JPS62155083A - 新規なヒトｂセル・リンパ芽球細胞変異株、そのヒト／ヒト・ハイブリド−マ及びその生産する抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、たとえば、人の抗原性疾患の予防、治療、診
断などの医学及び薬学分野や生化学的試薬、生体高分子
の精製試薬など薬理学分野、生化学分野等の如き広い分
野において有用な抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産
をヒト体外で工業的に行うことを可能とするヒト／ヒト
・ハイプリドーマの創製、その他各種の融合細胞株の形
成に利用できる融合７９−トナー（Ｆｒｂｓｉｏｎ　ｐ
ａｒｔｎｅｒ）として有用な新規なヒトＢセル・リンパ
芽球細胞変異株に関する。

本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リンパ芽球細胞
変異株を利用して創製される抗原特異的ヒト免疫グロブ
リン生産性ヒト／ヒト・ハイプリドーマ、更には該ハイ
プリドーマが生産する抗原特異的ヒト免疫グロブリンに
も関する。

更に詳しくは、本発明はヒトＢセル・リンパ芽球細胞か
ら導かれた変異株であって、且つ下記（１）〜（ｖ） （１）６−チオグアニン耐性である、 （ｉｉ）　　ウワバイン耐性である、 （ｉｉｉ）　　Ｎ　Ａ　Ｔ　Ｏ含有培地で死滅する、Ｇ
ｙ）　　免疫グロブリンＩｇＧ及びＩＱＭを実質的に生
産しない、 （ｖ）基礎培地ＲＤＦ中にインシュリン、トランスフェ
リン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプト
エタノール及び血清アルブミンを含む無血清培地におい
て増殖可能である、の形質（ｐｈｇｎｏｔｙｐｅ　）％
性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン・５芽球
細胞変異株に関する。

本発明はまた、この新規なヒトＢセル・リン・せ芽球細
胞変異株を融合パートナ−とするヒト／ヒト・ハイブリ
ドーマ、たとえば、ヒト胃癌患者のヒト９７７４球細胞
の如き悪性腫瘍患者のヒトリンパ球細胞と該融合・セー
トナーとのヒト／ヒト融合細胞株である抗原特異的ヒト
免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリドーマ、更
には、このようなヒト／ヒト・ハイブリドーマが生産す
る抗原特異的ヒト免疫グロブリンにも関する。

従来、ヒト／ヒト・ハイプリドーマの形成に利用できる
ヒドリンＡ系株化細胞についていくつか知られている。

そのような融合ハードナーとして利用できるヒ）　ＩＪ
ン・９系株化細胞の例としては、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ
　Ｔｏｄａｙ、　ｖｏｌ、　４、嵐３．１９８３．７３
頁のＴＡＢＬＥ　　ＩＴに記載のＳＫＯ−００７（Ｉｇ
ε、λ）、ｒＭ−Ｈ２（Ｉｒｔλ、ｋ）、ＤＨＭＣ（Ｉ
ｙｒ＋λ）、ＧＪｆ、１５００　（Ｉｇｒ２゜ｋ）、Ｋ
Ｒ−４（Ｉσγ、／ｃ）、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−１１Ｍｖ
２（Ｉｒｔｒｌ、ｋ）、　ｃＭｏ４６７．５（Ｉｒｔμ
、λ）、ｎ３５１．１（Ｉｃｔμ、ｋ）、ＵＣ７２９−
６（１（Ｊμ、＆）、０Ｍ４６７２（Ｉａγ２．ｋ）な
どを挙げることができる。しかしながら、これら従来公
知のヒトリンノ！系株化細胞は、上記文献のＴＡＥＬＥ
　　ｎに記載され、上記にカッコで示したように、程度
の差こそあれ免疫グロブリンを実質的に生産する点で、
その融合ツートナーとしての利用に好ましい株とは言い
難く、その利用に制約をうける。その理由は、これらの
融合ツートナーと例えば癌患者のヒトリンパ球細胞とか
ら導かれるヒト／ヒト・ハイブリドーマが生産するヒト
免疫グロブリンは、該融合ノぐ一トナーが本来生産する
免疫グロブリンが、該癌患者のヒトリンパ球細胞に由来
する目的とする免疫グロブリンに混入したポリ・クロナ
リテイ（ｐｏｌｖ−ｃＬｏｎα１ｉｔｙ　）形態で得ら
れるため、目的とする免疫／”ｇプリンの単一性（ｍｏ
ｎｏ−ｃｌｏｎａｌ　ｉｔｙ　）が失われるからである
。

本発明者は、上述のような制約から解放された融合パー
トナ−を創製すべく研究を行ってきた。

その結果、ヒトＢセル・リンツヤ芽球細胞から導かれた
変異株であって、免疫グロブリンを実質的に生産しない
新しいヒ）　ＩＪン・々系株化細胞を６：」製すること
に成功した。

