JPS61128886A - ヒト体細胞ハイブリドセルラインおよびその製造法 - Google Patents

ヒト体細胞ハイブリドセルラインおよびその製造法

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JPS61128886A
JPS61128886A JP60219985A JP21998585A JPS61128886A JP S61128886 A JPS61128886 A JP S61128886A JP 60219985 A JP60219985 A JP 60219985A JP 21998585 A JP21998585 A JP 21998585A JP S61128886 A JPS61128886 A JP S61128886A
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cell line
cell
cells
hybrid
human
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JP60219985A
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ダヌタ　コズボー
カーロ　エム．クロース
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Wistar Institute of Anatomy and Biology
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Wistar Institute of Anatomy and Biology
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 π明の分野 本発明は正常Ｂリンパ細胞を含む抗体産生性細胞と高度
の融合頻度を示すヒト体細胞ハイブリドに関する。本発
明は詳細には、ヒトリンパ芽球系細胞、（１■ｐＯｂｌ
ａＳｔＯｉｄ　ｃｅｌｌ　）とヒト形質細胞腫細胞（ｐ
ｌａｓｍａｃｙｔＯｍａ　ｃｅｌｌ　）との融合により
生成される体細胞ハイブリドに関する。
発明の背景 数種のヒトリンパ芽球系細胞およびヒトミエローマセル
ラインがヒトＢリンパ細胞との融合用に示唆されている
。純粋にヒト起原の融合パートナ−は特に有利である。
と言うのは、このような融合パートナ−とヒトＢリンパ
ｉ飽から生成されたハイブリドーマにより産生きれるモ
ノクローナル抗体は非ヒトまたは混合ハイブリドーマに
より産生きれた抗体に比較して天然のヒト免疫応答系と
一層適合できるからである。たとえば、マウス−ヒトハ
イブリドーマはそれらのヒト染色体を全く急速に失なう
傾向があるが、他方ヒト起原のハイブリドーマは一般に
、ヒト染色体に対して良好な安定性を示す。
利用できるヒトミエローマ融合パートナ−の中で、形質
細胞腫は豊富な、粗い小胞体２〜３の遊離ポリリボゾー
ム、多数のミドコンドリアおよび良好に発育したゴルジ
体の特徴を有する良く確立された細胞形態を有するもの
である。形質細胞腫はまた、高割合のイムノグロブリン
分泌を示す。
不幸なことに、形質細胞腫細胞はインビトロでまれに連
続的に維持されうるだＩ」である。さらにまた、大部分
の形質細胞腫は組織培養において、３６〜７３時間の２
培体化時間を有し、および増殖に形質細胞刺戟因子を必
要とすることがある。
このようなｌＩｌ！１１を使用するハイブリド形成の頻
度はまた一般に全く遅い。
利用できるヒトリンパ芽球系細胞は高度の融合頻度を示
し、組織培養でさらに容易に維持され、および約２０〜
３０時間の２培体化時間を有するがこれらの細胞は良好
に発育した粗い小胞体を有せず、およびかなり少ないイ
ムノグロブリンを分泌するだけである。
形質細胞ｌＩｉ！Ｉｌｌ胞およびリンパ芽球細胞の両方
