JPH0249597A - モノクローナル抗体及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規なモノクローナル抗体及びその利用方法に
関するものである。さらに詳しくいえば、本発明は、ヒ
トリンパ球の分化抗原を認識する作用、又はヒトリンパ
球に対し免疫抑制作用を有し、ヒトに副作用を示さない
治療薬などとして有用なヒト・ヒトハイブリドーマ由来
のモノクローナル抗体、ヒト・ヒトハイブリドーマ由来
のモノクローナル抗体を有効成分とする、ヒトに副作用
を示さない免疫抑制剤及びヒト・ヒトハイブリドーマ由
来で、ヒトリンパ球の分化抗原を認識するモノクローナ
ル抗体を用いる診断方法に関するものである。

従来の技術 近年、バイオテクノロジーの進展に伴い、モノクローナ
ル抗体が注目され、各分野においてその応用研究が盛ん
に行われている。

動物体内には免疫と呼ばれる自己防衛機能があり、体内
に細菌などの異物（抗Ｗ）が侵入すると自己防衛機能が
働き、体内のリンパ球が異物を排除又は抑え込む抗体を
作り出す。この場合、単クローンのリンパ球は１種類の
抗体しか作らないという特徴を有し、この抗体がモノク
ローナル抗体（単クローン性抗体）と呼ばれるものであ
る。

このようなモノクローナル抗体は、現在分析化学分野（
例えばアフィニティクロマトグラフイー）、臨床診断分
野及び治療分野などにおいて、その応用研究が積極的に
なされている。前記治療分野におけるモノクローナル抗
体の応用としては、例えば（１）がん細胞の表面に存在
する特異な糖タンパク質を抗原とするモノクローナル抗
体を調製し、これに抗がん剤やかん細胞を殺す毒素を結
合して患者に投与し、抗原抗体反応によってモノクロー
ナル抗体をがん細胞の表面のみに選択的にとりつかせ、
該抗体に結合している抗がん剤や毒素により、がん細胞
を破壊するがんミサイル療法、（２）臓器移植を行う場
合に、主要組織適合性抗原が致しないと拒否反応が生じ
るため、従来免疫抑制剤が投与されているが、従来の免
疫抑制剤では副作用及び感染症で死亡することがあるな
どの問題を有し、このため従来の免疫抑制剤の代りにモ
ノクローナル抗体の使用、（３）各種免疫不全症や重症
感染症の患者に対しては、従来ヒトの血液から調製した
抗体（抗血清）を投与する、いわゆるカンマ−グロブリ
ン療法が行われているが、モノクローナル抗体は特異性
が高く、かつ品質が安定して安価に製造しうる可能性が
あることから、従来の抗血清の代りにモノクローナル抗
体の使用などが試みられている。

ところで、モノクローナル抗体の製造方法としては、例
えば抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合し、得られ
たハイブリドーマ（雑種細胞）を培養する方法、リンパ
球をウィルスにより形質転換し、抗体産生細胞株を培養
する方法などが知られている。

しかしながら、ヒト型モノクローナル抗体を製造するに
は、所望の抗原により感作さ”れた該抗原に特異的なヒ
ト抗体産生細胞を得ることが必要であるが、ヒトでは生
体内（ｉｌ　ＶｉＶＯ）の抗原刺激が一部の抗原を除い
ては不可能であることから、種々の抗原に対応するその
ような手段は実用技術として未だ確立されておらず、−
また、ヒト抗体産生細胞の不死化手段、例えばエプスタ
イン・バー・ウィルス（ＥｐｓＬｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖ
ｉｒｕｓ、　　Ｅ　Ｂ　Ｖ）での形質転換などにより得
られるヒトの永久株化細胞やヒト骨髄腫細胞との融合に
より得られるヒトのハイブリドーマによりモノクローナ
ル抗体を取得する試みがなされているが、ヒトの系にお
いてはマウス系のように親株として有用な形質転換細胞
は樹立されておらず、その抗体産生能の安定したハイブ
リドーマは得られていないのが現状である。

したがって、現在入手可能なモノクローナル抗体は、主
としてマウス由来のものである。このようなマウス由来
のモノクローナル抗体は、分析化学分野（例えばアフィ
ニティークロマトグラフィー）や臨床診断分野などでは
有効に利用しうるが、これを治療の目的で人体に投与又
は注入する場合、異種タンパク質として認識され、アレ
ルギー反応を起こす可能性があるため、治療分野への応
用には制限がある。このため所望のヒト型モノクローナ
ル抗体を簡単に調製しうる技術の開発が強く望まれてい
る。