本発明者は、それ自体公知のヒトＢセル・リンパ芽球細
胞Ｗｌ　−Ｌ　２　［：微工研寄託受託拒否通知書、通
知番号：６０微寄文第１６２１号〕から、薬剤耐性化手
法を利用した特定の変異株形成操作を経て、それ自体増
殖能を有するが免疫グロブリンを実質的に生産しない新
規ヒトリンパ系株化細胞を創製し且つこの新規ヒトＢセ
ル・リンパ芽球細胞変異株は、ヒト／ヒト・ハイプリド
ーマの創製その他各種の融合細胞株の形成に利用できる
融合パートナ−として、前述の如き制約から解放された
単一性の高い免疫グロブリンの生ｉｔを可能とする融合
細胞株の形成に有用な新規ヒトＢセル・リンパ芽球細胞
変異株であることを発見した。

更に、本発明者は、このヒトＢセル・＋）７Ａ芽球細胞
変異株を用いて、ヒト胃癌患者のヒドリンＡ球細胞と該
ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株とのヒト／ヒト融合
細胞株である抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト
／ヒト・ハイブリドーマの創製に成功し、且つ該抗原特
異的ヒト免疫グロブリンの生産に成功した。

従って、本発明の目的は、医学、薬理学、生化学分野等
の広い分野において有用な新規ヒトＢセル・リンパ芽球
細胞変異株を提供するにある。

本発明の他の目的は、上記新規ヒトＢセル・リン・ぞ芽
球細胞変異株と悪性腫瘍患者のヒトリンパ球細胞から導
かれる抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト
・ノ・イブリドーマ、更にはその生産する抗原特異的ヒ
ト免疫グロブリンを提供するにある。

本発明によれば、ヒトＢセル・リン・ぞ芽球π；Ｕ胞か
ら導かれた変異株であって、且つ下記（１）〜（■）（
ｉ）６−チオグアニン耐性である、 （ｉｉ）　　ウワバイン耐性である、 （ｉｉｉ）　　ＨＡ　Ｔ　Ｏ（ヒポキサンチン、アメン
プテリン、チミジン及びウワバイン）含有培地で死滅す
る、 Ｇｖ）　　免疫グロブリンＩｇＧ及びＩＯＭを実質的に
生産しない、 （ｖ）基礎培地ＲＤＦ中にインシュリン、トランスフェ
リン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプト
エタノール及び牛血清アルブミンを含む無血清培地にお
いて増殖可能でめる、 の形質特性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン
・ぐ芽球細胞変異株が提供できる。

本発明の新規Ｂセル・リンパ芽球細胞変異株は、例えば
、ヒトＢセル・リン・ぐ芽球細胞を無血清培地で培養適
応させ、適応した細胞群から実質的に免疫グロブリン生
産能を欠如する細胞をスクリーニングし、このスクリー
ニングした細胞を６−チオグアニン含有無血清培地で培
養適応させ、斯くて形成された６−チオグアニン耐性細
胞を突然変異剤で処踊したのち、ウワパイン含有無血清
培地で゛培養適応させ、得られた耐性細胞を６−チオグ
アニン及びウワバインの両者を含有する無血清培地でク
ローン化することにより創製することができる。

この際利用する無血清培地の例としては、基礎培地ＲＤ
Ｆ　（基礎培地ＲｐＪｆ１１６４０”、基礎培地ＤＭＥ
”、基礎培地Ｆ１２＝２：１：１の混合基［ｔｊｔ　）
　Ｋ、インシュリン、トランスフェリン、セレニウム、
エタノールアミン、β−メルカプトエタノール及び牛血
清アルブミンの適量を配合した無血清培地を好ましく例
示することができる。

