JPS59132885A - 新規細胞ライン - Google Patents
新規細胞ラインInfo
- Publication number
- JPS59132885A JPS59132885A JP58007744A JP774483A JPS59132885A JP S59132885 A JPS59132885 A JP S59132885A JP 58007744 A JP58007744 A JP 58007744A JP 774483 A JP774483 A JP 774483A JP S59132885 A JPS59132885 A JP S59132885A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- cell
- human
- medium
- hybridomas
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は骨髄細胞由来の腫瘍細胞を除《腫瘍細胞．％に
ヒト腫瘍細胞から誘導された雑種細胞（ハイブリドーマ
）作製用の新規細胞ラインに関する。さらに詳しく言え
ば．本発明はー・イブリドーマの作製に有用であり、従
来とは異なる全く新しいラインの腫瘍細胞ラインに関す
るものであり。
ヒト腫瘍細胞から誘導された雑種細胞（ハイブリドーマ
）作製用の新規細胞ラインに関する。さらに詳しく言え
ば．本発明はー・イブリドーマの作製に有用であり、従
来とは異なる全く新しいラインの腫瘍細胞ラインに関す
るものであり。
この新規細胞ラインは別の親細胞，例えば特定の抗原で
感作された同種ま１こは異種動物（ヒトヶ含む）からの
Ｂ細胞等と融合により・〜イブリドーマを作製できる。
感作された同種ま１こは異種動物（ヒトヶ含む）からの
Ｂ細胞等と融合により・〜イブリドーマを作製できる。
このハイブリドーマを用いて弟クローン性抗体，その他
有用な生理活性２持つリンフ才力インの生産等に利用す
ることができろ。
有用な生理活性２持つリンフ才力インの生産等に利用す
ることができろ。
近年，生体外で増殖可能で且つ特定の免疫原（抗原）に
対する抗体生産鮨ヲ有するハイブリドーマを作製し．、
、該ハイブリドーマが分泌する均一で極めて特異性の高
い抗体（羊クローン性抗体）を診断剤や治療剤などに利
用しようとする研究が広く行われ、免疫学，生物学，医
学，薬学などの分野で大いに注目されている。このよう
な・〜イブリドーマの作製方法およびハイブリドーマの
利用概念を一般化させたのはケンブリッジ大学のＣｅａ
ｓｅｒ Ｍｉｌｓｉｅｉｎらであった（ ｆｖ１口ｓ
ｔ ｅ ｉ ｎ 。
対する抗体生産鮨ヲ有するハイブリドーマを作製し．、
、該ハイブリドーマが分泌する均一で極めて特異性の高
い抗体（羊クローン性抗体）を診断剤や治療剤などに利
用しようとする研究が広く行われ、免疫学，生物学，医
学，薬学などの分野で大いに注目されている。このよう
な・〜イブリドーマの作製方法およびハイブリドーマの
利用概念を一般化させたのはケンブリッジ大学のＣｅａ
ｓｅｒ Ｍｉｌｓｉｅｉｎらであった（ ｆｖ１口ｓ
ｔ ｅ ｉ ｎ 。
（］、ａｔ、ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５．
１９７５）。彼らはＳａ １ｋｉｎｓｔｉｔｕｔｅ の
Ｌｅｏ ５ａｃｋｓ らから分与されたマウスのミエ
ローマ（Ｐ３に株）からまず変異株（Ｐろ−Ｘ６ろ−Ａ
ｇ３ ”）を作製し１次にヒツジ赤血球の抗原で免疫し
たマウス牌細胞とを融合せしめ・・イブリドーマ乞作製
した。そしてその・・イブリトーマが生体外で増殖可能
で而もヒツジ赤血球に対する単クローン性抗体（ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下ＭｏＡｂと略
す）を生産ずろこと７明らかにした。
１９７５）。彼らはＳａ １ｋｉｎｓｔｉｔｕｔｅ の
Ｌｅｏ ５ａｃｋｓ らから分与されたマウスのミエ
ローマ（Ｐ３に株）からまず変異株（Ｐろ−Ｘ６ろ−Ａ
ｇ３ ”）を作製し１次にヒツジ赤血球の抗原で免疫し
たマウス牌細胞とを融合せしめ・・イブリドーマ乞作製
した。そしてその・・イブリトーマが生体外で増殖可能
で而もヒツジ赤血球に対する単クローン性抗体（ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下ＭｏＡｂと略
す）を生産ずろこと７明らかにした。
この１９７５年のＭｉｌｓｔｅ団らのイυｆ究以Ｖｎ、
多くの研究者により特定の抗原に対するｉ’Ｖ１ｏＡｂ
乞生産するハイブリドーマに関する研究がなされてい
るが、いずれも・・イブリドーマ作製に用いられろ親細
胞はミエローマ（骨髄腫）細胞やＢ細胞由来の所謂骨髄
細胞由来の腫瘍細胞である。以下に一般化しているハイ
ブリドーマ作製に用いろために必要なミエローマなどの
腫瘍細胞の遺伝学的性質とハイブリドーマの原理につい
て詳しく述べてみろ。
多くの研究者により特定の抗原に対するｉ’Ｖ１ｏＡｂ
乞生産するハイブリドーマに関する研究がなされてい
るが、いずれも・・イブリドーマ作製に用いられろ親細
胞はミエローマ（骨髄腫）細胞やＢ細胞由来の所謂骨髄
細胞由来の腫瘍細胞である。以下に一般化しているハイ
ブリドーマ作製に用いろために必要なミエローマなどの
腫瘍細胞の遺伝学的性質とハイブリドーマの原理につい
て詳しく述べてみろ。
・ヘイブリドーマ作製に用いられる生体外で増殖可能な
親細胞（腫瘍細胞）は、いずれもヒボキサンチンーグア
ニンフォスフォリボシルトランスフエラーゼ（Ｈｙｐｏ
ｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下［−１１Ｇ
ＰＬ（、Ｔ と略す）欠損株あるいはチミジンキナー
ゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）欠損株である
。両欠損株の遺伝生化学的機構は原理的には同じである
のでここでは一般的なＨＧＰＲＴ欠損株について述べる
。Ｅ（ＧＰＩ（、Ｔはすべての細胞のｆ）ＮＡ合成経路
においてザルベージ回路にょる１） Ｎ Ａ合成を担当
する１つの酸素である。言いがえるとＨＧＰ几Ｔは、ブ
リ７ （ｐｕｒｉｎｅ）やピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄ
ｉｎｅ） ’１１基質として行われるＤＮＡ合成（ｄｅ
ｎｏｖｏ回路）が、なんらかのインヒビター（例えば
アミノプテリン）で阻害された場合、その阻害を回避す
る系（ｒｅｓｃｕｅ ｐａｔｈｗａｙ）として。
親細胞（腫瘍細胞）は、いずれもヒボキサンチンーグア
ニンフォスフォリボシルトランスフエラーゼ（Ｈｙｐｏ
ｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；以下［−１１Ｇ
ＰＬ（、Ｔ と略す）欠損株あるいはチミジンキナー
ゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）欠損株である
。両欠損株の遺伝生化学的機構は原理的には同じである
のでここでは一般的なＨＧＰＲＴ欠損株について述べる
。Ｅ（ＧＰＩ（、Ｔはすべての細胞のｆ）ＮＡ合成経路
においてザルベージ回路にょる１） Ｎ Ａ合成を担当
する１つの酸素である。言いがえるとＨＧＰ几Ｔは、ブ
リ７ （ｐｕｒｉｎｅ）やピリミジン（ｐｙｒｉｍｉｄ
ｉｎｅ） ’１１基質として行われるＤＮＡ合成（ｄｅ
ｎｏｖｏ回路）が、なんらかのインヒビター（例えば
アミノプテリン）で阻害された場合、その阻害を回避す
る系（ｒｅｓｃｕｅ ｐａｔｈｗａｙ）として。
サルベージ回路が働くことによりＤＮＡ合成が行われ細
胞の生命を維持する役割をする。従って。
胞の生命を維持する役割をする。従って。
ＩＴＪ、ＧＰＲＴ欠損株はヒポキサンチン−アミノプテ
リン（ｄｅｎｏｖｏ回路の阻害剤）−チミジン培地（以
下ＨＡ Ｔ培地と略す）では、培地中にアミノプテリン
が存在するため生存することはできない。一方。
リン（ｄｅｎｏｖｏ回路の阻害剤）−チミジン培地（以
下ＨＡ Ｔ培地と略す）では、培地中にアミノプテリン
が存在するため生存することはできない。一方。
・・イブリドーマ作製に用いろ他方の親細胞例えば牌細
胞（Ｂ細胞）は、ｄｅ ｎｏｖｏ回路とサルベージ回路
の両方のＤＮＡ合成経路乞有している。従って、ＨＧＰ
凡Ｔ欠損株との細胞融合で得られる・・イブリドーマは
、ｆ（ＡＴ培地でアミノプテリンによるｄｅ ｎｏｖｏ
回路の阻害を受けてもヒポキサンチンを利用して肺細胞
由来のサルベージ回路によりＤＮＡ合成が行われ、増殖
ができろ。即ち・〜イブリドーマは、ミエローマなどの
親細胞からの生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での増殖能と
牌細胞からのサルベージ回路によるＤＮＡ合成能とを合
わせてＭＬ。
胞（Ｂ細胞）は、ｄｅ ｎｏｖｏ回路とサルベージ回路
の両方のＤＮＡ合成経路乞有している。従って、ＨＧＰ
凡Ｔ欠損株との細胞融合で得られる・・イブリドーマは
、ｆ（ＡＴ培地でアミノプテリンによるｄｅ ｎｏｖｏ
回路の阻害を受けてもヒポキサンチンを利用して肺細胞
由来のサルベージ回路によりＤＮＡ合成が行われ、増殖
ができろ。即ち・〜イブリドーマは、ミエローマなどの