ところで、治療分野において有用なヒトリンパ球の分化
抗原を認識するモノクローナル抗体については、マウス
由来のものはすでに知られているが、ヒト・ヒトハイブ
リドーマ由来の抗体はこれまで知られていない。

他方、モノクローナル抗体から成る免疫抑制剤について
は、０ＫＴ３　（特開昭５５−１４５６１７号公報）が
米国で移植組織の拒絶反応防止薬として実用化されてい
る。しかしながら、このものはマウス由来の抗体であっ
て、ヒトにとって異種タンパクであるために副作用が著
しく、投与は１回に限定せざるをえないという欠点を有
している［「日経バイオチック」７月１４日号（Ｈｒ６
年）、２月２３日号（１９８７年）］。例えば、臨床例
では投与後３０分で悪寒、戦りつ、発熱などを伴い、半
数は呼吸困難となり、しかも１６例中１２例では拒絶反
応が再発したことが報告されている「「臨床免疫」第１
７巻、第１０号、第８９５ページ（１９８５年）］。

発明が解決しようとする課題 本発明は、このような事情のもとで、ヒトリンパ球の分
化抗原を認識する作用、又はヒトリンパ球に対し免疫抑
制作用を有し、ヒトに副作用を示さない治療薬などとし
て有用なヒト・ヒトハイブリドーマ由来のモノクローナ
ル抗体、ヒト・ヒトハイブリドーマ由来のモノクローナ
ル抗体を有効成分とする、ヒトに副作用を示さない免疫
抑制剤及びヒト・ヒトハイブリドーマ由来で、ヒトリン
パ球の分化抗原を認識するモノクローナル抗体を用いる
診断方法を提供することを目的としてなされたものであ
る。

課題を解決するための手段 本発明者は、先にヒト型モノクローナル抗体産生能の安
定したヒト・ヒトハイブリドーマを作成するために種々
研究を重ね、形質転換ヒト細胞を増殖抑制処理し、次い
でこれをヒト抗体産生細胞と融合させることにより、ヒ
ト型モノクローナル抗体を安定に産生しうるヒト・ヒト
ハイブリドーマが得られることを見出した（特開昭６３
−ｕａｏ号公報）。

本発明者は、さらに鋭意研究を進めた結果、前記のよう
にして作成されたヒト・ヒトハイブリドーマから、ヒト
リンパ球の分化抗原を認識する作用、又はヒトリンパ球
に対し免疫抑制作用を有するヒト型モノクローナル抗体
が得られること、及び前記のようにして作成されたヒト
・ヒトバイブリドーマが産生するヒト型モノクローナル
抗体は、ヒトに副作用を示さない免疫抑制剤として有効
であること及び分化抗原を発現したヒトリンパ球の検出
又は測定に使用できることを見出し、この知見に基づい
て本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ヒトリンパ球の分化抗原を認識す
る作用、又はヒトリンパ球に対し免疫抑制作用を有し、
ヒトに副作用を示さない治療薬などとして有用なヒト・
ヒトハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体、ヒト・
ヒトハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体を有効成
分とする、ヒトに副作用を示せない免疫抑制剤、及び被
検生物学的試料を前記のヒトリンパ球の分化抗原を認識
するヒト・ヒトハイブリドーマ由来のモノクローナル抗
体と接触させることにより、該試料中の分化抗原を有す
るリンパ球と該モノクローナル抗体との複合体を形成さ
せ、次いで該複合体を検出又は測定することによって、
該試料中の分化抗原を有するリンパ球を検出又は測定す
る方法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明においては、安定した抗体産生能を有するヒト・
ヒトハイブリじ−マを作成するために、まず形質転換ヒ
ト細胞の増殖抑制処理が行われる。

親株としての形質転換ヒト細胞としては、例えばヒトＢ
細胞、ヒト肝細胞、ヒト牌細胞、扁桃細胞、ヒトリンパ
節細胞などを形質転換したものが用いられるが、これら
の中で、特にヒトＢ細胞を形質転換したものが好ましい
。形質転換は公知の方法、例えば細胞にウィルスを感染
さ−せる方法や遺伝子組み換え法などによって行われる
。