他の無血清培地も利用でき、培養適応させるヒトＢセル
・リン・ｅ芽球細胞及び基礎培地の種類、上記他の配合
成分のき類及びそれらの量などに応じて、実験的に適宜
に選択、変更、決定して利用することができる。又、利
用する突然変異剤の例としては、ＭＮＮＧ　（Ｎ−メチ
ル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニソン）、ＥＭＳ
（メチルスルホン酸エチル）、ＡＡＢ（４−アミノアゾ
ベンゼｙ）、ＡＡＦ　（２−アセチルアミノフルオレン
）、ＡＦ−ｚ（２−（２−フリル）−３−（５−ニトロ
−２−フリル）アクリルアミド）、ＢＰｏよ（ベンゾぎ
レンオキシド）、ＢＺＤ（ベンチリン）、ＤＡＢ（＃、
Ｎ’−ツメチルアミノアゾベンゼン）、ＤＡＭ　（ソア
ミンアニソール）、ＤＢＡ　（ソペンズアントラセン）
、ＤＢＥ（ソブロモエタン）、ＤＥｐ　（ヅプロモクロ
ログロ／ｌン）、ＤＭＮ　（ジメチルニトロサミン）、
ＥＮＮＧ（Ｎ−エチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグ
アニソン）、ＥＭＵ（エチルニトロソウレア）、ＨＦＡ
　（Ｎ−ハイド０−’Ｉ−シー２−７セｆルーアミノフ
ルオレン）、３ＭＣＡ　（３−メチルｗ５：ｙスｖｙ）
、ＭＭＳ（メチルスルホン酸メチル）、２Ａ’、（（２
−す７チルアミン）、ＮＡＡＡＦ　（Ｎ−アセトオキシ
アセチルアミノフルオレン）、ＮＥＡ（Ｎ−ニトロソツ
ブチルアミン）、４ＮＱ□（４−ニトロキノリン−１−
オキシド）、０ＡＴ（ｏ−アミノアゾトルエン）、ＰＩ
（プロピレンイミン）、ＴＣＥ（トリクロロエチレン）
、ＴＤＳ（トルエンソアミノスルフエイト）、ＴＯｘ（
トキサフェン）、ＶＣ（ビニルクロライド）などの公知
変異剤を例示することができる。

培養適応は、例えば３７℃、５％ｃｏ１条件下で行なう
ことができ、また、クローン化はそれ自体公知の例えば
限界稀釈法を利用して行なうことができる。培養適応手
段、スクリーニング手段、突然変異剤処理手段などの各
単位手段それ自体はよく知られており、適宜に選択利用
することができる。

上記において利用するヒトＢセル・リンパ芽球細胞の例
としては、前述したそれ自体公知のヒトＢセル・リン・
９芽球細胞ＩＩ−Ｌ２（微工研寄託受託拒否通知書、通
知番号＝６０微寄文第１６２１号）のほかに、例えば、
ヒトＢセル・リン・々芽球細胞ＩＭ−９（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ　　１５９　）、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＮＣ−
３７（ＡＴＣＣＣＣＬ　　２１４）及びヒトＢセル・リ
ンパ芽球細胞ＣＣＲＦ−５Ｅ（ＡＴＣＣＣＣＬ　　１２
０）などの如き公知株化細胞を例示することができる。

上述のようにして得ることのできる前記（１）〜（ｖ）
の形質特性を有するヒトＢセル・リン・ぐ芽球細胞Ｗｌ
−Ｌ２から導かれた変異株の１つはＨＩＥ／Ｔ０１株（
微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６０微寄文第１
１９８号）と命名された。

本発明によれば、上述のようにして得られるヒトＢセル
・リン・ぐ芽球細胞変異株を融合・イートナーとして利
用し、抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産をヒト体外
で工業的に行うことを可能とするヒト／ヒト・ハイプリ
ドーマの創製を包含して、たとえば悪性腫瘍患者のヒ）
　ＩＪン・９球細胞と該変異株とのヒト／ヒト・ハイブ
リドーマの創製、ソの他各種の融合細胞株を創製するこ
とができる。

以下、そのような融合細胞株創製の一態様について述べ
る。例えば、ヒト胃癌患者のヒトＢセルを用い、これを
本発明のヒトＢセル・リン・を芽球細胞変異株と人間の
体外で融合させ、たとえば胃癌、肺癌、悪性黒色腫細胞
などの癌関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリ
ン生産能を有するヒト／ヒト・ハイプリドーマを産生ず
るコトカできる。

この融合細胞を産生ずる融合操作それ自体はよく知られ
ており、本発明で利用することができる。

例えば、液媒中で融合促進剤の存在下に、ヒト胃癌患者
のヒトＢセルと本発明のヒトＢセル・リン・ぐ芽球細胞
変異株とを接触させることにょシ行うことができる。こ
のような融合方法の例としては、たとえば仙台ビールス
（ＨＶＪ）、ｄリエチレングリコールなどの如き融合促
進剤を用いる方法を例示できる。更に、高電圧で電気的
に融合する方法〔例えば、　Ｕ−Ｚｉｔｙｖｎｅｒｍａ
ｎ　ａｔ、　ａｌ、、　”　Ｅｌｅ−ｃｔｒｉｃ　Ｆｉ
ｅｌｄ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　　Ｆｒｂｓｉｏ
ｎ　’　　・Ｔｈｔｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｈｙｓｉｃｓ、１０゜４３−５０
　ｔ　１９８２゜Ｕ、Ｚｉｍｙｎｅｒｍａｎ　ａｔ、ａ
ｌ、。

