JPH02242671A - ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ）産業上の利用分野 本発明はヒトハイブリドーマ作製用の新規な親細胞株に
関する。更に詳細には、ヒト免疫グロブリン合成細胞に
由来し、ヒト免疫グロブリン非合成であり、かつ、ヒト
抗体産生細胞との融合特性とヒトハイブリドーマの選択
特性、及びヒトハイブリドーマに高い抗体産生能を付与
する能力を有する、ヒトハイブリドーマ作製用の新規な
親細胞株に関する。

２）従来の技術 １９７５年に、ケラ−とミルシュタインは、親細胞株と
してマウスミエローマ細胞株、　Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８を用
いてマウス肺臓細胞と融合後、アミノプテリン、ヒボキ
サンチン及びチミジンを含む選択培養液中で培養するこ
とにより、初めてマウスモノクローナル抗体を産生ずる
単一マウスハイブリドーマを選択分離した（Ｇ、Ｋ１５
ｈｌａｒとＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ。

２５６、４９５　（１９７５））、その後、親細胞株と
してマウスミエローマ細胞株、マウスミエローマ細胞と
ヒト細胞とのハイブリドーマであるヘテロミエローマ細
胞株、ヒトミエローマ細胞株あるいはヒトリンパ芽球細
胞株を用いてヒト抗体産生細胞と融合することによりヒ
トモノクローナル抗体を産生する単一ヒトハイブリドー
マを作製することが試みられている。しかし、マウスミ
エローマ細胞株やヘテロミエローマ細胞株を親細胞株に
用いてヒト抗体産生細胞と融合した場合、作製されたヒ
トハイブリドーマはヒト抗体と共にマウスの蛋白質を合
成、分泌するため、ヒトへ投与するヒトモノクローナル
抗体の生産株として用いるには必ずしも適当ではない。

一方、ヒト染色体のみを有する親細胞株とヒト抗体産生
細胞の融合によるヒトハイブリドーマの作製の試みは、
１９８０年にオルランとカブラン、及びクローチエら（
Ｌ、０１ｓｓｏｎと１１．ｓ、Ｋａｐｌａｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　７
７、５４２９．　（１９８０）、Ｃ６Ｍ、Ｃｒｏｃｅら
、Ｎａｔｕｒｅ、　２８８．４８８　（１９８０））が
報告した。その後、多くのヒトハイブリドーマの作製の
報告があるが、作製したヒトハイブリドーマに高い抗体
産生能を付与できるようなヒトハイブリドーマ作製に適
した親細胞株は程度の差はあれ細胞自体がヒト免疫グロ
ブリンを合成している。例えば、ヒトミエローマ細胞株
、ＲＰＭＩ　８２２６とヒトリンパ芽球細胞株、ＫＲ−
４とのヒトハイブリドーマに選択特性を付与したにＲ−
１２は、現在数少ないヒトハイブリドーマ作製に適した
親細胞株であるが、それぞれの細胞株に由来する重鎖（
ヒトガンマ鎖）および軽鎖（ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ
鎖）を合成、分泌する　〔特開昭６１−１２８８８６号
公報〕、ヒトミエローマ細胞あるいはヒトリンパ芽球細
胞に由来するヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株とし
ては、ＡＴＣＣＣＲＬ　８０３２およびＡＴＣＣＣＲＬ
　１１１０３ｇ　（特開昭５７−１２６４２４号〕、Ｖ
Ｉ−Ｌ２−７２９　ＨＦ２（特開昭５７−２０８９８７
号公報）、　ＡＴＣＣＣＲＬ　８０δ３〔特開昭５８−
５０１２５７号公報〕、ＡＴＣＣＣＲＬ　８１４７（特
開昭５９−６６８８３号公報〕、ＤＣ７２９−６（ＵＳ
−４４５１５７０号公報）、　ＡＴＣＣＣＲＬ　１１２
２１（特開昭５９−１９８９７０号公報）、ＬＴＲ２２
８（特開昭６０−２５１８８１号公報〕、ＨＩ）ＨＦ０
１〔特開昭６２−１５５０８３号公報〕、ＡＴＣＣＨＢ
９３２０〔特開平１−６０３７３号公報〕が出願されて
いる。これら親細胞株の一部は、ヒト免疫グロブリンを
分泌しないが、いずれもヒト免疫グロブリンを合成して
いる。

そのため、ヒトハイブリドーマ作製に適した既存の親細
胞株よりヒト免疫グロブリン非合成な細胞株を変異誘導
することが試みられている０例えば、成書（Ｌ、Ｂ、５
ｃｈｏｏｋ［著、　ｒＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉ
−ｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ　ａｎｄ　ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓＪ（１９８７
）、　ＭＡＲＣＦ！Ｌ　ＤＥＫＫＥＲ，ＩＮＣ，、・ρ
１２〕には、にＲ−１２より変異を誘導した細胞集団に
補体存在下に抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、細
胞膜表面にヒト免疫グロブリンを発現している細胞を死
滅させた後、セルソーター及び限界希釈法によるクロニ
ング操作をして細胞表面にヒト免疫グロブリンが非発現
な細胞を分離したが、ヒト免疫グロブリン非合成細胞の
取得には至らなかったことが記載されている。

ヒトリンパ芽球細胞に由来するヒト免疫グロブリンを合
成しない細胞株としては、８０ＭＯ７（特開昭６３−１
８５３７４公報〕が出願されているが１作製したヒトハ
イブリドーマの抗体産生量についての実施例の記載はな
い。

ヒトミエローマ細胞やヒトリンパ芽球細胞あるいはヒト
ハイブリドーマ以外に由来する親細胞株の存在も報告さ
れいる。しかし、バーキットリンパ腫に由来する親細胞
株の出願〔特開昭６０−１４１２８５号公報、特開昭６
１−２４２５７５号公報〕には、作製したヒトハイブリ
ドーマの抗体分泌量についての記載はない、ヒトミエロ
ーマ細胞に由来する親細胞株の出願〔特開昭５９−１３
２８８５号公報〕には、ヒトハイブリドーマの作製につ
いて実施例の記載はない。

３）発明が解決しようとする問題点 作製されたヒトハイブリドーマの抗体産生量が低い場合
、抗体の生産コストが高くなり、−殻内には、産業上の
利用はかなり限定される。そのため、作製したヒトハイ
ブリドーマに高い抗体産生能を付与することができない
親細胞株は、産業上の有用性が低い。

一方、親細胞株自体がヒト免疫グロブリンを合成してい
ると、作製したヒトハイブリドーマがヒト抗体産生細胞
に由来するヒト免疫グロブリンと親細胞株に由来するヒ
ト免疫グロブリンを合成するため、時に、一部が組み換
わった複数の抗体を分泌する可能性がある。さらに、抗
体の抗原への結合特異性はヒト免疫グロブリンの重鎮と
軽鎖の双方の可変アミノ酸配列領域の構造に由来するた
め、ヒト抗体産生細胞と親細胞株に由来する重鎖と軽鎖
が１組み換えを起こすと、分泌される抗体の目的抗原へ
の結合活性や特異性が低下することが推測される。事実
、シンモトらはヒトＩｇＭ　を合成するが分泌しない親
細胞株、　　）１０３２３とヒトリンパ球とのヒトハイ
ブリドーマは、親細胞株に由来するヒトＩｇＭの重鎖と
軽鎖とヒトリンパ球に由来するヒトＩｇＡの重鎖と軽鎖
が組み換った抗体を産生ずることを報告している（Ｈ，
Ｓｈｉｎｍｏｔｏら、　Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　５０．　２２１７　（１９
８６））。また、にＲ−１２と破傷風毒素に対する反応
性を有するヒトＩｇＭを産生する細胞株とのヒトハイブ
リドーマは、はぼ同量のヒトＩｇＧとヒトＩｇＮを分泌
し、さらに、２種の抗体のうちヒトｒｇＭのみが破傷風
毒素に対する反応性を有することを報告している（Ｄ、
Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ。

