハイブリドーマはヒトモノクローナル抗体産生能が
安定しており、増殖能が優れている。

継代株としては、ＡＣ−３３株を単に継代培養した株は
勿論、例えばこれを再びクローニングし良好な融合効率
を与えるクローン株などＡＣ３３株から派生した株すべ
てが挙げられる。

ＡＣ−３３株またはその継代株と融合させる抗体産生ヒ
トリンパ球系細胞としては、正常人あるいは患者由来の
リンパ球が使用でき、例えば目的とする抗体がＰＥＡの
ような感染性物質由来のものに対する時は、該物質に感
染したヒト由来のリンパ球を使用してもよい。これらヒ
トリンパ球は、肺臓・リンパ節・末梢血などいずれ由来
のものでもよいが、末梢血あるいはリンパ節由来のリン
パ球が有利に用いられる。これらのリンパ球系細胞はそ
のまま用いることもできるが、−旦試験管内で抗原やあ
るいはＢリンパ球マイト−ジエン（例、ポークライード
・マイト−ジエンやスタフィロコッカス・アウレウス・
コーワン■など）で刺激・活性化後、ＡＣ−３３株と融
合させてもよい。さらに好ましくは、採取したヒトリン
パ球にＥＢＶを感染させ不死化後、目的とする抗体産生
細胞を選別・濃縮し、これをＡＣ−３３株と融合させる
のがよい。以上のようにＥＢ■トランスホーマントを用
いる方法で、より効率的に抗体産生ハイブリドーマを取
得できるが、かかるＥＢＶ含有液としては、例えばマー
モセノト細胞Ｂ９５−８株「プロシーディング・オブ・
ナンヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐ　ｒｏ
ｅ、　　Ｎ　ａｔｌ、　　Ａ　ｃａｄ、　　Ｓ　ｃｉ。

ＵＳ　Ａ）、７０．　ｌ　９０（１，９７３）コの培養
土ｃｎが用いられる。

ＥＢ■トランスホーマントの調製に際しては、培地にヒ
トリンパ球を約０．５〜５ＸＩＯ７個／噌、好ましくは
約１×１０７個／ｄの濃度になるよう浮遊させ、これに
上記の８９５−８培養土清を適量加える。約３７°Ｃで
約１時間軽く振とうし感染後、さらに約３７°Ｃで約５
〜３０日間培養することにより、目的のヒトリンパ球の
ＥＢＶトランスホーマントが取得できる。

ＡＣ−３３株とＥＢＶトランスホーマントとを融合させ
るためには、これらの細胞混合浮遊液にセンダイウィル
スやポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合剤を
加えたり、あるいは電気刺激を与えるなどの処理をする
。ＰＥＧを用いる方法は好ましい方法の一例であるが、
もちろんこの方法に限定されるものではない。ＰＥＧを
用いる方法において、ＰＥＧの重合度は一般に約１，０
００〜６，０００．インキュベーションは約０．５〜３
０分、ＰＥＧの濃度は約１０〜８０％などが用いられる
。好ましくは、約３５〜５５％のＰＥＧ６０００を用い
て約３７°Ｃで５〜１０分細胞を処理するのがよい。融
合細胞の選択は、ＨＡＴ＋ウワバイン添加培地（ＨＡ　
Ｔ　Ｏ培地）などにより実施でき、この操作で親株は死
滅する。増殖してきたハイブリドーマの培養上清を抗体
価測定試験に供することにより、抗体活性陽性の細胞が
選別される。

抗ヒト癌細胞ヒトＭｏＡｂ測定のためには種々の方法が
使用できるが、例えば腫瘍細胞への指示赤血球の吸着で
みる混合血球凝集反応（以下、ＭＨＡと略記することが
ある）あるいはマイクロプレートに粘着した腫瘍細胞へ
の結合をエンザイムイムノアッセイ（以下、ＥＬＩＳＡ
と略記することがある）でみるＣｅ１ｌ−Ｅ　Ｌ　Ｉ　
Ｓ　Ａ法などが挙げられる。抗ＰＥＡヒトＭｏＡｂ測定
のためには、固相抗原としてＰＥＡを吸着させたマイク
ロプレートを用いるＥＬ［ＳＡが好ましく用いられる。