の望ましい特徴のいくつかを示す純粋にヒトの細胞は特
に有利である。
発明の概要 本発明の目的はヒトモノクローナル抗体の産生用のヒト
ハイブリドミ１０−マ融合パートナ−を提供することに
ある。、　　　　一 本発明のもう一つの目的は正常リンパ細胞のような抗体
産生性ｌｌｌ胞との高い融合頻度を示し、従ってヒト免
疫応答系と適合しうる抗体を示すハイブリドーマを生成
するヒト体細胞ハイブリドを提供することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は高レベルで抗体を分泌
するハイブリドーマの生成に使用できるヒト体細胞ハイ
ブリドを提供することにある。
本発明のさらにもう一つの目的は選択可能な表現型を発
現するヒト抗体産生性Ｂ細胞とのハイブリド化に適する
ヒト体細胞ハイブリドを提供することにある。
これらのおよびその他の目的が、その−態様において、
ヒト形質細胞腫セルラインＲＰＭＩ８２２６またはヒト
リンパ１芽球系セルラインＧＭ−１５００のどちらか一
方から得られる突然変異ｍ飽を前記形質細胞腫セルライ
ン８２２６または前記リンパ芽球系セルラインＧＭ−１
５００のどちらかの他の一方から得られる細胞と融合さ
せて最初のハイブリドセルラインを生成し、次いでこの
最初のハイブリドセルラインの細胞を突然変異させて、
抗体産生性細胞どの融合で相補されることができる選択
可能な表現型を示しおよび抗体産生性細胞との融合で安
定な連続セルラインを形成する能力を有するζ１体細胞
ハイブリドセルラインを生成することを含み、而して前
記突然変異細胞が前記の他の一方の細胞との融合で相補
されることができる第１の選択可能な表現型および伝達
されることができる第２の選択可能な表現型を示すこと
を含む本発明により達成される。
もう一つの態様において、本発明は抗体産生性ｌｌｌ飽
との融合パートナ−どして有用な安定な連続ヒト体細胞
ハイブリドセルラインを形成する方法を提供し、この方
法はヒト形質細胞腫セルラインＲＰＭＩ８２２６または
リンパ芽球系セルラインＧＭ−１５’ＯＯのどちらか一
方から得られる突然変、異細胞（この突−然変異細胞は
前記のもう・一方の細胞との融合で相補されうる第１の
選択可能な表現型および伝達されうる第２の・選択可能
な表現型を有するものである）を前記Ｒ，ＰＭ、ｌ　８
２２６セルラインまたは前記０Ｍ−１５００セルライン
のどちらかの他の一方から得られる細胞と融合させて、
最初のハイブリドセルライン、を生成し、次いでこの最
初のハイブリドセルラインから得られる細胞を突然変異
させて、抗体産生性細胞との融合で相補されることがで
きる選択可能な表現型を有するヒト体細胞ハイブリドセ
ルラインを得ることを、含む方ン入である。
さらにもう一つの態様に・おいて、本発明は抗体産生性
細胞を前記で同定されているヒト体細胞ハイブリドセル
ラインから得られる細胞と融合させて、前記抗体産生性
細胞と前記ヒト体細胞ハイ、ブリド、との細胞ハイブリ
ドを得ることを含むハイブリドーマの形成方法を提供す
る。
詳細な配達 −〇　一 本発明はヒト形質ａ胞腫セルラインＲＰＭＩ８２２６ま
たはヒトリンパ芽球系セルラインＧＭ・−１５００のど
ちらか一方から得られる突然変異細胞を前記ＲＰＭＩ８
２２６セルラインまた−は前記０Ｍ−１５，ＯＯセルラ
インのどちらかの他の一方から・得られる細胞と融合さ
せて、最初のハイブリドセルラインを生成し、次５いで
この最初のハイブリドセルラインのｌ胞を突然変異させ
て、抗体産生性細胞との融合で相補されうる選択可能な
表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐ、ｅ）を示すヒト体細胞ハイ
ブリドセルラインを得ることに・より製造される安定な
連続ヒト体細胞ハイブリドセルラインを提供する。この
ようむ体細胞ハイブリドは形質細胞腫親細胞の表現型的