これらの形質転換ヒト細胞の増殖を抑制する方法として
は、例えば薬剤処理、放射線照射などが挙げられるが、
このうち、タンパク質又はＲＮＡの合成を阻害する薬剤
、例えば、エメチン、アクチノマイシンＤなどを単独又
は組合せて行う薬剤処理が好ましい。薬剤処理を行う場
合の薬剤使用量については、融合に用いる細胞の種類に
よって定める必要があるが、一般には形質転換ヒト細胞
が７〜１０日で完全に死滅する量を用いることか好まし
い。このようにして増殖抑制処理された形質転換ヒト細
胞は、ペテロ接合性であってもホモ接合性であってもよ
いが、後のスクリーニングなどを勘案するとホモ接合性
のものが好ましい。

次に、このようにして増殖抑制処理された形質転換ヒト
細胞と抗体産生ヒト細胞とを融合させてヒト・ヒトハイ
ブリドーマを作成するが、該抗体産生ヒト細胞としては
、例えばヒトＢ細胞、ヒトプラズマ細胞、ヒト肝細胞、
ヒト胎児肝細胞、ヒト牌細胞、ヒトリンパ節細胞、培養
ヒトＢ細胞などが挙げられるが、このうち、ヒトＢ細胞
及び培養ヒトＢ細胞が好ましい。この抗体産生ヒト細胞
は、ヒト組織又は血液から分離したものをそのまま用い
てもよいが、融合操作などの容易さの点から形質転換さ
せたものを用いてもよい。この場合一般には融合操作の
のちに抗ＨＬＡ抗体処理を行い、非融合抗体産生ヒト細
胞を排除することが望ましい。また、細胞融合は、公知
の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ウィルスな
どを用いる方法又は電気細胞融合法などにより行われる
。細胞融合における増殖抑制されたヒト細胞と抗体産生
ヒト細胞の比は１〜３０：１が好ましい。この細胞融合
に用いられる培地としては、例えばＲＰＭＩ　　＋６４
０培地、ＭＥＭ培地、ダルベツコ変法培地、及びそれら
の血清加培地、並びにそれらの無血清培地などが挙げら
れる。

このようにして得られたヒト・ヒトハイブリドーマは、
さらに所望の抗体産生能の有無についての検索及びクロ
ーン化に付される。

抗体産生能の有無は、ヒト・ヒトハイブリドーマの産生
ずる抗体の検定により確認される。この抗体検定は、感
作抗原に対する反応性を試験することにより実施され、
その方法としては、例えばＥＬＩ　ＳＡ法（Ｍ　ｅ　Ｌ
ｈ、　Ｅ　ｎｘｙｍｏ　Ｉ　、第７０巻、第４１９〜４
３９ページ（１９８０年）〕、プラーク法、スポット法
、凝集反応法、オクテロニイ法、酵素免疫法（ＥＩＡ）
、放射免疫法（ＲＩ　Ａ）　、細胞毒試験法などの一般
の抗体検出に利用される各種方法に従うことができる［
「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）Ｒ
＆Ｄプランニング発行、第３０〜５３ページ、昭和５７
年３月５日など］５また、クローニングは、例えば公知
の継代培養操作をくり返すことにより、また通常の限界
希釈法に従うことにより容易に達成される。

このようにして、製造され′たヒト・ヒトハイブリドー
マは、例えばＲＰＭＩ　　１６４０培地、ＭＥＭ培地、
ダルベツコ変性培地及びそれらの血清加培地並びにそれ
らの無血清培地などの培地中で、通常温度３６．５〜３
７．５℃、ｐＨ６，７〜７．５、好ましくは７．０〜？
、３、溶存酸素濃度０．５〜６１’ｐｍｓ好ましくは３
〜５　ｐｐｍの条件下で培養される。該ｐＨが前記範囲
を逸脱すると初期の増殖速度が遅いし、溶存酸素濃度が
前記範囲を逸脱すると抗体の生産性が劣るようになるの
で好ましくない。また、培養容器としては、例えばマイ
クロプレート、ペトリ皿、フラスコ、培養槽などが用い
られる。

このようにして培養された該ヒト・ヒトハイブリドーマ
は培養上溝中に所望のヒト型モノクローナル抗体を産生
ずる。このヒト型モノクローナル抗体は、従来慣用され
ている方法、例えば遠心分離、限外ろ過、塩析、ゲルろ
過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー法などによって、単離、精製すること
ができるが、特にプロティンＡを担持したアフィニティ
ークロマトグラフィー法により、効率よく単離、精製す
ることができる。