抗体活性陽性ハイブリドーマは直ちにクローニングに供
されるが、これは通常限界希釈法などで容易に実施され
る。クローン化されたヒト−ヒトハイブリドーマの培養
上清については、上記の方法でその抗体価を測定し、安
定的に力価の高い抗体を産生ずるハイブリドーマを選択
することにより、目的とするモノクローナルなハイブリ
ドーマを取得することができる。

上記した本発明のＡＣ−３３株またはその継代株から由
来するハイブリドーマを用いてヒトモノクローナル抗体
を生成、蓄積せしめ、これを採取することにより抗体を
製造することができる。

該抗体の生成、蓄積は、本発明のハイブリドーマを培養
することにより行われ、培養は、通常液体培地中または
動物の腹腔内（通常はヌードマウス等哺乳動物の腹腔内
）で行うが、以下に液体培地中での培養の一例を挙げる
。

培地としては、例えば動物細胞培養用基礎培地〔イスコ
ツ培地とハムＦ１２培地の等量混合培地（１−Ｈ培地）
やＲＰＭＩ　　１６４０培地など〕に牛胎児血清等を添
加したものあるいはＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社
販売）（哺乳動物の血清を混在微生物の不活化工程およ
び塩析、脱塩工程を含む精製処理に付すことによって製
造される哺乳動物血清由来の動物細胞培養用組成物；特
開昭６０−１４５０８８号公報参照）などが挙げられ、
特にＧＩＴ培地が以下に述べる抗体の精製に関して有利
に用いられる。

培養は通常約３〜６０日間、好ましくは約５〜ｌＯ日間
、約３０〜３８°Ｃ１好ましくは約３７°Ｃで行う。

培養液中の抗体の精製については公知の生化学的手法を
組み合わせて用いることによりできる。

例えば、細胞培養液を遠心分離し、培養上清を取り出し
、塩析（通常は硫酸アンモニウムを用いる）を実施する
。得られたタンパク沈澱物を適当な溶液に溶解し、透析
後カラムクロマトグラフィー（イオン交換カラム、ゲル
ろ過カラム等）に付し、目的とする抗体を分離精製する
ことができる。以上のような分離精製操作により、例え
ば６Ｑの培養上清からタンパク重量比で９５％以上の純
度の抗ヒト癌細胞ヒトＭｏＡｂを約３０ｍｇ得ることが
できる。また、この精製抗体標品においては、異種タン
パクであるウシ血清アルブミンおよびウシ血清グロブリ
ンの含有量は各々約０．１％以下であり、ＥＢＶ混入の
可能性もないため、医薬などとして人体に投与する場合
、好都合である。

以上のようにして得られたヒトＭｏＡｂを蛋白分解酵素
（パパイン、ペプシンなど）処理ならびに還元剤処理な
どにより、ヒト癌細胞あるいはＰＥＡに対する結合能を
保持するＦａｂ、　　Ｆａｂ’、　　Ｆ（ａｂ’）を断
片などを得ることができ、本発明のヒトＭｏＡｂと同様
の目的で用いることができる。

本発明により製造される抗ヒト癌細胞ヒトＭ　ｏ　Ａ　
ｂは腫瘍細胞表面上の腫瘍関連抗原を特異的に認識し、
腫瘍細胞には結合するが、正常細胞には結合しない。ま
た同じく本発明により製造される抗ＰＥＡヒトＭｏＡｂ
は、ＰＥＡ分子の抗原決定基を特異的に認識し、ＰＥＡ
に対する強い結合能を有する。かかる抗体は均質で高力
価なため、生化学的製剤として用いるのにきわめて適し
ている。例えば、メンブレンフィルター等によるろ過除
菌操作の後に、それ自体あるいは適宜の薬理的に許容さ
れ得る担体、賦形剤、希釈剤などと混合し、注射剤など
として製剤化することができる。投与量は、対象疾患、
疾患の症状、投与ルートによりことなるが、例えば感染
症の患者に静脈注射する場合、投与■は約０．０１〜５
０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１〜２　ｍｇ／　
ｋｇ／日である。

以上のようにして得られたヒトモノクローナル抗体製剤
は、単に腫瘍関連抗原の分析、血中抗原の検出あるいは
診断薬への応用のみならず、予防薬・治療薬として哺乳
動物（マウス、ラット、ネコ。