特徴を有し、およびリンパ芽球系親細胞の程度の抗体産
生性細胞との融合頻度を示す。本発明の体ｌｌ１１１１
ハイブリドセルラインは抗体産生性細胞との融合パート
ナ−として有用である。
本発明はまた、このような体ｌｌｌ胞ハイブリドセルラ
インの製造方法を提供する。
本発明の体細胞セルラインは一般的にヒトＢ上ルライン
と抗体分泌性ヒトハイプリドーマを構築するために使用
できる。これは結腸癌患者の末梢血液から得られたヒト
Ｂリンパ細胞で、並びにエプスタイン−バールウィルス
（Ｅ、　Ｂ　Ｖ’　）で処理することにより免疫化され
たヒトＢセルラインで、バイブ、リド化される。
本発明のヒト体細胞ハイブリドはヒト形質細胞腫セルラ
インＲＰＭＩ８・２２６またはヒトリンパ芽球系セルラ
インＧＭ＝１５００のどちらか一方から得られる突然変
異細胞を前記ＲＰＭＩ８２２６セルラインまたは前記０
Ｍ−１５００セルラインのどちらかの他の一方から得ら
れる細胞と融合させることにより生成される。ヒト形質
細胞腫セルラインＲＰＭＩ８２．２６は多発性骨髄腫を
被患している患者から誘導した〔マツ才力（Ｈａｔｓｕ
ｏｋａ　）らのプロシーディンゲス・オブ・ソサイアテ
イ・エクスペリメンタル・バイオロジイ（Ｐｒｏｃ、　
ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　）　　にューヨーク
市）、１２５：１２４６（１９６７年）参照］。これは
アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１
ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（ロックビル、メリイラン
ド）からＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１５５として入手でき
る。
リンパ芽球系セルラインＧＭ−１５００はヒ１〜遺伝変
異細胞、医薬研究所（ｌｌｕｍａｎ’　Ｇｅｎｅｔ　ｉ
　ｃＨｕｔａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、
　Ｔｎｓｔｉｔ旧ｅ　ｆｏｒＭｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ）、にュージャーシイ州カンデン市）から得る
ことができる。
成功するハイブリドの選択を助けるためには、突然変異
細胞は選択可能な表現型の組合せを発現せねばならない
。本明細書および特許請求の範囲に用いられている、「
選択可能な表現型」（５ｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｐｈｅｎ
ｏｔｙｐｅ）なる表現は融合に際して相補または伝達の
どちらかが可能である選択的圧力に対して感受性または
敏感性であるかまたはそれが欠落しているかを意味する
。特に、この突然変異細胞は前記の他の一方の細胞との
融合で相補されうる第１の選択可能な表現型を示し、か
つまた前記の他の一方の細胞との融合で伝達されつる第
２０選釈可能な表現型を示さなければならない。しかし
ながら、本発明はこれら第１および第２の選択可能な表
現型のどちらかについて特異的性質に制限されず、いづ
れかの選択可能な特徴を使用できる。
成功するハイブリドはその性質を示す適当な親から伝達
されうる選択可能な表現型を遺伝し、他の選択可能な表
現型が融合により相補される。その結果、成功するハイ
ブリドは融合カルチャーに適当な選択圧を加えることに
より単離できる。ハイブリド化されていない親細胞はこ
れら２種のうち１方の選択圧の存在で死滅する。単離さ
れたハイブリドは次いでクローン的に増殖させてハイブ
リドセルラインを生成させることができる。
融合で相補されうる、広く使用されている選択可能な表
現型の一つは６−チオグアニン抵抗性である。６−チオ