Ｉｍｏ＋ｕｎｏＬ、、　１３３．３００１（１９８４）
）。

４）問題を解決するための手段 本発明者らは、ヒトのみに由来し、作製したヒトハイブ
リドーマに高い抗体産生能を付与し、細胞自体はヒト免
疫グロブリンを合成しないヒトハイブリドーマ用の親細
胞株を創製すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、ヒ
ト免疫グロブリン重鎖（ヒトガンマ鎖）と軽鎖（ヒトラ
ムダ鎖、ヒトカッパ鎖）を合成１分泌するヒトハイブリ
ドーマに由来する変異細胞株であって、重鎖（ヒトガン
マ鎖）を合成しない、あるいは１重鎖（ヒトガンマ鎖）
および軽鎖（ヒトラムダ鎖）を合成しない、重鎮（ヒト
ガンマ鎖）および軽鎖（ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖）
を合成しないヒトハイブリドーマ作製用の新規な親細胞
株を分離することに成功した・ ケラ−は、複数の異なる抗体を分泌するマウスハイブリ
ドーマを作製し、マウス免疫グロブリンの重鎮と軽鎖の
発現の欠失の様相を調べた結果。

染色体の欠落により主にマウス免疫グロブリン重鎖の発
現の欠失が認められることを報告している（Ｇ、Ｋ１５
ｈｌｅｒ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、　７７、２１９７（１９８０））、一方、本発
明者らは過去にマウスミエローマ細胞とマウス肺臓細胞
とのマウスハイブリドーマ株を凍結保存と継代培養を連
続的に繰り返すと、抗体の合成、分泌能を失うにもかか
わらず。

ミエローマ細胞としての高い増殖形質を保持したマウス
ハイブリドーマが高頻度に出現することを見いだしてい
た。

そこで、それ自体公知で一般に入手可能なヒトハイブリ
ドーマ細胞株、ＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８に変異を誘発
後、クローニングにより、増殖性能を保持するがヒト免
疫グロブリンの重１Ｉ４（ヒトガンマ鎖）あるいはヒト
免疫グロブリンの重鎮（ヒトガンマ鎖）と軽鎖（ヒトラ
ムダ鎖、ヒトカッパ鎖）の両方あるいは一方を合成、分
泌しない細胞をスクリーニングして新規な単一細胞株を
作製した。作製した新規細胞株はヒト抗体産生細胞との
融合特性を有し、ヒトハイブリドーマの選択特性を保持
し、かつ、作製したヒトハイブリドーマがヒト抗体産生
細胞に由来するヒト免疫グロブリンを合成、分泌するこ
とを確認し、ヒトモノクローナル抗体の実生産に適した
ヒトハイブリドーマの作製に有用な親細胞株であること
を見し出した。

特に本発明で強調されることは、ヒト抗体産生細胞との
ヒトハイブリドーマに高い抗体産生能力を付与する形質
を維持しながら、親細胞株自体がヒト免疫グロブリンを
合成するという好ましくない形質のみを取り除いた細胞
株の取得を目的として、変異誘発を行い１本発明の重＃
！（ヒトガンマ鎖）を合成しない、あるいは、重鎮（ヒ
トガンマ鎖）および軽鎖（ヒトラムダ鎖）を合成しない
、重鎖（ヒトガンマ鎖）および軽鎖（ヒトラムダ鎖、ヒ
トカッパ鎖）を合成しない親細胞株の分離に成功したこ
とである。更に、この新規な親細胞株がヒトリンパ芽球
細胞株との融合特性を有すること１例示されるヒトハイ
ブリドーマに高いヒト抗体産生能力を付与すること１重
鎖として、ヒトリンパ芽ＵＳ胞に由来する重鎖のみの産
生が確認されたことである。

従って１本発明の目的は、各種疾患の予防、治療１診断
などの広い分野に使用出来るヒトモノクローナル抗体の
工業的生産用の細胞株作製のための親細胞株を提供する
ことにある。

なお、本発明の主旨はヒト免疫グロブリン合成細胞から
のヒト免疫グロブリン非合成細胞の作製に関するもので
あり、出発材料としてはヒトミエローマ細胞株、　ＲＰ
ＭＩ　８２２６とヒトリンパ芽球細胞株、ＧＭ　１５０
０のヒトハイブリドーマ細胞株、ＡＴＣＣＣＲＬ　８６
５ｇという特定の細胞株にみの限定されるものではなく
、各種ヒトミエローマ細胞、ヒトリンパ芽球細胞あるい
はそれら細胞の融合により新たに創製されたヒトハイブ
リドーマも使用できる。

さらに、ＲＰＭＩ　８２２６あるいはＲＰＭＩ　８２２
６のヒト免疫グロブリン合成能を欠落した細胞株に由来
するヒトハイブリドーマや、ＧＭ　１５００あるいはＧ
Ｍ　１５００のヒト免疫グロブリン合成能を欠落した細
胞株に出来するヒトハイブリドーマが使用できる。これ
らから誘導される変異株の他、一般に入手可能な複数の
細胞より作製したヒトハイブリドーマが適宜選択される
。

（具体的な説明） 本発明の新規なヒト免疫グロブリン非合成突然変異細胞
株は、例えば、ＫＲ−１２などの公知のヒトハイブリド
ーマより染色体の変異や脱落の誘発操作により突然変異
細胞集団を作製し、この細胞集団よりヒト免疫グロブリ
ン合成能を一部あるいはすべてを欠落した細胞の存在を
スクリーニングし。

クローニング操作により単一細胞株を分離できる。

さらに、クローニング途中の細胞あるいは分離した単一
細胞株に再度の変異誘発操作を行い、クローニングを繰
り返すことにより、ヒト免疫グロブリンの合成能を一部
あるいはすべてを欠落した細胞の単一細胞株を分離でき
る。最後に８−アザグアニンとウアバインを含む培地に
適応させることによってヒト免疫グロブリン非合成突然
変異細胞株を創製することができる。

本発明で使用されるヒト免疫グロブリン合成細胞株とし
ては、前述のＫＲ−１２などの公知の細胞株の他に、各
種ヒトミエローマ細胞、ヒトリンパ芽球細胞あるいはそ
れら細胞の融合により新たに創製されたヒトハイブリド
ーマも例示される。本発明に使用したＫＲ−１２は、Ａ
ＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン）よりＣＲＬ　８６５８として入手できる。

染色体の変異や脱落の誘発は、複数回の凍結・融解、過
密度培養、低酸素濃度培養、低温あるいは高温培養、短
時間の培養温度の変化などの操作による環境変化や、紫
外線や放射線等をパルス的にあるいは連続的に照射する
操作などを加えることにより行える。また、８−アザグ
アニン、６−チオグアニン、コルヒチン、エチルメタン
スルフォネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−二トロ
ーＮ−二トロソグアニジン（Ｍ〜Ｇ）、アクリジン・マ
スタードなどの変異原性の薬剤を培地中に一定！ｉ添加
することによっても行える。これらの方法を適宜単独、
あるいは組み合わせて染色体の変異や脱落の誘発を効率
的に行うことが望ましい。