”　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｉｔｔｌｄ−１ｎｔｈｂｃｅ
ｄ　Ｃｅ１ｌ−ｔｏ−ＣｅｌｌＦｕｓｉｏｎ”　；　　
Ｔｈｅ　　Ｊｏｓｒｎａｌ　　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒｅｔｓ
ｅＢｉｏｌｏｃｔｖｔ　　６７、ｔ６ｓ−１ａ２．１９
８２゜Ｕ、Ｚｉｔｒａｎｅｒｍａｎ、”　Ｅｌｅｃｔｒ
ｉｃ　Ｆｉｅｌｄ　ＭｅｄｉａｔｅｄＦｕｓｉｏｎ　ａ
ｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎａ’；　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ａｔ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃαＡｃｔα６９４゜２２７−２７７．１
９８２゜等〕を利用して行なうこともできる。

前者の態様に於ては、例えば、水性媒体中、上記例示の
如き融合促進剤の存在下、所望によりおだやかな攪拌を
加えて系を均一にし、前記ヒト胃癌患者のヒトＢセルと
本発明変異株から成る融合細胞が産生される時間、たと
えば数分間のオーダーで両者を接触させることにより、
所望の融合細胞を産生ずることができる。利用する水性
媒体の例としては、水、生理食塩水、５％ツメチルスル
ホキシド水溶液、５％グリセロール水溶液などを例示す
ることができる。

斯くて所望の融合細胞が産生された系を、たとえば遠心
分離して細胞群を採取し、再び適当な培地たとえば１０
％仔牛血清を含有させた。前記（ｖ）無血清培地にＮＡ
ＴＯを加えた培地に、採取した該細胞群を分散させ、こ
の分散液を例えばマイクロ・タイター・プレートの穴に
、夫々、一定量づつ分取注入し、たとえば５％ＣＯ２の
存在下、６７℃で培養し、各穴中の培養液を例えば５日
毎に新しい培養液と取りかえ、たとえば２週間培養を続
けたのち、顕微鏡下で融合細胞の有無を調べ、コロニー
の認められた試料の培養液を採取し、ヒト免疫グロブリ
ンの有無をたとえば１ｍ！１７を用いたラジオ・イムノ
・アッセイや酵素抗体法により検出することにより、所
望のコロニーを選別することができる。

このようにして選別されたヒト免疫グロブリンの生産の
認められたコロニーを、新しい培養液に移して培養し、
融合細胞を増殖させることにより融合細胞クローンを取
得することができる。更に、必要に応じて、サブ・クロ
ーニングして、所望のヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫など
の癌関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリン生
産性クローンを得ることができる。

上述の態様で、ヒト胃癌患者のヒトＢ−セルと本発明ヒ
トＢセル・リン・！芽球細胞変異株から産生された抗原
特異的免疫グロブリン生産性ヒト／ヒトハイプリドーマ
Ｔ　ＯＳ／Ｇ　５株の細胞生化学的性質を以下に示す。

（１）　　ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）分泌（生産
）、 （２）倍加時間（ダブリング・タイム）〔於（■）無血
清培地〕約４０時間、 ｆ３１　　ＤＮＡ含量が正常ヒドリン・９球の２倍以上
、（４）上記（１）のＩｙＭはヒト株化細胞ＫＡＴＯ−
■（胃癌）に対して結合性を示す、 （５１ＨＡ　Ｔ　Ｏ含有培地（ヒポキサンチン、アメソ
グテリン、チミゾン及びウワパイン含有培地）中で分裂
増殖可能である。

尚、相対ＤＮＡ含量（正常ヒトリンパ球のＤＮＡ含量に
対する比率）は、ノ・イブリドーマをグロピソウム・ア
イオダイドで染色したのち、フローサイトメーター（ｆ
ｌｏｗ　ｃｙｔｏｍａｔａｒ）で分離分析する方法によ
って決定された。

本発明によれば、上述のようにして産生ずることのでき
るたとえばヒト胃癌患者のヒトＢセルと本発明ヒトＢセ
ル・リンパ芽球細胞変異株から導かれた抗原特異的免疫
グロブリン生産性ヒト／ヒト融合細胞株を利用して、抗
原特異的ヒト免疫グロブリンを得ることができる。該抗
原特異的ヒト免疫グロブリンは上記ヒト／ヒト融合細胞
株を培地に培養し、その培養物よシ抗原特異的ヒト免疫
グロブリンを採取することによシ製造できる。

例えば、上記ヒト／ヒト融合細胞株を適当な培地たとえ
ば前記（■）の培地で培養し、培養液を採取することに
よりヒト胃癌、肺癌、悪性黒色腫の如きガン関連抗原に
特異的に結合する免疫グロブリン含有物質を得ることが
できる。精製はたとえば、硫安分画法、アフィニティー
クロマトグラフィー、ｒル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、電気泳動法などの如き生体液から免疫グロブ
リンを採取、精製する際に利用できると同様な精製手段
を利用して行なうことができる。