グアニン抵抗性は６−チ冴グアニン感受性セルラインと
の融合により相補される劣性的性質である。この性質を
有する細胞は酵素ヒボキサンチン　ホスホリボシル　ト
ランスフェラーゼ（ｉｆ−ＩＰＲＴ）中で不完全であっ
て、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（
＋−Ｉ　Ａ　Ｔ　＞を含有する媒質中で死滅する。換言
寸れば、こめ性質を有する細胞はＨ−ＡＴ感受性を示す
。Ｈ’ＡＴ感受性セルラインを製造するための方法の一
つはネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、′２５６　：　４
９５〜４９７頁（１９７５年）に記載されている。
融合により相補されうるもう一つの選択可能な′表現型
は８−アザグアニン抵抗性である。８−アザグアニン中
で成功裡に増殖する細胞はまたＨ　Ｐ　Ｒ、Ｔ欠損細胞
であり、従うでＨＡＴ感受性である。
使用できるさらにもう一つの劣性的性質はチミジンキナ
ーゼ欠損である。チミジンキナーゼ欠損Ｉｌｌ胞はまた
１−ＩＡＴ感受竹である。融合で相補゛されうるその他
の適当な選択可能な表現型は当業者にとって明白であろ
う。
融合によって伝達される、すなわち成功するハイブリド
により遺伝される既知の選択可能な表現型はウワバイン
抵抗性である。ウワバイン抵抗性は常染色体優性的性質
である。ウワバイン感受性細′胞はウワバインの存在で
死滅する。ウワバインに対して抵抗性のセルラインを製
造する技法はプロシーディンゲス・ナショナル・アカデ
ミ・サイエン）、　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ、Ａｃａ
ｄ、　Ｓｃｉ、）’（米国）７９：６６５１〜６６５５
頁（１９８２年）に記載されている。融合により伝達さ
れうるもう一つの選択可能な表現型は抗体Ｇ−４−１８
に対する抵抗性である。抗体Ｇ−４１８に対する抵抗性
を授与する優性マーカーを有するセルラインはネオマイ
シン抵抗性についての細胞的遺伝子を有するＩ）ＮΔで
細胞をトランスフエクションすることにより得ることが
できる［たとえば、テンプ（Ｔｅｎ（１）らによる「Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｊ　（米
国）、８０ニア３０８〜７３１２頁（１９８３）参照１
゜成功するハイブリドに伝達されうるその他の可酷な選
択可能表現型は当業者にとって明白であろう。
たとえば、選択可能な表現型の組合せを示すヒトＢリン
パ芽球系セルラインＧＭ１５００の突然変異細胞は次の
方法を使用して製造できる。
ＧＭ−１５００セルラインから得られた細胞を先ずエチ
ルメチルスルホネートで処理することにより突然変異さ
せ、６−チオグアニン含有媒質中で１」ＲＲＴ欠損につ
いて選択する。得られたＧＭ−１５００６ＴＧ　　Ａ−
１１と称する１−ＩＰＰＴ欠損突然変異細胞の１つをり
［１−ン的に増殖させ、そのクローンを低レベルガンマ
照用より変異させ、次いでウワバイン抵抗性について選
択し、次いでクローン化する。この方法については］ズ
□ボール（Ｋ０７ｂＯｒ）らの１Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、＾ｃａｒ１．　Ｓｃｉ；Ｊ（米国）、７９：６６５１
頁（１９８２年）を参照できる。生成するセルラインは
ＫＲ−４と命名されており、このセルラインはクィーン
ズ大学、微生物学・免疫学部（キングストン、オントリ
オ、カナダ、Ｋ７１　３Ｎ６）から入手できる。このリ
ンパ芽球系セルラインはウワバイン抵抗性および６−チ
オグアニン抵抗性の両方を示し、本発明による体細胞ハ
イブリドのｔＪ　３ｆｉ用の突然変異細胞として使用で
きる。
本発明の体１胞ハイブリドは次いでヒトリンパ芽球系セ
ルラインＧＭ１５００またはヒト形質細胞腫セルライン