親細胞からの生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での増殖能と
牌細胞からのサルベージ回路によるＤＮＡ合成能とを合
わせてＭＬ。
しかも牌細胞（Ｂ細胞）からは特定の抗原に対する免疫
グロブリン（抗体）を生産する情報を受は継いでいろた
め、ＨＡＴ培地で増殖でき免疫グロブリンを分泌する。
グロブリン（抗体）を生産する情報を受は継いでいろた
め、ＨＡＴ培地で増殖でき免疫グロブリンを分泌する。
・ヘイブリドーマ作製に必要な親株であろ１−１０１月
（Ｔ欠損株は１通常適当な突然変異処理により生じる８
−アザグア ＝ ｙ （８−ａ ｚａｇｕａｎ ｉ ｎ
ｅ）耐性でＨＡＴ培地に増殖しえない性質７有する株と
して選択されろ。該親細胞としては、ミエローマや白血
病のＢ細胞など骨髄由来の腫瘍細胞が用いられるのが定
着化している。しかし、・ヘイブリドーマ作製用として
細胞ライン化できろこれらの腫瘍細胞は。
（Ｔ欠損株は１通常適当な突然変異処理により生じる８
−アザグア ＝ ｙ （８−ａ ｚａｇｕａｎ ｉ ｎ
ｅ）耐性でＨＡＴ培地に増殖しえない性質７有する株と
して選択されろ。該親細胞としては、ミエローマや白血
病のＢ細胞など骨髄由来の腫瘍細胞が用いられるのが定
着化している。しかし、・ヘイブリドーマ作製用として
細胞ライン化できろこれらの腫瘍細胞は。
マウスあるいはラットが中心でヒトのミエローマの例は
極めて少ない。その原因としく、ヒト・ミエローマでは
Ｄ Ａ Ｔ培地選択Ｃ以下Ｈ，Ａ Ｔセレクションとい
う）が利用できるような細胞ラインを作製することが困
難であること、また本来の目的とする親細胞の増殖能が
弱いため・・イブリドーマを作製したとしてもその・〜
イブリドーマは極めて増殖能が弱くしかも不安定で目的
とする免疫グロブリンの分泌量も少ないことなどがあげ
られる。
極めて少ない。その原因としく、ヒト・ミエローマでは
Ｄ Ａ Ｔ培地選択Ｃ以下Ｈ，Ａ Ｔセレクションとい
う）が利用できるような細胞ラインを作製することが困
難であること、また本来の目的とする親細胞の増殖能が
弱いため・・イブリドーマを作製したとしてもその・〜
イブリドーマは極めて増殖能が弱くしかも不安定で目的
とする免疫グロブリンの分泌量も少ないことなどがあげ
られる。
従って現状ではマウスやうにトなどの所謂動物−動物（
ａｎｉｍａｌ−ａｎｉｍａｌ）ノーイプリドーマからの
免疫グロブリンの利用が余儀なくされている。しかし、
ａｎ ｉｍａ Ｉ −ａｎ ｉｍａ ｌハイブリドー
マの生産する免疫グロブリンはヒトにとっては異種動物
の蛋白質であるためヒトに利用する場合その抗原性が重
大な問題となる。このブこめ、ヒト−ヒト（ｌｉｕｍａ
ｎ−ｈ ｕｍ ａ ｎ ）・・イブリドーマからの免疫
グロブリンが期待されている。また、現在こトのミエロ
ーマからの・・イブリトーマ乞大量に培養することは既
に述べたようにノ・イブリドーマの不女定さの点で間頂
か多い。
ａｎｉｍａｌ−ａｎｉｍａｌ）ノーイプリドーマからの
免疫グロブリンの利用が余儀なくされている。しかし、
ａｎ ｉｍａ Ｉ −ａｎ ｉｍａ ｌハイブリドー
マの生産する免疫グロブリンはヒトにとっては異種動物
の蛋白質であるためヒトに利用する場合その抗原性が重
大な問題となる。このブこめ、ヒト−ヒト（ｌｉｕｍａ
ｎ−ｈ ｕｍ ａ ｎ ）・・イブリドーマからの免疫
グロブリンが期待されている。また、現在こトのミエロ
ーマからの・・イブリトーマ乞大量に培養することは既
に述べたようにノ・イブリドーマの不女定さの点で間頂
か多い。
通常、ミエローマ細胞は培養液中にミエローマ蛋白とい
う免疫グロブリンを大量に分泌ずろが（但シ１分泌され
る免疫グロブリンはとの抗原に対１−る抗体であるか不
明であり、特定の抗原に対する抗体ヶ生産しているミエ
ローマ細胞を選択することは不可能）、最近ではミエロ
ーマ蛋白の存在が・・イブリドーマのスクリーニングや
抗体の精製を複雑化することが判ってきたためミエロー
マ蛋白外部・型から非分圧−型のミエローマ細胞か用い
ら１するようになっている。即ち、・・イブリドーマ作
製用の親細胞の性質として、生体外での増殖能力に要点
が絞らｆｔてきている。
う免疫グロブリンを大量に分泌ずろが（但シ１分泌され
る免疫グロブリンはとの抗原に対１−る抗体であるか不
明であり、特定の抗原に対する抗体ヶ生産しているミエ
ローマ細胞を選択することは不可能）、最近ではミエロ
ーマ蛋白の存在が・・イブリドーマのスクリーニングや
抗体の精製を複雑化することが判ってきたためミエロー
マ蛋白外部・型から非分圧−型のミエローマ細胞か用い
ら１するようになっている。即ち、・・イブリドーマ作
製用の親細胞の性質として、生体外での増殖能力に要点
が絞らｆｔてきている。
以上のような状況から、・ヘイブリドーマ作製用の親細
胞として増殖力が旺盛で細胞融合後に）（、ＡＴセレク
ションができるヒト由来の細胞ラインと生体外（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）で安定に免疫グロブリンを大量に生産する
ヒト・・ヘイブリトーマの出現が期待されている。親細
胞としてはミエローマやＢ細胞由来のがん化細胞（Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）による形
質転換細胞を含む）が定着化しているが。
胞として増殖力が旺盛で細胞融合後に）（、ＡＴセレク
ションができるヒト由来の細胞ラインと生体外（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）で安定に免疫グロブリンを大量に生産する
ヒト・・ヘイブリトーマの出現が期待されている。親細
胞としてはミエローマやＢ細胞由来のがん化細胞（Ｅｐ
ｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）による形
質転換細胞を含む）が定着化しているが。
これらの親細胞は上に述べたように種々の欠点乞有する
。
。
そこで本発明者らは、親細胞が生体外で増殖力旺盛であ
ればどのような細胞でも・・イブリドーマ作製に使用で
きるという観点にたち、鋭意研究の結果従来の親細胞の
もつ欠点欠補なう全く新しいタイプカヒト細胞ライン７
確立するとともに該細胞ラインか生体外で安定に抗体を
生産する・・イブリドーマの親細胞として実用可能であ
ること２明らかにした。本発明における新規な細胞ライ
ンは骨髄細胞やＢ細胞とは異なる由来のがん化細胞。
ればどのような細胞でも・・イブリドーマ作製に使用で
きるという観点にたち、鋭意研究の結果従来の親細胞の
もつ欠点欠補なう全く新しいタイプカヒト細胞ライン７
確立するとともに該細胞ラインか生体外で安定に抗体を
生産する・・イブリドーマの親細胞として実用可能であ
ること２明らかにした。本発明における新規な細胞ライ
ンは骨髄細胞やＢ細胞とは異なる由来のがん化細胞。
皮フかん（メラノーマ）、肝がん、胃がん、腸がん、肺
がん、乳がんなどの腫瘍細胞、特に好ましくはヒト・メ
ラノーマ乞自然もしくは人為的突然変異によって誘導し
た株（具体的にばＩ） Ｎ Ａ合成経路に関与する酵素
群の１つの生産欠欠く遺伝的欠損株）である。これらの
株は従来の骨髄由来の腫瘍細胞からの細胞ラインに比べ
て、生体外での増殖力が強（さらに例えば抗体産生細胞
（Ｂｉｌｉｌ胞）との融合によって得られる・ヘイブリ
ドーマも親細胞と同様の強い増殖能乞もちしかも安定に
免疫グロブリンケ分必することができる。
がん、乳がんなどの腫瘍細胞、特に好ましくはヒト・メ
ラノーマ乞自然もしくは人為的突然変異によって誘導し
た株（具体的にばＩ） Ｎ Ａ合成経路に関与する酵素
群の１つの生産欠欠く遺伝的欠損株）である。これらの
株は従来の骨髄由来の腫瘍細胞からの細胞ラインに比べ
て、生体外での増殖力が強（さらに例えば抗体産生細胞
（Ｂｉｌｉｌ胞）との融合によって得られる・ヘイブリ
ドーマも親細胞と同様の強い増殖能乞もちしかも安定に
免疫グロブリンケ分必することができる。
以上のように本発明におけろ肺瘍細、砲ライン。
特にヒト腫瘍細胞ラインは、ある特定の抗原で感作され
ｆこ異種動物からの牌細胞（１３，ｌ１ｌＩ胞）との融
合による特定の抗体乞生産する・・イブリドーマの作製
に非常に有用であるばかりでなく１本発明の細胞ライン
がヒト由来の細胞であるためヒト−ヒト・ヘイブリトー
マの作製にも利用できる。この場合、感作された細）抱
にはヒトの末梢血、へんとう腺、リンパ節、牌１藏など
からのＢ細１＠乞用いればよい。また、ヒト−ヒト されろ免疫グロブリンはヒトの蛋白質であるためヒトに
利用する場合にも抗原性の問題はない。さらに本発明の
細胞ラインケ用いれば，カンマ型インターフェロンなど
のリンフ才力インを生産できろヒトのＴ−細胞系の細胞
とのノ・イブリドーマ（Ｔ−ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ）の作製も可能テする。このように本発明における
細胞ラインは幅広い利用が可能である。
ｆこ異種動物からの牌細胞（１３，ｌ１ｌＩ胞）との融
合による特定の抗体乞生産する・・イブリドーマの作製
に非常に有用であるばかりでなく１本発明の細胞ライン
がヒト由来の細胞であるためヒト−ヒト・ヘイブリトー
マの作製にも利用できる。この場合、感作された細）抱