本発明によれば、前述した融合細胞クローン又はその培
養液からがン関連抗原に特異的に結合するヒト免疫グロ
ブリン含有物質又は該免疫グロブリンを取得するに際し
、抗原性組織（例えば癌組織）を一度、免疫物質生産能
を欠如するか若しくは生産能の極めて弱い生体たとえば
ヌード・マウス（ｎｕｄｅ　ｍｏｕｓｅ　）などに植え
つけ組織を維持した後、その組織に対して或いは培養系
にもどされた組織に対して反応するヒト免疫グロブリン
（抗体）を探し出し、これを分離するのが有利である。

上記ヒト／ヒトハイツリドーマの培養に利用できる培地
の例としては、前記（■）の無血清培地のほかに、例え
ば、基礎培地ＲＤＦに牛胎児血清、仔牛血清、成牛血清
、ヒト血清などの如き血清を含有させた培地、基礎培地
ＲＰＭ１１６４Ｄに上記の如き血清を含有させた培地な
どを例示することができる。又、培養条件としては、た
とえば５％ＣＯ２の存在下で３７℃の条件を例示できる
。

上述のようにして得ることのできる本発明のがン関連抗
ｆｇ、特異的ヒト免疫グロブリンの例として、前述した
ヒト、／ヒト・ハイプリドーマＴ　Ｏ５７０５株の生産
する本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンを例示でき
る。その特性を以下に示す。

（イ）ヒト免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）であって、（ロ
）　ヒト株化細胞ＮＡＴＯ−■（胃癌）及びヒト株化細
胞Ａ３４９（肺癌）に対して結合力を示す、 （ハ）Ｈ鎖（ｈｅａｒｙ　ｃｈａｉｎ　）及びＬ鎖（ｌ
ｉｇｈｔｃｈαｉｎ）よシ成シ、分子量が約１８万であ
る。

上記ヒト株化細胞ＫＡＴＯ−ｍ＜胃癌）はＡＴＣＣＨＴ
Ｂ　１０３として、又ヒト株化細胞Ａ３４９（肺癌）は
ＡＴＣＣＣ’ＣＬ１８５としてＡＴＣＣ（アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション）から自由に入手で
きる。

本発明の抗原特異的ヒト免疫グロブリンは、たとえばヒ
ト胃癌、肺癌、脳腫瘍、悪性黒色腫などの如きヒト癌へ
の作用抗体或いはそれ自体の作用でこれら癌細胞の増殖
抑制、癌細胞の死滅を行わせたり、更に、ヒト体外で量
産されたこれらの癌組織認識抗体に補体もしくは’ｆ　
＋　リン・に球（マクロファーソ）の助けをかシて癌細
胞の増殖抑制や癌細胞死滅のはたらきをさせたシするこ
とができる。更にまた、ヒト体外で量産されたこれら癌
特異的抗体をキャリアーとして利用して、例えば化学療
法剤結合−ヒト・モノクロナル抗体、インターフェロン
結合−ヒト・モノクロナル抗体、高分子毒素結合−ヒト
・モノクロナル抗体、楽物入りリポゾーム結合−ヒト・
モノクロナル抗体などの形で癌細胞の増殖抑制や死滅の
はたらきをさせたシするのに有用である。また、本発明
のヒト・モノクロナル抗体をキャリアーとして利用し、
これに放射線感受性物質を結合させて患者に投与し、癌
細胞に選択的に集まる性質を利用して患部を検知し放射
線療法に利用することができる。このような癌に対する
利用に際しては、ヒト・モノクロナル抗体として完全な
抗体を用いてもよいし、抗体を化学的な手法で特異的抗
原認識部位を含むよシ小さな分子に切断して用いたシ、
或は、そのような小さな分子もしくは特異的抗原認識部
位のみを他の抗体の非特異的抗原認識部分と結合させて
、より有効性のある修飾ヒト・モノクロナル抗体を化学
的手法で創製して用いることもできる。

以下、実施例によシ、本発明の数態様について更に詳し
く説明する。

実施例１　　ヒトＢセル・す／ノ臂芽球細胞変異株。

ヒトＢセル・リンパ芽球細胞ＩＩ−Ｌ’ｌ（微工研寄託
受託拒否通知書、通知番号：６ｏ微寄文第１６２１号）
を、基礎培地ＲＤＦ中にインシュリン、トランスフェリ
ン、セレニウム、エタノールアミン、β−メルカプトエ
タノール及び牛血清アルブミンの適量を含有する無血清
培地で培養適応させる。該無血清培地を分注した９６穴
マイクロタイターグレートに１　ｃｅｌｌ　／　ｗｅｌ
ｌ・となるように植えこみ、５％ＣＯ２，３７℃の条件
下で限界稀釈法によりクローニング操作を行なう。約１
ケ月経過後、増殖してきた５０穴よシ免疫グロブリンＩ
ｇＧ及びＩｇＭを実質的に培地中に生産していないクロ
ーンを１つ選び出した。

