JPS59132886A - 新規な雑種細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な雑種細胞（）１イブリドーマ）に関する
。更に詳細には、骨髄細胞由来の腫瘍細胞を除く腫瘍細
胞、特にヒト腫瘍細胞から誘導された雑種細胞作製用新
規細胞ラインとヒトを含む動物細胞とを親細胞として融
合した新規雑種細胞（ハイブリドーマ）およびこの雑種
細胞を培養して抗体およびリンフ才力インのような有用
物質を生産する方法に関する。

本発明の雑種細胞は骨髄細胞由来の腫瘍ａｌ胞を除く腫
瘍細胞、特にヒト腫瘍細胞例えばヒトメラノーマから人
為的または自然突然変異によって誘導した新規細胞ライ
ンを親細胞とし、−カヒトを含む動物の細胞５例えば特
定σ）免疫原で感作された同種または異種の動物のＢ細
胞、を別σ）親細胞として両者を融合して作製でとる。

本発明σ）雑種細紐は単クローン性抗体、そり阿世有用
な生理活性を持つリンフ才力インσ）生産等に利用する
ことがでとる。

近年、生体外で増殖可能で且つｈ定の免疫原（抗原）に
対する抗体生産能を翁する炸独細胞（ハイブリドーマ）
を作製し、該ハイブリドーマか分泌する均一でイクめで
特定性の高い抗体（単クローン性抗体）を診断剤や治療
剤などにオリ用しようとする研究が広く行われ、免役学
、生物学、医学、桑学などの分野で太いに注目されてい
る。このようなハイブリドーマの作製方法およびハイブ
リドーマの利用概念を一般化させたのはケンブリッジ大
学ノＣｅａｓｅｒ　Ｍｉ　ｌ５ｔｅｉｎらであった（Ｍ
ｉｌｓｔｅｉｎＯ，ｅｔ、ａｌ　Ｎａｔｕｒｅ　２．５
６．４９５．１９７５）、彼らは５ａｌｋ　Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅのＬＰ、Ｏ５ａｃｋｓらから分与されたマウス
のミエローマ（ＰＢＫ株）からまず変異株（Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８　）を作製し、次にヒツジ赤血球の抗原で免
疫したマウス牌細胞とを融合せしめハイブリドーマを作
製した。そしてそのハイブリドーマが生体外で増殖可能
で面もヒツジ赤血球に対する単クローン性抗体（ｍｏｎ
ｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　＋以下ＭｏＡｂと
略す）を生産することを明らかにした。

この１９７５年のＭｉｌｓｔｅｉｎらの研究以降、多く
の研究者により特定の抗原に対する１ｖｉｏＡｂを生産
するハイブリドーマに関する研究がなされているが。

いずれもハイブリドーマ作製に用いられる親細胞はミエ
ローマ（骨髄種）細胞やＢ細胞由来の所謂骨頭細胞由来
の腫瘍細胞である。以下に一般化しているハイブリドー
マ作製に用いるために必要なミエローマなどの腫瘍細胞
の遺伝学的性質とハイブリドーマの原理について詳しく
述べてみる。

ハイブリドーマ作製に用いられる生体外で増殖可能な親
細胞（腫瘍細胞）はいずれもヒポキサンチンーグアニン
フオスフオリボシルトランスフエラーゼ（）ｌｙｐｏｘ
ａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｉ
ｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ以下ｆ−ＩＧＰＨＴ
と略す）欠損株あるいはチミジン以下−ゼ（Ｔｈｙｍｉ
ｄｉｎｅＫｉｎａｓｅ）欠損株であるっ両欠損株σ）遺
伝生化学的機構は原理的には同じであるのでここでは一
般的な）］ＧＰＦｆＴ欠損株について述べるっＨＧＰＲ
Ｔはすべての細胞σ）ＤＮＡ合成経路においてサルベー
ジ回路によるＤＮＡ合成を担当する１つの酵素である。

袷かえるとＨＧＰＦｆＴはプリン（ｐｕｒｉｎｅ　）や
ピリミジン（ｐｙｒｉｍｉａｉｎｅ　）を基質として行
われろＤＮＡ合成（ｄｅ　ｎｏｖｏ回路）が、なんらか
α）インヒビター（例えはアミノプテリン）で阻害され
た場合、そのｌ５Ｌｉ害を回避する系（ｒｅｓｃｕｅ　
ｐａｔｈｗａｙ　）として。