にはヒトの末梢血、へんとう腺、リンパ節、牌１藏など
からのＢ細１＠乞用いればよい。また、ヒト−ヒト されろ免疫グロブリンはヒトの蛋白質であるためヒトに
利用する場合にも抗原性の問題はない。さらに本発明の
細胞ラインケ用いれば，カンマ型インターフェロンなど
のリンフ才力インを生産できろヒトのＴ−細胞系の細胞
とのノ・イブリドーマ（Ｔ−ｃｅｌｌ ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ）の作製も可能テする。このように本発明における
細胞ラインは幅広い利用が可能である。
以下，本発明の新規な腫瘍細胞ラインの作製法およびこ
れら新規な細胞ラインの用途として，これら乞親株とず
ろ・ヘイブリトーマの作製法並びに該・・イブリドーマ
培養物からのＭｏＡ．ｂの分離について説明する。説明
欠簡第にするｆこめヒトＩ庫瘍細胞乞用いろ例を記述ず
ろが，本発明ばこ１１に１狐定されるものではない。
れら新規な細胞ラインの用途として，これら乞親株とず
ろ・ヘイブリトーマの作製法並びに該・・イブリドーマ
培養物からのＭｏＡ．ｂの分離について説明する。説明
欠簡第にするｆこめヒトＩ庫瘍細胞乞用いろ例を記述ず
ろが，本発明ばこ１１に１狐定されるものではない。
まず・・イブリドーマ作製に使用可能なヒト親細胞を得
る１こめに必要な第一ステップは，ｌ−ＩＡＴセレクシ
ョンが利用できろＤＮＡ合成梯路におけるザルベージ回
路の酵素（ １−ｉＧ ’Ｐ ＩλＴ）欠損株の作製で
ある。１つは直接適当な濃度の８−アザグアニン（８−
Ａｚａｇｕａｎ １ｎｅ）Ｙ細胞培養液に添加し、生じ
ろ８−アザグアニン耐性株の出現をもって第１ステツプ
の終了とする。第１ステツプのもう１つの方法は紫外線
か突然変異誘起剤たとえはエチルメタンスルホネート（
Ｅｌ−Ｌ、Ｓ）、 Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−
二トロングアニジン（ＨＮＮＧ） ナト’ｆｉ４４細胞
の種類に応じ、フｆ当量、照射（ＧＬ−１５，直下ろ０
Ｃ７ｎ、１５秒〜１０分間）又は添加（０，０５〜１０
μｇ／ｍｌ’）シたのち、８−アザグアニジン含有培地
に細胞乞うつす。突然変異誘起剤は、不安定なものが多
いが、これで・数時間がら６日間培養し、処理後は無血
清培地にてよく洗い、８−アザグアニジン含有培地に細
胞をうつす。この場合も８−アザグアニジン耐性株の出
現をもって第１ステツプの終了とする。
る１こめに必要な第一ステップは，ｌ−ＩＡＴセレクシ
ョンが利用できろＤＮＡ合成梯路におけるザルベージ回
路の酵素（ １−ｉＧ ’Ｐ ＩλＴ）欠損株の作製で
ある。１つは直接適当な濃度の８−アザグアニン（８−
Ａｚａｇｕａｎ １ｎｅ）Ｙ細胞培養液に添加し、生じ
ろ８−アザグアニン耐性株の出現をもって第１ステツプ
の終了とする。第１ステツプのもう１つの方法は紫外線
か突然変異誘起剤たとえはエチルメタンスルホネート（
Ｅｌ−Ｌ、Ｓ）、 Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−
二トロングアニジン（ＨＮＮＧ） ナト’ｆｉ４４細胞
の種類に応じ、フｆ当量、照射（ＧＬ−１５，直下ろ０
Ｃ７ｎ、１５秒〜１０分間）又は添加（０，０５〜１０
μｇ／ｍｌ’）シたのち、８−アザグアニジン含有培地
に細胞乞うつす。突然変異誘起剤は、不安定なものが多
いが、これで・数時間がら６日間培養し、処理後は無血
清培地にてよく洗い、８−アザグアニジン含有培地に細
胞をうつす。この場合も８−アザグアニジン耐性株の出
現をもって第１ステツプの終了とする。
次に■」Ａ Ｔセレクションが利用出来るかを検討する
。細胞を培養したのち、遠心分離にて培地を除去し、１
−ＩＡＴ培地で２回洗い、同じＨＡ Ｔ培地におきかえ
る（ １０’ ／ｍｌ ）。５日間Ｉ硯祭ビ行ない生死
の判定をする。判定はトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎｅ
ｂｌｕｅ）染色で行なう。この方法で大半の細胞が死ん
だ場合は、ＨＡＴ培地におきかえろ前の細胞（１０”／
ｍｌ’）とフィーダーレイヤー（Ｆ’ｅｅｄｅｒｌａｙ
ｅｒ）細胞（牌細胞など）とを用意し、９６穴マイクロ
ウｘル（Ｃｏｓｔａ□ｒ Ａ、３５９６ ）の１穴当り
フィーダーレイヤー細胞を１０５まいた上に、処理細胞
が曜至でおよそ０１個になるようにつまり一穴当り処理
細胞が１個より多くならないようにまき。
。細胞を培養したのち、遠心分離にて培地を除去し、１
−ＩＡＴ培地で２回洗い、同じＨＡ Ｔ培地におきかえ
る（ １０’ ／ｍｌ ）。５日間Ｉ硯祭ビ行ない生死
の判定をする。判定はトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎｅ
ｂｌｕｅ）染色で行なう。この方法で大半の細胞が死ん
だ場合は、ＨＡＴ培地におきかえろ前の細胞（１０”／
ｍｌ’）とフィーダーレイヤー（Ｆ’ｅｅｄｅｒｌａｙ
ｅｒ）細胞（牌細胞など）とを用意し、９６穴マイクロ
ウｘル（Ｃｏｓｔａ□ｒ Ａ、３５９６ ）の１穴当り
フィーダーレイヤー細胞を１０５まいた上に、処理細胞
が曜至でおよそ０１個になるようにつまり一穴当り処理
細胞が１個より多くならないようにまき。
約１週間培養する。生じたクローンは順次数乞ふやし１
０” ／ｍｌ程度に生育した時点で再度ＨＡＴ培地にお
きかえ完全に細胞の死滅するのを確認し第２ステツプの
終了とする。但しこの第２ステツプば、最低２回する方
が望ましい。又、８−アザグアニンは細胞ラインが確立
するまでは常時培地に添加しておかねばならない。確立
後も適宜加えろ方が望ましい。通常の培地は、変異させ
る前に使用していた培地で良く、又、ハイブリドーマの
親細胞として利用する場合も、なんら特別な組成の培地
ケ用意する必要はない。
０” ／ｍｌ程度に生育した時点で再度ＨＡＴ培地にお
きかえ完全に細胞の死滅するのを確認し第２ステツプの
終了とする。但しこの第２ステツプば、最低２回する方
が望ましい。又、８−アザグアニンは細胞ラインが確立
するまでは常時培地に添加しておかねばならない。確立
後も適宜加えろ方が望ましい。通常の培地は、変異させ
る前に使用していた培地で良く、又、ハイブリドーマの
親細胞として利用する場合も、なんら特別な組成の培地
ケ用意する必要はない。
細胞の保存も通常法で良い。即ち、 １０％ｌ”Ｇ３
（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、１０％Ｄ
ＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）乞培地
に加え、液体窒素中又は−８０℃程度のフリーザーに保
存すれば問題はない。
（ｆｅｔａｌ ｃａｌｆ ｓｅｒｕｍ）、１０％Ｄ
ＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）乞培地
に加え、液体窒素中又は−８０℃程度のフリーザーに保
存すれば問題はない。
本発明の細胞ラインはハイブリドーマ作製用の親糾１胞
として有用であり、特にヒトＢ−細胞を別の親細胞とす
る・・イブリドーマ馨作製できるばかりでなく、ヒトＴ
−細胞との・ヘイブリドーマ作製にも利用可能であると
考えられている。
として有用であり、特にヒトＢ−細胞を別の親細胞とす
る・・イブリドーマ馨作製できるばかりでなく、ヒトＴ
−細胞との・ヘイブリドーマ作製にも利用可能であると
考えられている。
本発明の上言己細胞ラインの使用態様欠以下に記述する
。
。
本発明の細胞ラインを用いての・・イバリドーマ作製は
、培地として、イーグルのＩＶＩ ｂ Ｍ 、ダルベツ
コの改良ＭＥＭ、 ｌ充ＰＭ１１６４０などの通常よく
使用されているものに、 １Ｑ％Ｃ８（ｃａ ｌ ｆ
ｓｅｒｕｍ）又は５％ＦＣ８＋５％（Ｓ、あるいは、
１０％Ｉ” ＣＳ を刃口えろ。親細胞の通常の維持は
、上記のいずれでも良いが、ハイブリドーマ作製には１
０％Ｆｔ：Ｓが耀ましい。まず親細胞であるヒト腫瘍細
胞と牌＋Ｕ＋胞と７１：５の比率で用意する。融合剤と
しては。
、培地として、イーグルのＩＶＩ ｂ Ｍ 、ダルベツ
コの改良ＭＥＭ、 ｌ充ＰＭ１１６４０などの通常よく
使用されているものに、 １Ｑ％Ｃ８（ｃａ ｌ ｆ
ｓｅｒｕｍ）又は５％ＦＣ８＋５％（Ｓ、あるいは、
１０％Ｉ” ＣＳ を刃口えろ。親細胞の通常の維持は
、上記のいずれでも良いが、ハイブリドーマ作製には１
０％Ｆｔ：Ｓが耀ましい。まず親細胞であるヒト腫瘍細
胞と牌＋Ｕ＋胞と７１：５の比率で用意する。融合剤と
しては。
１−ＩＶＪＣ）Ｉｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ
ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、。
ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、。
別名５ｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、ポリエチレングリコ
ール（ＩＪＥＧ）などを使用する。特にＰＥＧ１０００
の６０％〜５０％程度が良い。融合後のＨＡＴセレクシ
ョンの方法は、既に一般化されているので省略する。
ール（ＩＪＥＧ）などを使用する。特にＰＥＧ１０００