イヌ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなど）に投与することが
可能である。

特に抗癌剤としての抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗
体は、それ目体の抗腫瘍効果のみならず、しかるべき抗
癌剤のキャリヤーすなわちミサイル療法剤として癌患者
に投与して癌を根治せしめることが期待されている。ま
た抗ＰＥＡ抗体は、感染症治療剤として従来のポリクロ
ーナルヒト免疫グロブリン製剤よりも安定性・安全性で
浸れており、大きな治療効果を上げることができる。

以上のように本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト
由来のため、マウス、ラットなど異種動物由来の抗体に
比べて、ヒトに対する抗原性、毒性が極めて低く、副作
用もほとんどないため、疾病の予防・治療のために直接
ヒトに投与することが可能である。また特定される確立
された細胞株より産生される抗体であるため、不特定多
数のヒト末梢血より製造された従来の免疫グロブリン製
剤にくらべ、未知のバイオハザードの混入の可能性が低
い。さらに該抗体産生ハイブリドーマは、生体外で安定
的にヒトモノクローナル抗体を産生しうるので、結合能
・中和能の高い品質の一定したヒトモノクローナル抗体
を安定的に大量製造することができる。

また、本発明に用いられる新規ヒトＢリンパ芽球様細胞
株ＡＣ−３３は高い融合効率を与えるので、ヒトモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマの作成に好都合に使用
できる。また、得られるハイブリドーマは増殖能が優れ
、ヒトモノクローナル抗体産生能が安定しており、長期
にわたり効率良くヒトモノクローナル抗体を製造できる
。

本発明は、ヒト−ヒトハイブリドーマ作成において高い
融合効率を与える新規なヒトＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ
−３３を提供するものでもある。

以下、参考例および実施例により本発明をより具体的に
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
。

なお、実施例１に開示するヒトＢリンパ芽球様細胞株Ａ
Ｃ−３３は、昭和６２年１２月１４日から財団法人発酵
研究所（ＩＦＯ）に寄託番号ＩＦＯ５０１５５として、
また昭和６２年１２月２４日から通商産業省微生物工業
技術研究所（Ｆｔ）に寄託番号ＦＥＲＭ　　Ｐ−９７８
８として寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄
託に切り換えられて、受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２］
４３として同研究所に保管されている。

実施例５に開示するヒト−ヒトハイブリドーマＰＡ−１
０・１は、昭和６２年１２月１４日からＩＦＯに寄託番
号ＩＦＯ５０１，５８として、また昭和６２年１２月２
４日からＦＲＩに寄託番号ＦＥＲＭ　　Ｐ−９７９１と
して寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づ（寄託に
切り換えられて、受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１４６
として同研究所に保管されている。

実施例７に開示するヒト−ヒトハイブリドーマＫｕｌ　
Ｏ２およびヒト−ヒトハイブリドーマＫｕ１０５は、昭
和６２年１２月１４日からＩＦＯに寄託番号ＩＦＯ５０
１５６およびＩＦＯ５０１５７として、また昭和６２年
１２月２４日からＦＲＩに寄託番号ＦＥＲＭ　　Ｐ−９
７８９およびＦＥＲＭ　　Ｐ−９７９０としてそれぞれ
寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切り
換えられて、受託番号ＦＥＲＭ　　ＢＰ２１４４および
ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１４５としてそれぞれ保管されて
いる。

参考例１ 混合血球凝集反応（ＭＨＡ） ■ヒト赤血球を用いる指示細胞の作製 ＩｇＧ抗体検出の場合には、リン酸食塩緩衝液（以下、
ＰＢＳと略記することがある）に懸濁した２％ヒヒト血
球に抗り抗体を添加し、室温で３時間インキュベートし
た。ＰＢＳで洗浄後再び２％懸濁液とし、ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体を添加して一夜室温でインキュベートした。Ｐ
ＢＳで３回洗浄し、指示細胞として使用した。

ＩｇＭ抗体検出の場合には、ＰＢＳにＶ！！、濁した２
％ヒヒト血球に、モルモット乾燥補体を加え、ただちに
指示細胞として使用した。

■ヌンクのテラサ牛プレートに標的腫瘍細胞ヲウエル当
り１，０００〜２，０００個播挿し、炭酸ガスインキュ
ベーター中で３７℃、−昼夜培養した。

２％牛脂児血清（以下、Ｆｅ２と略記することがある）
添加ＰＢＳで洗浄後、被検ハイブリドーマ培養上清を添
加し、室温で１〜２時間インキュベートした。２％ＦＣ
３添加ＰＢＳで洗浄後■で作製した指示細胞の０．２％
懸濁液をウェル当り１滴滴下し、さらに室温で１．５〜
２時間反応させ、２％ＦＣ３添加ＰＢＳで洗浄後、顕微
鏡下で腫瘍細胞への血球吸着を観察した。