サルベージ回路が働くことによりＤＮＡ合成か行われ細
胞の生命は維持する役割をするっ従って。

ＨｅＰＥ（Ｔ欠損株はヒボキザンテ／−アミノプテリン
（ｄｅｎｏｖｏ回路のｌ害剤）−チミジン培地（以下Ｈ
ＡＴ培地と略す）では、培地中にアミノプテリンか存在
するため生存することはできないっ一方、ハイブリドー
マ作製に用いる仙方の親細胞例えば牌細胞（Ｂ＃１胞）
は、　ｄｅｎｏｖｏ回路とサルベージ回路の両方σ）Ｄ
ＮＡ合成経路を有しているっ従って、ＨＣ：ｒＰＲＴ欠
損株とσ）細胞融合で得られるハイブリドーマｖ−ｚ、
ＨＡＴ培地でアミノプテリンによるｄｅｎｏｖθ回路の
園害を受けてもヒポキサンチンを第１ｊ用して牌細胞山
来１７）サルベージ回路によりＤＮＡ合成か行われ増殖
ができる。即ちノ・イブリドーマは、ミエローマなどの
親細胞からの生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　）　　での増
殖能と牌細胞から０）サルベージ回路によるＤＮＡ合成
能とを合せて有し。

しかも牌ｍ胞（Ｂ細胞）からは特定Ｑ〕抗原に対する免
役グロブリン（抗体）を生産する情報を受は継いでいる
ため、ＨＡＴ培地で増殖でき免疫グロブリンを分泌する
っ ハイブリドーマ作製に必要な親株であろＨＧＰＥ（Ｔ欠
損株は、通常適当な突然変異処理により生じる８−アザ
グア＝　ン（８−ａｚａｇｕａｎｉｎｅ）削性でＨＡＴ
培地に増殖しえない性質を有する株として選択されるっ
該親細胞としては、ミエローマ細胞［＋病）Ｂ細胞など
骨髄由来の腫瘍細胞か用いられるσ）が定着化している
つじがし、ハイプリドーマ作製用として細胞ライン化で
きるこれらの腫瘍細胞は。

マウスあるいはラットか中心でヒトのミエローマの例は
極めて少ない、その原因としてヒト・ミエローマではＥ
（ＡＴ培地選択（以下！−ＩＡＴセレクションという）
がオリ用できるような細胞ライ／を作製することが困難
であること、また本来０）目的とするＲ細胞の増殖能が
弱いためハイプリドーマを作製したとしてもそのハイブ
リドーマは極めて増殖能が弱くしかも不安定で目的とす
る免役グロブリンσ）分泌量も少ないことなどかあげら
れる。

従って現状ではマウスやラットなどの所Ｂ１１．動物−
動物（ａｎｉｍａｌ　−ａｎｉｍａｌ　）ハイブリドー
マからの免疫グロプリ／のオリ用が令嬢なくされている
うしかし、動物−動物ハイプリドーマの生産する免疫グ
ロブリンはヒトにとっては異種動物の蛋白質であるため
ヒトに利用する場合その抗原性が重大な問題となる。こ
のため、ヒト−ヒト（ｈｕｍａｎ　−ｈｕｒｎａｎ、）
ハイブリドーマからの免疫グロブリンが期待されている
。また現在ヒトのミエローマからのハイブリドーマを大
量に培養することは既に述べたようにハイブリドーマの
不安定さの点で問題が多いつ 通常、ミエローマ細胞はｗ−ｉ−ｉ中にミエローマ蛋白
という免疫グロブリンを大量に分泌するが　−゛（但し
５分泌される免疫グロブリンはどの抗原に対する抗体で
あるか不明であり、特定の抗原に対する抗体を生産して
いるミエローマ細胞を選択することは不可能）、最近で
はミエローマ蛋白の存在がハイブリドーマのスクリーニ
ングや抗体σ）精製を複雑化することが判ってきたため
ミエローマ蛋白分泌型から非分泌型のミエローマ細胞が
用いられるようになっている。即ち、ハイブリドーマ作
製用σ）親細胞σ）性質として、生体外での増殖能力に
焦点が絞られてきている。

以上のような状況から、ハイブリドーマ作製用の親細胞
として増殖力が旺盛で細胞融合後にＨＡＴセレクション
ができるヒト由来の細胞ラインと生体外（ｉｎ　ｖｉｔ
ｒｏ　）で安定に免疫グロブリンを大量に生産するヒト
・ハイブリドーマの出現が期待されている。親細胞とし
てはミエローマやＢ細胞由来のがん化細胞）　（Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ（ＥＢＶ）による形質
転換細胞を含む）が定着化しているが、これらの親細胞
は上に述べたように種４の欠点を肩するう そこで本発明者らは、親細胞が生体外で増殖力旺盛であ
ればどのような細胞でもハイプリドーマ作製に使用でき
るという観点にたち、鋭意研究Ｑ〕結果従来の親細胞の
もつ欠点を袖なう全（新しいタイプのヒト細胞ラインを
確立するとともに該細胞ラインが生体外で安定に抗体を
生産するハイブリドーマの親、細胞として実用可能であ
ることを明らかにした。本発明における新規な細胞ライ
ンは骨ａＪカ細胞やＢ細胞とは異なる由来のがん化細胞
。

皮）かん（メラノーマ）、肝がん、胃がん、腸がん、肺
がん、乳がん、ミニロイドなどの腫瘍細胞特に好しくは
ヒト・メラノーマを自然もしくは人為的突然変異によっ
て誘導した株（具体的にハＩ）ＮＡ合成経路に関与する
酵素群の１つの生産を欠く遺伝欠損株）である、これら
の株は従来の骨髄由来の腫瘍細胞からの細胞ラインに比
べて、生体外での増殖力が強く、さらに例えば抗体産生
細胞（Ｂ細胞）との融合によって得られる本発明のハイ
ブリドーマは親細胞と同様の強い増殖能をもちしかも安
定に免疫グロブリンを分泌することができる。