の６０％〜５０％程度が良い。融合後のＨＡＴセレクシ
ョンの方法は、既に一般化されているので省略する。
生じるハイブリドーマのスクリーニング法は、主に培養
土清乞用い、５ＰＡ−ｂｉｎｄ−８１％ＢＣ法（Ｓ−Ｐ
Ａ：５ｔｏｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ａ、５ＲＢＣ：５ｈｅｅｐ Ｒｅｄ Ｂ
ｌｏｏｄ Ｃｅ１ｌ：免疫実験操作法■Ｐ２ろ７５）、
ＥＴ、ｉｓＡ法ＣＩ）ｙｎａｔｅｃ１４ ）ｑ用いて免
疫グロブリン“暑分泌しているノ〜イブリドーマのクロ
ーン欠ひろいあげた。クローンは徐々にふやし。
土清乞用い、５ＰＡ−ｂｉｎｄ−８１％ＢＣ法（Ｓ−Ｐ
Ａ：５ｔｏｐｈｙｌｏｃｏｃｅｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ａ、５ＲＢＣ：５ｈｅｅｐ Ｒｅｄ Ｂ
ｌｏｏｄ Ｃｅ１ｌ：免疫実験操作法■Ｐ２ろ７５）、
ＥＴ、ｉｓＡ法ＣＩ）ｙｎａｔｅｃ１４ ）ｑ用いて免
疫グロブリン“暑分泌しているノ〜イブリドーマのクロ
ーン欠ひろいあげた。クローンは徐々にふやし。
１０５／ｍｔ！ Ｋ達した時点でサブクローニング７行
なう。続いて・・イブリドーマの単−件欠吟味するため
、９６大のマイクロウェルにフィーダーレイヤー（ｆｅ
ｅｄｅｒ １ａｙｅｒ）として正常な肺細胞ケおよそ１
Ｑ”ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ まいた上に、・・イブリド
−マン−穴に１個より多くならないように（−穴平均確
生として０１個）まき、約１週間培養後、生付してくる
クローンについて抗体産生能を調べる。この手順をくり
返すことにより単一性の／Ｎイブリド−マを得る。
なう。続いて・・イブリドーマの単−件欠吟味するため
、９６大のマイクロウェルにフィーダーレイヤー（ｆｅ
ｅｄｅｒ １ａｙｅｒ）として正常な肺細胞ケおよそ１
Ｑ”ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ まいた上に、・・イブリド
−マン−穴に１個より多くならないように（−穴平均確
生として０１個）まき、約１週間培養後、生付してくる
クローンについて抗体産生能を調べる。この手順をくり
返すことにより単一性の／Ｎイブリド−マを得る。
・ヘイブリドーマの分泌する免役グロブリンのクラス、
サブクラス分けの方法はアガロースを用いて行なうオフ
タロニー法（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ’）で簡単に識別
できる。即ち、予想さ才する抗グロブリン抗体を適宜用
意し、２４時間後の阻市Ｃをもって判定する（実施例２
を参照）。
サブクラス分けの方法はアガロースを用いて行なうオフ
タロニー法（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ’）で簡単に識別
できる。即ち、予想さ才する抗グロブリン抗体を適宜用
意し、２４時間後の阻市Ｃをもって判定する（実施例２
を参照）。
上述の如く本発明は、ハイブリドーマ作製に際し、最も
重要な親細胞が、従来ミエローマあるいはＢ−細胞由来
の腫瘍細胞でないと利用出来ないとされていた１ＶＪｉ
ｌｓｉｅｉｎからの足説をくつ返ずものである。即ち生
体外で増殖可能な腫瘍１Ｔ（ｕｌ胞であれはバイブｌ
１．−マ作製用の親細胞として用いること乞実証したも
のである。さらに本発明はヒト−ヒトハイブリドーマの
作製においても、従来のミエローマより、簡単な培養で
しかも安定性、増殖性とも上まわる親細胞としてのヒト
）匝瘍細胞ラインを確立し１こことを示すものである。
重要な親細胞が、従来ミエローマあるいはＢ−細胞由来
の腫瘍細胞でないと利用出来ないとされていた１ＶＪｉ
ｌｓｉｅｉｎからの足説をくつ返ずものである。即ち生
体外で増殖可能な腫瘍１Ｔ（ｕｌ胞であれはバイブｌ
１．−マ作製用の親細胞として用いること乞実証したも
のである。さらに本発明はヒト−ヒトハイブリドーマの
作製においても、従来のミエローマより、簡単な培養で
しかも安定性、増殖性とも上まわる親細胞としてのヒト
）匝瘍細胞ラインを確立し１こことを示すものである。
以下の実施例により１本発明のバイブ１ノドーマ作製用
親細１剋ライン欠ヒト腫瘍細胞ン用いて作製する方法を
説明し、更に実施例により作製された細胞ラインおよび
ヒト牌細胞を親細胞とするハイブリドーマの作製および
このハイブリドーマによる抗体産生な実験例において説
明する。
親細１剋ライン欠ヒト腫瘍細胞ン用いて作製する方法を
説明し、更に実施例により作製された細胞ラインおよび
ヒト牌細胞を親細胞とするハイブリドーマの作製および
このハイブリドーマによる抗体産生な実験例において説
明する。
実施例１ ヒ１ｌｌｉ瘍細胞Ｃｏ１ｏ３３からバイブリ
ド以下の実験の培養はすべてＣＯ２５％、空気９５％。
ド以下の実験の培養はすべてＣＯ２５％、空気９５％。
温度約１００％の条件下、６７°Ｃで行った。
ヒト悪性黒色腫Ｃｏ１ｏ３８乞予じめ培養し、２〜６日
用の特に増殖期にある細胞を用意した。これに終濃度０
．０５〜１０μＰ包の突然変異誘起剤ＪＶｉＮＮＧ（Ｎ
−メチル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソクアニジン：シ
グマ社製）をカロえ、約２０％の死細胞が出現する時間
および濃度を設定し１こ（５１９／ｍｌ ： ３６時間
）。次に血清を含まないＲＰＭｉ１６４０ （日永製薬
製）で６回遠心分離７することにより洗い。
用の特に増殖期にある細胞を用意した。これに終濃度０
．０５〜１０μＰ包の突然変異誘起剤ＪＶｉＮＮＧ（Ｎ
−メチル−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソクアニジン：シ
グマ社製）をカロえ、約２０％の死細胞が出現する時間
および濃度を設定し１こ（５１９／ｍｌ ： ３６時間
）。次に血清を含まないＲＰＭｉ１６４０ （日永製薬
製）で６回遠心分離７することにより洗い。
ＭＮＮＧ’Ｙ除去シｆｃ後、終濃度１〜５０ ｔｔｇ／
ｍｌｔの８−アザグアニン存在の培地に２Ｘ Ｉ Ｄ５
ｃｅｌ Ｉｓ／／ｍＬノ（全量１０ａｌＶ）のＭＮＮＧ
ＮＮ側胞を加えた。１週間以内にほとんど全ての細胞（
９９％以上）か死ぬ濃度（２０μｇ ／ｍｌ： ）を設
定し、これ７少くとも２週間風」二、このま＼の状態で
毎日観堅しながら、細胞の増殖の有無乞検討した。約２
週間経過より、＠、激に増殖を開始しはじめたので次に
遠心分離で細胞を集め、更に終濃度５０μｇＡｌの８−
アザグアニン存在下に加えた（第１回目処理回様２Ｘ１
０”ｃｅ ｌ ｌ ｓ ／ｍ、ｌ ）。この状態で更に
２１八間培養し、増殖してくる細胞を８−アザグアニン
１（ｉｉ′１性株とした。
ｍｌｔの８−アザグアニン存在の培地に２Ｘ Ｉ Ｄ５
ｃｅｌ Ｉｓ／／ｍＬノ（全量１０ａｌＶ）のＭＮＮＧ
ＮＮ側胞を加えた。１週間以内にほとんど全ての細胞（
９９％以上）か死ぬ濃度（２０μｇ ／ｍｌ： ）を設
定し、これ７少くとも２週間風」二、このま＼の状態で
毎日観堅しながら、細胞の増殖の有無乞検討した。約２
週間経過より、＠、激に増殖を開始しはじめたので次に
遠心分離で細胞を集め、更に終濃度５０μｇＡｌの８−
アザグアニン存在下に加えた（第１回目処理回様２Ｘ１
０”ｃｅ ｌ ｌ ｓ ／ｍ、ｌ ）。この状態で更に
２１八間培養し、増殖してくる細胞を８−アザグアニン
１（ｉｉ′１性株とした。
１−ＩＡＴセレクションが利用で・きるかを検討するた
め、８−アサグアニン存在下の細胞を血清を含まない培
地で６回遠心分離をくり返して洗い。
め、８−アサグアニン存在下の細胞を血清を含まない培
地で６回遠心分離をくり返して洗い。
ＨＡ Ｔ培地（ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％１（１
（二５（Ｃ８Ｌ社、オーストラリア製）に終濃度でヒポ
キサンチア１Ｏ−４Ｎ１．アミノ方リン４Ｘ１Ｑ−７ｉ
Ｊ チミジン１−６Ｘ１Ｄ−”ｉＶＩ□を加えろ）に
移した。細胞数は１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１０μ
、ｇ）が適数てあつ１こ。
（二５（Ｃ８Ｌ社、オーストラリア製）に終濃度でヒポ
キサンチア１Ｏ−４Ｎ１．アミノ方リン４Ｘ１Ｑ−７ｉ
Ｊ チミジン１−６Ｘ１Ｄ−”ｉＶＩ□を加えろ）に
移した。細胞数は１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量１０μ
、ｇ）が適数てあつ１こ。
５日間観某を行い生死の判定をした。判定はトリパンブ
ルー染色で行う。この方法で細胞か完全に死んだ場合で
も、さらにｌ（Ａ Ｔにおきかえる前の同じ８−アザグ
アニン処理細胞Ｙ １０” ｃｅ ｌ ｌ ｓ／ｍｌと
フィーダーレイアー細胞（Ｆｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ
ｃｅｌｌ）（牌ａ吃）とを用意し、９６穴マイクロプレ
ートの１穴当り供給細胞を１０５まいた上に処理細胞が
確率でおよそ０．１個になるようにまき、約１週間培養
した。生じたクローン（９６穴中、６個）は順次数をふ
やし、さらＶＣ１〜２週間培養後１０”ｃｅｌｌｓ／ｒ