参考例２ 腫瘍細胞を用いるＣｅ１ｌ−ＥＬＩＳＡヌンクの９６穴
マイクロプレートに標的腫瘍細胞をウェル当り１０．０
００〜４０，０００個播挿し、炭酸ガスインキュベータ
ー中で３７℃、−昼夜培養した。培養上清を除去後、抗
ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ
の培養上清を添加し、室温で２時間反応させた。次いで
０．２％牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略記するこ
とがある）添加培地で洗浄後、ホースラディソンユ・ペ
ルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略記することがある）
で標識したヤギ抗ヒトｒｇ抗体を添加した。さらに室温
で２時間反応させ、洗浄後酵素基質としてオルソフェニ
レンジアミンおよびＨ，Ｏ，を含有する００１Ｍクエン
酸緩衝液を各ウェルに加え、室温で酵素反応を実施した
。ＩＮ硫酸で反応停止後、マルチスキャン（フロー社製
）を用いて波長４９２ｎｍで発色色素量を測定した。

参考例３ 抗緑膿菌外毒素Ａ　（ＰＥＡ）抗体測定用ＥＬＩＳＡＰ
　Ｅ　Ａ　２　、５μｇ／ｄ溶液を９６穴マイクロプレ
ートにｌｏｏｍずつ分注し、４°Ｃて一昼夜放置後、さ
らに２％カゼイン含有ＰＢＳを添加して感作プレートを
作成した。ＥＬＩＳＡ測定時には、上記の液を除去し、
ＰＢＳで洗浄後、被検ハイプリドーマ培養上清を添加し
、室温で２時間反応させた。

次いでＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒト１μ抗体
を添加し、さらに室温で２時間反応させた。

以下、参考例２に記載の方法で酵素反応を実施し、抗体
価を測定した。

参考例４ ＥＢＶトランスホーマット 健康人の末梢血からＦ　１ｃｏｌｌ　−Ｈｙｐａｇｕｅ
を用いた比重遠心法でリンパ球を分離し、２０％ＦＣ３
を含むイスコツ・ハム培地（Ｉ−Ｈ−２０Ｆ）にＩ×１
０７個／〆になるよう浮遊させた。このリンパ球浮遊液
１に対し、ＥＢＶを含有するＢ９５８細胞培養上清を容
量にしてＩＯの割合に加え、３７°Ｃで１時間軽く振と
うしながら感染させた。

感染後、９６ウエルマイクロプレートにｌウェル当り２
ＸＩＯ’個播種し、３７°Ｃ炭酸ガスインキュベーター
中で２〜４週間培養を行ない、トランスホーマントを得
た。このようにして得られるトランスホーマントを、Ａ
Ｃ−３３株との融合に使用した。

実施例１ （１）ヒｈＢ’、Ｊンパ芽球様細胞株ＡＣ＝３３の取得
米国アルトンジコーンズ・セル・サイエンス・センター
より提供された６−ＴＧ抵抗性ヒヒトリンパ芽球様細胞
Ｗｌ−Ｌ２株を、まず０．００３μＭ濃度のウワバイン
を含有するｌＯ％ＦＣ３を含むイスコツ・ハム培地（Ｉ
−Ｈ−１０Ｆ）中で培養した。低濃度ウワバイン抵抗性
株の中から免疫グロブリン非分泌性の細胞を選別し、ウ
ワバイン濃度を順次０．００５μＭ、０．０１μＭ、　
０．０２μＭ、０．０５μＭ、０．１５μＭ、　　０．
５μＭさらに１μＭと上昇させながら免疫グロブリン非
分泌性の細胞を選別し、最終的に２μＭ濃度のウワバイ
ンに抵抗性を示す免疫グロブリン非分泌性ＡＣ−３３株
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１４３，ｒＦＯ５０１５５）を
得た。

（２）ＡＣ−３３株の染色体分析 実施例１（１）で得られた免疫グロブリン非分泌性・Ｈ
ＡＴ感受性・ウワバイン抵抗性ＡＣ−３３株（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２１４３，ＩＦＯ５０１５５）の染色体の解
析を実施した。