細胞培養は、例えば、５Ｘ１０’個／ｒｎＱから２×１
０６個／ａＱの細胞密度となるように培養液に分散し、
適当な細胞培養容器に播種した後、５％炭酸ガス存在下
３７℃で行うことができる。培養液の例としては、ＲＰ
）ＩＩ　１６４０やダルベツコの変法イーグル培地（Ｄ
Ｍ［ＥＭ）等の基礎培地に、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）の
適量を添加したものが好適である。また、各種の無血清
培地も使用できる。例えば、　ＮＹＳＦ　４０４無血清
培地にウシ血清アルブミンの適量を添加したものが推奨
される。継代培養は、３日から７目間隔で細胞の回収と
播種の操作を繰り返すとよい。

細胞の凍結は、一般的手法により行える１例えば、細胞
を適当な細胞凍結保存液にｌＸｌ０’個７ｍｍから５Ｘ
１０’個／ＩＩｎの細胞密度となるように分散し。

液体窒素あるいは液体窒素ガス中または、−２０℃から
一８０℃の冷凍庫中で凍結、保存する。細胞凍結保存液
には、上記基礎培地や中性緩衝液等に動物血清、アルブ
ミン、ぶどう糖やジメチルスルフォキサイド（Ｏ＋４Ｓ
Ｏ）などを適量添加して用いることが推奨される。

凍結細胞の凍結融解と融解後の処理及び再培養の操作は
、一般的手法により行える０例えば、凍結された細胞は
、温水中で急速に融解し、融解後の細胞は培養液等で洗
浄して保存液に含まれるＤＭＳＯを洗い出した後に培養
液に分散して培養を行うと良い。

突然変異細胞よりの本発明の細胞株のクローニングは、
軟寒天法ｒ成書「組織培養応用研究法」（１９８５）　
、ソフトサイエンス社、ｐ２８９など）、あるいは限界
希釈法〔成書「単クローン抗体Ｊ（１９８３）、講談社
、Ｐ　７３など〕により行うことができる０例えば、限
界希釈法によるクローニングでは、突然変異を誘発させ
た細胞集団を２０％のＦｅ２を含む培養液に分散し、フ
ィーダ細胞としてマウス肺臓細胞を播種した９６ウエル
平底プレート（以下、フィーダプレートと略す）のウェ
ルあたり１個となるように播種し、５％炭酸ガス存在下
３７℃で培養する。単一のコロニーとして増殖の認めら
れたウェルについて培養上清中のヒト免疫グロブリン量
をスクリーニングする。ヒト免疫グロブリン産生の認め
られないウェルの細胞について、再度、限界希釈法によ
るクローニングを行う、クローニングの操作を複数回繰
り返すことにより、ヒト免疫グロブリン非分泌の細胞株
を単一な細胞集団として得ることができる６なお、クロ
ーニング時に、ヒポキサンチンリン酸すボシル基転移酵
素（以下。

＋１ＧＰＲＴと略す）を合成する細胞を死滅させる薬剤
を培養液に添加することにより、ＩＩＧＰＲＴ欠損細胞
を効率的に選別できる。この様な薬剤としては８−アザ
グアニンなどが推奨される。

培養上清中のヒト免疫グロブリンのスクリーニングは、
一般のラジオイムノアッセイ法や酵素抗体分析法（ＥＬ
ＩＳＡ法）などの方法により行うことができる０例えば
、ＥＬＩＳＡ法による場合は、同相に抗ヒト免疫グロブ
リン抗体を固定しくこの時使用される抗体を以下、固相
化抗体と略す）、培養上清の一部を反応させる１次に、
酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を反応させ、基質を
加え酵素反応により生じる呈色割合より培養上清中のヒ
ト免疫グロブリンの検出および量の測定が行える。ヒト
ガンマ鎖、ヒトラムダ鎖またはヒトカッパ鎖の測定は、
固相化抗体として各々抗ヒトＩｇＧ（ヒトガンマ鎖特異
）抗体、抗ヒトラムダ鎖抗体または抗ヒトカッパ鎖抗体
を、酵素標識抗体として各々パーオキシダーゼ標識抗ヒ
トＩｇＧ（ヒトガンマ特異）抗体、パーオキシダーゼＩ
ＩＩＩ！を抗ヒトラムダ鎖抗体またはパーオキシダーゼ
標識抗ヒトカッパ鎖抗体を使用することにより行える。

本発明の親細胞株は、ヒボキサンチン、アミノプテリン
およびチミジンを含む培養Ｐ＆（ＨＡＴ培地）。

あるいはヒポキサンチンおよびアザセリンを含む培養液
（ＨＡ培地）中で死滅する。このＩＩＧＰＲＴ欠損の性
質ハ、　１０　ｐ　ｇ／ｒａｕカラ１００　μｇ／＊ｆ
ｌ濃度ノ８−濃度ノア−アザグアニン液中で培養するこ
とにより維持出来る。また１本親細胞株は１０μ−濃度
のウアバインを含む培養液中で死滅しない０本選択特性
により本発明の親細胞株とヒト抗体産生細胞とのヒトハ
イブリドーマが作製ができ、更に１作製したヒトハイブ
リドーマは実質的にヒト抗体産生細胞に由来する重鎖よ
りなる抗体のみを培養液中に分泌する。

本発明の親細胞株は、前述の培養液を用い継代培養を行
うことができるとともに、前述の凍結保存液を用い、長
期間安定に凍結保存が出来る。

本発明の細胞とヒト抗体産生細胞との融合は、ポリエチ
レングリコール（以下、ＰＥＧと略す）などの−殻内な
融合試薬や、センダイウィルス（Ｈａｍａｇｇｌｕｔｉ
ｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａｎ；　）Ｉ
ＶＪ）などのウィルス粒子を使用して行える０例えば、
平均分子量１０００から６０００程度のＰＥＧを、ＲＰ
ＭＩ　１６４０培地やＤＭＥに培地中に３０から５０％
（Ｖ／Ｖ）の濃度に添加したものが融合液として推奨さ
れる。また、融合効率を高めるため、融合液ＤＭＳＯを
添加することも望ましい、また、電気融合装置などを用
いた物理的手法によっても行える。細胞融合においては
、本発明の細胞に対して１から１０倍のヒト抗体産生細
胞を用いることが望ましい、ヒト抗体産生細胞には、エ
プスタイン・バー・ウィルス（以下、ｌ１ｉ８ウイルス
と略す）により形質転換した細胞集団、および形質転換
した細胞集団からクローニングにより得た単一ＥＢウィ
ルス形質転換細胞株を用いることができる。また、生体
内より分離したヒト抗体産生細胞を含むリンパ球画分お
よびヒトＢ細胞画分、これをマイト−ジエンあるいは抗
原により刺激、増殖させた抗体産生細胞などが細胞融合
用のヒト抗体産生細胞として用いることができる。