ｎｊ程度に生育した時点で再度全てのクローンについて
ＨＡ Ｔセレクションヲ行った。この方法では上記６ク
ローンの使用した細胞はすべて５日以内に死滅した。し
かし、６クローンのうち。
ルー染色で行う。この方法で細胞か完全に死んだ場合で
も、さらにｌ（Ａ Ｔにおきかえる前の同じ８−アザグ
アニン処理細胞Ｙ １０” ｃｅ ｌ ｌ ｓ／ｍｌと
フィーダーレイアー細胞（Ｆｅｅｄｅｒ １ａｙｅｒ
ｃｅｌｌ）（牌ａ吃）とを用意し、９６穴マイクロプレ
ートの１穴当り供給細胞を１０５まいた上に処理細胞が
確率でおよそ０．１個になるようにまき、約１週間培養
した。生じたクローン（９６穴中、６個）は順次数をふ
やし、さらＶＣ１〜２週間培養後１０”ｃｅｌｌｓ／ｒ
ｎｊ程度に生育した時点で再度全てのクローンについて
ＨＡ Ｔセレクションヲ行った。この方法では上記６ク
ローンの使用した細胞はすべて５日以内に死滅した。し
かし、６クローンのうち。
１クローンは更にもう一度９６穴マイクロプレー 、（
・に上記方法でまき、更にサブクローニング７行って８
クローンを得た。これらのクローンも同様に順次細胞数
をふやし、それぞれの細胞が１（ＡＴ培地で完全に死滅
すること乞確認した。
・に上記方法でまき、更にサブクローニング７行って８
クローンを得た。これらのクローンも同様に順次細胞数
をふやし、それぞれの細胞が１（ＡＴ培地で完全に死滅
すること乞確認した。
このようにして得られたヒトｊ厘瘍細胞（ヒト悪性黒色
腫）の８−アザグアニン耐性、Ｈ，ＡＴセレクションが
かかる細胞−４ＭＥｉシリーズと名付け。
腫）の８−アザグアニン耐性、Ｈ，ＡＴセレクションが
かかる細胞−４ＭＥｉシリーズと名付け。
通常ＩＶ１．Ｅ１ということにする。
細胞は１０％Ｆｅｄ、１０傑ＤＭＳＯ’（ジメチルスル
木片シト）および８０％通常培地組成にて液体窒素下ま
たは一８０°Ｇ８匣のフリーザー中で保存した。
木片シト）および８０％通常培地組成にて液体窒素下ま
たは一８０°Ｇ８匣のフリーザー中で保存した。
実施例２ ヒト腫瘍細胞Ｃｏ１ｏ３８から・・イブリド
この実施例では突然変異誘起剤のかわりに紫外線による
変異欠利用ずろガラを説明する。
この実施例では突然変異誘起剤のかわりに紫外線による
変異欠利用ずろガラを説明する。
増殖期にあろヒト悪性黒色腫（Ｃ’）ｏ ｌ ｏ３８
’）乞１０ｃｎｌ径のシャーレに２Ｘ Ｉ Ｑ” ｃｃ
ｌ ｌ ｓ／ｒｎｌ（全ｔ 、１ Ｑｍｌ ）入れ。
’）乞１０ｃｎｌ径のシャーレに２Ｘ Ｉ Ｑ” ｃｃ
ｌ ｌ ｓ／ｒｎｌ（全ｔ 、１ Ｑｍｌ ）入れ。
紫外線照射（ナショナルＧＬ−１５，直下３０ｍ）’（
ｒ約５分間行ったのち、これＶＣ，８−アザグアニンを
終濃度２０μｇ／Ｍ添加した。約１週間で９９．５％以
上の細、胞が死滅するが、さらに約２週間この状暢で培
養ン続け、毎日Ｇ祭した。８−アザグアニンを最初に添
加してから約６週間口より急激に細胞数が増力口し、均
一な浮遊細胞になった。遠心分離で細胞を集め次に終濃
度５０μｇ ／ｍｌの８−アザグアニン存在下に、この
細１＠ （２Ｘ１［］”ｃｅｌｌｓ／ｄ ）を加えた。
ｒ約５分間行ったのち、これＶＣ，８−アザグアニンを
終濃度２０μｇ／Ｍ添加した。約１週間で９９．５％以
上の細、胞が死滅するが、さらに約２週間この状暢で培
養ン続け、毎日Ｇ祭した。８−アザグアニンを最初に添
加してから約６週間口より急激に細胞数が増力口し、均
一な浮遊細胞になった。遠心分離で細胞を集め次に終濃
度５０μｇ ／ｍｌの８−アザグアニン存在下に、この
細１＠ （２Ｘ１［］”ｃｅｌｌｓ／ｄ ）を加えた。
この状態でさらに２週間培養し、増殖して来る細胞乞、
８−アサグアニン劇性株とした。
８−アサグアニン劇性株とした。
以下、１（ＡＴセレクションの方法は実施例１に同じで
ある。この方法でＭＥＩシリーズの細胞が６種得られた
。実施例１と比較すると８−アザグアニン耐性株が出現
する確座が約５分１程度に低下した。但し、８−アザグ
アニン耐性株が得られると、以後の操作であるＨ Ａ
Ｔセレクションがかかる確率は同じであった。
ある。この方法でＭＥＩシリーズの細胞が６種得られた
。実施例１と比較すると８−アザグアニン耐性株が出現
する確座が約５分１程度に低下した。但し、８−アザグ
アニン耐性株が得られると、以後の操作であるＨ Ａ
Ｔセレクションがかかる確率は同じであった。
実施例ろ ヒト腫瘍細胞Ｃｏ ｌ ｏろ８から・〜イブ
リドこの実施例では直接８−アザグアニンを培地に添加
し耐性株を作製する方法を説明する。
リドこの実施例では直接８−アザグアニンを培地に添加
し耐性株を作製する方法を説明する。
増殖期のヒト悪性黒色腫（ｃｏｌｏ３８）２Ｘ １０５
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量Ｉ Ｑｍｌ）に終濃度５ μｇ
／ｍＩ！で５日間培養したのち、さらに終濃度で２０
μｇ／ｍｌなるように８−アサグアニン７添加した。最
初から１０日の期間内に、はとんどすべての細胞が死滅
したが、少くとも、さらに２０日程度このままの状態で
培養を続けた。増殖が認められろ確寒は低かった。この
場合、１８フラスコ中、１フラスコに、急激に増殖する
細胞？認めることが出来た。次に、この細胞の１部をさ
らに終ａ度５０μｇ／ｍ１Ｂ−アザグアニン存在下で２
週間培養し１通常の増殖能７待った細胞の出現を待って
８−アザグアニン耐性株とした。
ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（全量Ｉ Ｑｍｌ）に終濃度５ μｇ
／ｍＩ！で５日間培養したのち、さらに終濃度で２０
μｇ／ｍｌなるように８−アサグアニン７添加した。最
初から１０日の期間内に、はとんどすべての細胞が死滅
したが、少くとも、さらに２０日程度このままの状態で
培養を続けた。増殖が認められろ確寒は低かった。この
場合、１８フラスコ中、１フラスコに、急激に増殖する
細胞？認めることが出来た。次に、この細胞の１部をさ
らに終ａ度５０μｇ／ｍ１Ｂ−アザグアニン存在下で２
週間培養し１通常の増殖能７待った細胞の出現を待って
８−アザグアニン耐性株とした。
１−Ｉ Ａ Ｔセｔ／クションの方法は実施例１に同じ
であった。この方法によりＭ Ｅ Ｉシリーズの細［抱
が６ｆ重得られブこ。
であった。この方法によりＭ Ｅ Ｉシリーズの細［抱
が６ｆ重得られブこ。
以上、ヒト悪性黒色腫（メラノー−７ｃｏｌｏ３３）よ
り６つの方法で１７種の１〜ＩＥｉシリーズの細胞ライ
ン （ＳＵＮ Ｎ−２１−１〜ｓＵＮ Ｎ−２ｌ
−１７）乞イ丑ブこ。
り６つの方法で１７種の１〜ＩＥｉシリーズの細胞ライ
ン （ＳＵＮ Ｎ−２１−１〜ｓＵＮ Ｎ−２ｌ
−１７）乞イ丑ブこ。
実施例４ ヒト腫瘍細胞（Ｍ２１）からノルイブリドこ
の実施例では他の種類のヒト１匝瘍にｉｌｌ胞からも（
、：ｏｌｏろＢと同様に、・〜イブリドーマ作製用親細
１１説が得られることヶ説明する。
の実施例では他の種類のヒト１匝瘍にｉｌｌ胞からも（
、：ｏｌｏろＢと同様に、・〜イブリドーマ作製用親細
１１説が得られることヶ説明する。
方法は実施例１１Ｌはとんど同じで゛ある。即ち。
ノラノーマＭ２１’Ｙ予め培養し、６０時間後の増殖期
の別ｊ胞を集め、終濃度５μｇ／ｍτの突然変異誘起剤
のＭＮＮＧを力日え、６６時間培養した。ｃ死細胞：約
６５％生じろ）。次に血清７含まないＲＰｒＪ、 １１
６４０で乙回、遠心分離をすることにより洗し・。
の別ｊ胞を集め、終濃度５μｇ／ｍτの突然変異誘起剤
のＭＮＮＧを力日え、６６時間培養した。ｃ死細胞：約
６５％生じろ）。次に血清７含まないＲＰｒＪ、 １１
６４０で乙回、遠心分離をすることにより洗し・。
ＭＮ Ｎ Ｑ Ｙ除去した。生細胞ｖ ２Ｘ １０５ｃ
ｅｌｌｓ／ｒＬＬｌ（全量ｉＱｍＡ）に終濃度で２ＣＪ
μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含んでいる培地で調整
したのち、培養した。１週間以内に、９９５％以上の細
胞が死滅するが、さらに２週間以上この状態のまま培養
ケ続げた。１日に１回細胞の増殖有′＃、を顕微鏡下で
観察した。２０日間前後から徐々に増殖する細胞が現わ
れ、それから５日以内に急激に増殖して行つｆこ。
ｅｌｌｓ／ｒＬＬｌ（全量ｉＱｍＡ）に終濃度で２ＣＪ
μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含んでいる培地で調整
したのち、培養した。１週間以内に、９９５％以上の細
胞が死滅するが、さらに２週間以上この状態のまま培養
ケ続げた。１日に１回細胞の増殖有′＃、を顕微鏡下で
観察した。２０日間前後から徐々に増殖する細胞が現わ
れ、それから５日以内に急激に増殖して行つｆこ。
次に遠心分離で細胞を集め、さらに終濃度５０μｇ／ｒ
ｎｌの８−アザグアニン存在の培地に２Ｘ Ｉ Ｑ”
ｃｅ ＩＩｓ ７ｍ（全量１０ｍ１）宛懸濁し、約２週
間培養し、増殖してくる細胞乞８−アザグアニン耐性株
とした。
ｎｌの８−アザグアニン存在の培地に２Ｘ Ｉ Ｑ”
ｃｅ ＩＩｓ ７ｍ（全量１０ｍ１）宛懸濁し、約２週
間培養し、増殖してくる細胞乞８−アザグアニン耐性株
とした。
１−Ｉ Ａ Ｔセレクション及び（り返しのサブクロー
ニングの方法は実施例１に同じであつｆこ。
ニングの方法は実施例１に同じであつｆこ。
この方法により、メラノーマＭ２１の８−アザグアニン