このようにして得られたモノクローナル抗体は、ヒト・
ヒトハイブリドーマ由来のものであるため、ヒトに副作
用を示さない免疫抑制剤として使用することができる。

また、細胞融合に用いる形質転換ヒト細胞及びヒト抗体
産生細胞を適宜選択して融合して成るヒト・ヒトハイブ
リドーマ、例えば形質転換ヒト細胞として、ヒト形質転
換Ｂ芽細胞（ＳＡ−１株）を、ヒト抗体産生細胞として
、ヒト形質転換抗体産生Ｂ細胞（Ｅ　Ｂ　Ｖ−３Ｕ株）
を用い、融合して成るヒト・ヒトハイブリドーマ（２２
３，１Ｏｊ３株）、（微工研菌寄第９９９５号）は、ヒ
トリンパ球の分化抗原を認識する作用、又はヒトリンパ
球に対し免疫抑制作用を有するヒト型モノクローナル抗
体を産生ずる。このヒトリンパ球の分化抗原を認識する
作用、又はヒトリンパ球に対し免疫抑制作用を有するヒ
ト型モノクローナル抗体は、従来見い出されていない新
規なものであって、治療分野や診断薬分野なとにおいて
有用であり、特にヒトに対して副作用を示さない免疫抑
制剤として好適に用いられる。

本発明の免疫抑制剤は、その形態については特に制限は
なく、例えば丸剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、
シロップ剤、軟膏、塗布剤、注射剤などの任意の形態と
して使用しうる。各製剤には、従来慣用されている他の
成分を薬理的に許容しうる範囲で配合することができる
。

また、該免疫抑制剤の投与量については、その中のモノ
クローナル抗体の１日の投与量が、成人−人当たり１ｍ
ｇ〜５ｇ程度になるような量で十分である。

さらに、本発明のモノクローナル抗体は正常なヒト末梢
血Ｔ、Ｂ細胞とは反応しないが、各種マイトーゲン、イ
ンターロイキン（ＩＬ）−２で刺激したリンパ球と反応
することから、リンパ球が活性化され、分化抗原が発現
したかどうか識別でき、診断分野に応用可能である。す
なわち、ヒトが微生物やウィルスに感染した場合、ある
いは化膿性疾患が発生した場合、免疫系の作用により、
異物を認識、排除しようとして、ヒトリンパ球が活性化
され分化抗原が発現する。本発明のモノクローナル抗体
はこのような活性化され、分化抗原が発現したヒトリン
パ球を認識するため、生物学的試料を本モノクローナル
抗体と接触させ、リンパ球との間に免疫複合体を形成さ
せ、複合化したリンパ球を検出又は開穴することにより
、感染症、疾患あるいは手術後のｉｎ　ｖｉｖｏ及びｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ診断に用いることができる。

発明の効果 本発明のヒトリンパ球の分化抗原を認識するモノクロー
ナル抗体は、ヒト・ヒトハイブリドーマから産生される
ものであって、ヒトの体内に投与又は注入しても、異種
タンパク質でないため、副作用が発生することがなく、
免疫抑制剤をはじめとして、治療分野や診断薬分野にお
いて好適に用いられる。

さらに、本発明のヒト・ヒトハイブリドーマ由来のモノ
クローナル抗体を有効成分とする免疫抑制剤は、従来の
マウス由来のモノクローナル抗体から成る免疫抑制剤０
ＫＴ３などと異なり、ヒトの体内に投与又は注入しても
副作用が発生するおそれがなく、臓器移植手術における
拒否反応防止薬として、また免疫異常症例えば自己免疫
疾患の治療薬などとして好適に用いられる。

本発明のモノクローナル抗体の認識する抗原は、分子量
１００〜Ｉ０５に、　１２０〜ＨＯＫ、　２７１１〜２
８０にダルトンで、これまでにない抗原であり、これま
で検出されない抗原の診断に用いることができる。

実施例 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが本
発明はこれらの例によってなんら限定されるものではな
い。

製造例　ヒト・ヒトハイブリドーマ（２２３，１０，３
３株）の製造 （Ｉ）抗体産生Ｂ細胞の調製： 妊娠した供与者（ＳＵ　：　ＨＬＡ−Ａ２．−　：　Ｂ
ｗ４６．２２：Ｃｗ　　７．−：ＤＲ４，８）の末梢血
を取り、これからリンパ球をコンレイ−フィコール勾配
により分離した。Ｔ細胞及びＢ細胞を、ノイラミダーゼ
で処理した５ＲＢＣを用いるロゼツト形成法により分離
し、Ｂ細胞を得た。