ＲＰＭ１８２２６のどちらか一方から得られた突然変異
細胞を前記Ｇ　Ｍ　−１５００セルラインまたは前記Ｒ
ＰＭＩ８２２６セルラインのどちらかの他の一方から得
られた細胞と融合させることにより製造する。細胞ハイ
ブリド化または融合用の技法は当技術で既知であり、た
とえば］−ラーら（に０ｈｌｅｒおよび旧１ｓｔｅｉｎ
）のｌ　ＮａｔｕｒｅＪ　２０５．４９５頁（１９７５
年）を参照できる。このような技法に従い、本発明の体
細胞ハイブリドを製造するハイブリド化または融合工程
では、多数の形質細胞腫セルラインＲＰＭ１８２２６ま
たはリンパ芽球系セルラインＧＭ−１５００のどちらか
から得られた突然変異細胞および多数の前記ＲＰＭＩ８
２２６セルラインまたは前記ＧＭ−１５００セルライン
のどちらかの他の一方から得られた細胞を使用する。代
表的には、細胞を混合し、遠心分離し、次いで生育媒質
中に稀釈されているポリエチレン　グリコール（Ｐ　Ｅ
　Ｇ　）の溶液中で融合用に再懸濁する。融合した細胞
は次いで洗浄し、培養する。この方法は典型的に成功す
るａｖｉハイブリドを比較的少ない数でだｔｉ生成する
。
親のセルラインの一つは適当に突然変異させて選択可能
な表現型の組合せ、す４ｉわち融合で相補されつる１つ
の表現型およびハイブリド化した細胞に伝達されうるか
または性質として有する他の表現型の組合せを導入させ
るので、適当な選択可能の圧力（ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を
使用してハイブリドされていないパートナ−から成功す
るハイブリドを単離できる。−例として、形質Ｉ１１＋
１１腫細１１ａＲＰＭ１８２２６をリンパ芽球系細胞Ｋ
Ｒ−４と融合させる場合に、リンパ芽球系細胞の６−チ
オグアニン抵抗性は成功するハイブリドに伝達される。
従って、成功するハイブリドは融合生成物を１１Ａ　Ｔ
およびクワバイン含有媒質中で培養することにより単離
できる。これはハイブリド細胞だけがこのような媒質中
で生き残ることができるためである。
ハイブリド化されていないリンパ芽球系［細胞はＨＡＴ
の存在で死滅し、他方ハイブリド化されていない形質Ｉ
ＩＩ飽腫ｉ飽はウワバインの存在で死滅する。
両方の親細胞から単離できる。抗体産生性細胞との融合
に適する体細胞ハイブリドを生成させるためには、前記
で生成された細胞バイブ響ナトを選択的に突然変異させ
て、生成する体細胞ハイブリドが抗体産生性細胞との融
合により相補されうる選択可能な表現型を示すようにす
る。便宜上、前記体細胞ハイブリドの単離に使用された
ものと同一の選択的圧力、すなわち６−チオグアニン抵
抗性を使用できるが、異なる選択可能な表現型も所望に
より使用できる。細胞はいずれか既知の物理的または化
学的技法により突然変異させることができ、次いで、適
当な媒質、たとえば１１Ａ　Ｔ感受性変異細胞を得よう
とする場合には、６−チオグアニン含有媒質中で選択す
る。
ＫＲ−４リンパ芽球系Ｉｌｌ胞をＲＰＭ１８２２６形質
ｌ１１１腫細胞と融合させることにより生成された細胞
ハイブリドから形成された体細胞ハイブリドの場合に、
適当な突然変異細胞は事前に単離された細胞ハイブリド
を６−チオグアニンお３よびウワパイン含有媒質中で培
養することにより自発的に単純に生成される。
本発明をリンパ芽球系セルラインＧＭ−１５００から得
られた突然変異細胞を使用して、最初のｌＩ飽ハイブリ
ドを得る方法について詳細に説明したが、本発明の広い
実用的観点から、別法として選択可能な表現型の要求さ
れる組合せを示す突然変異細胞を形質細胞腫細胞ＲＰ　
Ｍ　！８２２６を突然変異させることにより製造するこ
とができる。
融合すると、本発明の体ｌ１ｌｌ胞ハイブリドは一般に
低４倍体であることから、このハイブリドは望ましい性
質を失なうことなく染色体数で安定化しなければならな
い。
法例１は説明の目的のためだけのものであって、本発明