耐性及びｌ−Ｉ Ａ ′ｒ培地で死滅する・・イブリド
ーマ作製用親細１抱として利用出来る株を６種（ＳＴＪ
Ｎ Ｎ−２２−１〜ＳＵＮ Ｎ−２２−６）得た。この
シリーズｉＭＥ Ｚシリーズとし１通常ＭＥ２と総称す
ることにする。
耐性及びｌ−Ｉ Ａ ′ｒ培地で死滅する・・イブリド
ーマ作製用親細１抱として利用出来る株を６種（ＳＴＪ
Ｎ Ｎ−２２−１〜ＳＵＮ Ｎ−２２−６）得た。この
シリーズｉＭＥ Ｚシリーズとし１通常ＭＥ２と総称す
ることにする。
上記の実施例で確立された親、１４ｉｔ 吃が、牌細胞
などのＢ細胞との融合によりノ・イブリドーマヲ作り。
などのＢ細胞との融合によりノ・イブリドーマヲ作り。
実際に免疫グロブリンを培養液中に分泌することを以下
の実験例により説明する。
の実験例により説明する。
実験例１：実施例１で作製したＭＥ ’＋とヒト肺がん
（Ａ５４９）で免疫されブこマウス牌細胞とのハイブリ
ドーマの作製および牟りローン糾１晧培養して憔備し、
予めＢ Ａ Ｌ Ｂ／ ｃ マウス（メス４週令）にヒ
ト肺がん（Ａ５４９）ケ荀週１回。
（Ａ５４９）で免疫されブこマウス牌細胞とのハイブリ
ドーマの作製および牟りローン糾１晧培養して憔備し、
予めＢ Ａ Ｌ Ｂ／ ｃ マウス（メス４週令）にヒ
ト肺がん（Ａ５４９）ケ荀週１回。
１０７細胞宛、４週接種し、それから得られｆこ牌１１
＃２細胞（５Ｘ１０７細吃）と乞ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ１０００ｆＯ光純薬）（４０％所用いて融合
さぜた。即ち各細胞乞遠心分離チューブに混合し遠心し
たのち上清乞すて、 Ｒ’ＰＭ、ｉ １６４０で４０％
にした１）ＥＧ１００Ｏ乞パンクになった細胞の上に約
Ｑ、５＋ｎ６加え、６分静置したのち ５ Ｑ Ｑｒｌ
）１１で６分間遠心分離し、そののち、培地乞ゆっくり
５ｍｌ程度加え。
＃２細胞（５Ｘ１０７細吃）と乞ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ１０００ｆＯ光純薬）（４０％所用いて融合
さぜた。即ち各細胞乞遠心分離チューブに混合し遠心し
たのち上清乞すて、 Ｒ’ＰＭ、ｉ １６４０で４０％
にした１）ＥＧ１００Ｏ乞パンクになった細胞の上に約
Ｑ、５＋ｎ６加え、６分静置したのち ５ Ｑ Ｑｒｌ
）１１で６分間遠心分離し、そののち、培地乞ゆっくり
５ｍｌ程度加え。
Ｐ＋度遠心分離し、上清をすてた。次に′ｒ −７５（
Ｆａｌｃｏｎ Ａ３０２４’）に、ゆるやかにすべての
細胞を移しとり、約４０ｒｄになるように培地を加え、
１夜培養する。次の日に、この培養液をすべて遠心チュ
ーブに細胞も含めて移し取り遠心分離を行い上清欠すて
た。次にＨＡ Ｔ培地乞４０ｒｎＡ加えよく攪拌したの
ち、９６穴マイクロ０プレートに約１００μｇ１ｗｅ
ｌ ｌ死力えて行った。この方法で４プレートが児全に
満された。この状態で１週間培養ずろと、１０％程度の
穴にコロニーが認められた。
Ｆａｌｃｏｎ Ａ３０２４’）に、ゆるやかにすべての
細胞を移しとり、約４０ｒｄになるように培地を加え、
１夜培養する。次の日に、この培養液をすべて遠心チュ
ーブに細胞も含めて移し取り遠心分離を行い上清欠すて
た。次にＨＡ Ｔ培地乞４０ｒｎＡ加えよく攪拌したの
ち、９６穴マイクロ０プレートに約１００μｇ１ｗｅ
ｌ ｌ死力えて行った。この方法で４プレートが児全に
満された。この状態で１週間培養ずろと、１０％程度の
穴にコロニーが認められた。
但し、この場合のコロニーは、従来のコロニーに比べる
と平面状に広がる特徴を持っていた。１週間以後より、
適宜ＨＴ 培地（ＨＡＴよりアミンプテリン７除いた培
地）を１滴（約２５〜６０μ４）各穴に力目えた。ある
相段ハイブリドーマが生育してから（約１０日〜１４日
目）、培養」二清χ用いＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ｂｉｎｄ
−８ＲＢＣ去で目的のヒト肺がん（Ａ５４９ ） に
対する単クローン性抗体を分泌しているかどうか欠検討
した。その結果４５クローン（７）つち４クローンがＡ
３４９に対しての単りローン性抗体乞分泌していること
が判った。そこで、４クローンの５もの１クローンにつ
いて、サブクローニングを行った。方法は実施例１のサ
ブクローニングと同じであった。結果として、４クロー
ンが生育し、すべて単クローン性抗体を分泌した。
と平面状に広がる特徴を持っていた。１週間以後より、
適宜ＨＴ 培地（ＨＡＴよりアミンプテリン７除いた培
地）を１滴（約２５〜６０μ４）各穴に力目えた。ある
相段ハイブリドーマが生育してから（約１０日〜１４日
目）、培養」二清χ用いＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ｂｉｎｄ
−８ＲＢＣ去で目的のヒト肺がん（Ａ５４９ ） に
対する単クローン性抗体を分泌しているかどうか欠検討
した。その結果４５クローン（７）つち４クローンがＡ
３４９に対しての単りローン性抗体乞分泌していること
が判った。そこで、４クローンの５もの１クローンにつ
いて、サブクローニングを行った。方法は実施例１のサ
ブクローニングと同じであった。結果として、４クロー
ンが生育し、すべて単クローン性抗体を分泌した。
これらの細胞の保存法は１通常と同様で、１０％ＤＭ８
０．１０％Ｌ”Ｃ８，３Ｑ％ 通常培地で、液体窒累存
在下又は約−８０°Ｃのフリーザー保存である。
０．１０％Ｌ”Ｃ８，３Ｑ％ 通常培地で、液体窒累存
在下又は約−８０°Ｃのフリーザー保存である。
実験例２：実験例っで得たハイブリドーマが分泌した免
疫グロブリンのクラス及びザブ クラス父オクタロニー法による倹約 １５％のアカロース溶液（００１％Ｎ ａ Ｎ ３乞含
む）をペトリ皿（内径５２ｍｍ）に５ ｍ、ｌ死力え、
約ろ０分間凝固ずろまで待った。次に第１図に示すよう
に凝固アガロースに穴ンあけ、各穴に下記衣１の各抗体
ｗ５ｍｌづつ力ａえ、中央の穴には実験例１で得ブこ・
ヘイブリドーマが分泌した単クローン性抗体（Ｊ、ＡＣ
ｌ、２．ろ、４の４種）父含む培養液（１０／ｌ＠濃縮
）乞１５μｅ加えた。この状態で２４時間故放置、生じ
ブこ阻止線をもって単クローン性のクラス乞決定しｆこ
。
疫グロブリンのクラス及びザブ クラス父オクタロニー法による倹約 １５％のアカロース溶液（００１％Ｎ ａ Ｎ ３乞含
む）をペトリ皿（内径５２ｍｍ）に５ ｍ、ｌ死力え、
約ろ０分間凝固ずろまで待った。次に第１図に示すよう
に凝固アガロースに穴ンあけ、各穴に下記衣１の各抗体
ｗ５ｍｌづつ力ａえ、中央の穴には実験例１で得ブこ・
ヘイブリドーマが分泌した単クローン性抗体（Ｊ、ＡＣ
ｌ、２．ろ、４の４種）父含む培養液（１０／ｌ＠濃縮
）乞１５μｅ加えた。この状態で２４時間故放置、生じ
ブこ阻止線をもって単クローン性のクラス乞決定しｆこ
。
１ ａｎ ｔ ｉ −ｈｕｍａｎ Ｉ ｇＭ
うさぎ （ヘキスト社製）２ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｙＧ うさぎ （７，）３ ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅ Ｉ、ｇＧ うさぎ （カペル社製）４
ａｎｔ ｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉ ｇＭ ヤ キ
（ヘキスト社製）５ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｊｇ
ヤギ（，１）（Ｇ十Ａ十Ｍ ） ６ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ、 ＩｇＡ うさぎ
（，１）この結果得られた準クローン性抗体（ＬＡＣ
１〜４）の４種類は、すべてろと７の間にのみ阻止線が
生じたことにより、マウス１ｇＧであることが判明し１
こ。
うさぎ （ヘキスト社製）２ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ
ＩｙＧ うさぎ （７，）３ ａｎｔｉ−ｍ
ｏｕｓｅ Ｉ、ｇＧ うさぎ （カペル社製）４
ａｎｔ ｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉ ｇＭ ヤ キ
（ヘキスト社製）５ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｊｇ
ヤギ（，１）（Ｇ十Ａ十Ｍ ） ６ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ、 ＩｇＡ うさぎ
（，１）この結果得られた準クローン性抗体（ＬＡＣ
１〜４）の４種類は、すべてろと７の間にのみ阻止線が
生じたことにより、マウス１ｇＧであることが判明し１
こ。
次に１νＧのサブクラス乞検討するために、上記と同様
の実験７行った。即ち、アガロース上に第２図の如く穴
乞あけ１から４までに各サブクラスの抗体（表２ ）
’ｒ５μ、ｄ宛入れ、中央の５ＫＬＡＣ：１〜４（１種
類づつ）の羊りローン性抗体ケ１５μｅ加え。
の実験７行った。即ち、アガロース上に第２図の如く穴
乞あけ１から４までに各サブクラスの抗体（表２ ）
’ｒ５μ、ｄ宛入れ、中央の５ＫＬＡＣ：１〜４（１種
類づつ）の羊りローン性抗体ケ１５μｅ加え。