（Ｉｔ）エプスタイン−バービールス（ＥＢＶ）による
Ｂ細胞の感作： ＥＢＶ株を、１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）加ＲＰＭＩ　
　１６４０培地中で生育しているＥＢＶ−形質転換マー
モセット（ｍａｒｍｏｓｅｔ）細胞、Ｂ９５−８株の培
養物中で調製し、ビールスを含む上溝を得、２回ろ過し
た。Ｂ細胞を５　ｘ　１０　’ｃｅｌｌ／　１ＯＬｕ　
Ｑ含有する懸濁液１００μＣ中に、ビールス株を加え、
３７°Ｃで１時間インキュベートした。次いで、１０％
ＦＣ８加ＲＰＭ　Ｉ　　１６４０倍地ｇｏｏμａを加え
た。培地は３〜４日毎に加えた。形質転換したＢ細胞は
、感作倹約２週間で見出された。このＢ細胞をＥ　Ｂ　
Ｖ−８Ｕと称する。

（Ｉ［［）親株、ＥＢＶ−形質転換Ｂ　ＩＪンバ芽細胞
（ＳＡ−１）のエメチン及びアクチノマイシンＤ処理： ホモ接合性ＳＡ二１細胞（ＨＬＡ−Ａ２４．Ｂ７゜Ｃ−
、ＤＲｌ、Ｄｗ　　Ｉ）を１０％ＦＣ３加ＲＰＭ１１６
４０培地中で培養した。この細胞をその増殖期において
採取し、ＲＰＭＩ　　１６４０で３回（１０００ｒｐｍ
。

１０分間）洗浄し、Ｉ　Ｘ　１０　’ｃｅｌｌ／ｍｆｉ
の濃度に調整した。次いで５Ｘ１０−’Ｍエメチン塩酸
塩及びＯ，ｌｐｙ／ｍｌアクチノマイシンＤを用い、３
７００で２時間処理した。これらのエメチン及びアクチ
ノマイシンＤ濃度において、５Ａ−１細胞の分裂増殖は
完全に抑制された。遊離のエメチン及びアクチノマイシ
ンＤを完全に除去するため、この細胞をＲＰＭＩ　　１
６４０で３回洗浄し、増殖抑制ＳＡ１を得た。

（ＩＶ）細胞融合及びハイブリッドの成育条件二ＥＢＶ
−３Ｕを採取し、ＲＰＭＩ　　１６４０で３回洗浄した
。この細胞をＲＰＭＩ　　１６４０に懸濁させ、増殖抑
制５Ａ−１と１０＝１の割合で混合した。

１５％ＤＭＳＯ−４２，５％ポリエチレングリコル（Ｐ
　Ｅ　Ｇ　１０００）の０．２５ｍＱを継続的ニスライ
リング（ｓｗｉｌｌｉｎｇ）させながら１分間を要して
加え、次いで予熱（３７℃）したＲＰＭＩ　　１６４０
を１ｍＭＺ分の割合で加えた。

細胞を１０分間ＩＧＯＯｒｐｍで回転して固型化し、増
殖抑制ＳＡ、−１細胞が１ウェル当り５Ｘ１０’個とな
るように１０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ　　１６４０で懸濁さ
せ、ミクロテストプレートのウェルに分配した。培地は
２〜３日毎に加えた。

（Ｖ）ＨＬＡ抗原の検出及び融合細胞の選択：ハイブリ
ドーマの表面ＨＬＡ−ＤＲ抗原を標準の微小リンパ球障
害試験（ｍｉｃｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙＬｏＬｏｘｉｃｉ
ｔｙｔｅｓｔ）により検出し、１．４．８を有する融合
細胞の選択を行った。百方のＥ　Ｂ　Ｖ−３Ｕ細胞から
、ＨＬＡ−ＤＲｌ、４．８抗原を有するハイブリドーマ
２個を得た。さらに、限界希釈法により目的のハイブリ
ドーマを得た。

次に、このハイブリドーマ（２２３）をクローン化しく
　１０　ｃｅｌｌｓ／　ｗｅｌｌ）、サブクローン（２
２３，１０゜３３株）を得た。

製造例で得た２２３．＋０．３３株細胞を１０％牛脂児
血清含有のＲＰ　Ｍ　ｌ−１６４０培地を使用し、３７
℃、５％Ｃ０２ガス、９５％空気の環境下で、７ラスコ
による継代培養を行った。この細胞を、新たに上記培地
５１１に分散させ（細胞濃度２　ｘ　１０　”／ｍｌ）
、５悲容スピナーフラスコを用いてかくはん培養を行っ
た（回転数２　Ｏｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｐｐｍ）。