細胞約１０８個を２μｇ／ｄのコルヒチン（和光純薬工
業株式会社製）を含むｌｏｄの増殖用培地に浮遊し、３
７°Ｃで１．５時間培養した。次いで２５０Ｘｇで１０
分間遠心分離し、沈渣を３−の７５ｍＭＫ（ｊ！に浮遊
し２４°Ｃで１５分間静置した。その後、遠心法により
固定液（酢酸；メタノール−１：３）を用いて細胞を２
度洗った後、数滴の同固定液に浮遊し、スライドグラス
上に乗せ風乾した。このようにして得た標本をギムザ染
色液で染色し、顕微鏡下で観察した（ギムザ法）。この
染色標本を同固定液を用いて脱染色後、０．０２％トリ
ブンン（ギブコ社製）溶液を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ
、ｐＨ５，８）でＯ’Ｃ，６分間処理したのち、ＰＢＳ
で洗い、再びギムザ溶液で染色し、顕微鏡下で観察した
（Ｇバンド法）。

結果は第１図に示すとおりとなった。

第１図から明らかなように、染色体数は４６本ＸＹで、
３，１２．２０．２２座においてＴＡＷ−９２５株［Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋
＋＋＋＋＋、、　１４２　、８０５　（１９８７）］と
異なる特徴を示した。

（３）ＡＣ−３３株とＥＢＶ　ｌ−ランスホーマントと
の細胞融合 参考例４により得られるＥＢＶ　）ランスホーマントと
ＡＣ−３３株とをｌ：ｌの細胞比になるように混合し、
４５％ＰＥＧ６０００（コツホライト社製）で７分間処
理して細胞融合を実施した。

融合後、トランスホーマントをｌ−Ｈ−１０Ｆ培地に６
Ｘ］０３〜８Ｘ１０’個／ｄになるように浮遊させ、リ
ンプロ２４ウエルマルチデイツシユにｌｄずつ播種し、
３７℃炭酸ガスインキュベーター中で培養した。２４時
間後、ＨＡＴ・ウワバイン（ヒポキサンチン：１ＸＩＯ
−’Ｍ、アミノプテリン：４　Ｘ　Ｉ　０−７Ｍ、チミ
ジン：１．６Ｘ１０−５Ｍ、ウワバイン：２Ｘ１０−”
Ｍ）含有［・Ｈ−１０Ｆ（ＨＡＴ○）培地を１雇加え、
）ＩＡＴＯ選択培養を開始した。さらに３．５．７日の
奇数８後にｔＳずつのＨＡ　Ｔ　Ｏ新鮮培地の交換を実
施し、ＨＡＴＯ選択培養を継続した。

結果は第１表に示すとおりとなった。

比較のため、ＴＡＷ−９２５株［Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、、　１４
２．８０５　（１９８７）］を親株として用い、同様の
実験を実施した。

ＡＣ−３３株の場合、ハイブワドーマのｉｆｆは融合９
〜１５日後に認められ、その融合効率（増殖ウェル数／
播種つェル数）は４種のＥＢＶ　トランスホーマントに
対して５９〜１００％、平均上標準偏差、８５±１６％
であった。一方、良好な融合効率を与えると考えられて
いるＴＡＷ−９２５株の場合、４種のＥＢＶ　トランス
ホーマントに対して４１〜８１％、平均士標準偏差二６
３±１７％であった。

（以下余白） 実施例２ 抗ＰＥＡ抗体産生ハイブリドーマの取得抗ＰＥＡ抗体陽
性ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を参考例４に記載の方
法で形質転換し、抗ＰＥＡ抗体産生ＥＢＶトランスホー
マントを作成した。

次いでこのＥＢＶトランスホーマントとＡＣ−３３株と
を実施例１（３）に記載の方法で細胞融合し、ＨＡＴＯ
選択培養を実施した。細胞融合後９〜１５日で、播種し
た９４４ウエル中７２９ウエルにハイブリドーマの増殖
が認められ、培養上清中の抗ＰＥＡ抗体を参考例３に記
載のＥＬＩＳＡで測定した。その結果、７２９ウエル全
での培養上清中に抗ＰＥＡ抗体の存在が認められた。