上記方法によりヒト抗体産生細胞と本発明の細胞とを細
胞融合させ、これを２４ウエルまたは９６ウエルの培養
プレートに分注し、５％炭酸ガス存在下３７℃選択培地
中で培養する。この間、３日から５日ごとに選択培地の
半量を新しい選択培地と交換することが望ましい、この
際、フィーダー細胞としてマウスの腹腫浸出細胞等を共
存させるヒトハイブリドーマの増殖を早めることができ
る。該細胞集団よりヒトハイブリドーマを選択培地によ
り選別する。ヒト抗体産生細胞が無限増殖能を有さない
細胞の場合、選択培地としてＨＡＴ培地あるいはＨＡ培
地が使用できる。また、ヒト抗体産生細胞がＥＢウィル
ス形質転換細胞などの無限増殖能を有する細胞の場合、
選択培地としてウアバインを含有するＨＡＴ培地または
１１＾培地が使用できる。

実施例 以下、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１．ヒト免疫グロブリン非合成細胞株の作製−１ （１）変異細胞株の作製 ヒトハイブリドーマ細胞株、ＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８
を、１０■Ｑの１０％ＦＣ８を含むＲＰＭＩ　１６４０
培地（以下、１０％ＦＣ３培養液と略す）にｌＸｌ０’
個／ＩＩＲ密度となるように懸濁し、底面積７５ｃｍ”
のプラスチック製培養フラスコ（７５Ｔフラスコ、コー
スタ−）に播種後、５％炭酸ガス存在下、３７℃で５日
間静置培養した。

培養物を１５ｍ１２容量のプラスチック製遠心管（コー
ニング）に移し、遠心分離（２００Ｘ　ｇ、１０分間）
により細胞を集め、７５％ＦＣ５および１０％ＤＭＳＯ
を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（以下、凍結保存液と略
す）にＩ×１０６個／■ｉ密度となるように懸濁した。

２社容量のストックチューブ（コーニング）の１本当た
りに１−の細胞懸濁液を分注し、−２０℃に１時間静置
して凍結させた後、−８０℃に移し保存した。

凍結した細胞懸濁液を含むストックチューブを、３７℃
の湯浴中の緩やかに撹拌しながら融解した。

融解した細胞懸濁液を、１５ｍＱ容量のプラスチック製
遠心管に移し、１０＋ａＱの１０％ＦＣ５培養液で２回
洗浄した。

前述と同様、１０ｍ１２の１０％ＦＣＳ培養液にｌＸｌ
０’個／鳳Ｉｉ密度となるように懸濁し、７５Ｔフラス
コに播種後、静置培養した０以上の細胞培養（５日間）
と凍結保存（２日間）の操作を６週間にわたり継続して
行った。

凍結保存した細胞懸濁液を融解し、１０％ＦＣ３培養液
で２回洗浄後、　１０ｍ１２の１０％ＦＣＳ培養液に５
×１０’個／■ｇ密度となるように懸濁し、７５Ｔフラ
スコに播種後、４日間静置培養した。培養物を遠心分離
して細胞を集め、ｌＸｌ０’個／ｌＩＱ密度となるよう
Ｌニー　２００１１　ｇ／ｒａＱ濃度（７）　ＥＭＳを
含む１＠Ｑ（７１１０％ＦＣ５培養液に懸濁し、６ウエ
ル培養プレート（コースタ−）の１ウエルに播種後、２
４時間静置培養した。培養物を遠心分離し、ｌＯ％ＦＣ
３培養液で２回洗浄して。

１．２　Ｘ　１０＠個の細胞を得た。これを１２＠Ｑの
１０％ＦＣＳ培養液にＳ濁し、７５Ｔフラスコに播種後
、４日間静置培養した。培養物を遠心分離し、１０％Ｆ
Ｃ８培養液で２回洗浄して、８．ＯＸ　１０’個の細胞
を得た。

これを６＋ｍ１２の１０％ＦＣ３培養液に懸濁し、７５
Ｔフラスコに播種後、３日間静置培養した。培養物を遠
心分離して、７．０Ｘ１０’個の変異誘導細胞を得た。

（２）スクリーニング、クローニング 変異誘導細胞を、　１５μｇ／ｌＪ！濃度の８−アザグ
アニン（東京化成）を含む２０％ＦＣ５培養液に１０個
／＋１２密度となるように懸濁し、あらかじめフィーダ
ー細胞としてマウス＃ｌＩｍ細胞をウェルあたりｌＸｌ
０’個播種した１０枚の９６ウエル平底培養プレート（
コーニング）の各ウェルに０，１ｍｆｌずつ播種し、静
置培養した。２週間から３週間後、単一なりローンとし
てコロニーが十分に増殖したウェルから順次、培養上清
を採取した。上清中のヒト免疫グロブリンの有無をＥＩ
Ａ用９６ウエル平底プレート（グライナー）を用い、固
相化抗体液としてヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体（タボ
）を、酵素＃Ａ識抗体としてパーオキシダーゼ標識ヤギ
抗ヒト免疫グロブリン抗体（タボ）を使用したＥＬＩＳ
Ａ法でスクリーニングした。

その結果、細胞増殖の認められた２５０ウエルの内、１
０ウエル（ＩＣ３、ＩＧＩＯ１３Ｆ６．３８２．４Ｂ１
１．５Ｃ５，７Ａ８．８０１．８Ｈ７，１０Ｆ８）の培
養上清ではヒトガンマ鎖が検出されなかった。

１０ウエル中の細胞を、それぞれ別個に集め、２０％Ｆ
ＣＳ培養液に１０個／ｍｌｌ密度となるように懸濁し、
ＩＪ［！Ｉ胞株あたり１枚当てのフィーダープレートの
各ウェルに０．１ｍｊｌずつ播種し、静置培養した。２
週間から３週間後、単一なりローンとしてコロニーが増
殖したウェルから順次、培養上清を採取し。

上清中のヒトガンマ鎖の産生をＥＬＩＳＡ法でスクリー
ニングした。その結果、７＾８を播種したプレートでは
、単一なりローンとしてコロニーが増殖した６８ウエル
の培養上清原液すべてにヒトガンマ鎖の産生が認められ
ないことが判明した。このヒトガンマ鎖の産生が認めら
れなかったウェルの細胞について再度同様なりローニン
グ操作を繰り返して、１株の単一細胞株を得、ＭＰ　４
１０９と命名した。

ＨＰ　４１０９は微工研に微工研条寄第２１２９号とし
て寄託されている。

実施例２．ヒト免疫グロブリン非合成細胞株の作製−２ （１）変異細胞株の作製 実施例１でヒトガンマ鎖が検出されなかったｌＯウェル
（ＩＣ３、ＩＣｌ０．３Ｆ６，３Ｈ２，４Ｂ１１．５Ｃ
５，７Ａ８゜８０１、８Ｈ７，１０Ｆ８）の中の細胞を
集め、５＠Ｑの２０％ＦＣ３培養液に懸濁し、底面積２
５ｃｍ”のフラスコ（２５Ｔフラスコ、コーニング）に
播種後、４日間静置培養した。培養物を遠心分離して、
３ＸＩＯ’個の細胞を得た。これを０．５μｍ７ｍΩ濃
度のＭＮＮＧを含む３＠Ｑの１０％ＦＣ５培養液に懸濁
し、６ウエル培養プレートの３ウエルに１＋＋＋Ｊ１ず
つ分注し、２４時間静置培養した。３ウエルの培養物を
遠心分離し、１０％ＦＣＳ培養液で２回洗浄し、　３．
２Ｘ１０ｒ″個の細胞を得た。