約６日間の培養で、細胞濃度が約ｌＸｌ０’／ｍＱに達
した培養液を遠心分離（４０００ｒｐｍ１５分）により
細胞を除去し、５１１の培養上澄液を得た。この培養上
澄液を限外ろ過（分子量３０万以下を除く膜を使用）に
かけて、５００ｍＡに濃縮した。これに硫安を加えて５
０％飽和とし、沈殿物を遠心分離し、粗イムノグロブリ
ン（ＩｇＭ）含有物を得た。これを０．９％食塩入り、
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　１５０ｍＱに溶
解し、同緩衝液に対して透析を行い（約１８時間）、透
析内容成約２００ｍαを得た。別に内径５　ｃｍ、高さ
９０ｃｍのセファクリルＳ−３００のカラムを調整して
おき、これに上記の透析内容液１００ｍＱを載せて、同
緩衝液で溶出させた。

溶出液のＩｇＭのチエツクは、２８０ｎｍの吸光度測定
及びエライザ法によるＩｇＭの測定により行った。Ｉｇ
Ｍ溶出画分（約２５０ｍｆｆ１）を上記限外ろ過にかけ
、６’ｍＱに濃縮して、２２３．１０．３３株抗体を得
た。この抗体溶液は、１０ｍｇ／ｍＱのＩｇＭを含み、
補体依存性細胞障害性試験による力価は２５６倍であっ
た。

実施例２　　Ｈ３，ＩＯ，３３株によるＩｇＭのＧＩＴ
培地における製造 牛胎児血清の代りに、動物血清中の細胞増殖因子を添加
したＧＩＴ培地（大王栄養化学製造、和光紬薬販売）を
製造に使用した。

製造例で得た２２３．１Ｌ３３株細胞を前記培地におい
て、３７°Ｃ，５％ＣＯ２ガス、９５％空気の環境下で
、フラスコによる継代培養を行った。この細胞を遠心分
離（＋５００ｒｐｍ、５分）により集め、新しいＧＩＴ
培地培地３０企Ｑむ７５ｃｍ２のフラスコク０本に懸濁
させた（細胞濃度２　ｘ　１０５／ｍｌ）。

このフラスコ培養液６００ｍ１１と新しいＧＩＴ培地＋
４＋ＩＱ＋＋ｌを２（容スピナーフラスコに入れて細胞
を分散させ（細胞濃度２　ｘ　１０５／ｍｌ）、撹拌培
養を行った（回転数３２　ｒｐｍ、溶存酸素濃度４ｐｐ
ｍ）。

６日間の培養で、細胞濃度がＩ　Ｘ　１０６／ｍｌに達
した培養液を遠心分離（４０００ｒｐｍ、　５分）にか
けて、細胞を除去して２ｕの培養上溝液を得た。この培
１１上清液を、プロティンＡセファロースＣＬ−６Ｂを
充填したカラム（Ｇ、５ｘ　１５　ｃｍ’）に流速１　
ｍ１１１分で流してＩｇＭを吸着させたのち、ｐＨ４の
０．０２Ｍリン酸緩衝液で洗浄しく流速１　ｍｌｔｌ分
）、ｐＨ３の０．０３リン酸緩衝液でＩｇＭを溶出させ
た（流速１ｍＶ分）。溶出液中のチエツクは、２８０ｎ
ｍの吸光度測定及びエライザ法によるＩｇＭの測定によ
り行つに。

Ｉ　ｇＭ溶出画分（２００ｍＡ）について、ファルマシ
アスーパーロース６カラム（ファルマシア製）を用いて
、ＦＰＬＣによるゲルろ過クロマトグラフィ＝（０，０
１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ０６，ｓ、流速０．５ｍａ／分
）を行い、得られたＩｇＭ画分１００ｍＯを限外ろ過（
分子量３０万以下を除く膜を使用）にかけて、１０ｍ１
１の２２３．１０．３３株抗体（ＩｇＭ量１０ｍｙ’）
を得た。このものは、ＳＤＳ電気泳動でチエツクした結
果、純粋であることを確認した。この抗体溶液の補体依
存性細胞障害性試験による力価は５１２倍であった。

実施例３　２２３．＋０．３３抗体の末梢血単核球に対
する反応性（補体依存性細胞障害試瞼） １８人の正常ヒト末梢血からＣｏｎｒａｙ−Ｆｉｃｏｌ
ｌ法により単核球を分離し、さらにナイロンカラム法及
びヒツジ赤血球ロゼツト形成法によりＴ細胞とＢ細胞に
分離した。実験には、これらＴ細胞、Ｂ細胞と共に、各
種マイトーゲン（ＰＨＡ”ＰＷＭ”％　ＣｏｎＡ”）や
、ＩＬ−２”で刺激した末梢血単核球を使用した。Ｐ　
ＨＡ、　Ｐ　ＷＭ、　ＣｏｎＡ。