実施例３ 抗ＰＥＡ抗体産生ハイブゾドーマのクローニング 実施例２で得られる抗体活性陽性の２ウエル（ＰＡ−１
，ＰＡ−１０）の各ハイブリドーマを限界希釈法による
クローニングに供した。すなわち、ハイブリドーマが３
個／ｄになるようｌ−Ｈ１０Ｆ培地に浮遊させ、９６穴
マイクロプレートにｌウェル当り０．１〆ずつ分注した
。分注する際、フィーダー細胞としてＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／
Ｃマウスの胸腺細胞をウェル当り５Ｘ１０５個になるよ
う加えた。約１０−１５日後に細胞の増殖が認められ、
その上清を採取して抗体の有無を参考例３記載のＥＬ　
Ｉ　ＳＡで測定した。その結果、ＰＡ−１およびＰＡ−
Ｉ　Ｑから得られた各４０クローン全てに強い抗体活性
が認められた。このことから、本発明のハイブリドーマ
の増殖能および抗体産生能が優れていることは明らかで
ある。上記クローンの中から、特に増殖能および抗体産
生能の優れたヒト−ヒトハイブリドーマ　ＰＡ−１０・
１が選別・育種された（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２１４６，
ＩＦ０５０１５８）。

実施例４ モノクローナル抗体の製造 ヒト−ヒトハイブリドーマＰＡ−１ｏ−１（ＦＥＲＭ　
　ＢＰ　　２１４６．ｆＦＯ５０ｔ５８）をＧＩＴ培地
（大五栄養化学社製）に浮遊させ、３７°Ｃで培養を継
続し、順次培養容１を増加した。得られた培養上清６Ｑ
に硫酸アンモニウムを４７％の濃度になるように加え、
４°Ｃで撹拌しながら６０分間塩析を行ない、遠心分離
（１０，０００回転、１５分間）した。得られた沈澱物
を５０ｍＭＮａＣｆ２含有２０ｍＭトリス緩衝溶液（ｐ
Ｈ７，９）に溶解し、同じ緩衝液ｌσに対して透析を実
施した。

２時間後、透析液を交換し、さらに１５時間透析を実施
し、１０，０００回転、１５分間遠心分離した。上清を
充分量の５０ｍＭＮａＣ（ｌ含有トリス緩衝溶液で順化
したｌＯ〆のＤＥＡＥ−セルロースカラム（ワットマン
　ＤＥ５２）にかけ、５０ｍＭＮａＣＱ含有トリス緩衝
溶液で素通りする両分を濃縮してヒトモノクローナル抗
体ＰＡ−１０・１を得た。抗体の純度の確認にはラエム
リらの方法［不イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、　２２７．
．６８０（１９７０）］に従い５ＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を用いた。すなわち硫安塩析し、ＤＥ
ＡＥ−セルロースカラムで素通りした画分を、２−メル
カプトエタノールで還元して１０％５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル、１８０ボルト、２２時間の条件で泳動し
た。その結果、分子■約５２キロダルトン前後にＨ鎖、
約２８キロダルトン前後にＬ鎖の２つのバンドが認めら
れ、不純物にもとづくバンドは観察されなかった。

実施例５ 抗癌抗体産生ハイブリドーマの取得およびそのクローニ
ング ヒトＰＢＬを参考例４に記載の方法で形質転換し、ＥＢ
Ｖ）ランスホーマントを作成した。次いでこのＥＢＶ）
ランスホーマントとＡＣ−３］；Ｊとを実施例３に記載
の方法で細胞融合し、ＨＡＴＯ選択培養を実施した。細
胞融合後、４〜６×１０′″細胞／ｄの濃度でマイクロ
プレートに播種し、１２〜１４日でヒト−ヒトハイブリ
ドーマの増殖が認められたウェルについて、その培養上
清を参考例１および２にそれぞれ記載のＭＨＡおよびＣ
ｅ１ｌ−ＥＬＩＳＡ試験に供した。

比較のため、ＴＡＷ−９２５株を親株として用い、同様
の実験を実施した。結果は第２表に示すとおりとなった
。

ＡＣ−３３株の場合、播種した７、８５１ウエルに対し
て融合効率は３５％で、２種の抗癌抗体産生ハイブリド
ーマが得られたが、ＴＡＷ−９２５株では、播種した４
８，２３９ウエルに対して融合効率は４〜３１％、平均
上標準偏差：　１８±８％で、抗ヒト癌細胞ヒトモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマが１株のみ得られた。