以上のように本発明のハイプリドーマ作製に用いられる
親細胞である腫瘍細胞ライ／、特にヒト腫瘍細胞ライン
は、ある特定の抗原で感作された異種動物からの牌細胞
（Ｂ細胞）との融合による特定の抗体を生産するハイブ
リドーマの作製に非常に不用であるばかりでなく、こσ
）細胞ラインがヒト由来の細胞であるため本発明に含ま
れるハイブリドーマのうちヒト−ヒトハイプリドーマの
作製にも利用できる。この場合、一方の親細胞として感
作された細胞にはヒトの末梢血、へんとう腺。

リンパ節、牌臓などからのＢ細胞を用いればよい。

また、ヒト・ヒトハイプリドーマから分泌される免疫グ
ロブリンはヒトの蛋白質であるためヒトに利用する場合
にも抗原性の問題はない。さらに本発明のハイプリドー
マを作製するための細胞ラインを用いれは、ガンマ型イ
ンターフェロンなどのリンフ才力インを生産できるヒト
のＴ−細胞系の細胞を親細胞として本発明のハイブリド
ーマ（Ｔ−ｃｅｌ　ｌ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　）を作製
することも可能である。

こσ）ように本発明における細胞ラインは幅広い利用が
可能であり１種々のハイブリドーマを作製できる。

以下１本発明のハイブリドーマの作製並びにこのハイブ
リドーマ＠１ｖＩＪからの単クローン性抗体（ＭｏＡｂ
）の分離について説明する。説明を簡単にするために、
ヒト腫瘍細胞およびヒト牌細胞を用いるハイブリドーマ
の作製法を開示するが、本発明はこれに限定されるもの
ではない。

以下に、ハイプリドーマ作製用の親細胞ラインの作製に
ついて説明する。

まずハイプリドーマ作製に使用可能なヒト親細胞を得る
ために必要な第一ステップは、）３ＡＴセレクシヨンが
利用できるＤＮＡ合成経路におけるサルベージ回路の酵
素（）ＩＧＰＲＴ）欠損株の作製でちる。１つは直接適
当な濃度の８−アザグアニン（８−Ａｚａｇｕａｎｉｎ
ｅ）を細胞培養液に添加し、生じる８−アザグアニン耐
性株の出現をもって第１ステツプの終了とする。第１ス
テツプのもう１つの方法は紫外線か突然変異誘起剤たと
えばエチルメタンスルホネート、（ＥＭＳ）Ｎ−メチル
−Ｎ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）
などを癌細胞の種類に応じ、適当量、照射（ＧＬ−１５
゜直下３０ｃｒｎ１５秒〜１０分間）又は添加（０，０
５〜ｂ 培地に細胞をラリす。突然変異誘起剤は、不安定なもの
が多いが、これで数時間から６日間培養し、処理後は無
血清培地にてよく洗い、８−アザグアニン含有培地に細
胞をうりす。この場合も８−アザグアニン耐性株の出現
をもって第１ステツプの終了とする。

次にＨＡＴセレクションが利用出来るかを検討するっ細
胞を培養したのち、遠心分離にて培地を除去し）３ＡＴ
培地で２回洗い同じＨＡＴ培地におきかえる（１０７ａ
）。５日間観察を行ない生死の判定をする。判定はトリ
バンブルー（Ｔｒｙｐａｎｅｂｌｕｅ）染色で行なう。

この方法で大半の細胞が死んだ場合は、ＨＡＴ培地にお
きかえる前の細胞（１０／ｍｌｌ＞をフィーダーレイヤ
（Ｆｅｐｐｅｒ　１ａｙｅｒ）細胞（牌細胞など）とを
用意し９６穴マイクロウｘル（Ｃｏ５ｔａｒ　Ａ３５９
６　）の１六当りフィーダーレイアー細胞を１０　まい
た上に処理細胞が確率でおよそ０．１個になるようにつ
まり一穴肖り処理細胞力−１個より多くならないように
まき、約１週間培養する。生じたクローンは順次数をふ
やし１０５／ｍｌ程度に生育した時点で再度ＨＡＴ培地
におきかえ完全拠細側の死滅するのを確認し第２ステツ
プσ）終了とする。但しこの第２ステツプは最低２回す
る方が望ましい、又８−アザグアニンは細胞ラインが確
立するまでは常時培地に添加しておかねはならない。確
立後も適宜加える方が望ましい。

通常の培地は、変異させる前に使用していた培地で良く
、又、ハイブリドーマの親細胞として利用する場合もな
んら特別な組成の培地を用意する必要はない。

細胞の保存も通常法で良い、即ち、１０％ＦＣ８（ｆｅ
ｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ）、　１０　％ＤＭＳＯ
（ｄｉｍｅｒ　−ｈｙｌ　５ｕｌｆｏｘｉｄｅ　）を培
地に加え、液体窒素中又は−５ＯＣ程度のフリーザーに
保存すれば問題はない。