コノうち、ｌＸｌ０’個の細胞を１０ｍｆｆノＩＯ％Ｆ
Ｃ５＠　４１液に懸濁し、７５丁フラスコに播種後、２
日間静置培養した。培養物を遠心分離して、　１．２Ｘ
１０’個の細胞を得た。これをｌＯ鳳Ｑの１０％ＦＣ３
培養液にＳ濁し、７５Ｔフラスコに播種後、２日間静置
培養した。

培養物を遠心分離して、５．５　Ｘ　１０ｓ個の細胞を
得た。

これを５＠ＱのｌＯ％ＦＣＳ培養液に懸濁し、２５Ｔの
フラスコに播種後、２日間静置培養した。培養物を遠心
分離して、　２．５ＸＬＯ’個の細胞を得た。これを２
ＩＩＱの１０％ＦＣ５培養液に懸濁し、６ウエル培養プ
レートの２ウエルにｌ１ｍ１２ずつ播種後、２日間静置
培養した。培養物を遠心分離して、　７．０Ｘ１０’個
の変異誘導細胞を得た。

（２）スクリーニング、クローニング 変異誘導細胞を１０％ＦＣ５培養液で１回洗浄し。

ｌＯ％ＦＣ３培養液に４０個／ｗａｆｔ密度となるよう
に懸濁し。

あらかじめフィーダー細胞としてマウス肺臓細胞をウェ
ルあたりｔ　ｘ　ｉｏ’個播種した４枚の９６１／２ウ
エル平底培養プレート（コーニング）の各ウェルに０．
１ｍＡずつ播種し、１５日間静置培養した。その間。

３日から４日ごとに培地の半分量を新しいものと交換し
た。単一なりローンとしてコロニーが十分に増殖したウ
ェルから培養上清を採取し、上清中のヒト免疫グロブリ
ンの有無をＥＬＩＳＡ法でスクリニングした。

単一なりローンとしてコロニーが増殖した２８５ウエル
の培養上清についてヒト免疫グロブリン量の測定を行っ
た結果、４ウエル（ＳＩＡ６．５２ＣＩＯ１Ｓ２Ｇ？、
　５４Ｄ３）の培養上清はヒトガンマ鎖、ヒトラムダ鎖
及びヒトカッパ鎖の産生が、２ウエル（３２Ｅ７．５４
Ｅ２）の培養上清はヒトガンマ鎖とヒトラムダ鎖の産生
が、１ウエル（ＳＩＦ５）の培養上清はヒトガンマ鎖と
ヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。各ウェル中の細胞
を、拡大培養し、培養上清についてヒト免疫グロブリン
量の測定を再度行った結果、５４Ｄ３の細胞を播種した
ウェルの培養上清は、ヒトカッパ鎖の産生が、　５２Ｅ
７の細胞を播種したウェルの培養上清は、ヒトラムダ鎖
の産生が陰性であった０次に、　３２Ｅ７の細胞を、　
１０％ＦＣ８培養液で２０個／■Ｑ密度になるように懸
濁し、再クローニングした（フィーダープレート４枚使
用）、播種１６日間後、単一なりローンとしてコロニー
が十分に増殖したウェルについて、培養上清中のヒト免
疫グロブリン産生の有無をＥＬＩＳＡ法でスクリーニン
グした。測定した２３ウエルの培養上清のうち、１７ウ
エル（ＩＤ３．２Ａ９．２Ｆ７．４Ｂ２他）の培養上清
はヒトガンマ鎖とヒトラムダ鎖の産生が陰性であった。

翌日、４８２中の細胞を、クローニングした（フィーダ
ープレート３枚使用）、播種１６日後、単一なりローン
としてコロニーが十分に増殖したウェルについて、培養
上清中のヒト免疫グロブリン産生の有無をＥＬＩＳＡ法
でスクリーニングした。測定した２８１ウエルの培養上
清はすべてヒトカッパ鎖の産生が陽性で、ヒトガンマ鎖
とヒトラムダ鎖の産生は陰性であった。このうち、増殖
性の優れた単一細胞株を選択し、　ＭＰ　４１１２と命
名した。　ＭＰ　４１１２は微工研条寄第２１２８号と
しＣ寄託されている。

実施例３．ヒト免疫グロブリン非合成細胞株の作製−３ （１）突然変異細胞の作製 実施例２と同様にして、培養時期の異なるヒトハイブリ
ドーマ細胞株、ＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８からヒトガン
マ鎖とヒトラムダ鎖を合成しない細胞を作製し、５ＸＩ
Ｏ’個の細胞ヲ１５０　／Ｊ　ｇ／Ｉｌｌ濃度（７）［
ＥＭＳを含む５ｍＱの１０％ＦＣ３培養液に懸濁し、底
面積２５ｃｍ”のフラスコ（２５Ｔフラスコ、コーニン
グ）に播種後、２４時間静置培養した。培養物を遠心分
離して、変異誘導細胞を得た。

（２）スクリーニング、クローニング 変異誘導細胞を１０％ＦＣ５培養液で２回洗浄した後１
．２Ｘ１０″個／濡Ωの密度の細胞浮遊液とし、この細
胞浮遊液０，１ｍＱを０．３％アガロース（ジ−プラー
クアガロース、エフ・エム・シー社）を含む培養液２４
ＪＱに加え混合した。つぎに、あらかじめ０．５％アガ
ロースを含む培養液４ｍ１２を分注して固めた６ｃ讃シ
ヤーレに、細胞および０．３％アガロースを含む培養液
３ｙｓＱを分注して固めた（７枚）。細胞を分注した６
ｃｍシャーレは５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養
した。２週間後、軟寒天中に細胞が増殖しコロニーが肉
眼的に認められるようになったら、各コロニーをパスツ
ールピペットを用いて、あらかじめウェル当たり０．１
ｍ１２の培養液を分注した９６ウエル平底培養プレート
の各ウェルに移し培養した。２日後に培養液０．１ｍＲ
を加え、さらに３日後、培養上清を採取し、上清中のヒ
トカッパ鎖の有無をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした
。

４３２ウエルの培養上清についてヒトカッパ鎖の測定を
行った結果、４ウエル（２Ｆ１０．２Ｇ９．３０９゜４
Ｈ７）の培養上清ヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。

各ウェル中の細胞を、拡大培養し、培養上清についてヒ
トカッパ鎖の測定を再度行った結果、２Ｇ９の細胞を播
種したウェルの培養上清は、ヒトカッパ鎖の産生が陰性
であった。次に、２Ｇ９の細胞を、１０％ＦＣ３培養液
で１０個／１ｍｆｌ密度になるように懸濁し、１０％Ｆ
ＣＳ培養液で１回洗浄し、１０％ＦＣＳ培養液に４０個
／■Ｑ密度となるように懸濁し、あらかじめフィーダー
細胞としてマウス肺臓細胞をウェルあたりｌＸｌ０ｒ″
個播種した３枚の９６１／２ウエル平底培養プレート（
コーニング）の各ウェルに０．１ｍ１２ずつ播種し、８
日間静置培養した。その間、３日から４日ごとに培地の
半分量を新しいものと交換した。播種９日後、単一なり
ローンとしてコロニーが十分に増殖したウェルについて
、培養上清中のヒトカッパ鎖産生の有無をＥＬＩＳＡ法
でスクリーニングした。測定した１８４ウエルの培養上
清はすべてヒトカッパ鎖の産生が陰性であった。このう
ち、増殖性の優れた単一細胞株を選択し。