合計４枚のベトＩＪ皿乞２４時間室温で放置した。
表２：使用した抗体
１ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ Ｉ、！９Ｇ１ う
さぎ （マイルレフ社製）２ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ
ＩｙＧ２ａ うさぎ （ｌｌ）３ ａｎｔｉ−
ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ うさぎ （１ｊ）これら
の結果より、ＬＡＣＩ〜４のすべての単クローン性抗体
は、２と５の間に阻止線が生じたことから、Ｉ、ｇＧ２
ａであることが判つ１こ。
さぎ （マイルレフ社製）２ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ
ＩｙＧ２ａ うさぎ （ｌｌ）３ ａｎｔｉ−
ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ うさぎ （１ｊ）これら
の結果より、ＬＡＣＩ〜４のすべての単クローン性抗体
は、２と５の間に阻止線が生じたことから、Ｉ、ｇＧ２
ａであることが判つ１こ。
また１分泌量も親細胞としてマウスのミエローマを使用
して作製したハイブリドーマが分泌する準クローン性抗
体と同程度（約２０μｇ ／ｒｎｌ ’）であった。さ
らに・ヘイブリドーマが分泌する抗体の牟−件はゲル電
気泳動法により確認した。
して作製したハイブリドーマが分泌する準クローン性抗
体と同程度（約２０μｇ ／ｒｎｌ ’）であった。さ
らに・ヘイブリドーマが分泌する抗体の牟−件はゲル電
気泳動法により確認した。
以上の結果で本発明のヒト親細胞（例として。
ＭＢｌ：ＳＵＮ Ｎ−２ｌ−１）は、情報原としてのＢ
細胞と融合すれば、情報通りの免疫グロブリンを分泌す
ることが証明された。
細胞と融合すれば、情報通りの免疫グロブリンを分泌す
ることが証明された。
次に、従来のハイブリドーマ用に作製されたヒトミエロ
ーマは、培養が困難で細胞の増殖が悪い又は不安定であ
ると云われているが、これに対して本発明の細胞ライン
は本来のかん細胞の性質である安定した増殖能２持つこ
とを証明する。
ーマは、培養が困難で細胞の増殖が悪い又は不安定であ
ると云われているが、これに対して本発明の細胞ライン
は本来のかん細胞の性質である安定した増殖能２持つこ
とを証明する。
実験例６：がん細胞と本発明細胞（ｌＶＩＥｉ）の増殖
ヒト メラノーマ（←：ｏｌｏ３３）、および（シｏ
ｌ ｏ３３から誘導されたハイブリドーマ作製用親細（
ＭＥｌ：ＳＵＮ Ｎ−２ｌ−１） ’＆各ｈ ２Ｘ Ｉ
Ｑ５ｃｅ ｌ １ｓ／ｍｌ （全ｔ Ｉ Ｑｍｌ）
用意゛シ１通常のＲＰＭ１１６４０＋１０ｃ！１０Ｆ”
Ｃ８に入れ培養した。ＭＥｌは同数の細胞を終濃度で２
０ μｇ／ｒｎｌ の８−アザグア ＝ ７ ’（Ｊ含
むｌ−１，ＰＩＶＩ Ｉ １６４０＋１０％ＦｅＳ［も
入れ培養した。経時的にサンプリングし、生細胞を算定
した。
ヒト メラノーマ（←：ｏｌｏ３３）、および（シｏ
ｌ ｏ３３から誘導されたハイブリドーマ作製用親細（
ＭＥｌ：ＳＵＮ Ｎ−２ｌ−１） ’＆各ｈ ２Ｘ Ｉ
Ｑ５ｃｅ ｌ １ｓ／ｍｌ （全ｔ Ｉ Ｑｍｌ）
用意゛シ１通常のＲＰＭ１１６４０＋１０ｃ！１０Ｆ”
Ｃ８に入れ培養した。ＭＥｌは同数の細胞を終濃度で２
０ μｇ／ｒｎｌ の８−アザグア ＝ ７ ’（Ｊ含
むｌ−１，ＰＩＶＩ Ｉ １６４０＋１０％ＦｅＳ［も
入れ培養した。経時的にサンプリングし、生細胞を算定
した。
結果を第６図に示した。この図に示すように。
ＭＥｌはヒト・メラノーマ（ｃｏｌｏろ８）と同様の増
殖曲線を示した。また、８−アザグアニン存在下でもほ
とんど増殖に差異が見られなかった。
殖曲線を示した。また、８−アザグアニン存在下でもほ
とんど増殖に差異が見られなかった。
ま７＝、図示していないが、実験例１で得られた単クロ
ーン性抗体産生ハイブリドーマ４クローンも親細胞（Ｍ
ＥにＳＵ’Ｎ Ｎ−２ｌ−１）と同様の増殖曲線を示し
た。
ーン性抗体産生ハイブリドーマ４クローンも親細胞（Ｍ
ＥにＳＵ’Ｎ Ｎ−２ｌ−１）と同様の増殖曲線を示し
た。
第１図および第２図は実験クリ２で使用したオフタロニ
ーを示す平面図である。 第３図はがん細胞と本発明の親細胞（ＭＥｌ）の増殖曲
線を示すグラフである。 特許出願人 ザントＩＪ−株式会社 禾／図 ４２図 茶３図 ＠ ： ｍｅ／６Ｌ／Ｉｏｒｎａ （ｃｏｌｏ３ａ）
揺蚤時間（ｈＦ） 手 続 補 正 書 昭和５８年１り月゛２−日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第 ７７４４ 号 ２、発明の名称 新規細胞ライン ６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後４
１６ 酸素 酵素１１ ５ Ｅ
Ｈ８Ｅ”ＭＳ ｌｌ ６ ＨＮＮＣＭＮＮＧジン １２ １ Ｔｒｙｐａｎｅｂｌｕｅ Ｔｒ
ｙｐａｎｅ ｂｌｕｅｌろ １１ ハイバリドー
マ イ・イノリド−７１４７５ｔｏｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｅｕｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ １６ ２ ヒト牌細胞 牌細胞１７ １６
１０μｍ０ １Ｑｍ、１３２０ ２０
５０ ＡＰ／ｒｎｌ ５．０ μＰ／ｍ、
ｌの５ ２ ｄｅｎｏｖｏ ４ｅ
ｎｏｖ。 ２０ ３ ５分１ ５分の１２０ １３
２０ μＰ／１ｎｌ ２０１ｔＰ／ｍｌに２
１ ７ 悪性無色腫 悪性黒色腫２７ １６
情報原 情報源２８ ８ 親細
親細胞以 上 ４３４−
ーを示す平面図である。 第３図はがん細胞と本発明の親細胞（ＭＥｌ）の増殖曲
線を示すグラフである。 特許出願人 ザントＩＪ−株式会社 禾／図 ４２図 茶３図 ＠ ： ｍｅ／６Ｌ／Ｉｏｒｎａ （ｃｏｌｏ３ａ）
揺蚤時間（ｈＦ） 手 続 補 正 書 昭和５８年１り月゛２−日 特許庁長官 若杉和夫 殿 １、事件の表示 昭和５８年特許願第 ７７４４ 号 ２、発明の名称 新規細胞ライン ６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁 行 補正前 補正後４
１６ 酸素 酵素１１ ５ Ｅ
Ｈ８Ｅ”ＭＳ ｌｌ ６ ＨＮＮＣＭＮＮＧジン １２ １ Ｔｒｙｐａｎｅｂｌｕｅ Ｔｒ
ｙｐａｎｅ ｂｌｕｅｌろ １１ ハイバリドー
マ イ・イノリド−７１４７５ｔｏｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｅｕｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ １６ ２ ヒト牌細胞 牌細胞１７ １６
１０μｍ０ １Ｑｍ、１３２０ ２０
５０ ＡＰ／ｒｎｌ ５．０ μＰ／ｍ、
ｌの５ ２ ｄｅｎｏｖｏ ４ｅ
ｎｏｖ。 ２０ ３ ５分１ ５分の１２０ １３
２０ μＰ／１ｎｌ ２０１ｔＰ／ｍｌに２
１ ７ 悪性無色腫 悪性黒色腫２７ １６
情報原 情報源２８ ８ 親細
親細胞以 上 ４３４−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）骨髄細胞由来の腫瘍細胞を除く腫瘍細胞から。 自然または人為的突然変異により誘導されｆこ雑種細胞
作製用新規細胞ライン。 ２）前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である特許請求の範囲
第１項記載の細胞ライン。 ５）前記ヒト１１市瘍細胞がヒト・メラノーマ細胞であ
る特許請求の範囲第２項記載の細胞ライン。 ４）前記ヒト メラノーマ細胞が１ｏｌｏ３８ またば
Ｍ、２１ である特許請求の範囲第６項記載の細胞ラ
イン。 ５）前記の自然または人為的突然変異πより誘導された
細胞がヒポキザンチンーグアニンフォスフオリボシルト
ランスフエラーゼ欠損性あるいはチミジンキナーゼ欠損
性である特許請求の範囲項から第４項のいずれかの項に
記載の細胞ライン。
Priority Applications (16)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58007744A JPS59132885A (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 新規細胞ライン |
| CA000445216A CA1214123A (en) | 1983-01-20 | 1984-01-13 | Cell lines for use in the preparation of hybridoma cells |
| IL70686A IL70686A (en) | 1983-01-20 | 1984-01-13 | Mutant tumor cell lines for use in the preparation of hybridomas and the hybridomas obtained therefrom |
| AU23510/84A AU569002B2 (en) | 1983-01-20 | 1984-01-16 | Novel cell lines for use in preparation of hybridoma cells |