次にこの細胞ラインを親細胞として使用する本発明のハ
イプリドーマ作製法を説明する。

上記細胞ラインを用いてのハイプリドーマ作製は、培地
として、イーグルのＭ’　Ｅ　Ｍ　、ダルベツコの改良
ＭＥＭ、ＲＰＭＩ　１６４０などの通常よく使用されて
いるものに１０　％Ｇ　Ｓ　（ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ　
）又は５％ＦＯ８＋５チａＳ、あるいは１０チＦ’　Ｏ
Ｓを加える。親細胞の通常の維持は、上記のいずれでも
良いが、ハイプリドーマ作製には１３％Ｆｃｓが望まし
い。

まず親細胞であるヒト腫瘍細胞と牌細胞とを１：５の比
率で用意する。融合剤としては、Ｉ（ＶＪ（Ｈｐｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ　ｖｉｒｕｓ　ｏｆ　Ｊａｐａ
ｎ　　＋別名５ｅｎｄａｉ　ｖｉｒｕｓ）　ｒポリエチ
Ｖ７グリコー／Ｌ／（ＰＥＧ）などを使用する。特にＰ
ＥＣ１０００の６０％〜５０チ程度が良い。融合剤の）
ＩＡＴセレクションの方法は、既に一般化されているの
で省１＠する。生じるハイブリドーマのスクリーニング
法は、主に培養上清を用い、５ＰＡ−ｂｉｎｄ−３ＲＢ
Ｃ法（ＳＰＡ：５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒ
ｅｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　＋　Ｓ　ＲＢ　Ｃ：５ｈ
ｅｅｐ　Ｆ（ｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ］Ｉ　：　　免役
実験操作法■Ｐ２３７５）、ＥＬＩＳＡ法（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ法）を用いて免疫グロブリンを分泌しているハイ
ブリトーマのクローンをひろいあげた。クローンは徐々
にふやし、１０”／酎に達した時点でサブクローニング
を行なう。続いてハイブリドーマの単一性を吟味するた
め、９６穴のマイクロウェルにフィーダーレイア−（ｆ
ｅｅｄｅｒ　１ａｚｅｒ　）として正常な牌細胞をおよ
そ１０　　ｃｅｌｌ　／ｗｅｌｌまいた上にハイブリド
ーマを一穴に１個より多くならないように（−穴平均確
率として０．１個）まき、約１週間培養後生育してくる
クローンについて抗体産生能を調べる。この手順をくり
返すことにより単一性のハイブリドーマを得る。

ハイブリドーマの分泌する免疫グロブリンのクラス、サ
ブクラス分けの方法はアガロースを用いて行なうオフタ
ロニー法（ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎ’ｙ　）で簡単に識別
できる。即ち、予想される抗グロブリン抗体を適宜用意
し、２４時間後の阻止線をもって判定する（実施例６を
参照）。

上述の如く本発明はハイブリドーマ作製に際し。

最も重要な親細胞が、従来ミエローマあるいはＢ−細胞
由来の腫瘍細胞でないと利用出来ないとされていたＭｉ
ｌｓｔｅｉｎからの定説をくつ返すものであるっ即ち、
生体外で増殖可能な腫瘍細胞であれハイブリドーマ作製
用の親細胞として用いることを実証したものであるっさ
らに本発明のヒト−ヒトハイブリドーマは１本発明にお
いて従来のミエローマより、簡単な培養でしかも安定性
、増殖性とも上まわる親細胞としての確立されたヒト腫
瘍細胞ラインから作製される。

以下の実施例により１本発明のハイブリドーマの作製方
法を説明し、更に作製されたハイブリドーマによって生
産される抗体の同定を実施例により説明する。

実施例１　ヒト腫瘍細胞Ｃｏ１ｏ　３８からハイブリド
ーマ作製用親細胞の調製法 （その１） 以下の実験の培養はすべて００２５％、空気９５チ、湿
度約１００％の条件下、３７Ｃで行った。゛ヒト悪性黒
色腫Ｃｏ１ｏ　３８を予じめ培養し、２〜６日目の特に
増殖期にある細胞を用意した。これに終濃度０．０５〜
１０μｂ個の突然変異誘起剤ＭＮＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ
′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン：シグマ社製）を
加え、約２０ｆＯの死細胞力弛現する時間および儂度を
設定した（５μ９−／成：　３６時間）。次に血清を含
まないＢＰ＆ｉ１１６４０　（日永製薬製）で６回遠心
分離をすることにより洗い、ＭＮＮｅを除去した後、終
濃度１〜５０μｂ包σ）８−アザグアニン存在の培地に
２Ｘ　１０”　Ｃｅ１ｌｓ／ｍ　（全量１０尼）σ）Ｍ
ＮＮＧ処理細胞を加えた。１週間以内にほとんど全ての
細胞（９９％以上）が死ぬ濃度（２０μ９−／ｍｌ；　
）を設定し、これを少くとも２週間以上、このま瓦の状
態で毎日観察しながら、細胞の増殖の有無を検討したつ
約２週間経過より、急激に増殖を開始しはじめたので次
に遠心分離で細胞を集め、更に終濃度５０　、ａｆ／ｌ
ｎ１．の８−アザグアニン存在下に加えた（第１回目処
理同様２　Ｘ　１０”　ｃｅｌｌｓ　／ｒｒｔ１３　）
。