このクローンを、まず［］、１μＭの６−チオグアニン
を含む前記と同様な無血清培地中で培養適応させる。培
養は５％”＊、３７℃の条件下で、継代培養をくシ返す
ごとに、６−チオグアニン濃度をＱ、２ｐＨＳ　ａ５ｔ
ｔＭ、１　ａＭ、２ｐＨ，４μＭ、　　１０　ｐＨ，１
５ｐＨ，２０ｔｔＭと段階的に上げて行ない、最終的に
２０μＭの６−チオグアニン含有無血清培地中で増殖可
能な単クローンを、前記と同様な限界稀釈法によるクロ
ーニング操作で選別する。

この細胞を、１μ２／−の突然変異剤ＭＮＮＧ（Ｎ−メ
チル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニソン）を含有
する基礎培地ＲＤＦ中で、５％ＣＯｚ、３７℃の条件下
で３時間培養した後、前記と同様な無血清培地で洗浄し
、洗浄した細胞を２０μＭの６−チオグアニン及びウヮ
バインを含む前記と同様な無血清培地中で培養適応させ
る。

培養は５％ＣＯ，，３７℃の条件下で、継代培養をくシ
返すごとに、ウヮバインの濃度を０．１μＭ１０・２μ
Ｍ為　０・５μＭ、　　１μＭＸ　５μＭと段階的に上
げて行ない、最終的に２０μＭの６−チオグアニン及び
５μＭのウワパインを含む無血清培地中で増殖可能な単
クローンを、前記と同様な限界稀釈法によるクローニン
グ操作で選別する。

斯くて創製されたヒトＢセル・リン・セ芽球細胞変異株
は前記（ｉ）〜（■）の形質特性を示し、ＨＩＨ／ＴＯ
１株と命名された。

実施例２ 胃癌患者から手術の際に癌組織周辺のリンパ節を入手し
た。す７７９節をノ・サミで細かく切シきざみ、内部の
リン・２球を培地ＲＤＦ　（ＲＰＭＩ　１６４０　：Ｄ
ＭＥ：Ｆ−１２＝２　：　１　：　１　）中に分散させ
、続いて２重のガーゼを用いて、濾過を行い、脂肪層を
除いた後に、炉液中の細胞（リン・９球〉８０％）を遠
心法によって集める。その後、癌患者由来のリン・５球
分画（ドナーＢセル）を２０％牛脂児血清および、１０
％ツメチルスルホオキサイド（ＤＭＳＯ）を含むＲＤＦ
培地中で凍結（−１５０℃）シ、細胞融合を行う日まで
保存し六。

ドナーＢセルと免疫グロブリン生産能を実質的に欠損し
ている前記実施例１で得た親ヒトＢ−セル（ＩＩＩＨ／
Ｔｏ　１　）のそれぞれをｌＸ１０Ｔおよび２Ｘ１０？
個混合し、３５％ぼりエチレングリコール１５００の存
在下に融合を完了させる。

その後、１００×２．１０分間の遠心処理を行ってポリ
エチレングリコールを除き、新たに、１０％牛脂児血清
および、ヒポキサンチン、アメソプテリン、チミゾン、
ウワバイン（Ｈ，４ＴＯ）を含むＲＤＦ培地を加える。

この細胞群を含む培養液２００μｌ（この中にはｌＸ１
０’個のセルを含む）づつを９６個の穴をもつミクロプ
レートに分注し、約２０日間、３７℃、５％ＣＯ，条件
下のインキュベーターで培養した。この間、ＨＡ　Ｔ　
Ｏ及び１０％牛脂児血清を含むＲＤＦ培地を５日に１度
交換した。親Ｂ−セル（ＨＩＨ／Ｔｏ　１　）はアメソ
プテリン存在下ではヒポキサンチンホスホリボシールト
ランスフェラーゼを欠損しているため、生きることが出
来ない。またドナーＢセルは、ウワパインを含むＲＤＦ
＋１０％牛脂児血清中では永続的に増殖し生きのびるこ
とができない。よってＮＡＴＯを含む培地で永続的に増
殖した細胞はドナーＢセルと親Ｂ−セル（ＨＩＨ／ＴＯ
１）の融合した細胞である。３週間培養の後、ミクロプ
レートの９６個の穴の中に７個の７・イブリドーマのサ
ブクローンが見られた。このうちの１個のハイブリドー
マサブクローンは更にクローン化されるために、集めら
れ、新たに１０％牛脂児血清及び１．ＨＡＴＯを含むＲ
ＤＦ培地を加え、懸濁させる。この細胞群を含む培養液
を９６個の穴をもつミクログレートに各穴に５個の細胞
が入るよう分注し、約１ケ月、３７°Ｃ，５％ＣＯ，条
件下のインキュベーターで培養した。この間、ＨＡＴＯ
及び１０％牛脂児血清を含むＲＤＦ培地を６日に１度交
換した。生じたサブクローンのうち最も増殖率のよいも
のを選び、ＴＯＳ／Ｇ５と命名した。