の範囲を制限しようとするものではない。
例１ この例は形質１１１胞セルラインＲＰＭＩ８２２６とヒ
トリンパ芽球系セルラインＫＲ−４とを融合させること
により、モノクローナル抗体の産生用融合パートナ−と
して適する６−チオグアニン抵抗性およびクワバイン抵
抗性ハイブリドセルラインを製造する方法を説明するも
のである。前記したように、ＫＲ−４セルラインはリン
パ芽球系セルラインＧＭ−１５００から誘導されたもの
である。ヒトリンパ芽球系セルラインＫＲ−４の細胞は
０．１ｍＭウワバインおよび３０１１１Ｃ！＋　／’ｍ
ｅ６−チオグアニン（６−ＴＧ）を含有する培養液中に
保持する。形質細胞腫セルラインＲＰＭＩ８２２６の細
胞は１０％熱不活性化牛脂児血清、２　ｍ　Ｍ　Ｌ−グ
ルタミンおよび６０１１１Ｃ（１／ａ＋ｅゲンタマイシ
ンを含有するＲ　Ｐ、Ｍ　Ｉ　Ｂ　２２６媒質中に保持
する。
リンパ芽球系ｌＩｌ胞ＫＲ−４および形質ｌＩｌ胞腫セ
ルラインＲＰＭＩ８．２２６から得られた細胞のハイブ
リドは形質１１１ｒＩＡＩｌ細胞約百万個をリンパ芽細
胞系細胞百万個と混合し、遠心分離することにより製造
する。この細胞混合物は１５０Ｘ、９で約１０分間遠心
分離し、これらの細胞をコーラ−ら（にｏｈｌｅｒ　Ｇ
、およびＣ，Ｈｉｌｓｔｅｉｎ　）により［Ｎａｔｌｌ
ｒｅＪ　、２５６．４９５頁（１９７５年）に基本的記
載されている方法を使用して、ＲＰＭＩ媒質に稀釈され
ている４５％（重量／容量）のポリエチレン　グリコー
ル４００Ｑ　（ＰＥＧ）を用いて融合、させる。
融合した細胞を洗浄し、次いで微滴定板［リンブｏ　（
Ｌｉｎｂｒｏ）　１の四部で、１凹部当り約ｉｏ、ｏｏ
ｏ細胞をＩ’ｌｌ　（３０００Ｒ）したマウスヒ臓細胞
（１凹部当り約５．０００細胞）に接種することにより
培養する。細胞は次いで１０ｍＭウワバインを含有する
ＨＡＴ媒質中で最初の２週間培養し、次いで１００ｍＭ
ヒポキサンチン／１６．ｍＭチミジン含有ＨＡＴ［−質
中で次の一週間、Ｒ後に２０％牛脂児面清含有ＲＰＭ１
１６４０１１！質中で培養する。親のセルラインをそれ
ぞれ含有する対照培養物はｌｌ　Ａ　Ｔおよびクワバイ
ン。含有媒質中で１２日間５後に生き残りを含んでいな
かった。
成功するハイブリドは次いで、この同定されたハイブリ
ドを６−チオグアニン３０１１１Ｃ（１／ｍｉ！および
ウワバイン０．１ｍＭを含有する媒質中で単純に培養す
ることにより６−チオグアニン抵抗性およびウワバイン
抵抗性について逆選択処理する。
全てのハイブリドは３５Ｓ−メチオニン標識付けしたイ
ムノグロブリン並びに種１ｏＧ抗体で免疫沈澱させるこ
とにＪ：り測定して、カッパ（Ｋａｐｐａ　）およびラ
ムダ（ｌａｍｂｄａ）イムノグロブリン鎖を分泌した。
このハイブリドは２４〜２８時間の２培体化時間を示す
２種の親のセルラインの間の中間の生育速酊を有した。
ＫＲ−１２と命名したハイブリドの１種をアメリカン　
タイプカルチャー　］レクション（ＡＴＣＣ＞ （１２３０１、パークローン、ドライブ、ロックビル、
メリイランド、２０８５２）に１９８４年に寄託し、寄
託番号 を得ることができる。
この特別のセルラインは正常末梢血液リンパ細胞と約８
Ｘ１０−７の成功融合頻度を示し、およびエプスタイン
−バールウィルス（ＥＢＶ）で処理することにより不滅
化された抗体産生性リンパ芽球系セルラインと約１０−
５の程度のハイブリド形成頻度を示す。これらの融合頻
度はＫＲ−４リンパ芽球系親セルラインのものに匹敵す
る。ＫＲ−１２細胞は細胞内および表面イムノグロブリ
ン（ガンマ重質鎖並びにラムダおよびカッパ軽質鎖）の
両方を示し、親細胞のものの１５倍に相当するイムノグ
ロブリンを分泌し、そして親形質細胞の形態学的特徴を
有する。
例２ この例は例１に従い得られたＫＲ−１２１１１１１１を
既知抗原について特異性の抗体を分泌する抗体産生性細
胞と融合することによるハイブリドの製造を説明するも