ＩＬ−２を１０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地
中にそれぞれ０．１％、１％、１０　ｐｙ／ｍＱ、　　
ｌｕの濃度に添加し、５日間培養して刺激を行った。

テラサキプレートに、実施例１で調製した抗体１μａを
加え上記の標的細胞を各ウェル２００Ｇ（ｉｌ／ＧＶＢ
”（ゼラチンベロナール緩衝液）になるように分注し、
３７°Ｃで１時間反応させた。その後、ウサギ補体（ペ
リタス社製）を２倍希釈し、その５μａを加え、室温で
２時間反応させたのち、ニオシン染色、及びホルマリン
固定を行い、細胞の生死を顕鏡した。結果を第１表に示
す。

２２３、ＩＯ，３３抗体は、各種マイトーゲンやＩＬ−
２で刺激した末梢血単核球と反応したが、非刺激末梢血
Ｔ細胞やＢ細胞とは反応しなかった。

［注］ ｌ）：フィトヘムアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇ
ｇｌｕｔｉｎｉｎ）２）：アメリカヤマゴボウレクチン
（ｐｏｋｅｖｅｅｄｍｉＬｏ口ｎ） ３）：コンカナバリンＡ　（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
　Ａ）４）：インターロイキン２　（ｉｎＬｅｒｌｅｕ
ｋｉｎ　２）第　　　　１　　　　表 正常な３人のヒト末梢血から、Ｃｏｎｒａｙ−Ｆｉｃｏ
ｌｌ法により単核細胞を分離し、さらに羊赤血球ロゼツ
ト法によりＴ細胞を分離した。この細胞をＩＬ２　（１
０ｕ、ｌｕ）を含む２０％ヒト血清含有ＲＰＭＩ−１６
１０培地に懸濁しく細胞濃度１×１ｏ５／ｍト培地）、
３７°０１５％Ｃｏ２ガス、９５％空気の環境下で３日
に１回の割合で半量培地を交換しながら培養した。ＯＸ
　ｌ、２．３．５．７日後に細胞を集め、実施例３に示
した細胞障害試験法により細胞の生死を顕鏡した。

結果を第２表に示す。値は３人のＴ細胞に対する平均細
胞障害百分率で表した。

２２３．１０．３３抗体は、培養５日目以降のＴ細胞と
反応した。

Ｖ　（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）で形質
転換して、ＥＢＶ−Ｂ細胞を調製［「ネイチャー　（Ｎ
ａｔｕｒｅ）　、第２６９巻、第４２０〜４２２ページ
（１９７７年）コシた。実施例３と同様の細胞障害試験
法で抗体の作用を調へた。結果第３表に示す。抗体は、
培養開始後１２日ないし１４日目以降の細胞と反応した
。

第　　　　２　　　　表 正常な３人のヒト末梢血から、Ｃｏｎｒａｙ−Ｆｉｃｏ
ｌｌ法により単核細胞を分離し、さらに羊赤血球ロゼツ
ト法によりＢ細胞を分離した。このＢ細胞をＥＢ実施例
６　単核球の抗体産生に与える影響正常ヒト末梢血から
Ｃｏｎｒａｙ−Ｆｉｃｏｌｌ法により単核球を分離した
。この細胞をＰＷＭ（１％）を含む１０％ヒト血清含有
ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培地に懸濁しく細胞濃度５Ｘ１
０’／社）、９６穴Ｕ型マイクロプレートを用いて３７
°０．５％ＣＯ□ガス、９５％空気の環境下で培養を行
った。培養開始１．３．６．１２．２４．４８．７２．
９６及び１２０時間後にＲＰＭＴ−１６ｔｏ培地に溶解
した抗体溶液（２２３，１０，３３抗体５ｍｇ／ｍＱ、
あるいは標準ヒトＩｇＭ、カッペル社製５ｍｇ／ｍα）
を１ウェル当り２０μを添加した。

培養１週間後に細胞を遠心分離により回収し、リバース
プラーク法（「免疫実験操作法ＪＣ，第２００３−２０
０４ページ）を用いてＩｇＧ反応型及びＩｇＭ反応型プ
ラーク形成細胞（ＰＦＣ）を検出した。