これがハイプリドーマであることをさらに確認するため
に、細胞内ＤＮＡ含量を調べた。その方法を以下に説明
する。

遠心管の中に培養細胞液を入れ遠心処理によυ上清を除
去する。７０％エタノーク溶液で５０分以上固定を行う
。遠心処理により上清を除き、ＲＮＡ分解酵素（ＲＮα
口）溶液を加え、静かに振盪し、ＲＮＡを分解する。５
７℃で３０分間反応させた後、再蒸留水で２度洗浄する
。プロピデイウムイオダイド（ｐｌ）を加え、室温で２
０分間、染色した後再蒸留水で２度洗浄する。再蒸留水
で希釈し、セルンーターを用いて分析した結果、Ｔ　Ｏ
Ｓ／Ｇ５にはドナーＢセルの２倍以上のＤＮＡ含量が認
められた。以上の結果より、ＴＯＳ／Ｇ５はハイプリド
ーマであることが確認された。

このＴ　ＯＳ／Ｇ５がヒト免疫グロブリン（Ｈｕｌσ）
を産出していることを酵素抗体法を用いて確めた。

以下、その方法を説明する。

ミクロタイタープレートの中に抗ヒト免疫グロブリン抗
体を滴下（５０μＡｔ）Ｌ、３７℃で１時間プレートに
吸着させる。０．３にのゼラチンを含む１０ｍＭ　ＰＢ
Ｓ　（ゼラチン緩衝液）で６回洗浄した後、５％牛血清
アルブミン溶液を滴下（２００μｊ）Ｌ、３７℃で１時
間吸着させる。

ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する
。次に検液（培養上清）を滴下（５０μｌ）して、６７
℃で１時間反応後、ゼラチン緩衝液で３回洗浄スる。ペ
ルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体を滴下（５０μ
ｌ）して、６７°Ｃで６０分間反応させ、培養上清中の
ヒトＩｇと結合させる（酵素抗体法）。ゼラチン緩衝液
で５回洗浄後、過酸化不素とＯ−フエニレンソアミンを
含む基質浴液を加え、暗室で１０分間反応させる。５Ｎ
ＩＩ２５０４（５０μりを加え反応を止める。もしミク
ロプレート上にペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗
体が残っている場合、すなわちそれに結合されるヒトＩ
ｇが残っている場合には４９０ｎｍに吸収をもつ黄色の
基質反応物が生産される。

この量を吸光度計を用いて測定し、ハイプリドーマ培養
上溝中に含まれるヒトＩｇの量を知る。ハイプリドーマ
培養上清中にヒトＩｇが存在しない場合にはζペルオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇ抗体は洗浄の段階で洗い流
される。

以上の測定方法を用いた結果Ｔ　ＯＳ／Ｇ５はヒトＩｇ
Ｍを生産していることがわかった（ドナーＢ−セルと同
形質のＩｇ）。

１ケ月後にＴ　ＯＳ／Ｇ５を２４個の穴をもつミクロプ
レーＮ２ｍＪ／穴）に植えかえた後さらに１週間培養を
続けた。その培養液の上清を採取し、種々の株化細胞を
標的細胞としてヒトハイプリドーマから生産されるＩ（
１の特異性を調べた。その方法を以下に説明する。

ヒトの種々の株化培養細胞を、ＤＦ培地（ＤＭＥ”。

Ｆ−１２＝１：１）に１０％牛脂児血清を加えた培地で
培養する。細胞の数が５Ｘ１０’〜１×１０７になった
段階でトリプシンを用いて細胞をシャーレの底面から剥
がし、遠心法を用いて細胞を集め、培地でよく洗浄する
。９６個の穴をもつミクロタイタープレートの各穴に細
胞を一定数（１０”／１００μ！〕ずつ分注し、３７℃
で１晩、プレートに吸着させる。次に３％ダルタルアル
デヒド溶液を滴下（５０μ’）Ｌ、３７℃で２０分間、
細胞の固定を行う。遠心法（２ｏｏｆ、１ｏ分間）で細
胞をおとし、ゼラチン緩衝液で３回洗浄した後、１％牛
血清アルブミン溶液を滴下（２００μｌ）し、３７℃で
１時間グレートに吸着させる。