この状態で更に２週間培養し、増殖してくる細胞を８−
アザグアニン耐性株とした。

ＨＡＴセレクションが利用できるかを検討するため、８
−アザグアニン存在下の細胞を血清を含まない培地で６
回遠心分離をくり返して洗い。

ＨＡＴ培地（ＲＰＭ１１６４０培地、１０係ＦＣ８ＣＣ
３Ｌ社、オーストラリア製）に終濃度でヒポキサンチン
１０−４Ｍ、アミノプテリン４ＸＩＤ−７゜チミジン１
．６Ｘ１０−５Ｍを加える）に移したつ細胞数は１０　
　ｃｐ、ｌ　Ｉｓ　／ｍ！、　（全％−１０ｐＬ　）が
適量であった。

５日間観察を行い生死の判定をした。判定はトソバ／ブ
ルー染色で行う。この方法で細胞が完全に死んだ場合で
も、さらにＨＡＴにおきかえる前の同じ８−アザグアニ
ン処理細胞を１０　ＣＦ！ＩＩｓ／Ｍとフィーダーレイ
アー細胞（牌細胞）とを用意し、９６穴マイクロプレー
トク）１大当り供給細胞を１０５まいた上に処理細胞が
確率でおよそ０．１個になるように１き、約１週間培養
したつ生じたクローン（９６大中、６個）は順次数をふ
やし、さらに１〜２週間培養後１０５ＣｅｌｌＳ／ｒｎ
ｌ程度に生育した時点で丙度全てのクローンについてＨ
ＡＴセレクションを行った。この方法では上記６クロー
ング）使用した細胞はすべて５日以内に死滅した。

しかし、６クローンσ）うち、１クローンは更にもう一
度９６穴マイクロプレートに上記方法で−１：ぎ。

更にサブクローニングビ行って８クローノを得たつこれ
らのクローンも同様に順次孔１胞数をふやし、それぞれ
の細胞がＨＡＴ培地で完全に死滅することを確認したつ こσ）ようにしてイｑられたヒトｒ連＝；＋、１月１ｇ
Ｊ　（ヒト悪性黒色腫）の８−アサグアニン剛性、）Ｉ
ＡＴセレクションがかかる細胞をＭＥＩシリーズと名付
け。

通常ＭＥ１ということにするう 細胞は１０受ＦＣ８，１０φＤＭＳＯ（ジメチルスルホ
オキシド）および８０チ通常培地組成にて液体窒素下ま
たは一８０Ｃ程度のフリーザー中で保存し六−０ 実施例２　ヒト腫瘍細胞ｃｏｌｏ　３３からハイブリこ
の実施例では突然変異誘起剤のかわりに紫外線による変
異を利用する方法を説明する。増殖期にあるヒト、＝Ｂ
性黒色腫（ｃｏｌｏ　３　Ｂ　）を１０ｃｙ＋＋径のシ
ャーレに２　Ｘ　１　Ｑ５ｃｅｌｌｓ／Ｍ　（全ｉ１０
ｍＡ）入れ。

紫外線照射（ナショナルＧＬ−３５節下３０ｍ）を約５
分間行なったのち、これに８−アザグアニンを終濃度２
０μ汁乍添加した。約１週間で９９５゜係以上の細胞が
死滅するか、さらに約２週間この状態で培養を続け、毎
日観察するっ８−アザグアニンを最初に添付してから約
６週間口より急激に細胞数が増加し、均一な浮遊細胞に
なった。遠心分離で細胞を集め次に終濃度５０”ｐｐ／
ｍｇの８−アザグアニン存在下に、この細胞（２Ｘ　１
０　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を加えた。こσ）状態でさらに
２週間培養し。

増夕直して来る細胞を８−アザグアニン耐性株とした。

以下）（ＡＴセレクションの方法は実２６例１に同じで
あるっこＱ）方法でＭＥＩシリーズの細胞が６柚得られ
た。実施例１と比較すると８−アザグアニン耐性株が出
現する確率が約５分１程度に低下したつ但し８−アザグ
アニン耐性株が得られると以後の装作ＨＡＴセレクショ
ンがかかる確率（ま同じであった。