のである。この例では、Ｉ（ＪＭ抗破傷風トキソイド抗
体を分泌するリンパ芽球系セルラインＢ６を使用づ−る
。Ｂ６セルラインは免疫付与された供給者の未梢面液す
ンパ細飽から誘導され、次いで抗原−特異性Ｂ１１１ｌ
ｌｌについて選択され、エプスタイン−バール　ウィル
スで転換され、次いでクローン化されたものであるＬコ
ズボールら（Ｋｏｚｂｏｒ、　Ｄ、およびＪ、　Ｃ，Ｒ
ｏｄｅｒ　）　ニよるジャーナル◆オブ・イムノロシイ
（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）１２６　（４）：　１２
７５頁（１９８１年）参照］。
例１に概略されている融合方法を使用し、ハイブリドは
１０ｍＭウワバイン供給ＨＡＴ媒質中で選択する。
選択後２０日間のハイブリド形成頻度を陰性の凹部の分
画を数え、ポリシン（Ｐｏｉｓｓｏｎ　）の等式を用い
て、１０−５であると推定した。ハイブリド選択に使用
したものと同−媒質中で培養された親のセルラインのそ
れぞれを含有する対照板の中で生き残りを示したものは
なかった。
このハイブリドの全ては５〜３０１１１Ｃ（１／１ｄの
ＩＧＧおよびＩｑＭ杭体を分泌したが、１ｇＭカッパだ
けが酵素粘合免疫吸着分析法により測定して破傷風トキ
ソイドに対して特異性を有した［エングバルら（Ｅｎｏ
ｖａｌｌ、　Ｅ、およびｐ、　ｐｅｒ＋ｍａｎｎ　＞に
よるイムノグロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　）、８：８７１頁（１９７１年）参照］。
このハイブリド細胞はリンプロ板の四部で、照射された
（３０００Ｒ）マウスヒ臓細胞よりなる栄養供給層上で
の制限稀釈によりクローン化した。
この別々のクローンを抗体産生性について試験した。ク
ローン形成効率は約５４％であった。
１−ＩＹＢＡ−１，１−ＩＹ１３Ａ−２および）−Ｉ　
Ｙ　ＢΔ−３と命名された３種の代表的クローンはそれ
ぞれ、８日間の生育期間の終了時に、７．８および８Ｉ
ｃＯ／＃１１！のＩＧＧ抗体並びに９．８および１０１
１１ｃ（１／＃ｌｅのＩＯＭ抗体を産生した。これらの
ハイブリドは１２ケ月の連続培養を通して同レベルのイ
ムノグロブリン産生を維持しつづけた。
例３ 抗体産生を増加させにうとする試みで、抗破傷風トキソ
イド抗体産生性ハイブリドをプラスチンでプライムした
ヌードマウスの腹腔空洞で生育させた。ハイブリドは照
射したヌードマウス（３５０Ｒ）の固形皮下腫瘍として
単泡通過させ、次いでインビトロで生育させた後にヌー
ドマウスの腹水生育に適合した。さらに、８匹の照射し
たマウスのうちの２匹で、固形腫瘍として予め生育させ
ることなくハイブリドの腹水生育を達成できた。これら
のハイブリドは腹水液１ｄ当り１〜８ｍｇのヒトイムノ
グロブリンを分泌した。このヒトイムノグロブリン収率
レベルはＢ６セルラインおよびＫＲ−４リンパ芽球系セ
ルラインから生成された抗体産生性ハイブリドの腹水生
育ににり得られる収率より約１０倍高い。大部分の照射
マウスはハイブリド細胞の注入後に腹水液を発生したが
、極く少量の腹水、すなわち０．５〜２．’ｏ＝程度の
腹水がマウス−匹当りで得られた。
本明細書には本発明の好適態様を記載したが、特許請求
の範囲に定義され、これによってだｔ−１制限される本
発明の精神および範囲から逸脱す乞ことなく変更および
修飾を実施できることは当業者にとって明白であろう。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ヒト形質細胞腫セルラインＲＰＭＩ ８２２６またはヒトリンパ芽球系セルラインＧＭ１５０
    ０のどちらか一方から得られた突然変異細胞を前記ＲＰ
    ＭＩ８２２６セルラインまたは前記ＧＭ１５００セルラ
    インの他の一方から得られた細胞と融合させて、最初の
    ハイブリドセルラインを生成し、次いでこの最初のハイ