ゼラチン緩衝液で３回洗浄し、未吸着のものを除去する
。その後、検液（培養上清）を細胞の上に滴下（５０μ
ｌ）し、３７℃で１時間反応させ、ゼラチン緩衝液で３
回洗浄する。続いてペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇ抗
体を滴下（５０μりし、５７℃で３０分間、反応させる
。ゼラチン緩衝液で６回洗浄を行った後、先述の酵素抗
体法で述べた方法によって細胞に結合する培養液中のヒ
トＩｇの量を測定する。

以上の方法によってＴ　ＯＳ／Ｇ５のＩ、Ｍの標的細胞
特異性をそれぞれ調べた結果、ＴＯＳ／Ｇ５の培養液中
のＩｇｔ’ｌは胃痛由来の株化細胞ＫＡＴ　Ｏ−ＩＩＩ
及びＡＧＳに対して結合力を有しており、本発明者の検
討によれば胃癌以外の株化細胞であるＡ３４９（肺癌）
に対しても結合力を有する。

すなわち、ドナーＢ−セルは体内に胃癌をもつ患者から
採取されたものであるので、細胞融合法によって作シ出
された自己増殖性をもつハイプリドーマのクローンから
は、ドナーＢ−セルと同形質のかつ特定の抗原結合部位
をもつモノクロナール（単一）抗体を生産していること
を示している。

約４週間後に、ハイツリドーマの培地からＨＡＴＯを除
きＲＤＦを基礎培地とする前述（ｖ）の無血清培地で培
養、倍加時間４０時間で、ＴＯＳ／Ｇ５はｌＸ１０’個
／−細胞が培地で生材する特約１μ２／−の量でヒト１
ｇ間を生産し続けている。

ハイプリドーマの多量培養液を７０％の硫酸アンモニウ
ムで沈殿させ、粗ＩＱ分画を集めた。得られた沈殿を生
理食塩水に溶かし、ヤギ抗ヒトＩＱＭを結合させたセフ
ァロースを用いてアフイニテイクロマトグラフイーの手
法でＩＱＭを精製した。Ｔ　ＯＳ／Ｇ５の培養液１１か
ら精製しだＩｇＭｌ”７が得られた。この精製した１１
７Ｍ標品を５ＤＳ−電気泳動法で分析した結果、ヒトＩ
ｇと同形質の分子量１２０，０００のＩＱｔ’ｌを生産
していることが確かめられた。

手続補正書 昭和６１年７月２Ｃ日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトＢセル・リンパ芽球細胞から導かれた変異株で
   あって、且つ下記（ｉ）〜（ｖ） （ｉ）６−チオグアニン耐性である、 （ｉｉ）ウワバイン耐性である、 （ｉｉｉ）ＨＡＴＯ含有培地で死滅する、 （ｉｖ）免疫グロブリンＩｇＧ及びＩｇＭを実質的に生
   産しない、 （ｖ）基礎培地ＲＤＦ中にインシュリン、トランスフェ
   リン、セレニウム、エタノールア ミン、β−メルカプトエタノール及び血清 アルブミンを含む無血清培地において増殖 可能である、 の形質特性を有することを特徴とするヒトＢセル・リン
   パ芽球細胞変異株。 ２、該ヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株が、ＨＩＨ／
   ＴＯ１株（微工研寄託受託拒否通知書、通知番号：６０
   微寄文第１１９８号）である特許請求の範囲第１項記載
   のヒトＢセル・リンパ芽球細胞変異株。 ３、ヒト胃癌患者のヒトリンパ球細胞と特許請求の範囲
   第１項〜第２項のいづれかに記載のヒトＢセル・リンパ
   芽球細胞変異株とのヒト／ヒト融合細胞株である抗原特
   異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト・ハイブリド
   ーマ。 ４、該抗原特異的ヒト免疫グロブリン生産性ヒト／ヒト
   ・ハイブリドーマが、ＴＯＳ／Ｇ５株（微工研寄託受託
   拒否通知書、通知番号：６０微寄文第１１９６号）であ
   る特許請求の範囲第４項記載のヒト／ヒト・ハイブリド
   ーマ。 ５、ヒト胃癌患者のヒトリンパ球細胞と特許請求の範囲
   第１項〜第２項のいづれかに記載のヒトＢセル・リンパ
   芽球細胞変異株とのヒト／ヒト融合細胞株が生産した抗
   原特異的ヒト免疫グロブリン。 ６、ヒト／ヒト・ハイブリドーマＴＯＳ／Ｇ５株が生産
   した特許請求の範囲第５項記載の抗原特異的ヒト免疫グ
   ロブリン。