実施例ろ　ヒト腫瘍細胞ｃｏｌｏ　３８からハイブリこ
の実施例で（゛よ直接８−アザグアニンを培地に添加し
耐性株を作製する方法を説明する。

増殖期Ｑ）ヒト悪性黒色腫（ｃｏｌｏ３８）２Ｘ１０５
ｃｅＩ　１　ｓ　／ｍＬ（全量Ｉ　Ｑ　ｒｒｕ３　）に
終濃度５μｆ／ｒｔｔで５日間培養したθ−）ち、さら
に終一度で２０μＦ／／ＩＩＬｌ＝なるように８−アザ
グアニンを添加したつ最初から１０日の期間に、はとん
どずべての細胞が死滅したか少なくとも、さらに２０日
程度このままの状態で培養を続げた。増殖が認められる
確率は低かった。

この場合、１８フラスコ中１フラスコに急激に増殖する
細胞を認めることか出来たつ次にこの細胞ノ１　？Ａを
さらに終濃度５０μ！−／ｍｅ　８−アザグアニン存在
下で２週間培養し１通常の増殖能を持った細胞の出現を
持って８−アザグアニン耐性株とした。

）ＩＡＴセレクションの方法は実施例１に同じであった
っこり）方法によりＭＥｌシリーズの細胞が６携得られ
た。

以上、ヒト悪性黒色腫（メラノーマｃｏｌｏ　３８　）
より６つの方法で１７柚σ）ＭＥＩシリーズの細胞５と ライン（ＳＵＮＮ−２１−１へ５ＵＮＮ２１−１７）を
得たつ 実施例４　ヒＮ厘掲細胞（Ｍ２１）からハイブリこの実
施例では他の稠類のヒトｊ連掲細胞からもｃｏｌｏ　３
８と同様に、ハイブリドーマ作製用親細胞が得られろこ
とを説明するっ 方法は実施例１にほとんど同じであるっ即ち、メラノー
マＭ２１を予め培養し６０時間後の増殖期の細胞を集め
、終濃度５μ於／ｍ／！の突然変異誘起剤のＭＮＮＧを
加え６６時間培養した。（死細胞：約６５％生じる）次
に血清を含まないＲＰＭ工１６４０で６回、遠心分離を
することにより洗いＭＮＮＧを除去した。生細胞を２Ｘ
　１０　ｃｅｌｌｓ／ｍｌｌ　（全量１０ｄ）に終濃度
で２０　、αｙ−／ｍＡグ）８−アザグアニンを含んで
いろ培地で調整したのち、培養したっ　１過間以内に９
９，５係以上の卸ｊ胞か死滅するかさらに２週間以上こ
σ）状態のまま培養を続けた。

１日に１回細胞の増殖有無を顕微鏡下で観察した。

２０日間前後から徐々に増焔する細胞が現われ。

それから５日以内に急厳に増焔して行った。次に遠心分
離で細胞を集め、さらに終濃度５０．α７／ｒｒｄ３の
８−アザグアニン存在σ）培地に２Ｘ１０　ｃｅｌｌｓ
／Ｎ（全量１０ｉ１宛恕〜し、約２週間培養し、増殖し
てくる細胞を８−アザグアニン耐性株としたっＨＡＴセ
レクション及びくり返しのサブクローニングの方法は実
施例１と同じであった。

この方法によりメラノーマＭ２１の８−アザグアニン耐
性及びＨＡＴ培地で死滅するハイプリドーマ作製用親細
胞として利用出来る株を６棟（５ＩＪＮ５ν Ｎ−２２−１〜ＳＵＮ　Ｎ２２−６）得た。このシリー
ズをＭＥ２シリーズとし１通常ＭＥ２と総称することに
する。

上記の実施例で確立された親細胞が、牌細胞などのＢ細
胞との融合によりハイブリドーマを作り、実際に免疫グ
ロブリンを培養液中に分泌することを以下の実施例によ
り説明する。

実施例５　実施例１で作製したＭＥｌとヒト肺がん（Ａ
５４９）で免疫されたマウス牌 細胞とのハイブリドーマの（’ｌおよびｉｉＴＩＩｊｌ
）Ｍ　Ｅ’１　シリ−／Ｃ”　＆）内ＳＵＮ　Ｎ−２１
−１ヲ１０７細側培養して準備し、予めＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス（メス４週合）にヒト肺がん（Ａ５４９）を毎週１
回、１０細胞宛４週接棟し、それから得られたｐｓＰｉ
ＩＪ４細胞（５Ｘ１０７細艙）とをポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ１０００和光純薬）（４０チ）を用いて融
合させたつ即ち各細胞を遠心分離チューブに混合し遠心
したのち上清をすて、ＲＰＭＬ１６４０で４０受にした
ＰＥＧ１０００をパックになった糸ｈｉ胞σ）上に約０
．５　ｒｎｌ加え、６分静置したのち、５００ｒｐｌｎ
で６分間遠心分離し、そのうち、培地をゆっくり５ｍｌ
程度加え、再度遠心分離し、上？胃をすてたつ次にＴ　
　７５　（Ｆ”ａｌｃｏｎｙ％３　Ｄ　２４　）に、ゆ
るやかにすべてグ）細胞を移しとり、約４ＯＮになるよ
うに培地を加え、１夜培養する。次σ）日に、この培養
液をずべて遠心チューブに細胞も含めて移し取り遠心分
甜を行ない上ｍをすてたつ次にＨＡＴ培地を４０、ｕ加
えよくかくはんした（７）ち、９６穴マイクロプレート
に約１００μＬｏｗｅｌｌ宛那えて行ったっこの方法で
４プレートが見金に満たされた。