結果を第４表に示す。なおＰＦＣは細胞１０’個当りの
個数で表示した。２２３．１０．３３抗体は、ＰＷＭ刺
激直後から増殖分化段階の後期までＩｇＧ。

ＩｇＭの生産を著量に抑制した。一方、市販ヒトＩｇＭ
では、このような抑制はなかった。

実施例７　認識抗原分子量の検定 ウェスタンプロット法により認識抗原の分子量を検討し
た。２２３．ＩＯ，３３抗体と特に反応性の高いＢ　−
８５（Ｅｐｓｆｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルスで形質転換Ｂ
リンパ芽球細胞株）、ＢＴ−１（バーキットリンパ腫）
を０．５％ＮＰ−４０で可溶化し、遠心分離で核を除い
たのち、膜を含む細胞画分を得た。これを５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルにかけ、電気永動を行った。次いで
ゲルからニトロセルロースフィルターへ転写を行ったの
ち、２２３．１Ｇ、３３抗体と反応させ、ＰＯＤ（パー
オキシダーゼ）標識ヤギ■ｇＭ（カッペル社製）を用い
て認識抗原を検出した。

その結果、＋００−１０５に、　１２０−ＨＯＫ、　２
７Ｇ−ＨＯＫダルトンの３本のバンドを確認した。

実施例８　モノクローナル抗体で検出されるＢ細胞マー
カー Ｂ細胞の各分化段階を示すそれぞれの細胞株を標的細胞
として、２２３．Ｉｏ、３３抗体の反応性を、間接蛍光
抗体法（臨床免疫ハンドブック、日本臨床１９８４年春
季増刊号、第１５１０ページ）により調べた。

なお、ＣＤ抗体〔臨床免疫、第１８巻、夏季特別増刊号
、第Ｉ９ページ（１９８６年）〕として、Ｂ２（ＣＤ２
１、コールタ−クローン）　、Ｌｅａ　−１４（ＣＤ２
３、藤沢薬品）、Ｈ１０７（ＣＤ２３、ニチレイ）を使
用した。その結果を第５表に示した。

この表により、２２３．ＩＯ，３３抗体は、ＣＤ２３抗
体と関連のあることが確認された。

特許庁長官　　吉　　１）　文　　毅　　殿１．事件の
表示 昭和６３年特許願第２０１５０７号 ２、発明の名称 モノクローナル抗体及びその利用方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 神奈川県横浜市旭区用島町３０５０−１３９辻　　　　
　　　　公　　　　美 ４、代理人 東京都港区新橋２丁目２番２号川志満・邦信ビル８階８
、補正の内容 （１）　　明細書第２２ページ第８行のｒ　ｌ　Ｏｍ９
／ｍ１２Ｊをｒ　ｌ　ｍｇ／　ｒｎＱ」に訂正します。

（２）　同第２３ページ第１行の「（細胞濃度２×１０
’／ｍ１２）Ｊを「（細胞濃度４．６Ｘ　ｌｏ５／＋＋
＋ｆｆ）Ｊに訂正します。

（３）　同第２３ページ第２行の「フラスコ培養液」を
「フラスコ懸濁液」に訂正します。

（４）　同第２３ページ最下行のｒｐＨＯ６，５ｊをｒ
ｐＨ６，５Ｊに訂正します。

５、補正命令の日付　　自　発

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒトリンパ球の分化抗原を認識するヒト・ヒトハイ
   ブリドーマ由来のモノクローナル抗体。 ２　ヒトリンパ球に対し免疫抑制作用を有するヒト・ヒ
   トハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体。 ３　ヒト・ヒトハイブリドーマが、形質転換ヒト細胞を
   増殖抑制処理し、次いでこれをヒト抗体産生細胞と融合
   させて成るものである請求項１又は２記載のモノクロー
   ナル抗体。 ４　ヒト・ヒトハイブリドーマ由来のモノクローナル抗
   体を有効成分とする免疫抑制剤。 ５　モノクローナル抗体がヒトリンパ球の分化抗原を認
   識するものである請求項４記載の免疫抑制剤。 ６　モノクローナル抗体がヒトリンパ球に対し免疫抑制
   作用を有するものである請求項４記載の免疫抑制剤。 ７　ヒト・ヒトハイブリドーマが、形質転換ヒト細胞を
   増殖抑制処理し、次いでこれをヒト抗体産生細胞と融合
   させて成るものである請求項４、５又は６記載の免疫抑
   制剤。 ８　被検生物学的試料を請求項１記載のモノクロナール
   抗体と接触させることにより、該試料中の分化抗原を有
   するリンパ球と該モノクローナル抗体との複合体を形成
   させ、次いで該複合体を検出又は測定することを特徴と
   する、生物学的試料中の分化抗原を有するリンパ球の検
   出又は測定方法。