第２表の結果から、ＡＣ−３３株は融合効率が優れてお
り、抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマの取得に有利に用いられることが明らかである。

上記のように、ＡＣ−３３株を親細胞株として用いた融
合実験では、胃癌細胞ＡＺ−５２１および肺癌細胞ＣＡ
ＤＯ−ＬＣ３に結合性を示したウェルと、肝癌細胞ＨＥ
Ｐ−Ｇ２とｈｕ−Ｈ４に結合性を示したウェル、各１種
ずつが得られた。これら２種のウェルに含まれるハイブ
リドーマを限界希釈法によるクローニングに供し、実施
例５に記載の方法と同じ手法で、フィーダー細胞として
の胸腺細胞共存下でマイクロプレートの各ウェルに播種
した。約２週間後に細胞増殖の認められたウェルの上清
の抗体活性をＭＨＡおよびＣｅｌｌ−ＥＬＩＳＡで測定
し、増殖能および抗体産生能の優れたヒト−ヒトハイブ
リドーマを選別・育種した。

その結果、ＡＺ−５２１およびＣＡＤＯ−ＬＣ３反応性
ヒトモノクローナル抗体産生ヒト−ヒトバイブリド−７
Ｋｕ１０２と、ＨＥＰ−Ｇ２およびｈｕ−Ｈ４反応性ヒ
トモノクローナル抗体産生ヒト−ヒトハイブリドーマ　
Ｋｕ１０５とがそれぞれ得られた（それぞれＦＥＲＭ　
　ＢＰ−２１４４、ＩＦ○　５０１５６およびＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２１４５、［ＦＯ５０１５７）。

（以下余白） 第２表 実験　播種 親株　　Ｎｏ、　　ウェル数 ＡＣ−３３株　　１　　７，８５１ ＴＡＮ−９２５株　ｌ　　　９，１２３２　　６．６２
３ ３　　　Ｂ、８７４ ４　　６．９７７ ５　　４．１７６ ５　　９．８２６ ７　　２．６４０ 増殖 ウェル数 ２、７７ｇ ２、８５５ １、３３０ １、２６８ １、６４８ 計　　４８．２３９　　９．３９０ 融合　抗癌抗体 効率陽性ウェル数 ３５％　　　２ ３１％　　　１ ２０％　　　Ｏ １４％　　　０ ２４％　　　０ １３％　　　０ １７％　　　０ ４％　　　０ １８±８悲）１ 発明の効果 本発明に用いられるヒトＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ−３
３は増殖能および融合能に優れ、特にＥＢＶ）ランスホ
ーマントとの融合効率が高く、例えば抗ヒト癌細胞ヒト
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマあるいは抗緑膿
菌外毒素ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ取
得のための親株として有用で、また本細胞株を用いるこ
とによって得られたハイブリドーマは増殖能が優れ、ヒ
トモノクローナル抗体産生能が安定しており、長期にわ
たり効率良く抗体を製造できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で得られたＡＣ−３３株の染色体図
を示す。 代理人　　弁理士　　岩　１）　　弘

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒトＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ−３３またはその
   継代株と、エプスタイン−バーウイルスによって形質転
   換されたヒトリンパ球とのハイブリドーマ。 （２）抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体を産生する
   特許請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ。 （３）抗緑膿菌外毒素Ａヒトモノクローナル抗体を産生
   する特許請求の範囲第１項記載のハイブリドーマ。 （４）ヒトＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ−３３またはその
   継代株と、エプスタイン−バーウイルスによって形質転
   換されたヒトリンパ球とのハイブリドーマを培地に培養
   し、抗体を採取することを特徴とする抗体の製造法。 （５）抗体が抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナル抗体であ
   る特許請求の範囲第４項記載の製造法。 （６）抗体が抗緑膿菌外毒素Ａヒトモノクローナル抗体
   である特許請求の範囲第４項記載の製造法。 （７）ヒトＢリンパ芽球様細胞株ＡＣ−３３またはその
   継代株と、エプスタイン−バーウイルスによって形質転
   換されたヒトリンパ球とのハイブリドーマにより産生さ
   れた抗体。（８）抗体が抗ヒト癌細胞ヒトモノクローナ
   ル抗体である特許請求の範囲第７項記載の抗体。 （９）抗体が抗緑膿菌外毒素Ａヒトモノクローナル抗体
   である特許請求の範囲第７項記載の抗体。