この状態で１週間培養すると、１０飴札度の穴にコロニ
ーか認められたつ但し、この場合のコロニーは、従来０
）コロニーに比べると平面状に広がる特徴を持っていた
。１週間以後より１適宜Ｆ（Ｔ培地（ＨＡ　’ｒよりア
ミノプテリンを除いた培地）を１滴（約２５〜３’Ｏｐ
Ｌ）各穴に加えた。ある程度ハイプリドーマが生育して
から（約１０日〜１４日目）％培養上清を用イＰｒｏｔ
ｅｉｎ　Ａ　−ｂｉｎｄ　−５ＲＢＣ法で目的のヒト肺
がん（Ａ５４９）に対する単クローン性抗体を分泌して
いるかどうかを検討した。

その結果４５クローンのうち４クローンがＡ３４９に対
しての単クローン性抗体を分泌していることが判ったっ
そこで４クローンのうちの１クローンについてサブクロ
ーニングを行なった。方法は実施例１のサブクローニン
グと同じであったっ結果として、４クローンが生育しす
べて単クローン性抗体を分泌した。

これらの細胞の保存法は１通常と同様で５１０％ＤＭＳ
Ｏ１０チＦＣ８−８０φ通常培地で液体窒素存在下又は
約−８０ｉＣのフリーザー保存である。

実験例１　実施例５で得たハイブリドーマが分泌した免
疫グロブリンのクラス及びサブ １５％のアガロース溶液（０，０１係Ｎａ　Ｎ　３を含
む）をぺ）　ＩＪ皿（内径５２關）に５Ｍ宛死力、約６
０分間凝固するまで待つたつ次に第１図に示すように凝
固アガロースに穴をあけ、各穴に下記表１の各抗体を５
μｔづつ加え、中央の穴には実験例１で得たハイブリド
ーマが分泌した単クローン性抗体（ＬＡＣｌ、２，３．
４の４＠）を含む培養液（１０倍濃縮）を１５μを加え
た。この状態で２４時間放置し、生じた阻止線をもって
単クローン性のクラスを決定した。

煮　抗体及び由来 １　　　ａｎｔｉ　−ｈｕｍａｎ　　ＩｇＭ　　　うさ
ぎ（ヘキスト社製）２　　ａｎｔｉ　−ｈｕｍａｎ　　
ＩｇＧ　　うさぎ（〃）３　　ａｎｔｉ　−ｍｏｕｓｅ
　　ＩｇＧ　　うさぎ（カペル社製）４　　ａｎｔｉ　
−ｍｏｕｓｅ　　ＩｇＭ　　ヤ　ギ（ヘキスト社製）５
　　　ａｎｔｉ　−ｈｕｍａｎ　　Ｉｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）
ヤギ（〃）６　　ａｎｔｉ　−ｈｕｍａｎ　ＩｇＡ　　
　うさぎ（〃）この結果、得られた単クローン性抗体（
ＬＡＣ１〜４）の４種類は、すべて６と７の間にのみ。

阻止線が生じたことより、マウスＩｇＧであることが判
明した。

次にＩｇＧのサブクラスを検討するために、上記と同様
の実験を行なったっ即ち、アガロース上に第２図の如（
穴をあけ１から４までに各サブクラスの抗体（表２）を
５μを宛入れ、゛中央の５ＫＬＡ０１〜４（１棟類づつ
）の単クローン性抗体を１５μを加え、合計４枚のペト
リ皿を２４時間室温で放置したつ 表２＝使用した抗体 應　抗体及び由来 １　　ａｎｔｉ　−ｍｏｕｓｐ、　ＩｇＧ　１　　　う
さぎ（マイルス社製）２　　ａｎｔｉ　−ｍｏｕｓｅ　
ＩｇＧ２ａ　　うさぎ（〃）３　　ａｎｔｉ　−ｍｏｕ
ｓｅ　ＩｇＧ２ｂ　　うぎぎ（〃）４　　ａｎｔｉ　−
ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ３　　　うさぎ（〃）これらの結果
より、ＬＡＣ１〜４のすべての単クローン性抗体は２と
５の間に１泪止線が生じたことからＩｇＧ２ａであるこ
とが判った。

また分泌量も親細胞としてマウスのミエローマを使用し
て作製したハイブリドーマが分泌する単クローン性抗体
と同程度（約３０　’、ｕ汁笛）であったっさらにハイ
ブリドーマが分泌する抗体の単一性はゲル電気泳動法に
より確認した。