ＭＰ　４１２６と命名した。　ＭＰ　４１２６は微工研
条寄第２６１５号として寄託されている。

実施例４．染色体数の測定 ＭＰ　４１０９、ＭＰ　４１１２、ＭＰ　４１２６の染
色体数分布の測定は、吉川の方法〔成書「動物細胞利用
実用化マニュアルＪ　（１９８４）、リアライズ社、ｐ
３３７）に準じて行った。

対数増殖期にある阿Ｐ　４１０９．　ＭＰ　４１１２、
ＭＰ　４１２６を集め（約ｌＸｌ０＠個）を、０．１μ
ｇ／濃度のコルセミド（シグマ社）を含む１０％ＦＣ３
培養液中で、９０分間培養した。培養後、遠心分離（２
００Ｘ［，５分間）により得られた細胞残渣に５−虜の
０．０７５阿塩化カリウム水溶液を加えて軽く撹拌し、
３７℃に２０分間放置した。放置後、１履Ｑの固定液（
カルノア液；メタノール：酢酸＝３：１）を加えて軽く
撹拌し、４℃に３０分間放置した６次に、遠心分離（１
８０ｘ　ｇ、５分間）シ、上清を３履Ｑ除き、同量の固
定液を加えて撹拌した。遠心分離後に除く上清量を４，
５．６ｍ１２と増やし、同様の操作を繰り返した。最終
に、細胞残渣に０．５ｍ１２の固定液を加え、懸濁液と
した。

スライドグラス上にこの懸濁液を数滴おとし、沸騰水浴
上に約１分間放置した後、室温にて自然乾燥させた。

１／１５Ｍリン酸緩衝液（ρ）１７．０）で２０倍に希
釈したギムザ液中に、スライドグラスを１５分間浸けた
後。

水道水で余分な染色液を洗いおとし、乾燥させた。

乾燥後、封入剤を滴下し、カバーグラスをかけ。

光学ｗ４微鏡下写真撮影し、染色体数を計測した。

第１表、第２表、第３表に示すように、　ＭＰ　４１０
９、ＭＰ　４１１２．　ＭＰ　４１２６は各々染色体数
８９本、７５本、７３本にモードを有していた。

実施例５０合成、分泌ヒト免疫グロブリンの測定ＭＰ　
４１０９、ＨＰ　４１１２、ＨＰ　４１２６が細胞外へ
分泌するヒト免疫グロブリン量の測定用試料の調製は以
下の様に行った。対数増殖期の細胞を集め、１０％ＦＣ
Ｓ培養液にＩ×１０″個／１ｍＱ密度となるように懸濁
して、６ウエル培養プレートの各ウェルに１■悲ずつ播
種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静電培養した。２
４時間後、遠心分離（２５０Ｘ　ｇ、　１０分間）によ
り培養上清を分離し、これを測定試料とした。

ＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８を同様に培養して、ヒトガン
マ鎖、ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖分泌の陽性コントロ
ール試料とした。

ＭＰ　４１０９の細胞内でのヒト免疫グロブリン合成量
の測定試料の調製は以下の様に行った。対数増殖期の細
胞を集め（ｌ　Ｘ　１０’個）、１％のポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート（シグマ）を含む１ｍＱ
のリン酸緩衝液に懸濁し、ボッター型ホモジナイザーで
破砕した。細胞破砕液を還元分離（５０，０００Ｘｇ、
３０分間）して得られた上清を、０．２２μ層のフィル
ターで濾過し、ｍ定試料とした。

ＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８を同様に処理し、ヒトガンマ
鎖、ヒトラムダ鎖、ヒトカッパ鎖合成の陽性コントロー
ル試料に、また、Ｒａｊｉ細胞を同様に処理し、ヒト免
疫グロブリン非合成の陰性コントロール試料とした。試
料中のヒトガンマ銀量、ヒトラムダ鎖およびヒトカッパ
銀量の測定はＥＬＩＳＡ法にて測定した。

ＭＰ　４１０９の培養上清中および細胞破砕液中にヒト
ガンマ鎖は検出されなかった。なお、　ＭＰ　４１０９
が培養上清中に分泌するヒトラムダ鉛量およびヒトカッ
パ銀量はいずれもＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８の約５分の
１であった。　ＭＰ　４１１２の培養上清中および細胞
破砕液中にヒトガンマ鎖およびヒトラムダ鎖は検出され
なかった。なお、ＨＰ　４１１２が培養上清中に分泌す
るヒトカンパ銀量はＡＴＣＣＣＲＬ　８６５８の約３分
の１であった。　ＨＰ　４１２６の培養上清中および細
胞破砕液中にヒトガンマ鎖、ヒトカッパ鎖およびヒトラ
ムダ鎖は検出されなかった。

実施例６．細胞倍加時間の測定 対数増殖期の阿Ｐ　４１０９、ＭＰ　４１１２、ＨＰ　
４１２６を集め、１０％ＦＣ８培養液に５Ｘ１０’個／
ｒｍＱ密度となるように懸濁して、６ウエル培養プレー
トの各ウェルに１ｍＱずつ播種し％５％炭酸ガス存在下
、３７℃で静置培養した。培養開始後７日間にわたり、
１日１回、ウェル中の細胞数を血球計算板を使用して正
確に計測した。各回３ウェル中の細胞数を計測した。そ
の平均値から計算されるＨＰ　４１０９、肝４１１２、
ＨＰ　４１２６の対数増殖期における細胞倍加時間は各
々２４．６時間、２５．６時間、２０．５時間であった
。

実施例７．ヒトハイブリドーマの作製−１健常人末梢血
から分離したヒト抗体産生細胞（リンパ球）に８９５−
８細胞（感染性のＥＢウィルスを産生ずるマーモセット
リンパ芽球細胞）の培養上清を加えて、ＥＢウィルス感
染させた後、培養上清中にヒトＩｇＭ産生の認められた
ウェルの細胞をクロニングして得られたヒトＩｇＭ産生
ヒトリンパ芽球細胞、８７）１４Ｇを融合のパートナ−
に使用してヒトハイブリドーマの作製を行った。あらか
じめ１０％ＦＣ５培養液中で増殖させたヒトＩｇＭ産生
ヒトリンパ芽球細胞とＭＰ　４１０９を各々ＲＰＭＩ　
１６４０培地で洗浄した。３Ｘ１０’個のヒトリンパ芽
球細胞と同数の−Ｐ　４１０９細胞を５０ａ＋Ｉ２容量
のプラスチック製遠心管中で混合した。遠心分離（１７
５ｘｇ、１０分間）後、遠心上清を吸引除去し、遠心管
内に５０％ＰＥＧ（Ｍ、１１゜１５００、和光純薬）お
よび１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩ　１６４０培地０　
、５ｍ１２を静かに加えゆっくり回転させて、細胞を融
合させた。２分後、ＲＰＭＩ　１６４０培地１０−Ｑを
加え静かに撹拌後、遠心分離（１７５Ｘｇ、１０分間）
した。遠心上清を吸引除去し、２×１０″″４Ｍヒポキ
サンチン（シグマ）、１μｇ／ａｌｌアザセリン（シグ
マ）、５μＮウアバイン（シグマ）を含む２０％ＦＣＳ
培養液（以下＋１Ａ−０培養液と略す）を加えてＩ　Ｘ
　１０’個／＠Ｈの密度の細胞懸濁液とし、９６ウエル
平底培養プレートのウェル当たり０．１ｍ１２ずつ播種
（合計６２７ウエル）した。