    ブリドセルラインの細胞を突然変異させて、抗体産生性
    細胞との融合で相補されうる第２の選択可能な表現型を
    示しおよび抗体産生性細胞との融合で安定な連続セルラ
    インを形成する能力を有するヒト体細胞ハイブリドセル
    ラインを得ることにより生成され、前記突然変異細胞が
    相補されうる最初の選択可能な表現型および前記の他の
    一方の細胞との融合で伝達されうる第２の選択可能な表
    現型を示すものである、安定な連続ヒト体細胞ハイブリ
    ドセルライン。
  2. （２）最初の選択可能な表現型が６−チオグアニン抵抗
    性である、特許請求の範囲第１項記載のハイブリドセル
    ライン。
  3. （３）第２の選択可能な表現型がウワバイン抵抗性であ
    る、特許請求の範囲第１項記載のハイブリドセルライン
    。
  4. （４）ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン
    を含有する媒質中で生き残ることができない、特許請求
    の範囲第１項記載のハイブリドセルライン。
  5. （５）突然変異細胞がヒトリンパ芽球系セルラインＧＭ
    １５００から得られるものである、特許請求の範囲１項
    記載のハイブリドセルライン。
  6. （６）ヒト形質細胞腫セルラインＲＰＭＩ ８２２６をヒトリンパ芽球系セルラインＫＲ−４と融合
    させることにより生成される、特許請求の範囲第５項記
    載のハイブリドセルライン。
  7. （７）抗体産生性細胞と特許請求の範囲第１項のヒト体
    細胞ハイブリドセルラインとの融合により生成されたハ
    イブリドーマからクローン的に誘導されるハイブリドー
    マセルライン。
  8. （８）抗体産生性細胞がエプスタイン−バールウイルス
    で処理することによつて不滅化されたＢリンパ細胞であ
    る、特許請求の範囲第７項記載のハイブリドーマセルラ
    イン。
  9. （９）抗体産生性細胞が正常Ｂリンパ細胞である、特許
    請求の範囲第７項記載のハイブリドーマセルライン。
  10. （１０）抗体産生性細胞を特許請求の範囲第６項記載の
    ヒト体細胞ハイブリドセルライン由来の細胞と融合させ
    ることにより生成されたハイブリドーマからクローン的
    に誘導されるハイブリドーマセルライン。
  11. （１１）抗体産生性細胞用の融合パートナーとして有用
    な安定な連続ヒト体細胞ハイブリドセルラインの製造法
    であつて、ヒト形質細胞腫セルラインＲＰＭＩ８２２６
    またはヒトリンパ芽球系セルラインＧＭ−１５００のど
    ちらか一方から得られた突然変異細胞を前記ＲＰＭＩセ
    ルラインまたはＧＭ−１５００セルラインの他の一方か
    ら得られた細胞と融合させて最初のハイブリドセルライ
    ンを生成し、次いでこの最初のハイブリド細胞を突然変
    異させて、抗体産生性細胞との融合で相補されうる選択
    可能な表現型を示し、そして抗体産生性細胞との融合で
    安定な連続セルラインを形成する能力を有する前記ヒト
    体細胞ハイブリドセルラインを得ることを含み、而して
    前記突然変異細胞が相補されうる第１の選択可能な表現
    型および前記の他の一方の細胞との融合で伝達されうる
    第２の選択可能な表現型を有する、上記方法。
  12. （１２）抗体産生性細胞を特許請求の範囲第１項記載の
    ヒト体細胞ハイブリドセルラインから得られた細胞と融
    合させて、この抗体産生性細胞とこのヒト体細胞ハイブ
    リドとの細胞ハイブリドを得ることを含むハイブリドー
    マの製造方法。
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