| GB08401151A GB2134134B (en) | 1983-01-20 | 1984-01-17 | Novel cell lines for use in the preparation of hybridoma cells |
| HU84189A HU191984B (en) | 1983-01-20 | 1984-01-18 | Process for preparing hybridomes and by means thereof antibodies |
| EP84100548A EP0114670B1 (en) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | Novel cell lines for use in the preparation of hybridoma cells |
| DE8484100548T DE3485128D1 (de) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | Zellinien verwendbar zur herstellung von hybridomazellen. |
| ZA84415A ZA84415B (en) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | Cell lines for use in the preparation of hybridoma cells |
| KR1019840000221A KR930005453B1 (ko) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | 인간의 종양세포를 이용한 하이브리도마 세포의 제조방법 |
| FR8400828A FR2539759B1 (fr) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | Nouvelles lignees de cellules utilisables dans la preparation de cellules d'hybridome |
| AT84100548T ATE68012T1 (de) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | Zellinien verwendbar zur herstellung von hybridomazellen. |
| DK23384A DK23384A (da) | 1983-01-20 | 1984-01-19 | Cellelinier til anvendelse ved fremstilling af hybridomaceller |
| CH267/84A CH683526A5 (de) | 1983-01-20 | 1984-01-20 | Zellinie für die Herstellung von Antikörper bildenden Hybridomen, Verfahren zur Herstellung einer menschlichen Zellinie und Antikörper produzierendes Hybridom. |
| BE0/212255A BE898729A (fr) | 1983-01-20 | 1984-01-20 | Nouvelles lignees cellulaires se pretant a la preparation de cellules hybrides |
| US06/912,678 US5126253A (en) | 1983-01-20 | 1986-09-25 | Cell lines for use in the preparation of hybridoma cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58007744A JPS59132885A (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 新規細胞ライン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59132885A true JPS59132885A (ja) | 1984-07-31 |
Family
ID=11674202
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58007744A Pending JPS59132885A (ja) | 1983-01-20 | 1983-01-20 | 新規細胞ライン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59132885A (ja) |
| BE (1) | BE898729A (ja) |
| ZA (1) | ZA84415B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0368662A2 (en) | 1988-11-09 | 1990-05-16 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Parent cell lines for producing human hybridomas |
-
1983
- 1983-01-20 JP JP58007744A patent/JPS59132885A/ja active Pending
-
1984
- 1984-01-19 ZA ZA84415A patent/ZA84415B/xx unknown
- 1984-01-20 BE BE0/212255A patent/BE898729A/fr not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0368662A2 (en) | 1988-11-09 | 1990-05-16 | MITSUI TOATSU CHEMICALS, Inc. | Parent cell lines for producing human hybridomas |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA84415B (en) | 1984-09-26 |
| BE898729A (fr) | 1984-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4634664A (en) | Process for the production of human mono-clonal antibodies | |
| EP1064551B1 (en) | Development of human monoclonal antibodies and uses thereof | |
| JPS61128886A (ja) | ヒト体細胞ハイブリドセルラインおよびその製造法 | |
| HU190908B (en) | Process for preparing humane-humane hybridomes and - by means thereof - monoclonal antibodies | |
| JPS6317688A (ja) | ヒト―ヒトハイブリドーマの製造法 | |
| US5114847A (en) | Process for the production of permanently culturable animal and human cell lines and the use thereof | |
| US5126253A (en) | Cell lines for use in the preparation of hybridoma cells | |
| EP2009094B1 (en) | Fusion partner cells | |
| EP0057107A2 (en) | Method of manufacturing monoclonal antibodies and cells capable of manufacturing such antibodies | |
| EP1299524B1 (en) | Human myeloma cell line | |
| JPS59132885A (ja) | 新規細胞ライン | |
| JP4493882B2 (ja) | 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 | |
| JPS59132886A (ja) | 新規な雑種細胞 | |
| CS276448B6 (cs) | Způsob výroby permanentních buněčných lini-í živočišného i lidského původu | |
| JPS63185374A (ja) | ヒト−ヒトハイブリド−マ作製用親細胞株 | |
| JPH02283278A (ja) | 抗体産生細胞の製法及び抗体の製法 |