細胞は５％炭酸ガス存在下、３７℃で静電培養した。

４日後に０，１ｍｆｆ１のＨＡ−０培養液を加え、その
後、４日から５日毎に半量の）ＩＡ−０培養液を新しい
ＩＩＡ−０培養液で交換した。７週間後までのヒトハイ
ブリドーマのコロニー増殖が認められたウェル数は６２
７ウエル中７８ウエルであった。この結果、融合頻度は
２．６Ｘ１０−＠と計算された。

コロニーの増殖が認められたウェルより４ウエルを無作
為に選び、ヒトハイブリドーマを２４ウェルプレート、
６ウエルプレート、　　６ｃ票シャーレ５７５Ｔ　フラ
スコへと拡大培養した。４株のヒトハイブリドーマを、
各々２０％ＦＣ３培養液にＩ　Ｘ　１０’個／ｍＱ密度
となるように懸濁し、６ウエルプレートの各ウェル当た
り１ｍ１２ずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で
静置培養した。２４時間後に、遠心分離（２００Ｘｇ、
　１０分）して培養上清を分離し、培養上清中のヒトミ
ュウ銀量およびヒトガンマ顔量をＥＬＩＳＡ法にて測定
した。その結果を第４表に示した。

いずれのヒトハイブリドーマも、ヒトＩｇＭ産生ヒトリ
ンパ芽球細胞由来の重鎮であるヒトミュウ鎖は分泌する
が、他の重鎖（ヒトガンマ鎖）は分泌しなかった。

ヒトハイブリドーマ　分泌抗体量（μｇ／１０”細胞７
２４時間）ヒトミュウ鎖　　ヒトガンマ鎖 ２Ｓ３Ｂ１２　　　　　　１８．３　　　　　　＜０．
００１２５４Ｂ７　　　　　　２１．１　　　　　　＜
０．００１２５７Ａ２　　　　　　３３．３　　　　　
　＜０．００１２３６Ｂ１　　　　　　１８．６　　　
　　　＜０．００１実施例８．ヒトハイブリドーマの作
製−２実施例７と同様にして、ヒトＩｇＭ産生ヒトリン
パ芽球細胞、８７）１４ＧとＭＰ　４１１２を各々３Ｘ
１０’個づつ融合させた。７週間後までのヒトハイブリ
ドーマのコロニー増殖が認められたウェル数は６１０ウ
エル中６９ウエルであった。この結果、融合頻度は２．
４　Ｘ　１０−＠と計算された。

コロニーの増殖が認められたウェルより４ウエルを無作
為に選び、ヒトハイブリドーマを２４ウエルプレート、
６ウエルプレート、６ｃｍ＋シャーレ、７５Ｔフラスコ
へと拡大培養した。４株のヒトハイブリドーマを、各々
２０％ＦＣ３培養液にｌＸｌ０’個／ＩＩＱ密度となる
ように懸濁し、６ウエルプレートの各ウェル当たり１■
Ｑずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養
した。２４時間後に、遠心分離（２００Ｘｇ、１０分）
して培養上清を分離し、培養上清中のヒトミュウ銀量お
よびヒトガンマ顔量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。測定
結果を第５表に示した。いずれのヒトハイブリドーマも
、ヒトＩｇＭ産生ヒトリンパ芽球細胞、８７８４Ｇ由来
の重鎖であるヒトミュウ鎖は分泌するが、他の重鎖（ヒ
トガンマｍ＞は分泌しない。

ヒトハイブリドーマ ＮｌＡ３ Ｎ３Ｃ６ Ｎ５Ｅ１２ Ｎ５Ａ３ 分泌抗体量（μｇ／１０ｔ″細胞７２４時間）ヒトミュ
ウ鎖　　ヒトガンマ鎖 ２５．６　　　　　　＜０．００１ １５．８　　　　　　＜０．００１ ２８．２　　　　　　＜０．００１ ３５．５　　　　　　＜０．００１ 実施例９．ヒトハイブリドーマの作製−３健常人末梢血
から分離したヒト抗体産生細胞（リンパ球）に８９５−
８細胞（感染性のＥＢウィルスを産生ずるマー七セント
リンパ芽球細胞）の培養上清を加えて、ＥＢウィルス感
染させた後、培養上清中にヒトＩｇＭ産生の認められた
ウェルの細胞をクロニングして得られた。ヒトＩｇＭ（
ヒトミュー鎖、ヒトラムダ鎖）産生ヒトリンパ芽球細胞
、　８７Ｌ８ＧＮＭとＭＰ　４１２６を実施例７と同様
にして各々２．５　Ｘ　１０’個づつ融合させた。７週
間後までにヒトハイブリドーマのコロニー増殖が認めら
れたウェル数は４８０ウエル中６ウエルであった。この
結果、融合頻度は２．４　Ｘ　１０−’と計算された。

コロニーの増残が認められたウェルより４ウエルを無作
為に選び、ヒトハイブリドーマを２４ウニルプレート、
６ウエルプレート、６ｃｍシャーレ、７５Ｔフラスコへ
と拡大培養した。４株のヒトハイブリドーマを、各々２
０％ＦＣ５培養液にｌＸｌ０’個／ｍ９密度となるよう
にＳ濁し、６ウエルプレートの各ウェル当たり１ｍ１２
ずつ播種し、５％炭酸ガス存在下、３７℃で静置培養し
た。２４時間後に、遠心分離（２００×ｇ、１０分）し
て培養上清を分離し、培養上清中のヒトミュウ銀量およ
びヒトガンマ顔量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。その結
果を第６表に示した。いずれのヒトハイブリドーマも、
ヒトＩｇＭ産生ヒトリンパ芽球細胞由来の重鎖であるヒ
トミュウ鎖は分泌するが、他の重鎖（ヒトガンマ鎖）は
分泌しない。

また、培養上清中のヒトカッパ鎖とヒトラムダ鎖をＥＬ
ＩＳＡ法にて検出したところヒトラムダ鎖は検出された
がヒトカッパ鎖は検出されなかった。

ヒトハイブリドーマ ＣＩＨ９ Ｃ２Ｆ１ Ｃ２Ｇ６ Ｃ３Ｂ１２ 分泌抗体量（μｇ／１０’細胞７２４時間）ヒトミュウ
鎖　　ヒトガンマ鎖 １７．８　　　　　　　＜０．００１ ２１．３　　　　　　　＜０．００１ ３０．６　　　　　　　＜０．００１ １２、２　　　　　　　＜０．００１ ６）発明の効果 本発明の新規親細胞株を用いることにより、ヒト抗体産
生細胞とのヒトハイブリドーマの作製が達成される。

本発明で注目すべきことは、本発明の新規親細胞株ＭＰ
　４１０９．　ＭＰ　４１１２、ＭＰ　４１２６とヒト
抗体産生細胞の細胞融合により作製されるヒトハイブリ
ドーマは、その産生ずるヒトモノクローナル抗体に。