以上り）結果で本発明のヒト親細胞（例としてＭＥｌ　
：　ＳＵＮ　Ｎ−２ｌ−１）は、情報片としてのＢ細胞
と融合すれば、情報通りの免疫グロブリンを分泌するこ
とが証明されたつ 次に、従来のハイブリドーマ用に作製されたヒトミエロ
ーマは、培養が困難で細胞の増夕（αが惑い又は不安定
であると云われているが、これに対し、て本発明の細胞
ラインは本来のかん細胞の性質である安定した増殖能を
持つことを証明する。

実験例２　がん細胞と本発明親細胞（ＭＥｌ）のヒト・
メラノーマ（Ｇｏ１ｏ３８）、およびＣｏｌ。

６８からｕ４されたハイブリドーマ作製用親細胞（ＭＥ
　１　：　５ＵＩｉ　Ｎ−２１−１）を各々２Ｘ１０”
ｃｅ　ｌ　１　ｓ　／ｍｌ：　（全量１０ｄ）用意し１
通常のＲＰＭ１１６４０＋１０係ＦＧＳ　に入れ培養し
たつＭＥｌは同数の細胞を終隈度で２０μｇ−／祷の８
−アザグアニンを含むＲＰＭＬ　１６４０＋１０φＦ’
Ｃ８にも入れ培養したつ経済的にサンプリングし、生細
胞を算定した。

結果を第３図に示した。この図に示すようにＭＥｌはヒ
ト・メラノーマ（Ｃｏｌｏ３８）と同様の増殖曲線を示
した。また、８−アザグアニン存在下でもほとんど増殖
に差異が見られなかった。

また１図示していないが、実施例５で得られた単クロー
ン性抗体産生ハイプリ、ドーマ４クローンも親細胞（Ｍ
Ｅｌ　：ＳＵＮ　　Ｎ−２ｌ−１）と同様の増殖曲線を
示した。　　“

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は実験例１で使用したオフタロニー
を示す平面図である。 第６図はがん細胞と本発明のハイブリドーマ作製のため
の親細胞（ＭＥｌ）の増殖曲線を示すグラフである。 特許出願人　　サントリー株式会社 ＃／凹 第２図 茎３図 ＊　　：　　ｔｌ）ｅ（ｌｏ−ｎｏｍａ　（ｃｏｔｏ３
θ）ｏ；ＭＦ：ｌ 浩　香　Ｉ１％　ル’ｉ　　（ｈヒ９ 手続補正書 昭和５８年１１月　２日 ２、発明の名称 新規な雑種細胞 ６、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６、補正の内容 （１）　　明細書の記載を下記の通り訂正する。 頁　　　　行　　　　補正前　　　　　　補正後６　　
１６　　特定性　　　　　　特異性／）　　　　　１ｄ
ｅｎｏｖｏ　　　　　　ｄｅｎｏｖ。 １０　　　４　　　遺伝欠損株　　　　遺伝的欠損株１
７　　２０　　　ＸＩＱ５Ｃｅｌｌｓ　　　ｘｉＤ５ｃ
ｅｌｌｓ２１　　１８　　２０ｔｔ’ｉ／ｍ、ｌなる　
　２０　μＰ／ｍ、ｌになる２６　１４　２０日間　　
　　　２０日間１３　　　８　　　（Ｉ　Ｄ５／ｍｘ）
ｔ　　（１０”／ｍｌ）と２１　１０　　装作　　　　
　　　操作である２　２　　　５　　５０　μｆ／−／
ｒｎ１．　　　５０　ｔ４−／ｍｌの２４　　１７　　
　ＢＡＬＢ／ＣＢＡＬＢ／ｃ２９　　４　　情報源　　
　　　　情報渾身　　　上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）骨髄細胞由来の腫瘍細胞を除く腫瘍細胞から自然ま
   たは人為的突然変異により誘導された細胞ラインとヒト
   を含む動物からの細胞との融合により誘導された雑種細
   胞っ ２）前記細胞ラインがヒポキサンチンーグアニンフオス
   フオリボシルトランスフエラーゼ欠損性あるいはチミジ
   ンキナーゼ欠損性であることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載Ｑ）雑種細胞っ６）前記細胞ラインがヒト
   腫瘍細胞から誘導さｔたことを特徴とする特許請求の範
   囲第１項または第２項のいずれかに記載の雑種細胞っ４
   ）前記ヒト腫瘍細胞がヒト・メラノーマ細胞であること
   を特徴とする特許請求の範囲第６項記載のＳ種細胞。 ５）前記ヒト・メラノーマ細胞がＧｏｌｏ３３またはＭ
   ２１であることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
   の雑種細胞。 ６）ヒトを含む動物からの細胞が免疫原によって感作さ
   れたＢ細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項から第５項のいずれかに記載の雑種細胞っ ７）ヒトを含む動物からの細胞がＴ細胞であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項から第５項Ωいずれかに
   記載の雑種細胞。 ８）骨髄細胞由来の腫瘍細胞を除ぐ腫瘍細胞から、自然
   または人為的突然変異により誘導された細胞ラインとヒ
   トを含む動物からの細胞との融合により誘導された雑種
   細胞を培養して抗体およびリンフ才力インのような有用
   物質を生産する方法。