親細胞株に由来するヒト免疫グロブリン重鎖をまったく
含まない、ヒトハイブリドーマ作製用の親細胞株がヒト
免疫グロブリン重鎮非合成であることは、ヒトハイブリ
ドーマの産生ずるヒトモノクローナル抗体を産業上利用
する場合に、特に大きな意義を有するものである。すな
わち、本発明の重鎖非合成親細胞株とＩｇＡ型、　Ｉｇ
Ｇ型、ＩｇＭ型、ＩｇＥ型またはＩｇＤ型ヒト抗体産生
細胞の細胞融合により作製されるヒトハイブリドーマは
親細胞由来の重鎮を合成しないため、目的とするＩｇＡ
型、　ＩｇＧ型、ＩｇＭ型、ＩｇＥ型またはＩｇＤ型抗
体の精製が容易となる。また、本発明の重鎖非合成親細
胞株とヒト抗体産生細胞の細胞融合により作製されるヒ
トハイブリドーマは、目的とする抗体に親細胞由来の重
鎖が組み換わった抗体を産生ずる可能性がない。

さらに、ＨＰ　４１２６とヒト抗体産生細胞の細胞融合
により作製されるヒトハイブリドーマはヒト抗体産生細
胞由来のヒト免疫グロブリンのみを合成するため、目的
とする抗体の精製が容易となる１本発明の新規親細胞株
の使用はヒト抗体産生細胞の種類や使用目的により適宜
選択できる。

本発明の親細胞株は、その有する選択特性により、各種
の起源を異にするヒト抗体産生細胞との細胞融合後、作
製されたヒトハイブリドーマを選択的に増殖させること
が出来る。ヒト抗体産生細胞には、例えば、健康人また
は各種疾患の患者由来のｎｉＩ、リンパ節、扁桃腺、末
梢血などから分離される抗体産生細胞や、これら抗体産
生細胞をＥＢウィルスにより形質転換した細胞集団、お
よび形質転換した細胞集団からクローニングにより得た
単一ＥＢウィルス形質転換細胞株を用いることができる
。また、特定抗原免疫により特定抗原に対する高い血中
抗体価が誘導されたヒトの抗体産生細胞や、ヒト抗体産
生細胞（Ｂ細胞）をホークライードマイト−ジエン（ｐ
ｗＭ）などの因子と特定抗原を添加した培養液中で数日
間培養することにより刺激、増殖させた抗体産生細胞な
どが細胞融合用のヒト抗体産生細胞として用いることが
出来る。

本発明の新規親細胞株とヒト抗体産生細胞の細胞融合に
より、各種疾患の診断、予防、治療に用い得るヒトモノ
クローナル抗体の作製が達成される０例えば、サイトメ
ガロウィルス（ＣＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（
）ＩＴＬＶ）、ヘルペスシンプレックスウィルス（ＩＩ
ｓＶ）、バリセラシスターウィルス（ＶＺＶ）、Ｂ型肝
炎ウィルス（ＨＩＩＶ）、インフルエンザウィルス、Ｒ
Ｓウィルス（Ｒ５Ｖ）等のウィルス、緑膿菌、病原性大
腸菌、インフルエンザ菌、肺炎球菌、黄色ぶどう状球菌
等の細菌、アスペルギルス、カンジダ等の真菌に対する
ヒトモノクローナル抗体の作製が可能となる。また、診
断、治療の他、細胞分類、電気泳動分析、物質精製、組
織学、細胞学などの幅広い分野において使用できるヒト
モノクローナル抗体の作製が達成される０例えば、癌抗
原、緑膿菌が産生ずるエキソトキシンＡ等の毒素、すぎ
花粉などの各種アレルゲン、ホルモン、生理活性タンパ
ク質１組織適合抗原に対するヒトモノクローナル抗体の
作製が可能となる。ヒト抗体産生細胞の産生ずる抗体の
グロブリンクラスは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ
、　ＩｇＥのいずれであってもより）。

また１本発明の親細胞株は細胞融合用の親細胞株として
使用できるだけでなく、各種の遺伝子を導入、発現させ
て各種のタンパク質を産生ずるホスト細胞としても使用
できる。さらに、ヒト抗体産生細胞とのヒトハイブリド
ーマを作製し、ヒト抗体遺伝子調製用の材料細胞に使用
することも出来る。

本発明の新規親細胞株は、細胞融合により作製したヒト
ハイブリドーマに高い抗体分泌能を付加することが出来
る０本性質により、作製したヒトハイブリドーマを大量
に培養してヒトモノクローナル抗体を製造する場合に５
培養期間の短縮化と製造コストの低減をもたらすことが
出来る。

なお、本発明の親細胞株を選別するか、あるいは突然変
異を誘発後の選別により新たなヒト免疫グロブリン非合
成の細胞株を取得できる。あるいは１本発明の親細胞株
とヒトミエローマ細胞や、ヒトリンパ芽球細胞を細胞融
合し、新たな親細胞株を創製できる。本発明の親細胞株
は、さらに。

選択特性を付与するために新たに遺伝子を導入したり、
突然変異を誘発させることにより、新たな親細胞株に誘
導できる。例えば、ネオマイシンなどに対する薬剤耐性
遺伝子を有するプラスミドを導入したり、耐性遺伝子を
有する細胞と細胞融合させることもできる。

代理人　弁理士　戸　１）親　男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト免疫グロブリン合成細胞株に由来し、自己増殖
   と細胞融合能を有するヒト免疫グロブリン非合成突然変
   異細胞株および、それに由来する細胞株。 ２、ヒト免疫グロブリン合成細胞株がヒトミエローマ細
   胞とヒトリンパ芽球細胞の融合細胞株である特許請求の
   範囲第１項記載のヒト免疫グロブリン非合成突然変異細
   胞株および、それに由来する細胞株。 ３、ヒトミエローマ細胞が、ＲＰＭＩ８２２６由来であ
   る特許請求の範囲第２項記載のヒト免疫グロブリン非合
   成突然変異細胞株および、それに由来する細胞株。 ４、ヒトリンパ芽球細胞がＧＭ１５００由来である特許
   請求の範囲第２項記載のヒト免疫グロブリン非合成突然
   変異細胞株および、それに由来する細胞株。 ５、ヒト免疫グロブリン合成細胞株がＡＴＣＣＣＲＬ８
   ６５８である特許請求の範囲第１項記載のヒト免疫グロ
   ブリン非合成突然変異細胞株および、それに由来する細
   胞株。 ６、微工研条寄第２１２８号、第２１２９号、第２６１
   ５号の細胞株および、それに由来する細胞株。 ７、特許請求の範囲第１項から第６項記載の細胞株から
   の選別により得られる細胞株および、それに由来する細
   胞株。 ８、特許請求の範囲第１項から第７項記載の細胞株に突
   然変異を起こさせることにより得られる細胞株および、
   それに由来する細胞株。 ９、ヒト抗体産生細胞との融合能を有することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項から第８項記載の細胞株。 １０、ヒト抗体産生細胞がエプスタイン・バー・ウィル
   ス形質転換細胞である特許請求の範囲第９項記載の細胞
   株。 １１、ヒト抗体産生細胞がＢリンパ球である特許請求の
   範囲第９項記載の細胞株。 １２、特許請求の範囲第１項から第１１項記載の細胞株
   の作製方法。 １３、特許請求の範囲第１項から第１２項記載の細胞株
   とヒト抗体産生細胞との細胞融合方法。 １４、特許請求の範囲第１項から第１２項記載の細胞株
   とヒト抗体産生細胞との細胞融合により得られるヒトハ
   イブリドーマおよび、それに由来する細胞株。